小麥基因TaFUS3及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種小麥基因 TaFUS3及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物轉(zhuǎn)基因研究始于20世紀(jì)70年代末80年代初，1983年Zambryski獲得了世界 上第一例轉(zhuǎn)基因植株，1985年化rsch等創(chuàng)造了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的葉盤法，自此W后，分別建 立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激穿孔法、PEG介導(dǎo)法、花粉管通道法、顯微注射法、低能離 子束介導(dǎo)法等。轉(zhuǎn)基因成功的物種不斷擴(kuò)大，設(shè)及35科120多種植物，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 獲得的轉(zhuǎn)基因植物占轉(zhuǎn)基因總數(shù)的85%W上，基因槍法獲得的轉(zhuǎn)基因植物占10%左右。雙 子葉植物是農(nóng)桿菌的天然寄主，利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法已經(jīng)建立了多種雙子葉植物的 基因轉(zhuǎn)移體系，并將一些優(yōu)良的外源基因轉(zhuǎn)入了雙子葉植物，育成了轉(zhuǎn)基因品種，但是利用 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)單子葉植物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的工作進(jìn)展相對(duì)較慢。
[0003] 小麥?zhǔn)亲钪饕募Z食作物之一，但其基因工程的研究進(jìn)程已遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它作 物。小麥轉(zhuǎn)基因研究開(kāi)始于上世紀(jì)80年代初期。1992年Vasil等利用基因槍介導(dǎo)法獲得 了世界上第一例小麥轉(zhuǎn)基因植株。1994年曾君祉、成卓敏等利用花粉管通道法分別獲得了 小麥轉(zhuǎn)基因植株。1997年化eng等首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS和npt II轉(zhuǎn)入了小麥，標(biāo) 志著農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥的突破。目前在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多、效果最好的是基因槍 法，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小麥都是采用該方法獲得的。農(nóng)桿菌法在轉(zhuǎn)基因小麥中的應(yīng)用也日趨 成熟，而花粉管通道法也W其特有的優(yōu)點(diǎn)受到重視。隨著基因分離技術(shù)和克隆手段的提高， 今后將有更多與小麥改良有關(guān)的重要基因被克隆出來(lái)，同時(shí)小麥生產(chǎn)中的一些實(shí)際問(wèn)題， 如高溫、干旱、鹽堿、穗發(fā)芽及病蟲害等問(wèn)題相繼出來(lái)，而基因工程育種可能是最好的解決 途徑。
[0004] 植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，受到各種非生物逆境脅迫的危害，包括高溫、干旱、高鹽、穗 發(fā)芽W及病蟲害等，其中高溫和干旱對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育有著十分重要的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)， 每年由于高溫、干旱等原因我國(guó)小麥的受災(zāi)面積占到總種植面積的20-25%。因此，將外 源抗逆基因?qū)胄←溸M(jìn)行品種改良已成為解決小麥生產(chǎn)、育種的一個(gè)非常重要的手段。 即SCA3(即S3)是一種B3-類型的轉(zhuǎn)錄因子，在種子發(fā)育、種子休眠和非生物逆境脅迫應(yīng)答 中起著重要的調(diào)控作用。人們相繼從擬南芥、大麥、釉稻、油菜等植物中分離出FUS3基因并 對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究，而目前在世界范圍內(nèi)，小麥中關(guān)于即S3基因的分離、克隆W及 抗穗發(fā)芽、抗逆反應(yīng)的研究還比較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是：提供一種小麥基因 TaRJS3 W及該基因的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0007] 小麥基因 TaFUS3的全長(zhǎng)cDNA為1465bp，包括47bp的5'-非編碼區(qū)，484bp的 3'-非編碼區(qū)，906bp的編碼區(qū)，終止子，和28bp的多聚腺巧酸尾；核巧酸序列堿基組成 為：387 a 358c 339g 381t，其堿基序列如：SEQ ID NO :1 所示。
[0008] 所述的小麥基因 TaRJS3編碼的蛋白是一個(gè)全長(zhǎng)由301個(gè)氨基酸組成的含有B3結(jié) 構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如：SEQ ID NO :2所示。
[0009] 小麥基因 TaFUS3在種子發(fā)育和休眠中的作用。
[0010] 小麥基因 TaFUS3在抗逆反應(yīng)中的作用。
[0011] 小麥基因 TaFUS3在抗穗發(fā)芽、抗逆育種中的應(yīng)用。
[0012] 小麥基因 TaFUS3在基因忍片制作中的應(yīng)用。
[0013] 小麥基因 TaFUS3在設(shè)計(jì)合成新的抗逆相關(guān)基因中的應(yīng)用。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利具有W下積極有益效果：
[0015] 本發(fā)明從抗穗發(fā)芽品種"淮麥0360"和易穗發(fā)芽品種"中優(yōu)9507"中分離出小麥 TaFUS3基因，并通過(guò)生物克隆技術(shù)得到小麥基因 TaFUS3的全長(zhǎng)CDNA的序列長(zhǎng)度、組成和堿 基序列。
[0016] (1)小麥基因 TaRJS3在種子發(fā)育和休眠中起重要作用。W小麥易穗發(fā)芽品種"中 優(yōu)9507"巧粒為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)：小麥基因 TaFUS3在種子發(fā)育過(guò)程中，主要在小麥花后25d 的胚中特異性表達(dá)，在干種子胚和幼根中僅有很微量的表達(dá)；小麥花后35d(生理成熟期， 休眠種子）離體胚萌發(fā)過(guò)程中，TaRJS3基因表現(xiàn)呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；
[0017] (2)小麥基因 TaFUS3在抗逆反應(yīng)中起重要作用。小麥基因 TaFUS3是一個(gè)逆境脅 迫應(yīng)答基因，在分別受到高鹽、ABA、甘露醇、高溫脅迫時(shí)，表達(dá)顯著增強(qiáng)；
[0018] (3)小麥基因 TaFUS3在抗穗發(fā)芽、抗逆育種中的應(yīng)用：該基因可W插入到不同類 型的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成植物表達(dá)載體，通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行植物抗逆改良；
[0019] (4)小麥基因 TaFUS3在基因忍片制作中的應(yīng)用克隆的小麥基因 TaFUS3的 CDNA為模板，用基因特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得DNA產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化、溶解后，按照 基因忍片制作程序制作小麥基因忍片，用于抗穗發(fā)芽、抗逆等相關(guān)研究；
[0020] (5)小麥基因 TaFUS3在設(shè)計(jì)合成新的抗逆基因的應(yīng)用：根據(jù)TaFUS3基因和 Hv即S3基因的差異，將Hv即S3基因與Ta即S3基因相連接，合成全新的基因。然后，通過(guò)測(cè) 序驗(yàn)證合成基因的編碼框（OR巧是否正確，并將新的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，通過(guò)轉(zhuǎn) 基因技術(shù)對(duì)合成基因的抗逆性進(jìn)行檢測(cè)，具有良好抗逆性的合成基因可W用于轉(zhuǎn)基因抗逆 小麥新品種的培育。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1 TaRJS3基因在小麥發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，圖中，橫坐標(biāo)表示：小麥發(fā)育過(guò)程中 的組織；縱坐標(biāo)表示：小麥TaFUS3基因的相對(duì)表達(dá)量；
[0022] 圖2 TaFUS3在小麥花后35d離體胚萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)，圖中，橫坐標(biāo)表示：小麥花 后35d離體胚的處理時(shí)間，縱坐標(biāo)表示：小麥TaFUS3基因的相對(duì)表達(dá)量；
[002引圖3小麥基因 Ta即S3在不同培養(yǎng)條件下的抗逆表達(dá)，圖3(A)中，橫坐標(biāo)表示：小 麥種子在培養(yǎng)皿（A)中的時(shí)間，縱坐標(biāo)表示：小麥TaFUS3基因的相對(duì)表達(dá)量；圖3度）中，橫 坐標(biāo)表不：小麥種子在培養(yǎng)皿度）中的時(shí)間，縱坐標(biāo)表不：小麥TaFUS3基因的相對(duì)表達(dá)量； 圖3 (C)中，橫坐標(biāo)表示：小麥種子在培養(yǎng)皿（C)中的時(shí)間，縱坐標(biāo)表示：小麥TaFUS3基因的 相對(duì)表達(dá)量；圖3(D)中，橫坐標(biāo)表不：小麥種子在培養(yǎng)皿值）中的時(shí)間，縱坐標(biāo)表不：小麥 TaFUS3基因的相對(duì)表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，結(jié)合W下實(shí)施例和附圖，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[00巧]實(shí)施例1 :小麥基因 TaFUS3的克隆過(guò)程
[0026] (1)小麥基因 Ta即S3是從抗穗發(fā)芽品種"淮麥0360"和易穗發(fā)芽品種"中優(yōu)9507" 中分離的。W上述兩個(gè)品種，花后21、28和35天巧粒為材料提取總RNA，再進(jìn)一步分離 mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，用該CDNA為模板進(jìn)行基因克隆。
[0027] 似根據(jù)GenBank登錄的植物即S3基因保守功能域設(shè)計(jì)了 一對(duì)兼 并性引物（上游引物Pl :5 ' -WGGGAGAATTGTTCTYCCRM-3 '和下游引物P2 : 5' -ARTACCTSACRTTSGCTACYG-3')，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)獲得了一個(gè)分子量約為470bp 的cDNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收克隆于PMD18-T Eseay載體上，測(cè)序后通過(guò)序列分析證明運(yùn) 個(gè)CDNA片段是Ta即S3基因的一部分。在所得CDNA片段的基礎(chǔ)上，又在該CDNA片段5 ' 端設(shè)計(jì)了兩條巢式 PCR 引物 5' GSPl (序列為：5' -GCAACTAGATCATCTCCCGCCTTCT-3')、 5' GSP2(序列為：5' -GAAGTCTCCCACTCGAAGGTTATGG-3' )，3'端設(shè)計(jì)了一條基因特異 性引物 3' GSP (序列為：5' -AGAAGGCGGGAGATGATCTAGTTGCT-3')。通過(guò) 5'和 3'快速 擴(kuò)增CDNA末端技術(shù)巧'和3' -RACE)獲得了全長(zhǎng)CDNA克隆，將獲得的全長(zhǎng)CDNA插入在 pMDlS-TEseay載體上，并保存在大腸桿菌D冊(cè)a菌株中。
[0028] 具體克隆過(guò)程：
[002引 cDNA的合成：用TRIzol試劑提取總RNA。用化Iy (A) Tract mRNA分離系統(tǒng)皿分 離出mRNA。用SMARTTm RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒合成cDNA。
[0030] 反轉(zhuǎn)錄PCR : W cDNA為模板，并設(shè)計(jì)兼并引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng) 體系為 20 y L :含 10 X PCR Buffer 2. Oy UlOmmol .L MNTP 1.2 y UlOy mol .Li引物各 1 y L、5U ? y L iTaq 聚合酶 0. 2 y L、cDNA I y L，用（1地2〇 補(bǔ)齊至 20 y L。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?先95 °C預(yù)變性3分鐘；35個(gè)循環(huán)的95 °C變性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸1分鐘；最后 72 °C延伸10分鐘。
[0031] 快速擴(kuò)增 cDNA末端：使用?？诘脑噭┖校⊿MART?RACE cDNA Amplification Kit) 進(jìn)行擴(kuò)增。溶液配制按說(shuō)明書進(jìn)行，5' -RACE擴(kuò)增程序分為兩步：第一步：應(yīng)用5' GSPl和 SMARTTm RACE cDNA Amplification Kit的5'帽子巢式引物，采用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 °C預(yù)變性4分鐘；20個(gè)循環(huán)的95 °C變性30秒，62 °C退火30秒，72 °C延伸3分 鐘；10個(gè)循環(huán)的95°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸3分鐘；最后在72°C延伸10分 鐘；第二步：應(yīng)用5' GSP2和試劑盒5'帽子巢式引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性4分鐘；36個(gè)循環(huán)的95°C變性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸3分鐘；最后72°C 延伸 10 分鐘。3' -RACE 擴(kuò)增程序?yàn)椋簯?yīng)用 3' GSP 和 SMARTTm RACE cDNA Amplification Kit的3'特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序與5' -RACE第一步PCR擴(kuò)增程序相同。
[0032] 產(chǎn)物回收和測(cè)序分析：擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠切割下來(lái)，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段?；厥盏腄NA片 段用超純水溶解后，用T4-DNA連接酶將其與PMD18-T Eseay載體連接，4°C連接過(guò)夜。用 化Cl2熱擊法，在42°C熱擊90秒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊(cè)a菌株中。用質(zhì)粒小量 提取法提取質(zhì)粒DNA。在北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLASt和BLAS化計(jì) 算機(jī)輔助程序（Altschul等1997)在美國(guó)國(guó)家生物信息中屯、網(wǎng)站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. rov)和相關(guān)連的網(wǎng)站