專利名稱：提高植物谷氨酸含量的方法以及具有較高谷氨酸含量的植物的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種提高植物和/或種子的谷氨酸含量的方法、具有較高谷氨酸含量的植物和/或種子、具有較高谷氨酸含量的植物和/或種子在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用以及含有具有較高谷氨酸含量的植物和/或種子的食品。
一般來說，谷氨酸通常存在于蛋白質(zhì)之中并且被認(rèn)為是番茄、大豆、赤豆、蠶豆、菜豆、豌豆等所含的鮮味成分，并且還存在于通過對大豆等的發(fā)酵而制成的食品之中。在高等植物中，谷氨酸是在氨基酸生物合成的早期合成的，并且谷氨酸是諸如丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸和精氨酸這樣的主要氨基酸的氨基基團(tuán)供體。在葉片中合成的谷氨酰胺和天冬酰胺通過篩管被運(yùn)入種子，并且被用于在合成谷氨酸之后合成上述的主要氨基酸?；诮?jīng)嚴(yán)格調(diào)控的各功能的作用，轉(zhuǎn)移谷氨酰胺的氨基基團(tuán)的酶被認(rèn)為在已區(qū)室化(compartmentalized)的組織中具有功能，所述區(qū)室化的組織的例子有種皮、胚囊液和子葉。因此，在植物中提高游離的谷氨酸含量并非易事，這是因?yàn)楣劝彼崾前ǖ鞍踪|(zhì)的合成在內(nèi)的不同的體內(nèi)反應(yīng)的氨基基團(tuán)供體，并且通過生物合成途徑進(jìn)行代謝，這些途徑受到多種多樣的復(fù)雜調(diào)控。特別是，提高游離形式的某種特定的氨基酸的含量是困難的，這是因?yàn)榘被嶂匾缘鞍踪|(zhì)的形式存儲。實(shí)際上，關(guān)于這些事實(shí)迄今僅有幾篇報道。這些報道包括，例如，煙草和玉米的根中的游離谷氨酸含量通過引入谷氨酸脫氫酶基因而有所提高，以及當(dāng)編碼具有高賴氨酸含量的蛋白質(zhì)的基因在葉片中過度表達(dá)的情況下在大豆種子中積累了游離的賴氨酸。
已知丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶為一種與谷氨酸代謝有關(guān)的酶。該酶催化將L-丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)入α-酮戊二酸的反應(yīng)以及其逆反應(yīng)。該酶構(gòu)成了上述谷氨酸代謝的一部分。同樣已知該酶具有催化將氨基從丙氨酸轉(zhuǎn)移至乙醛酸以及從谷氨酸轉(zhuǎn)移至乙醛酸的反應(yīng)以進(jìn)行甘氨酸合成的活性(Biochem.J.195235-239，1981)。另一方面，提出了一種可能，即存在于過氧化物酶體中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性，也就是使用谷氨酸和乙醛酸作為底物合成α-酮戊二酸和甘氨酸的活性[Noguchi T.和HAYASHI S.，Biochem.J.195-235-239(1981)；Orzechowski等，Acta Biochem.Pol.447-457(1999)以及Orzechowski等，Acta Physiol.Plant 21331-334(1999)]。但是，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性在提高或者降低植物的谷氨酸含量中的作用仍未被闡明，并且沒有關(guān)于通過對編碼具有丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或者谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行遺傳操作而事實(shí)上提高植物或者種子中的谷氨酸含量的可能性的報道。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供提高植物和/或種子的谷氨酸含量的方法、具有較高谷氨酸含量的植物和/或種子、具有較高谷氨酸含量的植物和/或種子在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用，以及含有具有較高谷氨酸含量的植物和/或種子的食品。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，植物和/或種子中的谷氨酸含量可通過抑制谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(GGT)活性而提高。本發(fā)明基于該發(fā)現(xiàn)而完成。
也就是說，本發(fā)明提供了一種通過使GGT活性缺失或者降低而提高植物和/或種子的谷氨酸含量的方法，提供了GGT活性缺失或者降低的植物和/或種子，并且特別提供了谷氨酸含量高于在相同條件下培養(yǎng)的相應(yīng)的野生型植物的植物和/或種子。
特別地，本發(fā)明涉及一種通過使GGT活性缺失或者降低而提高植物和/或種子的谷氨酸含量的方法，其中GGT活性缺失或者降低是通過抑制編碼具有GGT活性的蛋白質(zhì)的基因的功能而實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明還涉及GGT活性缺失或者降低的植物，特別涉及GGT活性缺失或者降低并且所具有的谷氨酸含量高于在相同條件下培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物的植物和種子。
附圖簡述

圖1顯示的是來自擬南芥的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AlaAT同GGT)的氨基酸序列比較。星號所示為所有的氨基酸均相同的位置。
圖2顯示的是插入標(biāo)記的位置。(A)AlaAT1基因組結(jié)構(gòu)和插入標(biāo)記的位置的示意圖。方框所示為外顯子，線條所示為內(nèi)含子。(B)野生型(WT)的核苷酸序列和氨基酸序列示于頂部，底部所示為插入了一個T-DNA的核苷酸序列以及8046品系的氨基酸序列。方框所示為由T-DNA的插入所替代的區(qū)域。
圖3(A)顯示用于選擇純合子的引物的位置。(B)顯示了純合子和雜合子的分離率。
圖4通過RT-PCR顯示了AlaAT1基因在mRNA水平上的表達(dá)。WT野生型，8046純合的AlaAT1插入標(biāo)記的品系。
圖5顯示插入標(biāo)記的品系aat-1中的酶活性。Ala+αKG，Glu+Pyr以及Glu+乙醛酸所示分別為催化Ala+αKG→Glu+Pyr、Glu+Pyr→Ala+αKG以及Glu+乙醛酸→Gly+αKG的反應(yīng)的活性。該活性以偶聯(lián)以NADH的氧化反應(yīng)時每分鐘每1μg蛋白在340nm下的吸光度(ΔA)變化表示。
圖6所示為高等植物中的光呼吸途徑的示意圖。箭頭顯示了谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)。
圖7顯示在含1％的蔗糖的PNS培養(yǎng)基上培養(yǎng)了兩周的幼苗的氨基酸含量。A相對于鮮重的氨基酸含量，B同總氨基酸的比例。對照野生型植物，aat1-18046品系，插入了AlaAT1標(biāo)記的植物。
圖8顯示在aat1-1種子之中的氨基酸含量(nmol/mg FW)圖9顯示在aat1-1種子中的相對氨基酸含量(％)。
優(yōu)選實(shí)施方案描述本發(fā)明的目的在于提高植物和/或種子中的谷氨酸含量。該目的可通過消除或者降低GGT活性而實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，一種編碼GGT的基因的功能被抑制。本文所使用的術(shù)語“一種編碼谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(或GGT)的基因的功能”指的是基因表達(dá)谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的功能，該被表達(dá)的谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶具有野生型谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。相應(yīng)地，“編碼谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(或GGT)的基因的功能被抑制”的含義涉及，例如，該基因本身被破壞的情況、該基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄或者翻譯水平被抑制的情況，以及該基因被修飾以至于所表達(dá)的蛋白質(zhì)不具有野生型GGT的活性的情況。
通過抑制編碼GGT的基因的功能而使GGT活性缺失或降低可通過，例如，破壞GGT基因或者以用于抑制表達(dá)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該植物而獲得。
根據(jù)上文所述可通過使GGT活性缺失或者降低而達(dá)到本發(fā)明的目的。該酶活性在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和蛋白質(zhì)水平均可被抑制。例如，活性降低的植物可通過使該植物適應(yīng)不同的生長條件并且測定GGT活性而加以篩選，GGT活性的測定使用下文將要描述的方法進(jìn)行。還可以通過對該植物基因組中的編碼GGT的基因進(jìn)行修飾或者破壞而除去或者降低該活性。還可以通過反義或者共抑制方法除去或者降低GGT活性。特別是在本發(fā)明中，從性狀穩(wěn)定性出發(fā)，破壞GGT基因是優(yōu)選的。這樣的基因破壞可通過轉(zhuǎn)座子的插入、T-DNA的插入或者誘變而獲得，所述誘變通過用諸如EMS這樣的誘變劑處理而進(jìn)行。通過轉(zhuǎn)座子或者T-DNA的插入或者以誘變劑進(jìn)行處理而進(jìn)行基因破壞的常用技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在可獲得基因受破壞的植物的制備庫的情況下，可通過對該庫進(jìn)行篩選以查找含有受破壞的GGT基因的植物，從而容易地獲得所需的被轉(zhuǎn)化植物。
根據(jù)同在相同條件下生長的野生型植物進(jìn)行的比較，無論在總蛋白、鮮重或者葉片中，本發(fā)明的植物在發(fā)育的某些階段具有至多約80％的GGT活性，優(yōu)選的情況下至多約50％，更為優(yōu)選的情況下至多30％的GGT活性。
本發(fā)明中，GGT活性的去除或者降低在優(yōu)選的情況下發(fā)生在過氧化物酶體中，特別是在光合組織的過氧化物酶體中。該光合組織可為任何在普通培養(yǎng)條件下進(jìn)行光合的組織，例如葉片、莖或者長角果(silique)。
因此，根據(jù)同在相同條件下生長的野生型植物進(jìn)行的比較，通過本發(fā)明的方法而具有提高的谷氨酸含量的植物具有至多約80％的GGT活性，優(yōu)選的情況下至多50％，更為優(yōu)選的情況下至多30％的GGT活性，該GTT活性為總蛋白中的GGT活性、新鮮的組織或者細(xì)胞器的GGT活性或者葉片的組織或者細(xì)胞器中的GGT活性，該總蛋白在優(yōu)選的情況下提取自光合組織，更為優(yōu)選的情況下提取自光合組織的過氧化物酶體。
本文所使用的術(shù)語“谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶”指的是一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性，該活性亦可簡稱為“GGT”。術(shù)語“編碼谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的基因”在本文中涉及編碼具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白質(zhì)的所有核酸片段。
在本發(fā)明中被用作為目標(biāo)的GGT基因還可以獲自植物。例如，GGT基因的DNA堿基序列信息可通過使用“丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶”作為關(guān)鍵詞從數(shù)據(jù)庫中搜索而獲得。根據(jù)該序列信息，全長cDNA可通過RT-PCR、5’-RACE以及3’-RACE而獲得。還有可能根據(jù)已知的序列信息通過以適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行的雜交而篩選cDNA文庫。用于篩選的探針可根據(jù)GGT的氨基酸或者DNA序列進(jìn)行制備。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的情況下該目的GGT定位于過氧化物酶體中，特別是上文所描述的光合組織中的過氧化物酶體。GGT在過氧化物酶體中的定位可從定位于過氧化物酶體中的蛋白質(zhì)的特征性N-末端序列或者C-末端序列推斷出。在保持定位于過氧化物酶體、在該細(xì)胞中表達(dá)GGT并且測定該GGT的情況下，還有可能通過將GGT基因同諸如GFP或者GUS這樣的報告基因進(jìn)行融合而證實(shí)該定位。在另一種方法中，該定位可通過以特異性抗體檢測被標(biāo)記的GGT的表達(dá)而證實(shí)。
在可獲得基因受破壞的植物庫或類似的情況下，本發(fā)明的植物可通過對該庫中的GGT基因受破壞的植物進(jìn)行篩選而獲得。通過引物和探針的適當(dāng)組合，還有可能確認(rèn)GGT基因在這些植物中是如何被破壞的。這些篩選方法和分析方法在本領(lǐng)域中為人所熟知，可以參考，例如，“植物基因組研究方案”(秀潤出版社)。即使沒有這樣的庫，通過使用基因工程方法，例如轉(zhuǎn)座子以及T-DNA，可以獲得這樣的基因受破壞的植物，特別是具有受破壞的GGT基因的植物或者由于其它的原因而在GGT活性上有所缺陷或者抑制的植物。
可用于產(chǎn)生本發(fā)明的實(shí)施方案中的基因受破壞植物的核酸構(gòu)建體可通過本領(lǐng)域所熟知的方法而進(jìn)行制備。在諸如Sambrook等人的Molecular cloning-Laboratory manual第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press這樣的文獻(xiàn)中可以找到分子生物學(xué)的方法，包括，設(shè)計核酸構(gòu)建體、分離這些構(gòu)建體以及測定其序列的方法。為制備可用于本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，在某些情況下可能需要通過PCR進(jìn)行的基因擴(kuò)增。關(guān)于PCR方法，可以參照，例如，F(xiàn).M.Ausubel等，(eds)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
植物中的基因破壞可通過本領(lǐng)域中常用的方法進(jìn)行。例如，基因組GGT基因在優(yōu)選的情況下可以使用轉(zhuǎn)座子或者T-DNA而作為目標(biāo)被破壞。適于該方法的基因構(gòu)建體的設(shè)計很容易被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。以轉(zhuǎn)座子或者T-DNA進(jìn)行基因破壞的一般技術(shù)見Plantmolecular biology manual 2nd，S.B.Gelvin和R.A.Schilper的描述。
用于在上述的實(shí)施方案中引入該核酸構(gòu)建體的方法并無特別的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的任何用于將基因引入植物細(xì)胞或者植物體中的方法均可根據(jù)宿主而被選用。例如，可以使用農(nóng)桿菌所介導(dǎo)的基因引入方法、電穿孔方法或者顆粒槍。當(dāng)使用農(nóng)桿菌時，待引入的序列在優(yōu)選的情況下插入于T-DNA邊界序列的左側(cè)和右側(cè)。由此而基于T-DNA而進(jìn)行的轉(zhuǎn)化載體的適當(dāng)設(shè)計和構(gòu)建在本領(lǐng)域中是為人所熟知的。進(jìn)一步，以含有這樣的核酸構(gòu)建體的農(nóng)桿菌對特定植物進(jìn)行的感染所需的條件在本領(lǐng)域中也是為人所熟知的。對于這樣的工藝和條件，可以參照秀潤出版社(1996)出版的“模型植物實(shí)驗(yàn)方案水稻和擬南芥”的細(xì)胞技術(shù)分冊。
盡管進(jìn)行基因操作的植物的種類并無特別限制，但優(yōu)選容易培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化并且其再生系統(tǒng)已被建立的植物種類。除具有上述的特征化性狀的植物外，本發(fā)明中還有一些植物種類較為優(yōu)選，對于這些植物種類已經(jīng)建立了大規(guī)模的培養(yǎng)工藝并且作為食品具有高利用價值。這些植物，除作為模式植物的擬南芥之外，還包括水稻作物、菠菜、甘藍(lán)、萵苣、沙拉蔬菜、芹菜、黃瓜、番茄、蠶豆、大豆、赤豆、菜豆和豌豆。
隨后，將這些轉(zhuǎn)化子從由此而獲得的經(jīng)遺傳工程處理的植物細(xì)胞等等中篩選出來。篩選可基于存在于用于該轉(zhuǎn)化的核酸構(gòu)建體的標(biāo)記基因的表達(dá)而進(jìn)行。例如，當(dāng)該標(biāo)記基因?yàn)榭顾幓驎r，可通過在含有適當(dāng)濃度的抗生素或者除草劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)或者生長植物細(xì)胞而進(jìn)行該選擇。當(dāng)該標(biāo)記基因?yàn)棣?葡萄糖苷酸酶基因或者熒光素酶基因時，可通過對該活性進(jìn)行篩選而選擇轉(zhuǎn)化子。植物體可從由此而鑒定的轉(zhuǎn)化子中再生，該轉(zhuǎn)化子的例子如，原生質(zhì)體、愈傷組織和外植體。對各個植物可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的方法進(jìn)行再生。由此而獲得的植物可通過普通方法進(jìn)行培養(yǎng)，或者，換句話說，在與用于未轉(zhuǎn)化植物相同的條件下培養(yǎng)或者在適于各個轉(zhuǎn)化子的條件下培養(yǎng)。為對含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的被轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行鑒定，除上述的標(biāo)記基因選擇方法外還可以使用多種不同的分子生物學(xué)方法。特別地，本發(fā)明的具有降低的GGT活性的植物在優(yōu)選的情況下保持免受強(qiáng)光以保護(hù)其免于生長抑制。
為檢測該目的基因的受破壞或者重組DNA插入物的存在與否及其結(jié)構(gòu)，可以使用Southern雜交、PCR、Northern印跡或者RT-PCR。
隨后可測定由此而獲得的轉(zhuǎn)化植物的GGT蛋白量、GGT活性以及GGT的mRNA量。例如，可通過Western印跡法等來測定該蛋白質(zhì)的量，通過Northern印跡法、定量RT-PCR方法等等可測定mRNA的量。GGT活性可通過普通方法(Plant Physiol.991520-1525)進(jìn)行測定。例如，可通過以液氮將植物的光合組織，例如葉片，進(jìn)行冷凍干燥、研磨該冷凍組織、將所獲得的粉末懸浮于適當(dāng)?shù)奶崛【彌_液中，例如含有100mM Tris-HCl(pH7.3)或者10mM DTT的緩沖液，對所獲得的懸浮物進(jìn)行超濾并且將所獲得的樣品用于上述的測定方法，以此來測定光合組織中的GGT活性(Plant Physiol.991520-1525)。通過普通方法對過氧化物酶體進(jìn)行分離(Plant Physiol.43705-713，J.Biol.Chem.2435179-5184，Plant Physiol.49249-251等等)并且通過上述的方法測定GGT活性可測定定位于過氧化物酶體的GGT活性。這些方法在本領(lǐng)域?yàn)槿怂熘?br> 可對所產(chǎn)生的植物進(jìn)行谷氨酸含量的估定。谷氨酸含量的測定可通過，例如，研磨該植物體或其部分、從中獲取提取物并且以普通的氨基酸分析儀檢測該提取物而進(jìn)行。例如，可以通過向樣品(植物體或其一部分)中加入500μl的80％乙醇、以細(xì)胞攪拌機(jī)(blender)MM300(QIAGEN)進(jìn)行研磨并且在80℃下處理所獲得的產(chǎn)物10分鐘，從而提取出氨基酸。對該產(chǎn)物進(jìn)行離心并且進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)。將所剩的樣品溶解于0.02N HCl之中以獲得分析樣品。將該樣品通過0.22μm的濾器以除去雜質(zhì)。在氨基酸分析中，氨基酸含量可以使用氨基酸分析儀LS-8800(HITACHI)進(jìn)行測定。可根據(jù)谷氨酸在總氨基酸含量中的增加速率、相對于鮮重的谷氨酸含量或者進(jìn)行測定相對于特定組織的谷氨酸含量，并且同在相同條件下生長的野生型植物進(jìn)行比較而測定植物體的谷氨酸含量，該特定組織在優(yōu)選的情況下為光合組織，例如葉片，植物體的谷氨酸可根據(jù)情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。當(dāng)在上述至少一個指標(biāo)中谷氨酸含量的提高在統(tǒng)計上具有顯著性時(例如，當(dāng)該提高在5％(p＜0.05)的顯著水平上在統(tǒng)計上具有顯著性時)，可以認(rèn)為谷氨酸含量同在相同條件下生長的野生型植物進(jìn)行比較而顯著地提高了。
通過本發(fā)明的方法，植物體的谷氨酸含量(谷氨酸相對于總氨基酸含量的相對含量)提高至相當(dāng)于在相同條件下生長的野生型植物的該含量的至少約1.2倍，通常情況下約1.2到2.5倍；相對于鮮重的谷氨酸含量提高至約至少1.2倍，通常情況下約1.5到3倍。
在對具有提高的谷氨酸含量的轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行鑒定之后，可以檢測其特征在遺傳上是否可穩(wěn)定保持。為此目的，可在普通光照條件下培養(yǎng)該植物，從該植物中收取種子并且對其后代的性狀和分離進(jìn)行分析。當(dāng)該植物在普通光照條件下的生長抑制很強(qiáng)烈時，可在弱光條件或者高CO2濃度和普通光照條件下生長該植物，該弱光條件的例子如，約30μmol m-2s-1，該CO2濃度條件的例子如，0.7％的CO2，隨后可分析其性狀。所引入的核酸構(gòu)建體在后代中存在與否，其在后代中的位置及其表達(dá)可以以與原代轉(zhuǎn)化子相同的方式進(jìn)行分析。
關(guān)于產(chǎn)生自整合入基因組的核酸構(gòu)建體的序列或者受破壞的基因，由此而具有提高的谷氨酸含量的轉(zhuǎn)化子可為雜合子或者純合子。如果必要，雜合子或者純合子均可通過諸如雜交這樣的方法獲得。來自整合入基因組的核酸構(gòu)建體的序列根據(jù)孟德爾定律在子代中進(jìn)行分離。因此，為達(dá)到本發(fā)明的目的，從性狀穩(wěn)定的觀點(diǎn)出發(fā)使用純合子植物是較為優(yōu)選的。盡管本發(fā)明的植物可在普通培養(yǎng)條件下生長，但將它們生長在盡可能強(qiáng)的光照下較為理想，只要不發(fā)生生長抑制就行。
在本發(fā)明的種子的產(chǎn)生過程中，對純合植物進(jìn)行培養(yǎng)并且收集其種子是特別優(yōu)選的。該純合植物可通過重復(fù)傳代的培養(yǎng)直至所需的表現(xiàn)型不出現(xiàn)分離而進(jìn)行選擇，或者，換句話說，可通過對選擇一個在所有子代中均表現(xiàn)出所需的表型的種系而進(jìn)行該純合植物的選擇。這些純合子可通過PCR或者Southern分析進(jìn)行選擇。當(dāng)本發(fā)明的目的通過插入轉(zhuǎn)座子或者T-DNA而達(dá)到時，這樣的分子生物學(xué)工藝是可用的。
本發(fā)明的種子可通過在普通的條件下培養(yǎng)一種植物并且收集其種子而獲得，該植物中的GGT活性缺乏或者降低，或者在特定情況下，該植物被確認(rèn)具有提高的谷氨酸含量，該植物通過上文述及的方法獲得。例如，一個對于破壞的GGT基因是純合的植物在普通的條件下進(jìn)行培養(yǎng)并且收集其種子。在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明的植物在約為30到70μmol-2s-1的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)并且對其種子進(jìn)行收集以獲得本發(fā)明的種子。通過使用上述方法測定該植物中的谷氨酸含量，本發(fā)明的種子可被確認(rèn)所具有谷氨酸含量高于對應(yīng)的在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)的野生型植物的種子。
本發(fā)明的植物和種子可在與其對應(yīng)的野生型植物相同的方式下被用作為食品以及食品材料。因此，本發(fā)明的植物和種子可直接被用作為食品或者在經(jīng)普通方法的烹調(diào)或者加工下作為食品。特別優(yōu)選的食品是那些需要通過谷氨酸而具有改善的口味的食品，例如例如醬油、豆面醬(經(jīng)發(fā)酵的大豆調(diào)味品)、調(diào)味番茄醬、水豆豉(發(fā)酵的大豆)、湯和快餐。
以下的實(shí)施例將進(jìn)一步展示用于獲得本發(fā)明的植物的方法以及所獲得的植物和種子的特征，該方法通過對擬南芥基因破壞植物文庫進(jìn)行篩選而獲得本發(fā)明的植物。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，本發(fā)明的植物、其種子以及本發(fā)明的方法很明顯并不限定于該特定的植物擬南芥。
實(shí)施例實(shí)施例1擬南芥的GGT缺陷品系的獲得
(1)植物培養(yǎng)含有1％(w/v)的蔗糖、0.05％(w/v)的MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]以及0.8％(w/v)瓊脂的PNS(Mol.Gen.Genet.204430-430)或者M(jìn)S(Physiol Plant 15473-479)無機(jī)鹽被用作為平板的基底培養(yǎng)基。在于礦物纖維之上進(jìn)行的培養(yǎng)中，僅僅PNS無機(jī)鹽被用作為營養(yǎng)源。(2)用于篩選GGT缺陷型品系的引物的制備根據(jù)擬南芥的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AlaAT)基因的信息而獲得了AlaAT基因。AlaAT基因亦稱為GGT基因。
從發(fā)表于國際互聯(lián)網(wǎng)上的數(shù)據(jù)對AlaAT序列的拷貝數(shù)進(jìn)行估計并且制備引物。根據(jù)使用“丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶”以及“擬南芥”作為關(guān)鍵詞而搜索得到的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，至少4個拷貝的基因被認(rèn)為是存在于該基因組中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶。各個基因的Genbank登錄號為AC005292(F26F24.16)、AC011663(F5A18.24)、AC016529(T10D10.20)以及AC026479(T13M22.3)。這些基因分別被命名為AlaAT1、2、3和4。所推斷出的氨基酸序列的比較示于圖1。根據(jù)EST的信息，AlaAT1的表達(dá)量在四個拷貝中最高，因此，該基因破壞的效果被預(yù)期為最明顯。用于篩選基因破壞品系的PCR引物根據(jù)AlaAT1的序列(表1)進(jìn)行制備。這些引物根據(jù)Kazusa DNA實(shí)驗(yàn)室所提供的系統(tǒng)而進(jìn)行設(shè)計。
表1用于篩選基因破壞品系的PCR引物
*這些序列根據(jù)傳統(tǒng)符號以5’→3’的方向顯示。
(3)AlaAT破壞品系的分離AlaAT在基因破壞的擬南芥庫中的篩選根據(jù)Kazusa DNA實(shí)驗(yàn)室所提供的系統(tǒng)而進(jìn)行。篩選通過在“植物細(xì)胞工程系列14”“植物基因組研究方案”(秀潤出版社)2-4-c中描述的方法進(jìn)行。
在初始篩選中，(AAT1U/AAT1L)被用作為基因側(cè)翼的引物，并且(00L/02L/03L/04L/05L/06L/00R/02R/03R/04R/05R/06R)被分別用作為相應(yīng)合并液(pool)的標(biāo)記引物。所使用的標(biāo)記引物和對應(yīng)的組的關(guān)系見表2。
表2.標(biāo)記引物和合并液之間的聯(lián)系
所使用的聚合酶為EX-taq(TAKARA)。20μl的反應(yīng)溶液中含有大約38.4ng(約100pg×384)的模板DNA、10pmol的標(biāo)記引物、10pmol的基因引物、2μl的10×緩沖液、5nmol的dNTP和0.5μ的Ex-taq。PCR循環(huán)包括94℃進(jìn)行45秒、52℃進(jìn)行45秒以及72℃進(jìn)行3分鐘。在進(jìn)行35個循環(huán)的重復(fù)之后，通過電泳以1％的瓊脂糖凝膠對10μl的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。在EtBr染色后觀察到了擴(kuò)增的DNA片段。通過浸入變性溶液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)20分鐘而使該凝膠變性。隨后將該凝膠浸入中和溶液
20分鐘。在使用20×SSC(3M NaCl、0.3M檸檬酸鈉)對membrane-Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行印跡之后，DNA通過UV交聯(lián)而被固定于該膜上。使用AlkPhos-Direct DNA檢測試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)根據(jù)該試劑盒所附的方案進(jìn)行雜交和檢測。雜交溫度為65℃。PCR使用AAT1U/AAT1L作為探針并且使用基因組DNA作為模板。經(jīng)擴(kuò)增的片段使用GFX PCR DNA和Gel Band purification試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行純化。
在初始篩選之中，提取自384個獨(dú)立的插入標(biāo)記的品系的基因組DNA混合物被用作為一個組。54個合并液(384×54＝20736的品系)被用于該P(yáng)CR。擴(kuò)增產(chǎn)物被用于Southern分析以證實(shí)是否所期望的產(chǎn)物被擴(kuò)增。在初始篩選中具有陽性結(jié)果的合并液P0035被用于次級篩選。用于次級篩選的PCR所用的引物組合為AAT1U/00L以及AAT1L/00L，該組合在初始篩選中給出了陽性結(jié)果。通過次級篩選，很明顯AlaAT1標(biāo)記被插入于一個品系，品系8046。
(4)標(biāo)記插入物定位的確定提取自所確定的標(biāo)記插入品系的DNA被用作為模板。使用兩個引物組合(AAT1U/00L，AAT1L/00L)進(jìn)行PCR。對被擴(kuò)增的片段進(jìn)行克隆以獲得pGEM T-easy載體(Promega)。為進(jìn)行測序而使用了ABI PRISMTM 337 DNA測序儀(PERKIN ELMER)。
據(jù)發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記被插入于第六外顯子中并具有16bp的去除，并且176-GGTLV-180由于該標(biāo)記的插入而被替換為176-AIOL(末端)-180。所測定的標(biāo)記插入物的位置以及鄰近序列見圖2。
實(shí)施例2 GGT缺陷品系特征的分析(1)純合子的選擇已經(jīng)證實(shí)具有標(biāo)記插入的品系的T2種子被置于含有10mg/l潮霉素的MS培養(yǎng)基上。三周之后，將所獲得的幼苗移植入礦物纖維之中，并且從約5mm×5mm的玫瑰花結(jié)(rosette)葉樣品中提取DNA。該提取根據(jù)Li法(Plant J.8457-463)而進(jìn)行。為進(jìn)行純合子的鑒定，以側(cè)列于該標(biāo)記的引物(AAT1U/AAT1L2)進(jìn)行PCR。進(jìn)行了30個循環(huán)的PCR，其中變性在94℃下進(jìn)行30秒，退火在57℃下進(jìn)行30秒并且在72℃下進(jìn)行60秒的延伸。作為對照，野生型基因組DNA被用作為模板。通過電泳在1％的瓊脂糖凝膠上分離一份PCR產(chǎn)物。在總共35個品系中有11個品系發(fā)現(xiàn)了純合子(圖3)。
(2)GGT表達(dá)的檢測。
通過使用其后代而對所獲得的純合品系進(jìn)行PR-PCR，從而對基因破壞的存在加以證實(shí)。該純合子的種子被補(bǔ)充以含有10mg/l的潮霉素的MS培養(yǎng)基，并且已經(jīng)證實(shí)所有的個體均為抗性。在發(fā)芽兩周之后使用ISOGEN(Nippon gene)從幼苗中提取總RNA。在以DNAase進(jìn)行處理并隨后使用superscript II(GIBCO)以寡聚dT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄之后，使用側(cè)列于該標(biāo)記的引物(AAT1 RTU/AT1RTL)以所合成的單鏈cDNA作為模板進(jìn)行了PCR。PCR進(jìn)行了28個循環(huán)，其中變性在94℃下進(jìn)行30秒，退火在57℃下進(jìn)行30秒并且在72℃下進(jìn)行60秒的延伸。作為對照，使用了EF-1α(EFU/EFL)。通過電泳在1％的瓊脂糖凝膠上分離一份PCR產(chǎn)物。在插入了標(biāo)記的品系(圖4)中未發(fā)現(xiàn)AlaAT1的全長mRNA。根據(jù)這些結(jié)果，該插入了標(biāo)記的品系被命名為“aat-1”并且被用于隨后的分析。
(3)光照強(qiáng)度對于插入了標(biāo)記的品系aat-1的影響插入了標(biāo)記的品系aat-1的種子被種植于土壤之中，并且在普通光照強(qiáng)度條件(約70μmol m-2s-1)下進(jìn)行培養(yǎng)，光期為16個小時，暗期為8個小時。
收取在上述條件下所獲得的20個幼苗的地下部分，測定其重量，重復(fù)三次。計算其平均值。在弱光條件下(約30μmol m-2s-1)未發(fā)現(xiàn)有明顯的生長差異，盡管在普通光照強(qiáng)度條件下生長被嚴(yán)重地抑制了(表3)。這些結(jié)果提示，aat-1被光抑制所破壞，這是由不完全的光呼吸所導(dǎo)致的。
表3光強(qiáng)度的影響相對重量
(4)插入了標(biāo)記的品系aat-1的酶活性為測定酶活性，將該蛋白幼苗中提取出來，該幼苗在PNS培養(yǎng)基上發(fā)芽之后在70μmol m-2s-1的光照條件下生長了2周。在液氮中冷凍該植物(鮮重約200mg)并且隨后使用研缽和搗杵將其組織破碎。向其中加入1ml的提取溶液[100mM Tris-HCl(pH7.3)，10mMDTT]，并將所獲得的混合物在15,000rpm下離心10分鐘以除去不溶的物質(zhì)。將該過程重復(fù)三次。使用濾器UFV5BGCOO(Millipore)進(jìn)行超濾而進(jìn)行脫鹽處理。通過在1,000rpm下進(jìn)行約45分鐘的離心而將0.5ml的提取物濃縮直至十倍濃度。在使用提取物將該濃縮物稀釋十倍之后，相同的過程被重復(fù)三次。使用蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad)測定該蛋白質(zhì)濃度。加入含有10％的甘油的提取物以獲得終濃度為2mg每ml的提取物，從而獲得了粗提取物，該粗提取物被用于隨后的酶活性測定。
反應(yīng)Ala(丙氨酸)+αKG(α酮戊二酸)→Glu(谷氨酸)+Pyr(丙酮酸)的活性根據(jù)340nm下的OD變化而進(jìn)行測定，該OD變化通過同該反應(yīng)所偶聯(lián)的NADH被LDH(ECl.1.1.27)的氧化反應(yīng)而產(chǎn)生。為進(jìn)行反應(yīng)，10mg的粗提取物被用于600μl的反應(yīng)溶液[100mM Tris-HCl(pH7.3)，100mM Ala，0.11mM吡哆醛5-磷酸，0.11mM NADH，15mM αKG，80mM NH4Cl，1200U/l LDH(SIGMALL2375)]。
Glu+Pyr→Ala+αKG以及Glu+乙醛酸→甘氨酸(Gly)+αKG的反應(yīng)性根據(jù)340nm下的OD變化而進(jìn)行測定，該OD變化通過同該反應(yīng)所偶聯(lián)的NADH被NAD+-GDH(EC1.4.1.3)的氧化反應(yīng)而產(chǎn)生。為進(jìn)行反應(yīng)，10mg的粗提取物被用于600μl的反應(yīng)溶液[100mMTris-HCl(pH7.3)，100mM Glu，0.11mM吡哆醛5-磷酸，0.11mMNADH，15mM αKG，1200U/l GDH(G2501)]。當(dāng)乙醛酸被用作為氨基受體時，除Pyr被代之以乙醛酸之外，使用相同的反應(yīng)溶液。
各反應(yīng)的活性見圖5。已發(fā)現(xiàn)在所有這三個被認(rèn)為是AlaAT所催化的反應(yīng)之中，aat-1之中的反應(yīng)性有所降低。還發(fā)現(xiàn)，催化將氨基基團(tuán)從谷氨酸轉(zhuǎn)至乙醛酸的反應(yīng)的活性，即，GGT活性，在aat1-1中明顯降低。
因此，從強(qiáng)光照條件下的生長抑制和酶活性測定的結(jié)果綜合來看，可以發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下AlaAT1深入?yún)⒂枇送ㄟ^羥乙酸途徑從乙醛酸合成甘氨酸的反應(yīng)，該途徑是實(shí)際上的光呼吸途徑(參照圖6之中的箭頭)。
(5)插入了標(biāo)記的aat-1的氨基酸分析為測定氨基酸含量而從幼苗之中對氨基酸進(jìn)行了提取，這些幼苗通過在PNS培養(yǎng)基上發(fā)芽之后在70μmol m-2s-1的光照條件下生長2周而獲得。在液氮中冷凍該植株(鮮重約40mg)并隨后在-80℃下保存。為解凍該樣品，加入了500μl 80％的乙醇。隨后使用細(xì)胞破碎機(jī)MM300(QIAGEN)破碎該組織，并隨即在80℃下處理10分鐘以提取氨基酸。在15,000rpm下進(jìn)行10分鐘的離心之后棄去上清。在80℃下向所獲得沉淀中加入500μl 80％的乙醇，并且對該混合物進(jìn)行徹底地攪拌，隨后在80℃下進(jìn)一步處理10分鐘。在15,000rpm下進(jìn)行10分鐘的離心之后，收取上清作為氨基酸提取物。在負(fù)壓下旋轉(zhuǎn)1ml的氨基酸提取物以徹底除去乙醇和水。將300μl的0.02N HCl加至存留的樣品中。經(jīng)過渦旋混和和隨后進(jìn)行的離心后收取上清。通過0.22μm的濾器而除去雜質(zhì)以獲得用于分析的樣品。使用一臺氨基酸分析儀LS-8800(HITACHI)。主要氨基酸的含量(nmol/mg MW)和其與氨基酸總量相比的相對含量見圖7。分析的結(jié)果顯示，谷氨酸的累積量在aat1-1中有所提高(圖7)。
<序列表free text>
SEQ ID NO2到NO20 PCR引物實(shí)施例3對插入了標(biāo)記的品系aat-1的種子中的氨基酸含量的測定(1)aat1-1植物的培養(yǎng)插入了標(biāo)記的品系aat-1和對照植物Co1-0的種子被種植于PNS固體培養(yǎng)基中并且在該光照條件下(70μmol m-2s-1)進(jìn)行三周的培養(yǎng)，其光期為16小時，暗期為8小時，并隨后移植入礦物纖維之中。植物體Co1-1所植入的礦物纖維以及植株aat1-1所植入的礦物纖維被置于相同的盤中。每周給入一次PNS以充肥料。收集種子，并且在干燥器中進(jìn)行完全干燥之后對氨基酸進(jìn)行分析。隨后進(jìn)行了氨基酸的分析。
(2)在aat1-1的種子中的氨基酸分析將約合10mg的干種子以及500μl 80％乙醇轉(zhuǎn)入一個2ml的試管中，并且使用細(xì)胞破碎機(jī)MM300(QIAGEN)破碎這些種子，并隨即在80℃下處理10分鐘以提取氨基酸。在15,000rpm下進(jìn)行10分鐘的離心之后除去上清。在80℃下向所獲得沉淀中加入500μl 80％的乙醇，并且對該混合物進(jìn)行徹底地攪拌，隨后在80℃下進(jìn)一步處理10分鐘。在15,000rpm下進(jìn)行10分鐘的離心之后，收取上清作為氨基酸提取物。
負(fù)壓下旋轉(zhuǎn)一毫升的氨基酸提取物以徹底除去乙醇和水。向由此而被干燥成固體的該樣品中加入五百微升的無菌水以及500μl的乙醚，并對其進(jìn)行徹底地攪拌。在15,000rpm下離心5分鐘之后，除去上清(醚相)。在負(fù)壓下對水相進(jìn)行離心以徹底除水。將300μl的0.02NHCl加至被干燥的樣品中。經(jīng)過渦旋混和和隨后進(jìn)行的離心后收取上清。通過0.22μm的濾器而除去雜質(zhì)以獲得用于分析的樣品。使用一臺氨基酸分析儀LS-8800(HITACHI)。主要氨基酸的含量(nmol/mgMW)和其與氨基酸總量相比的相對含量分別見圖8和圖9。
分析的結(jié)果表明這些種子中的谷氨酸含量有所提高。
根據(jù)本發(fā)明，植物和/或其種子的谷氨酸含量可被提高，并且由此可以獲得具有較高的谷氨酸含量的植物和/或其種子。因此，根據(jù)本發(fā)明，有可能提高食用植物體或者其完整果實(shí)的谷氨酸含量，例如菠菜、甘藍(lán)、萵苣和番茄，并且可能提高植物的食用種子的谷氨酸含量，例如大豆、赤豆、蠶豆、菜豆和豌豆。其結(jié)果，這些植物和/或種子的口感可被改善。進(jìn)一步，從這些植物體或者種子制備的食品的口感可被改善。
序列表<110>味之素公司<110>Kazusa DNA Research Institute<120>提高植物谷氨酸含量的方法以及具有較高谷氨酸含量的植物<130>Y1J0188<140>
<141>
<150>JP 2001-208238<151>2001-07-09<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>481<212>PRT<213>擬南芥<400>1Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val Lys1 5 10 15Lys Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu20 25 30Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Val Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro35 40 45His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ala50 55 60Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Leu65 70 75 80Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr85 90 95Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val
100 105 110Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser115 120 125Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met130 135 140Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Asn Gly Asp Gly Ile Leu Val145 150 155 160Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly165 170 175Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Asp Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu180 185 190Asp Val Ala Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly195 200 205Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly210 215 220Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Lys Phe Cys Tyr225 230 235 240Asn Glu Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile245 250 255Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met Glu260 265 270Met Gly Ser Pro Phe Ser Lys Glu Val Gln Leu Val Ser Phe His Thr275 280 285Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe290 295 300Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Arg Val Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val305 310 315 320Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly325 330 335
Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe340 345 350Ala Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg355 360 365Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe370 375 380Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu Pro Thr Gly385 390 395 400Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr405 410 415Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser420 425 430Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu435 440 445Pro Ala Glu Asp Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe450 455 460Asn Asp Glu Phe Met Thr Gln Tyr Asp Asn Asn Phe Gly Tyr Ser Lys465 470 475 480Met<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>2ctctagaacc gaacgtgact ctccag 26<210>3
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>3ccatgatctc cggcatctca tcttc25<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>4atcacaaatc aggcacaagg ttagac 26<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>5ggagggaaga agtgagctag ggattg 26<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>6
cgctcatcct ggtatatgtt ctgctg 26<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>7ataacgctgc ggacatctac 20<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>8ttagacaagt atctttcgga tgtg 24<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>9aacgctgcgg acatctacat ttttg25<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>10gtgggttaat taagaattca gtacattaaa 30<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>11aagaaaatgc cgatacttca ttggc25<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>12aagaaaatgc cgatacttca ttggc 25<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>13tagatccgaa actatcagtg 20<210>14
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>14acgtgactcc ctttaattct ccgctc 26<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>15cctaactttt ggtgtgatga tgctg25<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>16ttcccttaat tctccgctca tgatc25<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>17
ttcccttaat tctccgctca tgatc 25<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>18ttcccttaat tctccgctca tgatc 25<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>19gtttcacatc aacattgtgg tcattgg27<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物<400>20gagtacttgg gggtagtggc atcc 2權(quán)利要求
1.一種植物，其中谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的活性缺失或者降低。
2.權(quán)利要求1的植物，其中谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的活性缺失或者降低，并且其中所述植物的谷氨酸含量同在相同條件培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物相比有所提高。
3.權(quán)利要求1的植物，其中谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的活性缺失或者降低，并且所述植物的谷氨酸含量高出在相同條件培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物至少1.2倍。
4.權(quán)利要求1的植物，其中一種基因的功能被抑制，所述基因編碼具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。
5.權(quán)利要求4的植物，其中一種基因被破壞，所述基因編碼具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。
6.權(quán)利要求4的植物，其中一種基因的表達(dá)被抑制，所述基因編碼具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的植物，其中所述谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性為過氧化物酶體中的活性。
8.權(quán)利要求7中的植物，其中谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性為光合組織的過氧化物酶體中的活性。
9.權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的植物，其中具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白具有SEQ ID NO1中的第1號氨基酸殘基到第478號氨基酸殘基的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的植物，其中具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白具有SEQ ID NO1中的第1號氨基酸殘基到第481號氨基酸殘基的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的植物的種子
12.權(quán)利要求11的種子，其中谷氨酸含量同在相同條件培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物的種子相比有所提高。
13.權(quán)利要求11的種子，其中谷氨酸含量同在相同條件培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物的種子相比提高了至少1.2倍。
14.一種提高植物和/或種子中谷氨酸含量的方法，所述提高是同在相同條件下培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物相比而言的，所述方法包括導(dǎo)致谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性缺失或者降低的步驟。
15.權(quán)利要求14的方法，其中一種基因的功能被抑制，所述基因編碼具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。
16.權(quán)利要求15的方法，其中一種基因被破壞，所述基因編碼具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。
17.權(quán)利要求15的方法，其中一種基因的表達(dá)被抑制，所述基因編碼具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。
18.權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)的方法，其中谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性為過氧化物酶體中的活性。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的活性為光合組織的過氧化物酶體中的活性。
20.權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)的方法，其中具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白具有SEQ ID NO1中第1至478號氨基酸殘基的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求14到17中任一項(xiàng)的方法，其中具有谷氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白具有SEQ ID NO1中第1至481號氨基酸殘基的氨基酸序列。
22.一種生產(chǎn)種子的方法，所述種子同從以相同條件培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物所獲得的種子相比具有提高的谷氨酸含量，所述方法包括對權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的植物進(jìn)行培養(yǎng)并且從所述植物中收獲種子的步驟。
23.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的植物在生產(chǎn)食品中的應(yīng)用。
24.一種食品，該食品含有權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的植物。
25.權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的種子在生產(chǎn)食品中的應(yīng)用。
26.一種食品，該食品含有權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的種子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種方法，該方法通過去除或者降低GGT活性而提高植物和/或種子的谷氨酸含量，本發(fā)明還提供了GGT活性缺失或者降低的植物和/或種子，特別是具有同在相同條件培養(yǎng)的相應(yīng)野生型植物相比谷氨酸含量較高的植物和/或種子。
文檔編號A23L1/29GK1525814SQ0281388
公開日2004年9月1日 申請日期2002年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月9日
發(fā)明者五十嵐大亮, 大住千榮子, 榮子 申請人:味之素株式會社, 財團(tuán)法人上總Dna研究所