專利名稱：提高植物對病源、干旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高植物對病源、干旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法。
背景技術(shù)：
隨著植物基因組學(xué)和多種研究手段的發(fā)展，對植 物抗逆的分子機(jī)理有了較多的了解，逆境誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較清楚的至少有3條一是依賴于ABA的傳導(dǎo)途徑；二是獨立于ABA的脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)；三是部分依賴于ABA的信號途徑，如擬南芥似泛劃基因(Yamaguchi SK et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103，1988-1993，2006)。除此之外，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)包括油菜素內(nèi)酯、乙烯、茉莉酸、水楊酸等物質(zhì)在植物抗旱耐鹽脅迫中也扮演著重要角色(Kaschani F et al. , Curr. Opin. Chem. Biol. , 11,88-98,2007 ；Catinot J etal. , FEBS Lett. ，4，473-478，2008)。利用合適的外源性化學(xué)物質(zhì)調(diào)控大田生長作物中某些基因的表達(dá)，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食生產(chǎn)相當(dāng)關(guān)鍵，尤其是對于以下幾類在轉(zhuǎn)基因植物中有較高應(yīng)用價值的基因(1)增加目的營養(yǎng)物質(zhì)在種子、根、莖中的積累；(2)在植物生長發(fā)育周期內(nèi)某一時段產(chǎn)生某產(chǎn)物并集聚于某一植物組織內(nèi)以便于收集或/和分離；(3)在病原攻擊的位置啟動對于某一蟲害有特異毒性的毒素的表達(dá)；(4)提高植物抵抗多種逆境尤其是干旱，鹽堿的能力；(5)對目標(biāo)植物的生長周期進(jìn)行調(diào)節(jié)。第二點可使生物反應(yīng)器具有更高的效率，而第四點能更好的提高大田作物忍受惡劣天氣的能力，保障正常生長。烯丙異噻唑probenazole (3-allyloxy-l, 2-benzisothiazole-l, I- dioxide,PBZ)，是防治稻瘟病的優(yōu)良試劑，是目前日本殺菌劑中用量最大的品種之一。PBZ本身以及其代謝物不具有生物活性，并不影響稻瘟病的生長和對植物的侵染能力，它主要是通過激活植物自身的系統(tǒng)獲得抗性的抗病機(jī)制而使植物產(chǎn)生抗病性(Michiaki Lwata, The RoyalSociety of Chemistry Pesticide Outlook, 28-31, 2001)。PBZ 可以誘導(dǎo)擬南芥和煙草等雙子葉植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性，在水稻等單子葉植物中可通過類似的抗病反應(yīng)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。本發(fā)明研究小分子物質(zhì)PBZ時首先發(fā)現(xiàn)了 PBZ能夠提高擬南芥對多種逆境脅迫的抗性，并隨即對這一現(xiàn)象展開了系統(tǒng)的研究。形態(tài)學(xué)觀察、順式元件誘導(dǎo)變化、基因芯片分析和突變體阻斷分析等手段最終確定了 PBZ誘導(dǎo)提高擬南芥對多種逆境脅迫抗性的大致信號途徑，為進(jìn)一步通過篩選和利用小分子物質(zhì)提高植物在生長生活中的綜合優(yōu)勢提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高植物多種逆境脅迫(包括病源、干旱和高鹽等逆境脅迫)抗性的方法。本發(fā)明提供的提高植物多種逆境脅迫(包括病源、干旱和高鹽等逆境脅迫)抗性的方法，采用化學(xué)誘導(dǎo)劑一烯丙異噻唑進(jìn)行誘導(dǎo)，即對植物施加化學(xué)誘導(dǎo)劑PBZ，施加的方式可以為噴施PBZ溶液。噴施時，PBZ溶液濃度控制為O. 3—0.6禮，優(yōu)選濃度為O. 5mM。植物材料為營養(yǎng)生長后期的植物材料。為了增強(qiáng)化學(xué)誘導(dǎo)劑PBZ施加的效果，本發(fā)明還對植物組織或細(xì)胞導(dǎo)入擬南芥AtNPRl基因或擬南芥基因。本發(fā)明中，所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: I編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO :2氨基酸序列的多核苷酸系列。擬南芥AtNPRl編碼蛋白，是具有SEQ ID NO: 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: 3編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO :4氨基酸序列的多核苷酸。擬南芥AtICSl編碼蛋白，是具有SEQ ID NO: 4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基序列經(jīng) 過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的上述基因在植物提高植物多種逆境脅迫抗性中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明還提供一種在植物中引起所選擇的基因產(chǎn)物表達(dá)增高的方法，具體步驟如下
(1)用重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物；
(2)用化合物PBZ處理轉(zhuǎn)基因植物；
(3)使轉(zhuǎn)基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產(chǎn)物的表達(dá)。本發(fā)明中，所述的植物可以為水稻、玉米等。


圖I為在干旱脅迫處理16天后，野生型擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現(xiàn)。圖2為在干旱脅迫處理后復(fù)水，野生型擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的存活情況。圖3為在300mM NaCl處理下，野生型擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗鹽性表現(xiàn)。圖4為在干旱脅迫處理18天后，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現(xiàn)。其中，(a) PBZ處理的野生型擬南芥材料；(b)水處理的野生型擬南芥材料；(c) PBZ處理的轉(zhuǎn)似況7基因的擬南芥材料；(d)水處理的轉(zhuǎn)似況7基因的擬南芥材料。圖5為在干旱脅迫處理18天后，AtICSl轉(zhuǎn)基因擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現(xiàn)。圖6為在干旱脅迫處理13天后，野生型玉米分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現(xiàn)。圖7為在干旱脅迫處理13天后，野生型玉米分別在PBZ處理和水處理下的相對含水量情況。
圖8為在干旱脅迫處理13天后，野生型玉米分別在PBZ處理和水處理下的丙二醛積累情況。圖9為在干旱脅迫處理下，野生型水稻分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現(xiàn)。
具體實施例方式實施例I、擬南芥和編碼基因的獲得。I. I RNA 提取
取擬南芥葉片約O. lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，加Iml TRIzoIe(invitrogen公司),混勻后,室溫放置15分鐘,加O. 2ml氯仿:異戍醇(24:1),劇烈搖動15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經(jīng)O. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存于_80°C備用。I. 2 cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR
采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2ug制備的總RNA，0. 5ul Rnaseinhibitor,加DEPC處理過的去離子水至8. 5ul, 2ul 的01igo(dT)18 primer. 65°C 5min,室溫放置 IOmin, 13000rpm 離心 5s。再依次加入 4μ1 5XFirst-Strand buffer,0. 5M-1RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-I dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄I小時，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放于-20°C待用。I. 3 AtNPRl和AJC57全序列的獲得
根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫給出的序列，設(shè)計了 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6作為克隆全序列的PCR反應(yīng)的引物，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8作為克隆全序列的PCR反應(yīng)的引物。PCR反應(yīng)體系為50ul，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，58°C復(fù)性40s，72°C延伸60s，循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離?；厥詹⑶彝ㄟ^TA克隆至TAKARA pMD-19-T載體后，由上海英駿公司測序，獲得A tNPRl和A tICSl的序列。實施例2、擬南芥J tNPRl和A tICSl轉(zhuǎn)基因分析。2. I LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
1)在含利福霉素40ug/ml，鏈霉素100ug/ml的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C培養(yǎng)48h-72h ；
2)挑單菌落到含利福霉素40ug/ml，鏈霉素100ug/ml的YEB液體培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)至 0D600 0. 5 ；
3)冰上冷卻菌液，5000rpm,4°C 10分鐘收集菌體；
4)ImM Hepes pH 7. O洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次；
5)懸浮菌體于3ml10%甘油中，分裝至Ij I. 5ml離心管中，每管40ul。2. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
I)200ng質(zhì)粒DNAjP 40ul農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻后按以下條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；U I. 8 KV R 200 Ω C 25 uF
2)電擊后添加800ulSOC液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)Ih ；
3)4000rpm,10分鐘收集菌體，懸浮于200ul SOC中，涂在含100 ug/ml壯觀霉素，利福平40ug/ml，鏈霉素100ug/ml LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)48h_72h。2. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化
擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)
基質(zhì)組分蛭石黑土珍珠巖=9 : 3 : 0.5 營養(yǎng)液組分
權(quán)利要求
1.一種提高植物病源、干旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法，其特征在于采用化學(xué)誘導(dǎo)劑--烯丙異噻唑進(jìn)行誘導(dǎo)，即對植物施加化學(xué)誘導(dǎo)劑PBZ，施加的方式為噴施PBZ溶液；噴施時，PBZ溶液濃度控制為O. 3—0. 6 mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高植物病源、干旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法，其特征在于還對植物組織或細(xì)胞導(dǎo)入擬南芥基因或擬南芥JiJCM基因； 所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: I編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO 2氨基酸序列的多核苷酸系列； 所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: 3編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者 編碼SEQ ID NO :4氨基酸序列的多核苷酸。
3.—種在植物中引起所選擇的基因產(chǎn)物表達(dá)增高的方法，其特征在于具體步驟如下 (1)用重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物； (2)用化合物PBZ處理轉(zhuǎn)基因植物； (3)使轉(zhuǎn)基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產(chǎn)物的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的植物為水稻或玉米。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的植物為水稻或玉米。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種提高植物對病源、干旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法。本發(fā)明采用化學(xué)誘導(dǎo)劑—PBZ(烯丙異噻唑)進(jìn)行誘導(dǎo)，即對植物施加化學(xué)誘導(dǎo)劑PBZ，施加的方式為噴施PBZ溶液；噴施時，PBZ溶液濃度控制為0.3—0.6mM；為了提高施加化學(xué)誘導(dǎo)劑PBZ的效果，還對植物組織或細(xì)胞導(dǎo)入擬南芥AtNPR1基因或擬南芥AtICS1基因。
文檔編號A01G7/06GK102630512SQ201210104599
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者張建建, 楊進(jìn)孝, 王曉彥, 蒯本科, 高炯 申請人:復(fù)旦大學(xué)