專利名稱：一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
楊屬Populus L.在全世界約有100多種,廣泛分布于歐亞和北美洲。我國約有62種，是世界楊樹種質(zhì)資源最多的國家。楊屬植物因其生長快、適應(yīng)性強、用途廣泛，不僅在水土保持和維護生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用，而且還具有廣泛的工業(yè)用途，是制漿造紙、膠合板、包裝材料等的重要原料。長期以來，楊樹的改良主要通過雜交育種的方式進行，但因其生長發(fā)育受光照、水分、溫度很多因素影響，與其它農(nóng)作物和園藝植物比較，有許多特有的生物學(xué)特性，如較長的生長周期、復(fù)雜的生殖方式、高度雜合性等，使得傳統(tǒng)的楊樹育種方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代育種的要求，所以，利用組織培養(yǎng)技術(shù)和基因工程方法來滿足實踐中對楊樹育種的要求具有重要的意義。進入二十世紀(jì)八十年代后，隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以1983年首株轉(zhuǎn)基因煙草問世為標(biāo)志，功能基因的克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用到植物抗性的研究領(lǐng)域。盡管以木本植物為實驗材料的林木基因工程因研究難度較大，進展相對滯后，但是由于楊樹生長速度快，易繁殖，核基因組(約420Mb)及染色體數(shù)目相對較小，易于通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，使得楊樹成為研究樹木分子生物學(xué)、林業(yè)生物技術(shù)及樹木基因組的模式植物。目前，在植物上應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有DNA直接轉(zhuǎn)移法和根癌農(nóng)桿菌(Agrobactenium tumefaciens)介導(dǎo)法。其中后者最為常用，是目前應(yīng)用最廣泛且結(jié)果較為理想、技術(shù)較為成熟的一種基因轉(zhuǎn)化方法。它具有操作簡便，外源基因插入一般為單拷貝或低拷貝，整合位點穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移DNA片段明確，整合后外源基因結(jié)構(gòu)變異小，可轉(zhuǎn)移大片段DNA，可直接用不同的植物組織進行基因轉(zhuǎn)移等優(yōu)點。已被應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因植物如煙草擬南芥西紅柿玉米等，80%以上是通過這種方法獲得的。雖然目前對楊屬的遺傳轉(zhuǎn)化已逐步趨于深入，但是這些研究多應(yīng)用于胡楊、歐洲黑楊、毛果楊、小葉楊等樹種，對白楊派及其雜種無性系的研究相對較少；而且目前所用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對白楊派并不適用。鑒于白楊派樹種具有適應(yīng)生境廣、抗逆性強、鄉(xiāng)土樹種多、種間雜交能力強、能在大陸半干旱帶和大陸濕潤帶等廣泛生境范圍內(nèi)栽培并可發(fā)揮較大的生產(chǎn)作用等獨特優(yōu)勢，本研究以白楊雜種無性系717_1B4(P. tremulaXP. alba)為實驗對象，建立了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟(I)預(yù)培養(yǎng)
將717楊樹( P. tremulaXP. alba)腋芽或頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄置于Ml'培養(yǎng)基中，于24-26°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-3天；(2)菌種活化與培養(yǎng)用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農(nóng)桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，27-29°C倒置暗培養(yǎng)20-28h ;挑取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27-29°C倒置暗培養(yǎng)36-48h ；挑取單菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，150_200rpm27-29°C暗培養(yǎng)12-16h ;吸取0. 1-1. OmL菌液至含有抗生素的50_75mLYEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，150-200rpm 27-29°C暗培養(yǎng)至 OD600 = 0. 6-0. 8 ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10_15min，棄去上清液，將沉淀用 50-75mL M 液重懸，24_26°C，80-100rpm 活化 0. 5_lh 得到侵染液；按 30-50 個25mL的比例將經(jīng)步驟(I)預(yù)培養(yǎng)的莖段或帶有葉片的葉柄放入所述侵染液中，24-26°C條件下80-100rpm 侵染 30_60min ；(4)共培養(yǎng)從侵染液中取出莖段或帶有葉片的葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，24-26 0C，暗條件下共培養(yǎng)2-3天；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養(yǎng)的莖段或帶有葉片的葉柄，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4-5min，洗滌2_3次，接著用濃度為350-500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌
4-5min,洗滌2_3次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉(zhuǎn)移至CM延遲選擇培養(yǎng)基中，24-26°C暗培養(yǎng)10-11天，取出更換至新的CM延遲選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)24-26°C暗培養(yǎng)10-11天，得到帶有愈傷組織的莖段或葉柄；(6)誘導(dǎo)不定芽將所述帶有愈傷組織的莖段或葉柄轉(zhuǎn)移至SIMa篩選培養(yǎng)基中，光照條件下進行培養(yǎng)，每15-20天更換一次培養(yǎng)基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有SIMb篩選培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養(yǎng)切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態(tài)的不定芽，轉(zhuǎn)移至含有SEM篩選培養(yǎng)基的組培瓶中進行伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)2-4周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導(dǎo)生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉(zhuǎn)入RM培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化了的雜交楊樹。步驟(I)中所述Ml'培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，生長素NAAI. 86mg,細(xì)胞分裂素 2ip I. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L。
步驟(2)中所述農(nóng)桿菌為C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)時，所述抗生素為利福平(Rifampicin)、慶大霉素(Gentamicin)和壯觀霉素(spectinomycin),在YEB固體培養(yǎng)基或YEB液體培養(yǎng)基中利福平的濃度為25-50mg/L、慶大霉素的濃度為20_30mg/L、壯觀霉素的濃度為30-50mg/L。步驟⑶中所述M液的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，生長素NAA I. 86mg,細(xì)胞分裂素 2ip I. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，加水至 IL0步驟(4)中所述Ml固體培養(yǎng)基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，生長素NAAI. 86mg，細(xì)胞分裂素 2ip I. 02mg,pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，瓊脂 7-7. 2g，加水至IL0步驟(5)中所述CM延遲選擇培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，生長素NAA1. 86mg, pH = 5. 6-5. 8，細(xì)胞分裂素 2ip I. 02mg,頭孢霉素 350_500mg，瓊脂 7-7. 2g，加水至1L。步驟(6)中所述SMa篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細(xì)胞分裂素TDZO. 05mg, pH = 5. 6-5. 8，頭孢霉素 350_500mg,潮霉素 B IOmg,瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L，所述光照條件下進行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度22-26°C，光照1500-20001UX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。步驟(6)中所述SMb篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細(xì)胞分裂素TDZO. 0022mg,頭孢霉素 350_500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L。步驟(7)中所述SEM篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細(xì)胞分裂素BAPO. 05mg,頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L。步驟⑶中所述RM培養(yǎng)基的組成為MS鹽2. 2g，蔗糖20_30g，頭孢霉素350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0本發(fā)明提供了一種高效的用于雜交楊樹轉(zhuǎn)化的方法，NAA和2ip聯(lián)合作用誘導(dǎo)經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖段或葉柄產(chǎn)生愈傷組織，在細(xì)胞分裂素TDZ作用下，促使愈傷再分化形成不定芽，呈玻璃化狀態(tài)的幼芽在BAP誘導(dǎo)下伸長，形態(tài)逐漸趨于正常，具有抗性的再生楊樹在含有抗生素潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基中生根。本方法獲得的抗性轉(zhuǎn)基因楊樹，周期短，轉(zhuǎn)化效率高，為轉(zhuǎn)基因楊樹在實踐中的育種提供了堅實的基礎(chǔ)和理論支持。本發(fā)明可在短時間內(nèi)選育出新雜交楊抗逆、抗蟲等新品種，為林木的遺傳改良提供了一個新途徑。


圖I侵染時間對717楊樹轉(zhuǎn)化效率的影響圖2乙酰丁香酮的濃度對717楊樹轉(zhuǎn)化效率的影響圖3延遲選擇時間對717楊樹轉(zhuǎn)化效率的影響圖4全基因組PCR檢測結(jié)果
具體實施方式
本發(fā)明的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，并不能對本發(fā)明作任何限制。下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例I一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟(I)預(yù)培養(yǎng) 將717楊樹(P. tremulaXP. alba)腋芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4周獲得組培苗；切取組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2次造成傷口置于Ml'培養(yǎng)基中，于24°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2天；(2)菌種活化與培養(yǎng)用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農(nóng)桿菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平、慶大霉素和壯觀霉素的YEB固體培養(yǎng)基上，27°C倒置暗培養(yǎng)20h ;挑取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌在另一含有與前面同樣的抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27°C倒置暗培養(yǎng)48h ；挑取單菌落至含有與前面同樣的抗生素2mLYEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，150rpm 27°C暗培養(yǎng)16h ;吸取0. ImL菌液至含有與前面同樣的抗生素的60mLYEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，150rpm 27°C暗培養(yǎng)至OD600 = 0 . 7 ；在YEB固體培養(yǎng)基或YEB液體培養(yǎng)基中利福平的濃度為50mg/L、慶大霉素的濃度為30mg/L、壯觀霉素的濃度為30mg/L ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3500rpm離心15min，棄去上清液，將沉淀用60mL M液重懸，240C，90rpm活化30min得到侵染液；按50個25mL的比例將經(jīng)步驟⑴預(yù)培養(yǎng)的莖段放入所述侵染液中，24°C條件下90rpm侵染30min ；(4)共培養(yǎng)從侵染液中取出莖段，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，24V，暗條件下共培養(yǎng)2天；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養(yǎng)的莖段,先用去離子水在180rpm下洗漆5min,洗漆2次,接著用濃度為500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌5min，洗滌2次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉(zhuǎn)移至CM延遲選擇培養(yǎng)基中，24°C暗培養(yǎng)11天，取出更換至新的CM延遲選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)24°C暗培養(yǎng)10天，得到帶有愈傷組織的莖段；(6)誘導(dǎo)不定芽將所述帶有愈傷組織的莖段轉(zhuǎn)移至SMa篩選培養(yǎng)基中，光照條件下進行培養(yǎng)，每20天更換一次培養(yǎng)基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有SIMb篩選培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養(yǎng)切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態(tài)的不定芽，轉(zhuǎn)移至含有SEM篩選培養(yǎng)基的組培瓶中進行伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)3周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導(dǎo)生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉(zhuǎn)入RM培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化了的雜交楊樹(見圖4)。
基本培養(yǎng)基1/2 MS，蔗糖25g，pH 5. 6，瓊脂7. 2g，余量為水。Ml'培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，生長素NAA I. 86mg,細(xì)胞分裂素2ipI. 02mg, pH = 5.6,瓊脂 7. 2g，加水至 1L。M液的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖25g,生長素NAA I. 86mg,細(xì)胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 6,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固體培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖25g,生長素NAA 1.86mg,細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6,乙酰丁香酮 19. 86mg,瓊脂 7. 2g，加水至 1L。CIM延遲選擇培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，生長素NAA I. 86mg, pH =5. 6，細(xì)胞分裂素2ip I. 02mg,頭孢霉素400mg,瓊脂7. 2g，加水至IL0SIMa篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，細(xì)胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 6，頭孢霉素400mg，潮霉素B IOmg,瓊脂7. 2g,加水至1L，所述光照條件下進行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24°C，光照15001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。SIMb篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，細(xì)胞分裂素TDZ 0. 0022mg,頭孢霉素400mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.6,瓊脂7. 2g，加水至IL0SEM篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，細(xì)胞分裂素BAP 0. 05mg,頭孢霉素400mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.6,瓊脂7. 2g，加水至IL0RM培養(yǎng)基的組成為MS鹽2.2g，蔗糖25g，頭孢霉素400mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 6，瓊脂7. 2g，加水至1L。實施例2一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟(I)預(yù)培養(yǎng)將717楊樹(P. tremulaXP. alba)頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)5周獲得組培苗；切取所述組培苗的帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄，置于Ml'培養(yǎng)基中，于26°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天；(2)菌種活化與培養(yǎng)用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農(nóng)桿菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平，慶大霉素和壯觀霉素的YEB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置暗培養(yǎng)24h ;挑取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌在另一含有與前面同樣的抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C倒置暗培養(yǎng)40h ；挑取單菌落至含有與前面同樣的抗生素的3mLYEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，180rpm 28°C暗培養(yǎng)14h ;吸取0. 5mL菌液至含有與前面同樣的抗生素的50mLYEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，180rpm 28°C暗培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6 ；在YEB固體培養(yǎng)基或YEB液體培養(yǎng)基中利福平的濃度為25mg/L、慶大霉素的濃度為25mg/L、壯觀霉素的濃度為50mg/L ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3750rpm離心13min，棄去上清液，將沉淀用50mL M液重懸，260C，80rpm活化45min得到侵染液；按40個25mL的比例將經(jīng)步驟⑴預(yù)培養(yǎng)的葉柄放入所述侵染液中，26°C條件下80rpm侵染45min ；(4)共培養(yǎng)從侵染液中取出葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，26 °C，暗條件下共培養(yǎng)60h ；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養(yǎng)的葉柄,先用去離子水在200rpm下洗漆4min,洗漆3次,接著用濃度為350mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌4min，洗滌3次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉(zhuǎn)移至CM延遲選擇培養(yǎng)基中，26°C暗培養(yǎng)10天，取出更換至新的CM延遲選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)26°C暗培養(yǎng)11天，得到帶有愈傷組織的葉柄；(6)誘導(dǎo)不定芽將所述帶有愈傷組織的葉柄轉(zhuǎn)移至SIMa篩選培養(yǎng)基中，光照條件下進行培養(yǎng)，每17天更換一次培養(yǎng)基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有SIMb篩選培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養(yǎng)切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態(tài)的不定芽，轉(zhuǎn)移至含有SEM篩選培養(yǎng)基的組培瓶中進行伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)2周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導(dǎo)生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉(zhuǎn)入RM培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化了的雜交楊樹?；九囵B(yǎng)基1/2MS，蔗糖20g，pH 5. 8，瓊脂7. lg，余量為水。Ml'培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，生長素NAA I. 86mg,細(xì)胞分裂素2ip
I.02mg, pH = 5. 8,瓊脂 7. Ig,加水至 1L。M液的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖20g,生長素NAA I. 86mg,細(xì)胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 8,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固體培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖20g,生長素NAA 1.86mg,細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 8,乙酰丁香酮 19. 86mg,瓊脂 7. lg，加水至 1L。CIM延遲選擇培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，生長素NAA I. 86mg, pH =5. 8，細(xì)胞分裂素2ip I. 02mg,頭孢霉素350mg,瓊脂7. Ig,加水至IL0SIMa篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，細(xì)胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 8，頭孢霉素350mg，潮霉素B IOmg,瓊脂7. Ig,加水至1L，所述光照條件下進行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度26°C，光照18001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。SIMb篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，細(xì)胞分裂素TDZ 0. 0022mg,頭孢霉素350mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.8,瓊脂7. Ig,加水至IL0SEM篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，細(xì)胞分裂素BAP 0. 05mg,頭孢霉素350mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.8,瓊脂7. Ig,加水至IL0RM培養(yǎng)基的組成為MS鹽2.2g，蔗糖20g，頭孢霉素350mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 8，瓊脂7. lg，加水至1L。 實施例3一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟(I)預(yù)培養(yǎng)
將717楊樹(P. tremulaXP. alba)腋芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)6周獲得組培苗；切取所述組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃3次造成傷口置于Ml'培養(yǎng)基中，于25°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天；(2)菌種活化與培養(yǎng)用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農(nóng)桿菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平，慶大霉素和壯觀霉素的YEB固體培養(yǎng)基上，29°C倒置暗培養(yǎng)28h ;挑取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌在另一含有與前面同樣的抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，29°C倒置暗培養(yǎng)36h ；挑取單菌落至含有與前面同樣的抗生素的4mLYEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，200rpm29°C暗培養(yǎng)12h ;吸取ImL菌液至含有與前面同樣的抗生素的75mLYEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，200rpm 29°C暗培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 8 ；在YEB固體培養(yǎng)基或YEB液體培養(yǎng)基中利福平的濃度為30mg/L、慶大霉素的濃度為20mg/L、壯觀霉素濃度為40mg/L ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、4000rpm離心lOmin，棄去上清液，將沉淀用75mLM液重懸，250C，IOOrpm活化60min得到侵染液；按30個25mL的比例將經(jīng)步驟⑴預(yù)培養(yǎng)的莖段放入所述侵染液中，25°C條件下IOOrpm侵染60min ；(4)共培養(yǎng)從侵染液中取出莖段，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，25 0C，暗條件下共培養(yǎng)3天；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養(yǎng)的莖段，先用去離子水在220rpm下洗滌5min，洗滌2次，接著用濃度為500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌5min，洗滌2次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉(zhuǎn)移至CM延遲選擇培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)10天，取出更換至新的CM延遲選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)25°C暗培養(yǎng)11天，得到帶有愈傷組織的莖段；(6)誘導(dǎo)不定芽將所述帶有愈傷組織的莖段轉(zhuǎn)移至SIMa篩選培養(yǎng)基中，光照條件下進行培養(yǎng)，每15天更換一次培養(yǎng)基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有SIMb篩選培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養(yǎng)切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態(tài)的不定芽，轉(zhuǎn)移至含有SEM篩選培養(yǎng)基的組培瓶中進行伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)4周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導(dǎo)生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉(zhuǎn)入RM培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化了的雜交楊樹?；九囵B(yǎng)基1/2MS，蔗糖30g，pH 5. 7，瓊脂7. Og，余量為水。Ml'培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，生長素NAA I. 86mg，細(xì)胞分裂素2ip
I.02mg, pH = 5. 7，瓊脂 7. Og,加水至 IL0
M液的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖30g,生長素NAA I. 86mg,細(xì)胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 7,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固體培養(yǎng)基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖30g，生長素NAA I. 86mg，細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 7,乙酰丁香酮 19. 86mg,瓊脂 7. 0g，加水至 1L。CIM延遲選擇培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，生長素NAA I. 86mg, pH =5. 7，細(xì)胞分裂素2ip I. 02mg,頭 孢霉素500mg,瓊脂7. Og,加水至IL0SMa篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細(xì)胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 7，頭孢霉素500mg，潮霉素B IOmg,瓊脂7. Og,加水至1L，所述光照條件下進行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度22°C，光照20001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。SMb篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細(xì)胞分裂素TDZ 0.0022mg，頭孢霉素500mg,潮霉素B IOmg, pH = 5. 7，瓊脂7. Og,加水至IL0SEM篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細(xì)胞分裂素BAP 0. 05mg,頭孢霉素500mg,潮霉素B IOmg, pH = 5. 7，瓊脂7. Og,加水至IL0RM培養(yǎng)基的組成為MS鹽2. 2g，蔗糖30g，頭孢霉素500mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 7，瓊脂7. 0g，加水至1L。上面各實施例所涉及的MS鹽(Duchefa Biochemie B. V.公司)各實施例中的YEB固體培養(yǎng)基牛肉浸膏5. Og/L、胰蛋白胨5. Og/L、酵母提取物
I.Og/L、蔗糖 5. 0g/L、MgSO4. 7H20 0. 5g/L、瓊脂 15g/L ；pH = 7. 0，余量為水。各實施例中的YEB液體培養(yǎng)基牛肉浸膏5. 0g/L、胰蛋白胨5. 0g/L、酵母提取物
I.0g/L、蔗糖 5. 0g/L、MgSO4. 7H20 0. 5g/L、pH = 7. 0，余量為水。實施例4 :不同外植體類型對717 (P. tremulaXP. alba)楊樹產(chǎn)生陽性抗性芽的影響本實驗采用717楊樹不帶腋芽的莖段，帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄，l_2cm2的葉片三種不同的組織作為農(nóng)桿菌侵染的外植體材料。實驗步驟和條件均采用實施例I的步驟和條件，結(jié)果表明(表I)，在其它轉(zhuǎn)化條件相同的情況下，不同的外植體材料產(chǎn)生的抗潮霉素陽性再生芽的頻率不同，其中莖段的轉(zhuǎn)化效率最高，葉柄次之，但差異并不顯著，而由葉片產(chǎn)生的再生芽的頻率最低，幾乎沒有再生芽產(chǎn)生。因此本發(fā)明采用不帶腋芽的莖段，帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄作為合適的轉(zhuǎn)化受體材料，而不選用現(xiàn)有技術(shù)常用的葉片為轉(zhuǎn)化受體材料。這表明本發(fā)明中所建立的轉(zhuǎn)化體系適合莖段及葉柄的轉(zhuǎn)化，對以葉片作為外植體的轉(zhuǎn)化并不適用。表I不同受體材料對717楊樹產(chǎn)生抗性不定芽的影響
權(quán)利要求
1.一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征包括下述步驟 (1)預(yù)培養(yǎng) 將717楊樹腋芽或頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄置于Ml'培養(yǎng)基中，于24-26°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-3 天； (2)菌種活化與培養(yǎng) 用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農(nóng)桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，27-29°C倒置暗培養(yǎng)20-28h ;挑取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27-29°C倒置暗培養(yǎng)36-48h ； 挑取單菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，150_200rpm27-29°C暗培養(yǎng)12-16h ;吸取0. 1-1. OmL菌液至含有抗生素的50_75mLYEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，150-200rpm 27-29°C暗培養(yǎng)至 OD600 = 0. 6-0. 8 ； (3)侵染 將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10_15min，棄去上清液，將沉淀用 50-75mL M 液重懸，24_26°C，80-100rpm 活化 0. 5_lh 得到侵染液；按 30-50 個25mL 的比例將經(jīng)步驟(I)預(yù)培養(yǎng)的莖段或帶有葉片的葉柄放入所述侵染液中，24-26°C條件下80-100rpm 侵染 30_60min ； (4)共培養(yǎng) 從侵染液中取出莖段或帶有葉片的葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，24-26 °C，暗條件下共培養(yǎng)2-3天； (5)延遲選擇 取出步驟(4)共培養(yǎng)的莖段或帶有葉片的葉柄，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4-5min，洗滌2_3次，接著用濃度為350-500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌4_5min，洗滌2-3次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉(zhuǎn)移至CM延遲選擇培養(yǎng)基中，24-26°C暗培養(yǎng)10-11天，取出更換至新的CM延遲選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)24-26°C暗培養(yǎng)10-11天，得到帶有愈傷組織的莖段或葉柄； (6)誘導(dǎo)不定芽 將所述帶有愈傷組織的莖段或葉柄轉(zhuǎn)移至SIMa篩選培養(yǎng)基中，光照條件下進行培養(yǎng)，每15-20天更換一次培養(yǎng)基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有SIMb篩選培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ； (7)伸長培養(yǎng) 切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態(tài)的不定芽，轉(zhuǎn)移至含有SEM篩選培養(yǎng)基的組培瓶中進行伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)2-4周，獲得表型趨于正常的芽； (8)誘導(dǎo)生根及檢測 取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉(zhuǎn)入RM培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化了的雜交楊樹。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(I)中所述Ml'培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20-30g，生長素NAA 1.86mg，細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(2)中所述農(nóng)桿菌為C58/pMP90/pH 7GWIWG2(I)，所述抗生素為利福平、慶大霉素和壯觀霉素，在YEB固體培養(yǎng)基或YEB液體培養(yǎng)基中利福平的濃度為25-50mg/L、慶大霉素的濃度為20-30mg/L、壯觀霉素的濃度為30-50mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(3)中所述M液的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA I. 86mg，細(xì)胞分裂素2ipI. 02mg, pH = 5. 6-5. 8,乙酰丁香酮 19. 86mg,加水至 1L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(4)中所述Ml固體培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20-30g，生長素NAA 1.86mg，細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(5)中所述CM延遲選擇培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20-30g，生長素NAA I. 86mg, pH =5.6-5. 8，細(xì)胞分裂素2ip I. 02mg,頭孢霉素350_500mg,瓊脂7-7. 2g，加水至IL0
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(6)中所述SMa篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細(xì)胞分裂素TDZ O. 05mg, pH=5. 6-5. 8，頭孢霉素350-500mg，潮霉素B 10mg，瓊脂7-7. 2g，加水至1L，所述光照條件下進行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度22-26°C，光照1500-20001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于在步驟(6)中所述SMb篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，細(xì)胞分裂素TDZO. 0022mg,頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于在步驟(7)中所述SEM篩選培養(yǎng)基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，細(xì)胞分裂素BAP O. 05mg,頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于在步驟(8)中所述RM培養(yǎng)基的組成為MS鹽2.2g，蔗糖20-30g，頭孢霉素350_500mg，潮霉素BIOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟(1)預(yù)培養(yǎng)；(2)菌種活化與培養(yǎng)；(3)侵染；(4)共培養(yǎng)；(5)延遲選擇；(6)誘導(dǎo)不定芽；(7)伸長培養(yǎng)；(8)誘導(dǎo)生根及檢測。本發(fā)明提供的方法，NAA和2ip聯(lián)合作用誘導(dǎo)經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖段或葉柄產(chǎn)生愈傷組織，在細(xì)胞分裂素TDZ作用下，促使愈傷再分化形成不定芽，呈玻璃化狀態(tài)的幼芽在BAP誘導(dǎo)下伸長，形態(tài)逐漸趨于正常，具有抗性的再生楊樹在含有抗生素潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基中生根。本方法獲得的抗性轉(zhuǎn)基因楊樹，周期短，轉(zhuǎn)化效率高，為轉(zhuǎn)基因楊樹在實踐中的育種提供了堅實的基礎(chǔ)和理論支持。
文檔編號A01H5/00GK102634541SQ20121010490
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者王旭, 王潔華 申請人:天津大學(xué)