烏頭堿在治療紅斑狼瘡中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及烏頭堿在治療紅斑狼瘡中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及烏頭堿或其藥學(xué)上可接受的鹽或含有其的藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療紅斑狼瘡特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物中的用途。本發(fā)明所述烏頭堿是多種常用中藥的有效成分，經(jīng)藥效學(xué)研究表明，烏頭堿是治療紅斑狼瘡的有效藥物，具有高效、安全、無(wú)毒副作用的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
烏頭堿在治療紅斑狼瘡中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及源于中藥的化合物烏頭堿的新用途。具體而言，本發(fā)明涉及烏頭堿在 治療紅斑狼瘡中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 紅斑狼瘡(LE)是一種典型的自身免疫性結(jié)締組織病，多見(jiàn)于15~40歲女性。紅斑 狼瘡是一種疾病譜性疾病，可分為盤狀紅斑狼瘡(DLE)、亞急性皮膚型紅斑狼瘡(SCLE)、深 在性紅斑狼瘡(LEP)、新生兒紅斑狼瘡(NLE)、藥物性紅斑狼瘡(DIL)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) 等亞型。
[0003] 盤狀紅斑狼瘡，主要侵犯皮膚，是紅斑狼瘡中最輕的類型。少數(shù)可有輕度內(nèi)臟損 害，少數(shù)病例可轉(zhuǎn)變?yōu)橄到y(tǒng)性紅斑狼瘡。皮膚損害初起時(shí)為一片或數(shù)片鮮紅色斑，綠豆至黃 豆大，表面有粘著性鱗肩，以后逐漸擴(kuò)大，呈圓形或不規(guī)則形，邊緣色素明顯加深，略高于中 心。損害主要分布于日光照射部位，如面部、耳輪及頭皮，少數(shù)可累及上胸、手背、前臂、口唇 及口腔黏膜也可受累。多數(shù)患者皮損無(wú)自覺(jué)癥狀，但很難完全消退。新?lián)p害可逐漸增多或多 年不變。盤狀皮損在日光暴曬或勞累后加重。頭皮上的損害可引起永久性脫發(fā)。陳舊性損害 偶爾可發(fā)展成皮膚鱗狀細(xì)胞癌。
[0004] 亞急性皮膚型紅斑狼瘡，臨床上較少見(jiàn)，是一種特殊的中間類型。皮膚損害有兩 種，一種是環(huán)狀紅斑型，另一個(gè)類型是丘疹鱗肩型。兩種皮損多數(shù)病例單獨(dú)存在，少數(shù)可同 時(shí)存在。皮損常反復(fù)發(fā)作，絕大多數(shù)患者均有內(nèi)臟損害，但嚴(yán)重者很少，主要癥狀為關(guān)節(jié)痛、 肌肉痛、反復(fù)低熱，少數(shù)有腎炎、血液系統(tǒng)改變。
[0005] 深在性紅斑狼瘡又稱狼瘡性脂膜炎，同樣是中間類型的紅斑狼瘡。皮膚損害為結(jié) 節(jié)或斑塊，位于真皮深層或皮下脂肪組織，其大小、數(shù)目不定，表面膚色正?；虻t色，質(zhì)地 堅(jiān)實(shí)，無(wú)移動(dòng)性。損害可發(fā)生于任何部位，最常見(jiàn)于頰部、臀部、臂部，其次為小腿和胸部。深 在性紅斑狼瘡性質(zhì)不穩(wěn)定，可單獨(dú)存在，以后即可轉(zhuǎn)化為盤狀紅斑狼瘡，也可轉(zhuǎn)化為系統(tǒng)性 紅斑狼瘡，或與它們同時(shí)存在。
[0006] 新生兒紅斑狼瘡，表現(xiàn)為皮膚環(huán)形紅斑和先天性心臟傳導(dǎo)阻滯，有自陷性，一般在 生后4~6個(gè)月內(nèi)自行消退，心臟病變常持續(xù)存在。
[0007] 藥物性紅斑狼瘡主要表現(xiàn)為發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛、面部蝶形紅斑、口腔潰瘍，可有 漿膜炎。ANA、抗組蛋白抗體、抗ss-DNA抗體等可為陽(yáng)性。停藥后逐漸好轉(zhuǎn)，病情較重者可給 予適量糖皮質(zhì)激素。
[0008] 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE)，是一種較常見(jiàn)的累及多 器官系統(tǒng)的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)多種多樣，病情呈反復(fù)發(fā)作與緩解交替過(guò)程、血清 中出現(xiàn)以抗核抗體為代表的多種自身抗體和多系統(tǒng)累及是SLE的兩個(gè)主要臨床特征 2。幾乎 各種自身免疫性疾病的臨床表現(xiàn)均有可能發(fā)生在SLE。因此，許多學(xué)者稱之為自身免疫性疾 病的原型。
[0009] SLE在發(fā)病年齡、性別、種族、地區(qū)上差異較大。本病好發(fā)于青壯年，多見(jiàn)于15~45 歲年齡段，男：女為1:7~1:9。近年來(lái)世界范圍內(nèi)報(bào)道的病例有增多的趨勢(shì)。美國(guó)多地區(qū)的 流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，SLE的患病率為14.6~122/10萬(wàn);我國(guó)大樣本的一次性調(diào)查(>3萬(wàn)人)顯 示SLE的患病率為70/10萬(wàn)人，婦女中則高達(dá)113/10萬(wàn)人 3。另?yè)?jù)一項(xiàng)最新流行病調(diào)查報(bào)告， 在1995至2013年間，我國(guó)SLE患者在5年內(nèi)的存活率是94%，10年內(nèi)存活率是89%，主要死亡 原因比例是感染(33.2%)、狼瘡腎炎（18.7%)、狼瘡腦?。?3.8%)和心血管疾?。?1.5% )4。
[0010] SLE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前研究認(rèn)為，SLE的發(fā)病既有遺傳、性激素 等內(nèi)在因素，也與環(huán)境因素、藥物等有關(guān)。SLE在同卵雙胎的共患率25%，而異卵雙胎的共患 率則為2% ;5%~13%的SLE患者可在一級(jí)或二級(jí)親屬中找到另一SLE患者;SLE患者的子女 中，SLE的發(fā)病率為5%，表明SLE存在遺傳的易感性。紫外線是與SLE最具有顯著相關(guān)性的環(huán) 境因素之一，紫外線照射可激發(fā)或加重SLE皮疹，可能與其損害角質(zhì)形成細(xì)胞，使DNA發(fā)生改 變或"隱蔽抗原"釋放或新抗原表達(dá)致機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，從而形成免疫復(fù)合物引起損傷有 關(guān)。含有芳香族胺基團(tuán)的藥物(如普魯卡因、肼苯噠嗪等)可以誘發(fā)藥物性狼瘡。雖然藥物性 狼瘡不等同于SLE，目前還缺乏有力的證據(jù)說(shuō)明引起藥物性狼瘡的藥物會(huì)使SLE病情加重， 但藥物性狼瘡的臨床表現(xiàn)和部分血清學(xué)特征類似SLE。此外，某些感染如鏈球菌、EB病毒等 也可誘發(fā)或加重本病 5。
[0011]目前已有研究出多種自發(fā)性紅斑狼瘡鼠模型，其中包括NZB、NZB X NZWF1、BXSB、 MRL/lpr等6。長(zhǎng)鏈烴類化合物可以誘導(dǎo)小鼠自身抗體的產(chǎn)生，而降植烷(PriStane，2,4，10， 14-四甲基十五烷)是研究較多且最成功的一種。降植烷誘導(dǎo)雌性BALB/c小鼠出現(xiàn)病變，包 括蛋白尿、免疫復(fù)合物性腎小球腎炎、關(guān)節(jié)炎，包括抗RNP/Sm抗體、抗ds-DNA抗體等多種自 身抗體，具備SLE的重要特征，符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)推薦的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，成為國(guó)內(nèi)外認(rèn)可的 誘導(dǎo)型SLE模型 7_9。
[0012] 雖然近年來(lái)SLE的治療方面有許多新進(jìn)展，但目前還沒(méi)有根治的辦法。對(duì)于中度和 重度SLE目前仍以糖皮質(zhì)激素加免疫抑制劑為主，以上藥物雖能有效控制疾病活動(dòng)、改善病 情，但此類藥物主要針對(duì)抗SLE的免疫亢進(jìn)的表現(xiàn)，而非矯正其免疫失衡，常影響免疫系統(tǒng) 以外的機(jī)體其他系統(tǒng)。尤其是長(zhǎng)期使用增加了患者發(fā)生腫瘤和感染擴(kuò)散的危險(xiǎn) 1()。盡管新出 現(xiàn)的生物制劑對(duì)SLE患者療效良好，但其不良反應(yīng)仍較多，部分患者不敏感或容易復(fù)發(fā)n。因 此，積極探尋新的治療方法、治療藥物刻不容緩。
[0013] 中醫(yī)中藥在SLE治療中的作用逐漸引起人們的重視。中醫(yī)古代文獻(xiàn)中雖沒(méi)有與SLE 相應(yīng)的病名，但有與之相類似的癥狀描述，如根據(jù)皮疹特征出發(fā)稱之為"蝴蝶丹"、"陰陽(yáng) 毒"；根據(jù)本病可累及周身的特點(diǎn)，稱為"周痹"；有腎功損害者，屬"水腫"；有胸水者屬"懸 飲"等等 12。大量臨床研究亦表明中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合對(duì)SLE有較好的療效，可減少藥物長(zhǎng)期 應(yīng)用帶來(lái)的毒副作，代表中藥如雷公藤、紅藤、青蒿素等。
[0014]烏頭堿是一種雙酯型生物堿，廣泛存在于川烏、草烏、附子、雪上一支蒿等傳統(tǒng)中 藥材及其各種炮制品中。烏頭屬(毛茛科）中藥材具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、祛風(fēng)除濕和溫經(jīng) 散寒等功能，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)臨床用于治療氣喘咳嗽、心腹疼痛、慢性腹瀉、陽(yáng)痿滑精、各種風(fēng)濕 疼痛、心衰、頑癬、帶狀皰疹、疥瘡等病癥，而烏頭堿作為此類中藥材的主要有效成分，在強(qiáng) 心、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面己顯現(xiàn)了良好的療效 13。由于烏頭堿是此類中藥材 的主要有毒成分，所以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其的開(kāi)發(fā)應(yīng)用并不多見(jiàn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)烏頭堿的毒性有 了深入的研究。烏頭堿小鼠皮下LD5Q為0.295~0.32mg/kg。日本學(xué)者認(rèn)為小鼠皮下、腹腔、靜 脈注射及灌胃 LD5Q為0 ? 27mg/kg、0 ? 38mg/kg、0 ? 12mg/kg及1 ? 8mg/kg14。烏頭堿口服0 ? 2mg即 可發(fā)生中毒反應(yīng)，3~5mg可致死亡。亦有報(bào)道其致死量為2.5mg。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中尚未有烏頭堿用于治療紅斑狼瘡的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明人通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)證明烏頭堿對(duì)于紅斑狼瘡具有很好的治療效果，可以作為 一種高效、安全且無(wú)毒副作用的治療紅斑狼瘡的新型藥物。
[0017] 因此，本發(fā)明一方面提供烏頭堿或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于預(yù)防和/或治 療紅斑狼瘡的藥物中的用途。
[0018] 本發(fā)明另一方面提供含有烏頭堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物在制備用 于預(yù)防和/或治療紅斑狼瘡的藥物中的用途。
[0019] 本發(fā)明所述的紅斑狼瘡可以是盤狀紅斑狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、深在性紅 斑狼瘡、新生兒紅斑狼瘡、藥物性紅斑狼瘡、或系統(tǒng)性紅斑狼瘡，優(yōu)選藥物性紅斑狼瘡或系 統(tǒng)性紅斑狼瘡，特別優(yōu)選系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
[0020] 本發(fā)明的烏頭堿可進(jìn)一步與藥學(xué)上可接受的、可廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體 組合使用，所述的載體如稀釋劑、粘合劑、吸收劑、崩解劑、分散劑、濕潤(rùn)劑、助溶劑、緩沖劑、 表面活化劑等。本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域任何已知方法制成，以使病人用藥后能提 供快速、持久或緩慢釋放的活性成分。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)具體的施用方式被配制 成各種本領(lǐng)域熟知的制劑形式，例如口服劑型(粉劑、片劑、膠囊、軟膠囊、口服溶液、糖漿、 酏丸、散劑、囊劑、顆粒劑等），或局部施用制劑(霜?jiǎng)?、乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、香脂、膏藥、糊 劑、噴霧劑、氣霧劑等），或注射制劑(溶液、懸浮劑、乳劑）。上述各種劑型的藥物均可以按照 藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0022] 本發(fā)明活性成分烏頭堿的給藥劑量可以根據(jù)個(gè)體的情況和重量、病情的嚴(yán)重程 度、藥物形式、給藥途徑以及給藥周期的不同而不同，其也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選 擇。為了獲得需要的作用，通常建議每日有效劑量為1~i〇yg/kg(遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于毒性劑量）。劑量 可以是每天單次給藥或每天分多次給藥。
[0023] 本發(fā)明的烏頭堿可以通過(guò)各種途徑施用至個(gè)體動(dòng)物如哺乳動(dòng)物(大鼠、小鼠、馴化 動(dòng)物或人類），所有的給藥方式均是預(yù)期的，例如，給藥可以是口服、直腸給藥或經(jīng)靜脈、肌 肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、鞘膜內(nèi)、硬膜外或腦室內(nèi)注射?？赏ㄟ^(guò)注射、噴射、滴鼻、滲透、吸收、物理 或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織;或是被其它物質(zhì)混合或包 裹后導(dǎo)入機(jī)體。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于預(yù)防和/或治療紅斑狼瘡的藥物組合物，其含有烏頭 堿作為活性成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，所述的載體可以包括稀釋劑、粘合 劑、吸收劑、崩解劑、分散劑、濕潤(rùn)劑、助溶劑、緩沖劑、和表面活性劑中的一種或多種。
[0025] 本發(fā)明的藥物組合物可以為固體、液體或氣體形式，其中所述固體形式可以為粉 末劑、片劑、顆粒劑、丸劑、硬膠囊或軟膠囊、乳膏劑、軟膏劑、硬膏劑、凝膠劑、糊劑、散劑或 貼劑;所述液體形式可以為溶液劑、混懸劑、注射劑、糖漿劑、搽劑、乳劑、酊劑或酏劑;所述 氣體形式可以為氣霧劑、噴霧劑。
[0026] 以下將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但應(yīng)理解其僅是舉例說(shuō)明的作 用，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為本發(fā)明烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠尿蛋白影響的尿蛋白評(píng)分圖。
[0028]圖2為本發(fā)明烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠自身抗體影響的血清抗雙鏈DNA(ds-DNA)自身抗 體水平變化圖。其中圖2A為治療3周，圖2B為治療6周，圖2C為治療9周。
[0029]圖3為本發(fā)明烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠腎臟損傷影響的HE染色顯微鏡照片(400X)。其中 圖3A為正常對(duì)照組，圖3B為模型對(duì)照組，圖3C為醋酸潑尼松組，圖3D為烏頭堿低劑量組，圖 3E為烏頭堿高劑量組。
[0030]圖4為本發(fā)明烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠腎臟損傷影響的Masson染色顯微鏡照片(400X)。 其中圖4A為正常對(duì)照組，圖4B為模型對(duì)照組，圖4C為醋酸潑尼松組，圖4D為烏頭堿高劑量 組，圖4E為烏頭堿低劑量組。
[0031]圖5為本發(fā)明烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠腎臟損傷影響的PAS染色顯微鏡照片(400X)。其 中圖5A為正常對(duì)照組，圖5B為模型對(duì)照組，圖5C為醋酸潑尼松組，圖5D為烏頭堿高劑量組， 圖5E為烏頭堿低劑量組。
[0032]圖6為本發(fā)明烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠腎臟免疫球蛋白沉積影響的顯微鏡照片(400X)。 其中圖6A為正常對(duì)照組，圖6B為模型對(duì)照組，圖6C為醋酸潑尼松組，圖6D為烏頭堿低劑量 組，圖6E為烏頭堿高劑量組。
[0033]圖7為本發(fā)明烏頭堿對(duì)炎癥因子PGE2影響的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]化合物的獲取和處置：
[0035] 烏頭堿(Aconitine，AC) (C34H47N0n，分子量645.74)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究 院，純度2 99.5%。按需配制成所需濃度(yg ? mL-1)。
[0036]造模劑降植烷（Pristane)購(gòu)自 Sigma公司，批號(hào)：SHBF3678V，CAS: 1921-70-6，> 98%GC〇
[0037]醋酸潑尼松片購(gòu)自河南天方藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150111191。
[0038]實(shí)施例1烏頭堿對(duì)降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠尿蛋白的影響 [0039] 試驗(yàn)材料：
[0040] BALB/c小鼠，雌性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
[0041 ]尿蛋白試紙購(gòu)自廣州市珠江生化試劑有限公司。
[0042]試驗(yàn)方法：
[0043]模型的建立:BALB/c小鼠（一共66只小鼠，正常組、模型組各15只，給藥組各12只） 于SPF級(jí)屏障系統(tǒng)適應(yīng)飼養(yǎng)5天后，腹部用75%酒精棉消毒，除正常對(duì)照組腹腔注射0.5ml生 理鹽水外，其余小鼠腹腔直接注射降植烷〇.5ml/只。繼續(xù)飼養(yǎng)，于造模后4周、8周、12周、16 周、20周檢測(cè)尿蛋白，于成模(尿蛋白++)后開(kāi)始分組給藥。
[0044] 實(shí)驗(yàn)分組及給藥:分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組(6.3mg/kg)、烏頭 堿低、高劑量組(25yg/kg和75yg/kg)。
[0045] 受試物配制：
[0046] ⑴溶劑0.5%CMC-Na，稱取5g CMC-Na溶解在雙蒸水中，定容至1000ml，備用。
[0047] ⑵醋酸潑尼松(劑量6 ? 3mg/kg)，規(guī)格5mg/片，取3片（15mg)研磨，用0 ? 5%CMC-Na稀 釋至47.6ml，備用。
[0048]⑶烏頭堿配制濃度依次為:3.75μg/ml (高劑量組）、1.25μg/ml (低劑量組）。
[0049] 稱取烏頭堿2.1mg，用0.1M醋酸鈉(pH 5.0)溶于10ml，取2ml用0.5%CMC-Na定容至 1121111，配成3.75噸/1111備用；取271111，用0.5%01?：-他定容至811111，配成1.25噸/1111備用。
[0050] 造模5個(gè)半月開(kāi)始灌胃給予醋酸潑尼松和烏頭堿，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組分別 給予等量溶劑，給藥體積為〇. 2ml/10g，連續(xù)9周。每3周眼眶取血，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫椎處死小 ￡3
[0051] 尿蛋白的檢測(cè):壓迫膀胱法取鼠尿，以尿蛋白試紙測(cè)試讀取尿蛋白含量并分級(jí)(-: 0;±:10 ; + :30;++:100;+++:300 ;單位:11^/10011^)。按療效等級(jí)評(píng)分，-，記0分；±，記1分 ;+， 記2分;++，記3分;+++，記4分。
[0052]試驗(yàn)結(jié)果：
[0053]如圖1所示，分組給藥后3周開(kāi)始烏頭堿即顯示出降低尿蛋白的效果，與模型對(duì)照 組比較具有明顯差異;較之模型對(duì)照組和醋酸潑尼松組，用藥6~9周后，烏頭堿各劑量組均 顯示良好的降低尿蛋白的效應(yīng)，與正常對(duì)照組尿蛋白水平相當(dāng)。
[0054] 實(shí)施例2烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠ds-DNA的影響 [0055] 試驗(yàn)材料：
[0056] ds-DNA檢測(cè)用ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美科技有限公司，產(chǎn)品號(hào):CSB-E11194m。 [0057]試驗(yàn)方法：
[0058]模型的建立以及實(shí)驗(yàn)分組及給藥同實(shí)施例1。
[0059]抗核抗體(ds-DNA)的檢測(cè):分組給藥后每3周眼眶采集抗凝血液約0.2mL，取血清-80°C保存待用。抗ds-DNA檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書操作，具體方法如下：
[0060] 1)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和空白組做2個(gè)復(fù)孔。按說(shuō)明書采用倍比稀釋法用樣品稀 釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)樣品不稀釋。
[0061] 2)加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。蓋上膜 板，輕輕振蕩混勻，37°C溫育2小時(shí)。
[0062] 3)甩去孔內(nèi)液體，立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻， 37°C溫育1小時(shí)。
[0063] 4)甩去孔內(nèi)液體，每孔加250ul洗滌液，用MM-1微量振蕩器(江蘇國(guó)宇儀器)振蕩30 秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。
[0064] 5)每孔加入50ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37°C溫育30分鐘。
[0065] 6)重復(fù)步驟4。
[0066] 7)每孔加入TMB底物50ul，輕輕在振蕩器上振蕩混勻，37 °C溫育15分鐘，避光。
[0067] 8)取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
[0068] 9)采用酶標(biāo)儀RT-6000 (Ray to，USA)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的0D值。
[0069] 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并算得待測(cè)組ds-DNA的含量(ng/ml)。與模型組比較，#，P〈0.05;##，P 〈0.01。
[0070] 試驗(yàn)結(jié)果：
[0071] 如圖2所示，給藥3周后（圖2A)，烏頭堿治療組血清ds-DNA水平顯著降低，具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(P〈0.01);給藥6周后（圖2B)，烏頭堿組尤其是低劑量組表現(xiàn)出降低ds-DNA水平的效 應(yīng)(P〈0.01);給藥9周后（圖2C)，烏頭堿組也顯示了降低ds-DNA水平的趨勢(shì)，其中大劑量組 降幅約為20 %。
[0072]實(shí)施例3烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠腎臟損傷的病理檢查 [0073]試驗(yàn)方法：
[0074] 模型的建立以及實(shí)驗(yàn)分組及給藥同實(shí)施例1。
[0075] 腎臟損傷的病理檢查:脫椎處死小鼠后，解剖。用10%的中性福爾馬林將腎臟組織 固定備用。送檢組織經(jīng)甲醛充分固定后，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)制備如 m石蠟切片。分別用HE、Masson、PAS染色，光學(xué)顯微鏡(DP71型，OLYMPUS，放大400倍)檢查組 織損傷情況。
[0076]試驗(yàn)結(jié)果：
[0077]如圖3所示，腎臟HE染色結(jié)果顯示，烏頭堿對(duì)降植烷誘導(dǎo)的狼瘡小鼠的腎臟有良好 的保護(hù)作用，可以完全緩解腎臟損傷。
[0078] 圖3A正常對(duì)照組，顯示腎小球組織結(jié)構(gòu)正常。圖3B模型對(duì)照組，顯示腎小球基底膜 增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚。圖3C醋酸潑尼松組，顯示腎小球基底膜 增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，腎小管蛋白管型。圖3D烏頭堿低劑量組， 顯示腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。圖3E烏頭堿高劑量組，顯示腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。
[0079]同時(shí)做了 Masson和PAS染色，結(jié)果也表明烏頭堿可以完全緩解狼瘡小鼠的腎臟損 傷?？梢詼p少腎臟膠原纖維的沉積，降低蛋白的沉積水平。結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。
[0080] 圖4A為正常對(duì)照組，顯示腎小球組織結(jié)構(gòu)正常。圖4B為模型對(duì)照組，顯示腎小球基 底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚。圖4C為醋酸潑尼松組，顯示腎小球 系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚。圖4D為烏頭堿高劑量組，顯示腎臟組織結(jié)構(gòu)正 常。圖4E為烏頭堿低劑量組，顯示腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。
[0081 ] 圖5A為正常對(duì)照組，顯示腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。圖5B為模型對(duì)照組，顯示腎小球基底 膜增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚。圖5C為醋酸潑尼松組，顯示腎小球基 底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚。圖5D為烏頭堿高劑量組，顯示腎臟 組織結(jié)構(gòu)正常。圖5E為烏頭堿低劑量組，顯示腎小球組織結(jié)構(gòu)正常
[0082]實(shí)施例4烏頭堿對(duì)狼瘡小鼠腎臟免疫球蛋白沉積的影響 [0083] 試驗(yàn)材料：
[0084] 抗鼠IgG抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自Abeam公司 [0085]試驗(yàn)方法：
[0086] 模型的建立以及實(shí)驗(yàn)分組及給藥同實(shí)施例1。
[0087] 腎臟免疫球蛋白沉積的檢測(cè):脫椎處死小鼠后，解剖。用10%的中性福爾馬林將腎 臟組織固定備用。送檢組織經(jīng)甲醛充分固定后，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī) 制備3mi石蠟切片。切片加入兔抗鼠IgG抗體（1:1000)，37°C孵育2小時(shí)后，用PBS洗去多余抗 體。再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:2000)，37 °C孵育1小時(shí)，用PBS洗去多余抗體。加 入3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB，Abeam)顯色液顯色，封片。陰性對(duì)照以PBS替代抗鼠IgG抗體。腎 臟免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IgG免疫復(fù)合物的沉積。
[0088] 試驗(yàn)結(jié)果：
[0089] 如圖6所示，給予烏頭堿后，狼瘡小鼠腎臟IgG沉積明顯減少(腎小球及腎小管間質(zhì) 可見(jiàn)棕黃色沉積物），提示烏頭堿可以減少免疫球蛋白沉積對(duì)腎臟造成的損傷，具有保護(hù)腎 臟的作用。
[0090] 圖6A為正常對(duì)照組，未見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)；圖6B為模型對(duì)照組，腎小球及腎小管間質(zhì)可見(jiàn) 棕黃色沉積物；圖6C為醋酸潑尼松組，腎小球及腎小管間質(zhì)可見(jiàn)棕黃色沉積物；圖6D為烏頭 堿低劑量組，個(gè)別動(dòng)物腎小球及腎小管間質(zhì)可見(jiàn)棕黃色沉積物；圖6E為烏頭堿高劑量組，個(gè) 別動(dòng)物腎小球及腎小管間質(zhì)可見(jiàn)棕黃色沉積物。
[0091]實(shí)施例5烏頭堿對(duì)炎癥因子前列腺素E2(PGE2)的影響 [0092] 試驗(yàn)材料：
[0093]小鼠PGE2檢測(cè)試劑盒為泛柯(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品
[0094] RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品
[0095] ConA為北京索萊寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品
[0096] 酶標(biāo)儀1^-6000為1^7切公司制造
[0097]試驗(yàn)方法：
[0098] 模型的建立以及實(shí)驗(yàn)分組及給藥同實(shí)施例1。
[0099] PGE2的檢測(cè):脫椎處死小鼠后，無(wú)菌解剖得到脾臟，取脾臟(半個(gè))在無(wú)菌條件下放 在200目的小網(wǎng)上剪碎，加入lml無(wú)菌RPMI無(wú)血清1640培養(yǎng)基，用玻璃棒將剪碎的脾臟研磨 成單個(gè)細(xì)胞，再用1~2ml RPMI無(wú)血清1640培養(yǎng)基將皿洗凈，將收集到的脾細(xì)胞液放入離心 管中，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，然后用紅細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞裂解，取10倍稀釋液在 Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至1 X 107/ml，鋪板，每孔200iil，分為正常組，ConA 刺激組，每組4復(fù)孔，正常組加入5yl無(wú)血清RPMI 1640液，ConA組每孔加入ConA 5yl (終濃度5 μg/ml)，將板搖勻，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，然后將板取出，收集上清，備用。
[0100] 按照試劑盒說(shuō)明書操作，具體方法如下：
[0101] 1)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)上清和空白組做2個(gè)復(fù)孔。按說(shuō)明書采用倍比稀釋法用樣品稀 釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)上清5倍稀釋。
[0102] 2)加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo) 記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37°C溫育1小時(shí)。
[0103] 4)甩去孔內(nèi)液體，每孔加250ul洗滌液，用MM-1微量振蕩器(江蘇國(guó)宇儀器)振蕩30 秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。
[0104] 5)每孔加入50ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37°C溫育30分鐘。
[0105] 6)重復(fù)步驟4)。
[0106] 7)每孔加入顯色劑各50ul，輕輕振蕩混勻，37°C溫育10分鐘，避光。
[0107] 8)取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
[0108] 9)采用酶標(biāo)儀RT-6000 (Ray to，USA)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的0D值。
[0109]結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean土 SD)表 示;采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較，采用學(xué)生t檢驗(yàn)。
[0110]試驗(yàn)結(jié)果：
[0111] 各種免疫活性細(xì)胞參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，病程中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò) 失衡并產(chǎn)生大量的驗(yàn)證介質(zhì)。前列腺素E2(PGE2)作為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，是相當(dāng)重要 的致炎因子。如圖7所示，烏頭堿可以降低典型炎癥因子PGE2的表達(dá)，具有明顯的抑制炎癥 作用。
[0112] 實(shí)施例6烏頭堿對(duì)血常規(guī)的影響
[0113] 試驗(yàn)材料：
[0114] 全自動(dòng)血液分析儀SYSMEX-XS800i為日本Sysmex公司產(chǎn)品
[0115] 試驗(yàn)方法：
[0116] 模型的建立以及實(shí)驗(yàn)分組及給藥同實(shí)施例1。
[0117] 血常規(guī)檢測(cè)：于解剖前眼眶采集血液0.2mL左右，EDTA-K2抗凝，血液分析儀檢測(cè)血 細(xì)胞分類。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean土SD)表示;采 用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較，采用學(xué)生t檢驗(yàn)。
[0118] 試驗(yàn)結(jié)果：
[0119] 烏頭堿對(duì)降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠血細(xì)胞的影響見(jiàn)表1。
[0121] 與模型組比較，烏頭堿組在白細(xì)胞數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、淋巴細(xì)胞(LYMPH) 和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)均顯著降低。提示本發(fā)明烏頭堿具有抑制免疫的作用。
[0122]下文將列出本發(fā)明組合物的構(gòu)成方法和輔料的種類，但本發(fā)明不限于它們。代表 性的制備實(shí)施例敘述如下。
[0123] 注射劑的制備
[0124] 烏頭堿1000微克
[0125] 偏亞硫酸氫鈉3.0毫克
[0126] 對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.8毫克
[0127] 對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.1毫克
[0128] 注射用蒸餾水適量
[0129] 注射劑的制備如下:溶解活性組分，控制pH值至約7.5,然后將所有組分填充至2毫 升安瓿中，并用常規(guī)的注射劑制備方法滅菌。
[0130] 粉末劑的制備
[0131] 烏頭堿200微克
[0132] 玉米淀粉100毫克
[0133] 乳糖100毫克
[0134] 滑石粉10毫克
[0135] 粉末劑制備方法如下:將上述組分混合，裝入密封包裝中。
[0136] 片劑的制備
[0137] 烏頭堿100微克
[0138] 玉米淀粉100毫克
[0139] 乳糖100毫克 [0140]硬脂酸鎂適量
[0141 ] 片劑是通過(guò)將上述組分混合和壓片制得。
[0142] 膠囊劑的制備
[0143] 烏頭堿50微克
[0144] 乳糖50毫克
[0145] 玉米淀粉50毫克
[0146] 滑石粉2毫克
[0147] 硬脂酸鎂適量
[0148] 膠囊劑制備是通過(guò)將上述組分混合裝入按照常規(guī)的明膠制備方法制備的明膠膠 囊中制得。
[0149] 工業(yè)適用性
[0150]如在本發(fā)明中所描述的，本發(fā)明通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)證明了烏頭堿對(duì)于尿蛋白、ds-DNA、 腎臟、炎癥因子等的影響，并提示具有抑制免疫的作用，因此可以被開(kāi)發(fā)為用于預(yù)防或治療 紅斑狼瘡的藥物。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 烏頭堿或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于預(yù)防和/或治療紅斑狼瘡的藥物中的用 途。2. 含有烏頭堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療紅斑狼 瘡的藥物中的用途。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述紅斑狼瘡選自盤狀紅斑狼瘡、亞急性皮膚 型紅斑狼瘡、深在性紅斑狼瘡、新生兒紅斑狼瘡、藥物性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，優(yōu)選藥 物性紅斑狼瘡或系統(tǒng)性紅斑狼瘡，更優(yōu)選系統(tǒng)性紅斑狼瘡。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物進(jìn)一步含有一種或多 種藥學(xué)上可接受的載體，例如稀釋劑、粘合劑、吸收劑、崩解劑、分散劑、濕潤(rùn)劑、助溶劑、緩 沖劑、或表面活性劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，通過(guò)口服、舌下、口腔粘膜、靜脈 內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、鼻腔、直腸途徑施用所述藥物組合物，優(yōu)選通過(guò)口服、靜脈 內(nèi)施用。6. 根據(jù)權(quán)利要求2至5任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物為固體、液體或 氣體形式，其中所述固體形式優(yōu)選粉末劑、片劑、顆粒劑、丸劑、硬膠囊或軟膠囊、乳膏劑、軟 膏劑、硬膏劑、凝膠劑、糊劑、散劑或貼劑;所述液體形式優(yōu)選溶液劑、混懸劑、注射劑、糖漿 劑、搽劑、乳劑、酊劑或酏劑;所述氣體形式優(yōu)選氣霧劑、噴霧劑。7. -種用于預(yù)防和/或治療紅斑狼瘡的藥物組合物，其含有烏頭堿作為活性成分以及 一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述的載體包括稀釋劑、粘合劑、吸收劑、崩 解劑、分散劑、濕潤(rùn)劑、助溶劑、緩沖劑、和表面活性劑中的一種或多種。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的藥物組合物，其為固體、液體或氣體形式，其中所述固體形 式優(yōu)選粉末劑、片劑、顆粒劑、丸劑、硬膠囊或軟膠囊、乳膏劑、軟膏劑、硬膏劑、凝膠劑、糊 劑、散劑或貼劑;所述液體形式優(yōu)選溶液劑、混懸劑、注射劑、糖漿劑、搽劑、乳劑、酊劑或酏 劑;所述氣體形式優(yōu)選氣霧劑、噴霧劑。
【文檔編號(hào)】A61P37/02GK105853417SQ201610340107
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】沈建英, 谷麗維, 李曉東
【申請(qǐng)人】中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所