專利名稱：功能性人類嗅覺環(huán)核苷酸門控(cng)通道在重組宿主細胞中的表達及其在鑒定嗅覺調節(jié) ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分離的核酸序列，所述核酸序列編碼人類嗅覺環(huán)核苷酸門控(CNG)通道亞基，以及相應多肽。本發(fā)明還進一步涉及人類CNG通道在表征(profile)，篩選和鑒定能夠調節(jié)人類嗅覺CNG通道的化合物中的應用。更具體的，本發(fā)明涉及在細胞中，優(yōu)選哺乳動物細胞中或昆蟲細胞中，表達人類嗅覺CNG通道，以及所述細胞在基于細胞的高通量檢定法中的應用，以鑒定增強或阻斷人類嗅覺CNG功能的化合物。激活嗅覺CNG通道的化合物將增強嗅覺并可被用于制備對嗅覺功能減退個體來說更適口的食品。相反的，抑制嗅覺CNG通道的化合物將抑制嗅覺并可被用于阻斷調節(jié)子。此外，本發(fā)明涉及基于細胞的嗅覺CNG通道檢定法在鑒定G-蛋白質耦聯(lián)受體(GPCRs)和其它能調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質的調節(jié)子中的應用。
背景技術：
增味劑(odorant)與嗅覺神經元頂纖毛上嗅覺受體的交互作用是我們感知氣味的第一步。數量眾多(例如人體內約為400)而且結構多樣的具有嗅覺受體功能的視蛋白樣GPCRs是我們能夠覺察和分辨大量易揮發(fā)化合物的基礎(Buck和Axel，(1991)，F(xiàn)uchs等，(2001))。盡管人體內有數百種不同的嗅覺神經元細胞類型，而每種類型表達不同的嗅覺受體基因(Chess等，(1994)；Malnic等，(1999)；Touhara等，(1999))，但有證據表明嗅覺神經元中的信號傳導涉及相同的下游信號傳導通路，該通路涉及第二信使cAMP。很多增味劑都顯示出能夠引起嗅覺神經元中cAMP的增加(Breer，(1993))。另外，關于Gs樣G蛋白Golf(Gs-like G protein Golf)(Jones和Reed，(1989)；Belluscio等，(1998))，III型腺苷酸環(huán)化酶(Bakalyar和Reed，(1990)；Wong等，(2000))，和嗅覺CNG通道亞基(Dhallan等，(1990)；Brunet等，(1996))的小鼠敲除研究表明上述這些信號分子在嗅覺信號傳導中發(fā)揮專性作用。概括起來，嗅覺信號傳導被確認為包含以下步驟(1)嗅覺刺激激活嗅覺受體；(2)活化的嗅覺受體激活Golf；(3)III型腺苷酸環(huán)化酶被Golf激活并催化cAMP合成；(4)cAMP激活嗅覺CNG通道；(4)離子從活化的嗅覺CNG通道中流過，使得嗅覺神經元去極化并啟動動作電位的發(fā)生(Gold，(1999))。CNG通道由結構相關的亞基組成，包括6個跨膜片段和C-末端核苷酸結合域(Zagotta和Siegelbaum，(1996))。嗅覺神經元特異性CNG通道的第一個亞基，OCNC1，已經根據其與視網膜CNG通道亞基的同源性而從大鼠嗅覺cDNA中得以克隆鑒定(Dhallan等，(1990))。在傳導性以及對cAMP和cGMP的敏感性方面，天然嗅覺CNG通道和異源表達的OCNC1通道之間的不一致引發(fā)了對其它CNG通道亞基的研究。兩個另外的亞基，OCNC2和β1b(桿狀細胞光感受器CNG通道亞基的拼接變體)，隨后從嚙齒動物嗅覺cDNA中通過基于同源性的克隆方法得以鑒定(Liman和Buck，(1994)；Bradley等，(1994)；Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999))。組織化學實驗表明這些分子在嗅覺神經元頂纖毛內選擇性表達。嗅覺CNG亞基的異源聯(lián)合表達可生成具有類天然特性的通道(Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999))。因此，嗅覺CNG通道可能由三種不同的亞基組成。(OCNC1也被稱為CNG2、CNGC4、CNCα3，和嗅覺CNG通道α；OCNC2也被稱為CNG5、CNCα4，和嗅覺CNG通道β；β1b也被稱為CNCβ1b和CNG4.3)。嗅覺CNG通道是嗅覺調節(jié)子的強制性靶位。首先，該通道位于嗅覺神經元的頂纖毛上，而且暴露于嗅上皮的外表面。因此，通道活化子無需穿過細胞膜。其次，嗅覺CNG通道可在異種細胞中功能性表達(Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999)；Qu等，(2000))。第三，基于鈣成像的試驗方法，其可用于采用自動化熒光裝置的高通量篩選方法，該方法可用于測定CNG通道，因為該通道具有Ca2+可透過性。其實，鈣成像已經用于記錄原代培養(yǎng)物中嗅覺神經元的增味劑依賴性激活作用(Hirono等，(1992)；Ma和Shepherd，(2000))，而且基于鈣染料的試驗方法已經用于異種細胞中表達的大鼠OCNC1(Rich等，(2001))。第四，這些通道由環(huán)核苷酸門控，亦即，這些通道由小分子將其變構性激活。最后，一些小分子已被鑒定為可通過直接抑制CNG通道活性來調節(jié)嗅覺。(Kurahashi等，(1994))。而且能夠激活非離子化作用受體離子通道的小分子已有大量先例，如L-型Ca2+通道的二氫吡啶激動劑(Hockerman等，(1997))。嚙齒動物嗅覺CNG通道已經在非洲爪蟾卵母細胞和HEK-293細胞中表達，而且通過直接測定包含CNG通道的膜的電特性對其進行了功能性特征描述(Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999)；Qu等，(2000))。但是，電生理學方法不適用于高通量篩選。為克服這一局限，本發(fā)明公開了一種基于細胞的熒光測定方法，所述方法適用于對嗅覺CNG通道調節(jié)子的自動化高通量篩選。該方法使用熒光鈣或膜電位染料定量測定由腺苷酸環(huán)化酶活化子毛喉素所致cAMP水平升高后，流過在HEK-293細胞上表達的嗅覺CNG通道的離子流。另外，本發(fā)明鑒定出編碼人類嗅覺CNG通道亞基的核酸序列，該序列在本發(fā)明以前未被鑒定過。
發(fā)明概述本發(fā)明包括人類嗅覺CNG通道的分離的OCNC1，OCNC2和β1b亞基多肽，和編碼所述多肽的核酸序列。本發(fā)明還包括表達所述核酸序列的手段，包括含有所述核酸序列的載體，和含有所述載體的宿主細胞。本發(fā)明進一步包括使用所述核酸，載體和宿主細胞來鑒定化合物的方法，所述化合物通過調節(jié)嗅覺CNG通道活性而調節(jié)嗅覺。而且，本發(fā)明公開的方法還適用于定量測定GPCRs和其它調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質的活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，表達人類嗅覺CNG通道的宿主細胞首先用能夠增加cAMP的因子，如腺苷酸環(huán)化酶活化子毛喉素、磷酸二酯酶抑制劑IBMX、或膜可透過性環(huán)核苷酸類似物進行刺激。隨后通過使用熒光鈣螯合劑如fura-2(Abe等，(1992))、熒光鈉螯合劑如綠色四乙酸鈉鹽(sodium green tetraacetate)(Molecular Probes)和Na+-敏感的染色試劑盒(Molecular Devices)、或膜電位染料如膜電位染色試劑盒(Molecular Devices)和Oxanol-香豆素試劑盒(Aurora Biosciences)來監(jiān)測已處理細胞中的離子流從而定量測定嗅覺CNG通道的活化。嗅覺增強的嗅覺CNG通道活化子即可根據其增強對增高的cAMP的熒光效應的能力而被鑒定出來，而阻斷嗅覺的通道拮抗劑可根據其減弱熒光效應的能力而被鑒定出來。所述鑒定方法通過使用自動熒光檢測設備如Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR，Molecular Devices)和Voltage Ion Probe Reader(VIPR，Aurora Biosciences)可用于化合物文庫的高通量篩選。
發(fā)明目的和優(yōu)選實施方案本發(fā)明的一個目的是提供分離的核酸序列，所述核酸序列編碼人類嗅覺CNG通道的OCNC1，OCNC2和β1b亞基，以及該核酸序列的變體和功能片段，突變體，及嵌合體；包括，例如拼接變體，等位基因變體，單核苷酸多態(tài)性(SNPS)和用重組或化學手段制備的突變性變體。本發(fā)明的另一個目的是提供分離的人類嗅覺CNG通道的OCNC1、OCNC2和/或β1b亞基多肽及其功能片段，嵌合體和變體；包括，拼接變體，等位基因變體，用化學或重組方法制備的SNPS突變體和其非人類的靈長類動物的直向同源物(orthologs)。本發(fā)明的另一個目的是生產一種細胞系，該細胞系表達功能性人類CNG通道多肽亞基或亞基組合。本發(fā)明一個優(yōu)選的目的是生產一種細胞系，該細胞系功能性表達人類OCNC1、OCNC2和β1b亞基多肽中的每種(優(yōu)選地具有分別包含于SEQ ID NO.1、2和3中的氨基酸序列)，或由DNA序列編碼的功能體、嵌合體或突變體或所述每種亞基多肽的片段。本發(fā)明更為優(yōu)選的目的是提供一種表達功能性人類嗅覺CNG通道的哺乳動物細胞系，例如人胚腎細胞(HEK293 cells)，COS細胞，小鼠L細胞，嵌合倉鼠卵巢細胞，非洲綠猿腎細胞，LtK-細胞和BHK細胞。本發(fā)明另一優(yōu)選的目的是用所述細胞系鑒定通過調節(jié)嗅覺CNG通道活性來調節(jié)嗅覺的化合物。本發(fā)明的另一個目的是用所述細胞系定量測定GPCRs和其它調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質的活性。本發(fā)明一個更具體的目的是穩(wěn)定或瞬時表達功能性人類CNG通道的細胞系在如下檢測方法中的應用，所述檢測方法為首先用能夠增高cAMP的因子，如腺苷酸環(huán)化酶活化子毛喉素、磷酸二酯酶抑制劑IBMX，、或膜可透過性環(huán)核苷酸類似物對CNG通道進行刺激，隨后通過例如使用熒光鈣螯合劑或熒光鈉螯合劑測量離子流入細胞從而定量測定CNG通道的活化。本發(fā)明另一個具體的目的是穩(wěn)定或瞬時表達功能性人類CNG通道的細胞系在化合物文庫高通量篩選方法中的應用，所述篩選方法采用自動化熒光檢測設備如，F(xiàn)luorometric Imaging Plate Reader(FLIPR，Molecular Devices)和Voltage Ion Probe Reader(VIPR，Aurora Biosciences)。具體的，本發(fā)明的一個目的是通過采用鈣成像檢測法來檢測化合物對表達功能性人類嗅覺CNG通道的HEK-293所產生的效果從而鑒定調節(jié)氣味感知的化合物。本發(fā)明的另一個具體目的是提供高通量CNG平板檢測方法，其中用細胞可透過性cAMP或cGMP(借助快速光分解進行傳遞)來激活人類CNG通道，且活化的CNG通道用于鑒定調節(jié)氣味感知的化合物。本發(fā)明一個更具體的目的是產生表達功能性人類嗅覺CNG通道的HEK-293、昆蟲細胞或非洲爪蟾卵母細胞。本發(fā)明另一個具體的目的是產生表達大鼠OCNC1、大鼠OCNC2和大鼠β1b基因中至少一個，優(yōu)選為全部三個基因的人類直向同源物的HEK-293或昆蟲細胞或非洲爪蟾卵母細胞。本發(fā)明另一個具體的目的是產生表達對cAMP和cGMP敏感性增強的β1b蛋白質變體的HEK-293或昆蟲細胞或非洲爪蟾卵母細胞。本發(fā)明另一個具體的目的是提供一種挑選調節(jié)氣味感知的化合物的平板檢測方法，包括(i)提供表達功能性人類CNG通道的哺乳動物或昆蟲細胞；(ii)刺激所述細胞以增加細胞內cAMP/cGMP水平，從而激活CNG通道；(iii)比較存在或不存在化合物時的陽離子流以獲得其對CNG活性的調節(jié)效果；和(iv)測試調節(jié)化合物對氣味感知的效果。


圖1.包含三個大鼠嗅覺CNG通道亞基的直向同源物的人類基因組。橫向同源物(paralogs)的成對序列相同性范圍為30-50％，直向同源物為84-90％。該圖顯示與大鼠和人類CNG通道亞基的C-末端環(huán)核苷酸結合域相應的序列。本發(fā)明的人類OCNC1、OCNC2，和β1b嗅覺CNG通道亞基的序列分別為SEQ ID NOs1-3；大鼠CNG通道亞基OCNC1、OCNC2和β1b在數據庫序列中的登錄號分別為NM012928，NM053496和AJ000515(分別為SEQ ID NOs5-7)。
圖2.hOCNC1的序列(SEQ ID NO1)。該cDNA序列對應于包含在克隆基因組間區(qū)HSAF002992的hOCNC1等位基因。
圖3.hOCNC2序列(SEQ ID NO2)。該cDNA序列對應于包含在克隆基因組間區(qū)AC022762的hOCNC2等位基因。
圖4.hβ1b的序列(SEQ ID NO3)。該cDNA代表新的等位基因。
圖5.嗅覺CNG通道活性依賴于亞基的組成。對用不同組合的人類嗅覺CNG通道亞基進行轉染的，并用鈣染料染色的細胞在加入50μM毛喉素后，于6分鐘時檢測到熒光強度增加。活性表示為8個獨立反應的均值±標準誤，并在加入鈣離子導體離子霉素后6分鐘時將其標準化為熒光的增加。OCNC1標為’1’，OCNC2為’2’，而β1b為’B’。
圖6.基于膜電位的針對嗅覺CNG通道活性的熒光檢測法效果很好。對用人類嗅覺CNG通道亞基的不同組合進行轉染，并加載膜電位染料的細胞在加入毛喉素后，于6分鐘時檢測到熒光強度增加?；钚员硎緸?個獨立反應的均值±標準誤，并在加入KCl后6分鐘時將其標準化為熒光的增加。對兩條劑量反應曲線顯示了EC50和Z系數值。OCNC1標為’1’，OCNC2為’2’，而β1b為’B’。
圖7.基于鈣的針對嗅覺CNG通道活性的熒光檢測法的效果很好。對用不同組合的人類嗅覺CNG通道亞基進行轉染的，并用膜電位染料(黑)或鈣染料(灰)染色的細胞在加入毛喉素后，于6分鐘時檢測到熒光強度增加?；钚员硎緸?個獨立反應的均值±標準誤，并在加入KCl或離子霉素后6分鐘時將其標準化為熒光的增加。對四條劑量反應曲線顯示了EC50值。OCNC1標為’1’，OCNC2為’2’，而β1b為’B’。
圖8.人類OCNC1[C458W/E581M]和β1b形成敏化的CNG通道。對用不同組合的人類嗅覺CNG通道亞基進行轉染的，并用膜電位染料染色的細胞在加入毛喉素后，于6分鐘時檢測到熒光強度增加?；钚员硎緸?個獨立反應的均值±標準誤，并在加入KCl后6分鐘時將其標準化為熒光的增加。對兩條劑量反應曲線顯示了EC50值和Z系數值。OCNC1標為’1’，OCNC1[C458W/E581M]為‘1*’，OCNC2為’2’，而β1b為’B’。
圖9.嗅覺受體活性可在異種細胞中與人類嗅覺CNG通道耦聯(lián)。用小鼠嗅覺受體mOREG、OCNC1[C458W/E581M]、OCNC2和β1b轉染HEK-293細胞，用鈣染料染色，并用嗅覺刺激物丁子香酚進行刺激。用熒光顯微鏡檢測反應細胞的數目，并與Gα15和mOREG轉染的反應性HEK-293細胞，mOREG轉染的HEK-293細胞以及OCNC1[C458W/E581M]、OCNC2和β1轉染的HEK-293細胞的反應細胞數進行比較。
圖10.穩(wěn)定表達的人類CNG通道亞基比瞬時表達的轉染亞基對丁子香酚更敏感。在HEK-293中穩(wěn)定或瞬時表達人類CNG亞基hOCNC1、hOCNC2和hβ1b，并用mOREG.瞬時轉染。用多種濃度的丁子香酚刺激該細胞，并使用Fluo-4和熒光顯微鏡檢測鈣離子流。當采用hOCNC1[C458W/E581M]和β1b亞基時獲得了類似的結果(數據未顯示出)。
圖11.穩(wěn)定表達的野生型或強化的人類CNG通道亞基對受體介導的活化作用和腺苷酸環(huán)化酶活化化合物具有反應性。在圖11(a)中，HEK-293細胞穩(wěn)定表達hOCNC1、hOCNC2和β1b，或hOCNC1[C458W/E581M]和β1b，用多種濃度的β2受體配體異丙腎上腺素刺激該細胞，并在FLIPR-1上用Fluo-4檢測鈣離子流。在圖11(b)中，HEK-293細胞穩(wěn)定表達hOCNC1、hOCNC2和β1b，或hOCNC1[C458W/E581M]和β1b，用多種濃度的腺苷酸環(huán)化酶活化子毛喉素刺激該細胞，并在FLIPR-1上用Fluo-4檢測鈣離子流。
發(fā)明詳述 在對本發(fā)明進一步詳細描述以前，先給出如下定義。而其它使用的詞語和術語則與相關領域技術人員所理解的一般含義一致。
定義 “功能性人類嗅覺CNG通道”是指由至少一個人類嗅覺CNG通道亞基、或其變體或片段組成的嗅覺神經元特異的CNG單位。所述CNG亞基包括OCNC1、OCNC2和β1b。功能性通道對細胞外陽離子是可充分透過的，從而在使用膜電位敏感熒光染料或鈣敏感熒光染料的時候，產生細胞內陽離子可檢測的改變。
“人類嗅覺CNG通道亞基”是指選自大鼠OCNC1、大鼠OCNC2和大鼠β1b的大鼠嗅覺多肽的人類直向同源物，或表現(xiàn)為具有與野生型人OCN1、人OCN2和人β1b的序列有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80-90％，更優(yōu)選為至少90-99％序列相同性的DNA。在一個優(yōu)選的實施方案中，人類直向同源物包括如圖1中所示的序列或與其有至少80％，更優(yōu)選為至少90％，更為優(yōu)選的為至少95-99％相同性的其片段或變體。進一步的變體或片段可根據其獨立表達或與其它CNG亞基聯(lián)合表達而構建功能性嗅覺(鈣可透過的)CNG亞基的能力來選取。
此處所用術語“純化的”，“基本上純化的”和“分離的”是指不含其它不相類似化合物的狀態(tài)，這些不相類似的化合物與本發(fā)明化合物在自然狀態(tài)下通常是結合在一起的，因此，以重量計，“純化的”，“基本上純化的”和“分離的”物質占給定樣品質量的至少0.5％，1％，5％，10％或20％，最優(yōu)選地至少50％或75％。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些術語用來指，以重量計，至少占指定樣品95％質量的本發(fā)明化合物。當涉及核酸或蛋白質時，此處所用術語“純化的”，“基本上純化的”和“分離的”的核酸和蛋白質是指不同于哺乳動物體、特別是人體內天然狀態(tài)的一種純化狀態(tài)或濃度。大于哺乳動物特別是人體內天然狀態(tài)的任何程度的純化程度或濃度，包括(1)從其它相聯(lián)系結構或化合物中純化出來的或(2)與哺乳動物體、特別是人體內非正常相聯(lián)系的結構和化合物結合，均屬于“分離的”定義范疇。此處描述的核酸或蛋白質或核酸或蛋白質類可根據本領域技術人員已知的多種方法和過程分離，或與自然狀態(tài)下無關聯(lián)的結構和化合物相聯(lián)合。
術語“擴增”是指如下詳述的為生產或檢測重組體或天然表達的核酸的任何適用的擴增方法學的應用。例如本發(fā)明提供方法和試劑(例如簡并寡核苷酸引物對)，用于體內或體外擴增(例如通過聚合酶鏈反應PCR)本發(fā)明天然表達的(例如基因組或mRNA)或重組(例如cDNA)核酸(例如本發(fā)明味覺結合序列)。
術語“表達載體”是指用來在任何細胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)中體內或體外組成性或誘導表達本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達系統(tǒng)的載體。該術語包括線性或環(huán)狀表達系統(tǒng)。該術語包括游離狀態(tài)或已整合至宿主細胞基因組中的表達系統(tǒng)。該表達系統(tǒng)可具有自我復制或不具有自我復制(即在細胞內引發(fā)短暫表達)的能力。本術語包括僅含有重組核酸轉錄所需的最小元件的重組表達“盒”。
術語“文庫”指一種含有不同核酸或多肽分子的混合制劑，例如重組產生的感覺(特別是嗅覺或味覺)受體配體結合域的文庫(用簡并引物擴增核酸得到)，或分離的含有擴增的感覺物(sensant)結合區(qū)的載體集合，或每個細胞都隨機轉染了至少一個編碼味覺受體的載體的細胞混合物。
術語“核酸”或“核酸序列”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。該術語包括核酸，即含有天然核苷酸的已知類似物的寡核苷酸。該術語還包括有合成主鏈的核酸樣結構，參見下列文獻，例如寡核苷酸及類似物，操作方法，F(xiàn).Eckstein編，Oxford Univ.Press(1991)；反義策略，Annals of the N.Y.Academyof Sciences，Vol.600，Baserga等編(NYAS(1992))；Milligan(1993)J.Med.Chem.361923-1937；反義研究和應用(1993，CRCPress)，WO97/03211；WO96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry368692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev6153-156。
術語“保守性變體”或“類似物(analog)”或“模擬物(mimetic)”是指修飾過氨基酸序列的多肽，這類修飾基本上不影響多肽的(保守性變體的)在此描述的結構和/或活性。這包括氨基酸序列的保守性修飾變異，即替換、增加或缺失對于蛋白質活性無關緊要的氨基酸殘基，或使用相同屬性的殘基進行氨基酸替換(例如酸性、堿性、正電、負電、極性或非極性等)，以至于替換關鍵的氨基酸也基本上不影響結構和/或活性。能夠提供功能相似的氨基酸的保守性替換表在本領域是眾所周知的。
例如一個選擇保守替換的示例性指南包括(原始殘基，其后是示例替換)Ala/Gly或Ser；Arg/Lys；Asn/Gln或His；Asp/Glu；Cys/Ser；Gln/Asn；Gly/Asp；Gly/Ala或Pro；His/Asn或Gln；IIe/Leu或Val；Leu/IIe或val；Lys/Arg或Gln或Glu；Met/Leu或Tyr或Iie；Phe/Met或Leu或Tyr；Ser/Thr；Thr/Ser；Trp/Tyr；Tyr/Trp或Phe；Val/Ile或Leu。另一示例指南使用下列六組，每組包含保守性互相替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天東氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天東酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(I)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；(參見例如Creighton，Proteins，W.H.Freeman，(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag，(1979))。本領域的技術人員會理解上述確定的替換并不是唯一的可能保守性替換。例如由于某種原因，人們可能將所有帶電的氨基酸互為保守性替換體，不管它們是正電還是負電。另外，在編碼序列中的個別替換、缺失或增加從而導致變化、增加或缺失單一氨基酸或小部分氨基酸也同樣被認為是“保守性修飾變異”。
術語“模擬物”和“肽模擬物”指合成的化學化合物，它具有本發(fā)明多肽的基本上同樣結構和/或功能特征，例如轉位結構域、感覺物結合區(qū)或嵌合受體。模擬物既可以是完全由化學合成的非天然氨基酸類似物組成，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。該模擬物同樣可以具有任意量的天然氨基酸保守性替換，只要這種替換也同樣不改變類似物的結構和/或活性即可。對于本發(fā)明中多肽的保守性變體，可利用常規(guī)試驗確定模擬物是否屬于本發(fā)明的范圍，即它的結構和/或活性基本上沒有被改變。多肽模擬組合物可包括任何非天然結構組分的組合，其通常來源于三個結構基團a)非天然酰胺鍵(“肽鍵”)的殘基連接基團；b)非天然殘基替代天然的氨基酸殘基；或c)可誘導二級結構模擬的殘基，即能夠誘導或穩(wěn)定二級結構例如β轉角，γ轉角，β折疊，α螺旋構象等的殘基。當多肽的所有殘基或一些殘基是通過化學手段而非天然肽鍵連接時，該多肽就可以被鑒定為模擬物。單獨的肽模擬物殘基可通過肽鍵、其它化學鍵或耦聯(lián)手段連接，諸如戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰亞胺，N，N’-雙環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)或N，N’-二異丙基碳二酰亞胺(DIC)?？梢猿蔀閭鹘y(tǒng)酰胺鍵(“肽鍵”)的替代物的連接基團包括，例如酮亞甲基(例如-C(＝O)-CH2-替換-C(＝O)-NH-)，氨亞甲基(CH2-NH)，亞乙基，烯烴(CH＝CH)，醚(CH2-O)，硫醚(CH2-S)，四唑(CN4)，噻唑，retroamide，硫代酰胺，或酯(參見，例如Spatola，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，Vol.7，pp267-357，″肽主鏈修飾″，Marcell Dekker，NY(1983))。包含所有或部分非天然殘基替代天然殘基的多肽也可以被鑒定為模擬物；非天然殘基在科學和專利文獻中有詳盡描述。
此處所用“重組(體)”是指合成的或其它體外操作獲得的多核苷酸(例如“重組多核苷酸”)，以及使用重組多核苷酸在細胞或其它生物系統(tǒng)中產生基因產物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白質”)。“重組手段”也包括將來源不同、具有不同編碼區(qū)或結構域或啟動子序列的核酸連接至一個表達盒或載體中用來表達，例如可誘導性或組成性表達融合蛋白質，所述融合蛋白質包含本發(fā)明轉位結構域和使用本發(fā)明的引物擴增的核酸序列。
術語“跨膜域”是指能完全橫穿胞漿膜的多肽結構域。跨膜域的一般二級和三級結構，特別是7-跨膜受體如嗅覺受體的7個跨膜域，是本領域眾所周知的。因此根據已知跨膜域序列，一級結構序列可被設計和預測，如下面詳細描述的。
術語“CNG通道”亞基蛋白質或其片段、或編碼“CNG通道”蛋白質的三個亞基中之一或其片段的核酸是指核酸和多肽、多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源體，其(1)與包含在SEQ IDNO1、2或3中的cDNA所編碼的氨基酸序列具有高于大約80％的氨基酸序列相同性，85％、90％、優(yōu)選的91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，在至少大約25、50、100、200或500或更多氨基酸的區(qū)域上；或(2)特異性與抗體，例如多克隆抗體結合，所述抗體所針對的抗原包含由SEQ ID NO1、2或3所編碼的氨基酸序列或其免疫片段，和其保守性修飾變體；或(3)在嚴謹雜交條件下與反義鏈特異性地雜交，所述反義鏈與編碼人類CNG蛋白質的核酸序列，例如SEQ ID NO1、2或3或其互補體，和其保守性修飾變體相應；或(4)與SEQ ID NO1、2或3或其互補體具有高于大約80％的序列相同性，85％、90％、優(yōu)選的91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列相同性，優(yōu)選地，在至少大約25、50、100、200、500或1000或更多核苷酸的區(qū)域上；或(5)此處所述人類CNG的功能等價物，例如用對陽離子的反應中膜電位染料的可檢測熒光來鑒定的。
功能等價的CNG通道蛋白質包括一級結構與以下那些已鑒定的不同，但具有用功能試驗所確定的等價功能的亞基?！按_定功能性效果”是指檢驗增加或減少間接或直接受CNG通道多肽影響的參數的化合物的效果，例如功能性、物理和化學效果。這些功能性效果包括，但不限于，離子流、膜電位、電流幅度和電壓門控的變化，以及其它生物效應如任何標記基因的基因表達變化等。離子流可包括通過通道的任意離子，如，鈉離子和鋰離子及其類似物如放射性同位素。所述功能性效果可用任何對本領域技術人員來說已知的方法進行檢測，例如通過使用雙電極電生理學或電壓敏感染料、或通過檢測參數如分光鏡特征(例如熒光、吸光率和折光指數)、流體力學(例如形狀)、層析和可溶性特征的變化。
此處使用的CNG通道多核苷酸和多肽序列的“抑制子”、“活化子”和“調節(jié)子”是指利用CNG通道多核苷酸和多肽序列的細胞試驗所鑒定的抑制性、激活性或調節(jié)性分子。抑制子是指例如結合、部分或完全阻斷活性、降低、防止、延遲激活、使之失活、脫敏、或下調CNG通道蛋白質的活性或表達的化合物，如拮抗劑?！盎罨印笔侵冈黾?、打開、激活、促進、增強活化、使增敏、激動、或上調CNG通道蛋白質的活性的化合物。抑制子、活化子和調節(jié)子還包含遺傳上修飾的CNG通道蛋白質，例如改變活性的遺傳上修飾的CNG通道蛋白質，以及天然出現(xiàn)和合成的配體、拮抗劑、激動劑、肽、環(huán)肽、核酸、抗體、反義分子、核酶、有機小分子等。這些抑制子和活化子的試驗包括，例如在細胞、細胞提取物或細胞膜內表達CNG通道蛋白質，應用推定的調節(jié)化合物，然后再確定對上述活性的功能性影響。
包含CNG通道蛋白質的樣品或試驗物經潛在的活化子、抑制子或調節(jié)子處理后，與不用抑制子、活化子或調節(jié)子處理的對照樣品比較以檢驗激活，抑制或調節(jié)的程度 此處使用的術語“試驗化合物”或“試驗候選物”或“調節(jié)子”或其語法等價詞是指用來檢測其調節(jié)CNG通道活性能力的任何分子，可以是天然存在的或合成的，例如蛋白質、寡肽(例如長度為從約5到約25個氨基酸、優(yōu)選的長度為從約10到20或12到18個氨基酸、優(yōu)選的長度為12、15或18個氨基酸)、有機小分子、多糖、脂質(例如鞘脂)、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。試驗化合物可以是試驗化合物文庫的形式，如，組合或隨機文庫，其提供充分的多態(tài)性范圍。試驗化合物可選擇性地連于融合陪伴物(partner)，例如靶向化合物、援救化合物(rescue compounds)、二聚化合物(dimerizationcompounds)、穩(wěn)定化化合物(stabilizing compounds)，可尋址化合物(addressable compounds)和其它功能性部分。具有有用特性的新化學實體可常規(guī)地通過鑒定試驗化合物(稱為“引導化合物(leadcompound)”)生成引導化合物變體和評估這些變體化合物的特性和活性來生成，所述試驗化合物具有某些需要的特性或活性，例如增強活性。優(yōu)選地，高通量篩選(HTS)方法用于所述分析中。
“有機小分子”是指有機分子，可以是天然的也可以是合成的，其分子量大于約50道爾頓，小于約2500道爾頓，優(yōu)選小于約2000道爾頓，優(yōu)選地在約100至約1000道爾頓之間，更優(yōu)選地在約200至約500道爾頓之間。
“生物樣品”包括組織切片如活組織和尸解樣品，和為組織學目的所取的冰凍切片。該樣品包括血液、唾液、組織、培養(yǎng)細胞，例如原代細胞、外植體和轉化細胞、糞便、尿等。生物樣品一般獲自真核生物，最優(yōu)選的為哺乳動物如靈長類動物(例如黑猩猩或人類)、牛、狗、貓、嚙齒目動物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、兔、鳥類、爬行動物或魚。
在關于兩個或更多個核酸或多肽序列的描述中的術語“相同的”或“相同性”百分數是指兩個或更多個序列或子序列，它們是相同的或其相同的氨基酸殘基或核苷酸具有采用BLAST或BLAST 2.0序列比較算法用下述默認參數所進行測量的、或用手工比對和肉眼觀察(參見，例如NCBI網站等)的特定百分數(即當在“比較窗口”或指定區(qū)域上比較和比對最大一致性時，在特定區(qū)域(例如核苷酸序列SEQID NO1、2、或3)上具有約80％相同性，優(yōu)選的85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性)。該序列即被稱為“基本相同的”。這一定義還指，或可被用于試驗序列。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及那些具有替代的序列。如下所述，優(yōu)選的算法能夠考慮間隙等。優(yōu)選地，相同性存在于長度至少為約25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或更優(yōu)選地，存在于長度為50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。
在序列比較中，通常將一條序列作為參考序列，而試驗序列則與其進行比較。當使用序列比較算法時，將試驗和參考序列輸入計算機，必要時指定子序列坐標，并指定序列算法程序參數。優(yōu)選地，使用默認程序參數，或指定替代參數。序列比較算法隨后根據程序參數計算試驗序列相對于參考序列的序列相同性百分比。
此處使用的“比較窗口”指包括任何毗鄰位置數的區(qū)段，該數目選自20-600，通常大約50-200，更通常是大約100-150，其中在兩個序列優(yōu)化比對后，可在該區(qū)段范圍內將序列與相同毗鄰位置數的參考序列比較。比對序列以進行比較的方法在本領域已為眾所周知?？梢酝ㄟ^使用，例如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法、Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法、Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性搜索方法、上述這些算法的計算機化實施方案(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和Wisconsin Genetics軟件包中的TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr，Madison，WI)、或手工比對和肉眼觀察(參見，例如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等，eds.1995增刊))的方法進行比較序列的優(yōu)化比對。
適于確定序列相同性和序列相似性的算法優(yōu)選的實例為BLAST和BLAST 2.0算法，其分別由Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)描述。BLAST和BLAST 2.0采用此處所描述的參數，用以確定本發(fā)明核酸和蛋白質序列相同性百分比。執(zhí)行BLAST分析的軟件可公開地從國家生物工程信息中心得到。該算法包括首先確定查詢序列中W長度的短字來確定高分序列對(HSPs)，當與數據庫中序列的相同長度的字比對時，其或是匹配或是滿足一些陽性閾值分數T。T此處是指鄰近字分數閾值(Altschul等，如前)。這些初始的鄰近字命中值(wordhit)作為種子，以啟動搜索尋找包含它們的更長的HSPs。字命中值沿著序列向兩邊延伸，只要累積比對分數能被增加。對于核苷酸序列，用參數M(一對匹配殘基的獎勵分數；總是＞0)和N(錯配殘基的懲罰分數，總是＜0)來計算累積分數。對于氨基酸序列，使用計分矩陣來計算累計分數。字命中值向每個方向的延伸當出現(xiàn)下列情形即停止累計比對分數從其最大獲得值下降X量；由于一種和多種負分數殘基比對結果導致累計分數變?yōu)?或以下；或達到了序列任一末端。BLAST算法參數W，T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認值為字長(W)為11，預期值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認值為字長為3，預期值(E)為10和BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))中比對(B)為50，預期值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩條鏈的比較。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”此處可交換使用，是指氨基酸殘基多聚物。本術語適用于序列中一種或多種氨基酸殘基是相應天然氨基酸的人工化學類似物的氨基酸多聚物，以及天然氨基酸多聚物和非天然氨基酸多聚物。
術語“氨基酸”是指天然和合成氨基酸，以及與天然氨基酸具有相同功能模式的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸指由遺傳密碼編碼的，以及被修飾的氨基酸例如羥脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然氨基酸相同的基本化學結構的化合物，即，與氫原子結合的α碳原子，羧基基團，氨基基團和R基團，例如同型絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類似物具有修飾的R基團(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但仍保留與天然氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學結構不同的結構的化學化合物，但其功能模式與天然氨基酸相似。
此處的氨基酸可用普遍熟知的三字母代號指代，也可以用IUPAC-IUB生物化學命名委員會所推薦的單字母代號指代。同樣的，核苷酸也可以用普通接受的單字母代碼進行指代。
“保守性修飾的變體”對氨基酸和核酸序列都適用。對于特定核酸序列，保守性修飾變體是指編碼相同和基本相同氨基酸序列的核酸，或當核酸并不編碼氨基酸序列時，是指與它基本相同的序列。由于遺傳密碼子的簡并性，大量功能相同的核酸分子編碼任一給定的蛋白質。例如密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此在每一個由密碼子決定的丙氨酸位置，密碼子可以改變?yōu)槿魏嗡鱿鄳拿艽a子，而不改變所編碼的多肽。這些核酸改變是“沉默變異”，是一種保守性修飾的變異。此處的每一條編碼多肽的核酸序列也包括了該核酸的每一種可能的沉默變異。本領域技術人員可以判斷核酸中的每個密碼子(除了通常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG，和通常情況下是色氨酸的唯一密碼子的TGG之外)都可以被修飾而產生功能完全相同的分子。因此，在涉及表達產物時，編碼多肽的核酸的每一個沉默變異都隱含在每個描述的序列中，但涉及實際的探針序列時，情況不是這樣的。
關于氨基酸序列，本領域技術人員會認識到導致編碼序列中變換、添加或缺失單個氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質序列的單個替換、缺失或添加就是“保守性修飾”，前提是這一變換導致氨基酸替換為化學相似的氨基酸。提供了功能性相似的氨基酸的保守性替換表是本領域熟知的。該保守性修飾變體并不排除本發(fā)明的多態(tài)變體，種間同源體和等位基因。
下列八組中每組包含互相保守性替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7) 絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton，Proteins，(1984))。如前所述，本發(fā)明包括能夠表達ENaC亞基多肽的細胞，所述多肽具有與在適當試驗(如下述全細胞鈉電導試驗)中應用的功能性等價物所公開的序列不同的一級結構。
大分子結構如多肽結構可在多種結構水平進行描述。對這一結構的概述，參見，例如Alberts等，Molecular Biology of the Cell(3rd ed.，(1994))和Cantor及Schimmel，Biophysical ChemistryPart IThe Conformation of Biological Macromolecules(1980)?！耙患壗Y構”是指特定肽的氨基酸序列。“二級結構”是指多肽內局部區(qū)域有序的三維結構。這些結構作為結構域是眾所周知的，例如跨膜域，孔域和胞漿尾域(cytoplasmic tail domains)。結構域是多肽的一部分，其構成多肽的致密單位，其長度一般為15到350個氨基酸。示例性的結構域包括細胞外結構域，跨膜域和胞漿結構域。典型的結構域由較小組織結構如幾段β片層和α螺旋組成?！叭壗Y構”是指多肽單體的完整三維結構?！八募壗Y構”是指由獨立三級單位非共價聯(lián)結所構成的三維結構。各向異性術語作為能量術語也是眾所周知的。
特定的核酸序列還隱含地包含“拼接變體”。同樣的，由核酸編碼的特定蛋白質隱含地包含核酸拼接變體所編碼的任何蛋白質?！捌唇幼凅w”，如名字所示，為選擇性拼接基因的產物。在轉錄后，初始核酸轉錄子可被剪接從而不同的(交替的)核酸拼接產物編碼不同的多肽。產生拼接變體的機制各異，但包含外顯子交替拼接。通過通讀轉錄來自同一核酸的可變多肽也包含在本定義內。拼接作用的任何產物，包括拼接產物的重組體形式，都包括于本定義中。
CNG通道核酸序列還包括單核苷酸多態(tài)性，其編碼CNG通道亞基，所述亞基在用合適試驗如此處所述的熒光試驗檢測時，其是此處所公開的人類CNG通道多肽的功能性等價物。
膜電位染料和電壓敏感染料是指膜去極化中能夠改變熒光特性的分子和分子組合。
“標記”或“可檢測的部分”是可以被光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理手段檢測到的物質。例如有用的標記包括32P、熒光素染料、電子致密試劑、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、地高辛配基或半抗原和蛋白質，該半抗原和蛋白質可以通過例如在肽中整合放射性標記而變得可探測，或者用于檢測與所述肽特異性反應的抗體。
當針對，如細胞、或核酸、蛋白質或載體使用術語“重組(體)”時，是指細胞、核酸、蛋白質或載體通過引入異源核酸或蛋白質、或天然核酸或蛋白質的變換而進行修改了或者指源自于經上述修飾的細胞的細胞。因此，例如，重組細胞表達天然細胞(非重組)中未發(fā)現(xiàn)的基因或表達那些非正常表達的、低表達的或根本不表達的天然基因。本發(fā)明中，其一般指用編碼一個或多個人類CNG通道亞基的核酸序列轉染的細胞。
當針對核酸的部分使用術語“異源性”時，是指該核酸包含兩個或更多在天然狀態(tài)下互相沒有相同的關系的子序列。例如核酸通常是重組產生的，具有兩個或更多來自非相關基因的序列重組在一起形成一個新的功能性核酸分子，例如一個來源的啟動子和另一個來源的編碼區(qū)。同樣，異源蛋白質是指該蛋白包含兩個或多個天然狀態(tài)下不以相同相互關系存在的子序列(例如融合蛋白質)。當針對基因、cDNA、mRNA或蛋白質的細胞表達使用術語“異源性”時，是指該基因、cDNA、mRNA或蛋白質是在該細胞內非正常表達的或表達于細胞原始源以外的其它物種。
短語“嚴謹雜交條件”是指在這樣的條件下，探針僅與通常存在于核酸復合混合物中的靶序列雜交，而不與其它序列雜交。嚴謹條件是序列依賴性的并且在不同的情況下會有所不同。長序列在高溫下才具有雜交特異性。有關核酸雜交更詳盡的指南參見Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“雜交原理和核酸試驗策略的概述”(1993)。通常，在特定的離子強度pH下，選擇的嚴謹條件比特定序列的熱溶解點(Tm)低大約5-10℃。Tm值是指達到平衡后(靶序列過剩，在Tm下，平衡條件下50％的探針雜交)與靶序列互補的探針中有50％與靶序列發(fā)生雜交時的溫度(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)。加入一些破壞穩(wěn)定的試劑如甲酰胺也可以形成嚴謹條件。對于選擇性和特異性的雜交，陽性信號至少是背景值的兩倍，優(yōu)選10倍于背景雜交。示例性嚴謹條件如下50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，42℃溫育，或者5×SSC和1％SDS，65℃溫育，使用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下漂洗。
如果核酸編碼的多肽是基本相同的話，在嚴謹條件下互不雜交的核酸仍是基本上相同的。例如利用遺傳密碼允許下的最大密碼子簡并性產生核酸拷貝時就會發(fā)生這種情況。在這些情況下，核酸通常在中等嚴謹雜交條件下雜交。示例的“中等嚴謹雜交條件”包括在具有40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的緩沖液中，37℃下的雜交，使用1×SSC在45℃下漂洗。陽性雜交至少是背景值的兩倍。本領域的普通技術人員應該很容易認識到其它雜交和漂洗條件可以用來提供相似嚴謹程度的條件。很多文獻中都提供了更多的確定雜交參數的指導，例如Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等。
對PCR來說，約36℃的溫度一般用于低嚴謹性擴增，但退火溫度可根據引物長度在約32℃到48℃之間變化。對高嚴謹性PCR擴增而言，溫度一般為約62℃，但退火溫度的范圍可根據引物長度和特異性選在約50℃到約65℃之間。高和低嚴謹性擴增的一般循環(huán)條件都包括30秒-2分鐘，溫度為90℃-95℃的變性期，持續(xù)30秒-2分鐘的退火期，和大約72℃，1-2分鐘的延伸期。低和高嚴謹性擴增反應的操作流程和指南可從如Innis等，PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)中獲得。
“抗體”是指含有架構區(qū)的來自免疫球蛋白基因的多肽或其能特異性地結合和識別抗原的片段。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被歸類為κ或λ。重鏈被歸類為γ、μ、α、δ或ε，它們因此分別確定了免疫球蛋白的種類，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗體的抗原結合區(qū)在結合的特異性和親和力上是最關鍵的。
特別地，該抗體包含能夠特異性結合此處公開的人類CNG通道亞基多肽的抗體，或能夠與所述CNG通道亞基多肽特異性結合的抗體混合物。
當涉及到蛋白質或肽時，短語與抗體“特異性(或選擇性)結合”或“特異性(或選擇性)與---發(fā)生免疫反應”是指結合反應，其可以在蛋白質和其它生物物質的異源群中確定目的蛋白質的存在。因此，在指定的免疫試驗條件下，指定抗體與特定蛋白質的結合至少是背景值的兩倍和更通常地大于背景值10到100倍。這些條件下與抗體的特異性結合要求針對其對某個特定蛋白質的特異性進行了選擇的抗體。例如針對CNG通道亞基蛋白質或多態(tài)變體、等位基因、直向同源物和保守性修飾變體或拼接變體，或其部分的多克隆抗體可被選用以獲得那些僅與CNG通道亞基蛋白質即OCNC1、OCNC2和β1b發(fā)生特異性免疫反應(所述通道亞基蛋白質具有由包含在SEQ ID NO.1、2和3中的cDNAs所編碼的氨基酸序列)，而不與其它蛋白質發(fā)生免疫反應的抗體。該選擇過程可以通過去除與其它分子有交叉反應的抗體來完成。有很多種免疫試驗形式可以用于選擇特異性地與特定蛋白質發(fā)生免疫反應的抗體。例如固相ELISA免疫試驗一般用來選擇特應性與蛋白質發(fā)生免疫反應的抗體(參見，例如Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual(1988)，其中描述了可用于確定特異性免疫反應的免疫試驗形式和條件)。
本發(fā)明包含分離的核苷酸序列，其編碼人類OCNC1嗅覺CNG通道亞基，其中所述核苷酸序列具有與SEQ ID NO1至少約95％的相同性；分離的核苷酸序列，其編碼人類OCNC2嗅覺CNG通道亞基，其中所述核苷酸序列具有與SEQ ID NO2至少約95％的相同性；和分離的核苷酸序列，其編碼人類β1b嗅覺CNG通道亞基，其中所述核苷酸序列具有與SEQ ID NO3至少約95％的相同性。
更優(yōu)選地，本發(fā)明包含分離的核苷酸序列，其在高嚴謹條件與SEQ ID NO1-3雜交。術語“核苷酸序列”意指包含RNA和DNA二者，其具有任意數目的鏈，例如單鏈和雙鏈。在本發(fā)明說明書和權利要求中涉及DNA、RNA、多肽或蛋白質的定語“分離的”或“純化的”意指所指的DNA、RNA、多肽或蛋白質已從其天然細胞環(huán)境中分離出來，并且可用人工，即重組方法，以此種形式生產。高嚴謹條件為雜交在6×SSC，5×Denhart’s溶液，0.5％SDS，2mM EDTA和1mM焦磷酸鈉及65℃的條件下進行，隨后用0.1×SSC和0.1％SDS在65℃下漂洗。
多肽 本發(fā)明還包括分離的多肽，其由本發(fā)明的核苷酸序列所編碼，所述多肽包含人類嗅覺CNG通道亞基多肽，既可以是個別亞基多肽，也可以是亞基多肽相互之間和與其它蛋白質構成的復合物。本領域技術人員能夠清楚的知道，根據三聯(lián)體密碼方案的簡并性，相同的多肽可由不同的核苷酸序列所編碼。因此，編碼此處所述相同蛋白質的簡并核酸也包含在本發(fā)明范圍內。
多核苷酸和蛋白質變體 本發(fā)明還包含此處所述核苷酸和蛋白質亞基序列的變體和突變體，特別是那些包含了能夠改變由這些亞基所構成的CNG通道活性的突變的序列。SEQ ID NO4中顯示了一個特別優(yōu)選的OCNC1突變體，其中所述序列與SEQ ID NO1是不同的，因為其具有C458W和E581M的突變。
表達序列 本發(fā)明還包含分離的表達序列，其包含此處公開的核苷酸序列，其中CNG通道亞基的編碼序列可操作性地與轉錄和翻譯調節(jié)序列相連。該表達序列可包括天然編碼序列聯(lián)合天然啟動子區(qū)?；蛘?，表達構建物可通過編碼序列可操作性地連于異源啟動子區(qū)(例如為了在特定宿主細胞中表達)來構建。同樣可以預想重組報告構建體，其中編碼序列的部分或全部與編碼可選擇的或可篩選的標記物的報告基因相融合?！氨磉_序列”或構建體可在缺少載體的情況下被轉染至宿主細胞內，且可被整合到宿主細胞的染色體內。
表達載體 本發(fā)明還包括含有此處公開序列的表達載體，和含有該載體的宿主細胞?！氨磉_載體”是指能夠表達其含有的基因序列的載體。但是，本發(fā)明還包括其它含有此處公開序列的載體(和宿主細胞)，其中所述其它載體不是非要“表達”的載體，而是含有編碼序列但不表達多肽的載體，例如作為增殖載體或基因測序的手段。
宿主細胞 本發(fā)明還包括除表達另一CNG通道亞基的表達構建體或載體以外，還含有本發(fā)明中至少一個表達構建體或載體的宿主細胞，其中表達的多肽與所述細胞表面相聯(lián)并構建部分或完整功能性CNG通道。適用于本發(fā)明的宿主細胞包括人胚腎細胞(優(yōu)選HEK-293)，COS細胞，小鼠L細胞，中國倉鼠卵巢細胞，非洲綠猿腎細胞，LtK-細胞和BHK細胞。本領域技術人員應清楚地知道在特定宿主細胞中表達所必需的序列，即，啟動子，上游非翻譯區(qū)，轉錄終止序列，載體增殖序列等，可根據所使用宿主細胞而變化，并可很容易地從現(xiàn)有技術中已知的且可獲得的分子工具中進行選擇。
嗅覺CNG通道試驗 本發(fā)明還包括采用此處公開的核酸，蛋白質，載體和宿主細胞的試驗。所述試驗包括那些用于如下目的的試驗，即為檢測CNG通道活性或與CNG通道活性相關的蛋白質或第二信使的活性變化，亦即為鑒定配體或篩選小分子，所述配體或小分子可用于阻斷或增強嗅覺信號傳導。例如，本發(fā)明包括基于陽離子的試驗，其用于監(jiān)測CNG通道活性的變化，所述試驗包括(1)將編碼和表達至少一個人類嗅覺CNG通道亞基的一個或多個核酸引入宿主細胞，在細胞中所述至少一個CNG通道亞基構建功能性CNG通道；和(2)在存在和不存在不同刺激物的情況下定量測定所述CNG通道的活性變化，其中所述變化借助一個和多個細胞內陽離子水平的變化來測定。如這里所述，功能性CNG通道可通過表達全部三個亞基，或表達ONCN1和ONCN2，或單獨表達ONCN1來構建。在這一意義上，“功能性”是指形成一個通道，細胞外陽離子能夠通過該通道進入細胞，并且由于CNG的激活或抑制而造成的細胞內陽離子水平可被檢測和定量。
在所述試驗中，至少一個功能性人類嗅覺CNG通道亞基優(yōu)選地由選自能夠在高嚴謹條件下與SEQ ID NO1雜交的序列組中的序列所編碼。該亞基可單獨表達或與其它嗅覺CNG通道亞基聯(lián)合表達以構建功能性CNG通道，即由環(huán)核苷酸調節(jié)的陽離子通道。例如OCNC1亞基可與OCNC2和/或β1b亞基(特別是那些由本發(fā)明所述能在高嚴謹條件下分別與SEQ ID NO2和3雜交的核酸所編碼的)一起表達。CNG通道亞基的直向同源物，即來自其它物種的OCNC2和/或β1b亞基，也可以在本發(fā)明的試驗中與人類CNG通道亞基(例如人類OCNC1亞基)一起表達，其中所述亞基聯(lián)合表達可構建CNG通道的功能性嵌合體。
本發(fā)明所述試驗可被用于鑒定能夠調節(jié)嗅覺的嗅覺CNG通道調節(jié)子。在所述試驗中，宿主細胞可首先用能引發(fā)CNG基礎活化水平的因子，如毛喉素(或其它腺苷酸環(huán)化酶活化子)、IBMX(或其它cAMP磷酸二酯酶的抑制子)或cAMP或cGMP的膜可透過性類似物進行刺激。能直接活化嗅覺CNG通道的試劑同樣可被使用，如能生成氧化氮的化合物，其通過S-亞硝化反應激活通道(Broillet，(2000))。隨后通過使用熒光鈣螯合劑如fura-2(Abe等，(1992))、熒光鈉螯合劑如綠色四乙酸鈉鹽(Molecular Probes)和Na+-敏感的染色試劑盒(Molecular Devices)、或膜電位染料如膜電位染色試劑盒(Molecular Devices)和Oxanol-香豆素試劑盒(AuroraBiosciences)來監(jiān)測經處理的細胞中的離子流入從而定量測定嗅覺CNG通道的活化。嗅覺增強的嗅覺CNG通道活化子即可根據其能強化對增高的cAMP的熒光反應的能力而被鑒定出來，而阻斷嗅覺的通道拮抗劑可根據其減弱熒光效應的能力而被鑒定出來。嗅覺CNG通道還可以用作鑒定其它CNG通道調節(jié)子的代用品。
針對GPCRs和其它能調節(jié)cAMP水平的蛋白質的試驗 本發(fā)明還包括針對能調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質的試驗。該試驗包括那些目的在于檢測由于環(huán)核苷酸水平變化所致CNG通道活性變化的試驗。優(yōu)選的，敏化的嗅覺CNG通道(利用亞基變體如OCNC1[C458W/E581M](SEQ ID NO4))可用于增加這些試驗的靈敏度。所述試驗可用于定量測定與G蛋白耦聯(lián)的能夠調節(jié)腺苷酸環(huán)化酶或磷酸二酯酶的GPCRs的活性，并可通過高通量篩選用于鑒定GPCR調節(jié)子。
例如，編碼G-蛋白耦聯(lián)受體的核酸同樣可被引入用于本發(fā)明試驗中的宿主細胞內，如有需要還可加上編碼一個或多個CNG通道亞基的核酸和編碼G蛋白的核酸。適用的G-蛋白耦聯(lián)受體包括，舉幾個例子增味劑受體、味覺受體、犁鼻器(VNO)受體，μ鴉片受體、毒蕈堿性乙酰膽堿受體、腎上腺素能受體、5-羥色胺受體、多巴胺受體、血管緊張素受體、腺苷受體、緩激肽受體、metabotropic excitatoryamino acid receptors。在所述試驗中，刺激物借助隨后環(huán)核苷酸水平對CNG通道活性的效果，可作為G-蛋白耦聯(lián)受體活性潛在調節(jié)子而被篩選。
當G蛋白耦聯(lián)受體也在本發(fā)明試驗細胞中表達時，G-蛋白耦聯(lián)受體優(yōu)選為嗅覺受體。所述細胞可用于篩選能夠導致G蛋白受體活化(從而導致CNG活化)的刺激物，即與增味劑受體相互作用的增味劑配體。試驗同樣可以設計為G蛋白耦聯(lián)受體首先通過暴露于配體而被活化，且所述細胞可用于篩選能夠導致所述受體活化而導致CNG活化作用增強的刺激物(即增味劑增強劑)。所述增強劑可在受體或CNG通道水平上發(fā)揮作用而增強CNG通道的活化。該增強劑同樣可作用于腺苷酸或鳥苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶或其它任何能夠調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質?；蛘撸摷毎捎糜诤Y選能夠降低受體活化或降低借助受體的CNG通道活性活化而導致CNG活化降低的刺激物(即增味劑阻斷劑)。
本發(fā)明還包含此處所述任一試驗的更進一步包含使用對照細胞的變化形式。例如包含表達所需G蛋白耦聯(lián)受體的試驗還進一步包括如下步驟(a)提供能表達所述至少一個CNG通道亞基以構建功能性CNG通道但不表達所述G-蛋白耦聯(lián)受體的第二個宿主細胞；(b)在存在和不存在不同刺激物的情況下，檢測所述第二個宿主細胞中的CNG通道活化的變化量；和(c)將所述第二個宿主中所述CNG通道的活化的所述變化量與表達所述G-蛋白耦聯(lián)受體的所述細胞中所述CNG通道的活化變化量相比較。
鑒定參與感覺信號傳遞的蛋白質的編碼核酸的試驗 如下面更詳細的描述，本發(fā)明還包含鑒定參與感覺反應的蛋白質，特別是與CNG通道發(fā)生和協(xié)作用的蛋白質的編碼核酸的方法。例如來自對特定感覺信號發(fā)生反應的細胞的G蛋白耦聯(lián)受體的編碼核酸可用如下步驟鑒定(1)將編碼和表達至少一個人類嗅覺CNG通道亞基的一個或多個核酸引入宿主細胞，其中所述至少一個CNG通道亞基構建功能性CNG通道；和(2)將從目的細胞中分離的cDNAs或RNAs文庫引入所述哺乳動物或非洲爪蟾宿主細胞內；和(3)將轉染的宿主細胞暴露于已知的感覺配體以鑒定能表達可與配體結合的G蛋白耦聯(lián)受體的宿主細胞。
高通量試驗 本發(fā)明的試驗特別包括高通量篩選試驗。同時對多樣品進行定量化檢測的設備是本領域眾所周知的。例如FluorometricImaging Plate Reader(FLIPR)可從Molecular Devices獲得，其可用于細胞內鈣或鈉、膜電位和pH變化的單波長檢測。設備和讀取器可程序化設置以同時傳遞化合物至微量反應板的全部96孔，并在一秒內對微量反應板的全部96孔成像，因此就可改良為高通量的形式。氬離子激光刺激適用于檢測特定變化的熒光指示劑染料，然后用連接的光學系統(tǒng)檢測發(fā)射光。隨后照相機系統(tǒng)對整個平板成像并在用戶指定的時間間隔內將數據整合。
或者，如Aurora Biosciences的Voltage ion Probe Reader(VIPR)設備可用于對兩個熒光分子間的熒光諧振能量傳遞(fluorescence resonance energy transfer FRET)的雙波長檢測。FRET是兩個電激活狀態(tài)的染料分子間的距離依賴性相互作用，其可被用于研究能夠產生分子鄰近變化的許多生物學現(xiàn)象，包括Na+，K+，Cl-，Ca2+和配體門控離子通道的活性。Aurora Biosciences公司的電壓傳感器探針技術使用了膜結合供體分子和易動的、電壓敏感的受體分子間的FRET以檢測膜電位。VIPR讀取器適用于96-孔和384-孔這二者形式。
本發(fā)明的高通量試驗包括多種形式。例如一個可實施的用來同時檢測或測量在至少兩個或更多獨立腔室中對至少兩種或更多種潛在試驗化合物發(fā)生響應的CNG通道活性的高通量試驗，包括(1)將編碼和表達至少一個人類嗅覺CNG通道亞基的一個或多個核酸引入適用的宿主細胞中，其中所述至少一個CNG通道亞基構建功能性CNG通道，以便在直接或間接激活時，所述通道導致細胞內預先確定離子的濃度改變；(2)將所述宿主細胞轉移至已被分隔開的培養(yǎng)容器中(在轉染前或轉染后)，所述容器有陣列排列的獨立腔室；(3)用足以檢測預先確定離子的濃度改變的離子敏感性熒光指示劑對所述細胞染色；(4)在所述兩個或更多個獨立腔室中加入一種或多種不同的試驗化合物或試驗化合物組合，其中所述試驗化合物具有潛在的直接或間接活化CNG通道的能力；和(5)在至少兩個或更多個所述腔室中通過檢測或測定離子敏感性指示劑發(fā)射的熒光，以檢測對所述CNG通道潛在活化響應的預先確定離子的濃度變化。該試驗可用于同時檢測至少兩種上述樣品，優(yōu)選高通量形式優(yōu)選地包括同時對至少5，更優(yōu)選為10，更優(yōu)選為50，更優(yōu)選為100種和可能甚至幾百或幾千種樣品的篩選。單通量中篩選樣品的數量可以基于所使用的特定平板中的獨立腔室數量，即24、96、384等。
本發(fā)明高通量試驗的一個變化形式中，在所述至少兩個腔室中加入所述試驗化合物的同時，陣列中至少一個獨立腔室可以加入已知的CNG通道活化子。該腔室可作為檢測CNG通道活性的陽性對照。試驗中還可包括含有適當陰性對照的腔室?？捎糜陉栃詫φ盏腃NG通道已知活化子包括毛喉素，IBMX，cAMP和cGMP的可透過性類似物和氧化氮(NO)-生成化合物(如S-亞硝基半胱氨酸-SNC)。
任何適用于高通量試驗的細胞都可用于本發(fā)明的試驗中。特別優(yōu)選單層生長的細胞，因為這種細胞在用于熒光板讀取器時可產生更加一致的結果。適用的細胞包括人胚腎細胞(HEK293細胞)，COS細胞，小鼠L細胞，中國倉鼠卵巢細胞，非洲綠猿腎細胞，LtK-細胞和BHK細胞。
分離和表達CNG通道亞基 本發(fā)明嗅覺CNG通道亞基或其片段或變體的分離和表達可用下述方法實施?；趫D1所包含的序列，PCR引物可用于擴增嗅覺CNG通道亞基的編碼核酸，這些核酸的文庫從而得以產生。然后可以使用表達載體文庫感染或轉染宿主細胞以功能性表達這些文庫。這些基因和載體可在體外或體內制備和表達。本領域技術人員應認識到，通過調節(jié)本發(fā)明載體內基因和核酸(例如啟動子、增強子等)的表達或活性，可以得到改變和控制核酸表達的理想表型?？梢允褂帽幻枋鰹榭捎糜谠黾踊蚪档捅磉_或活性的任何已知方法。本發(fā)明可與本領域任何已知方法或方案結合實施，所述方法或方案在科學和專利文獻中有詳盡描述。
本發(fā)明的核酸序列和其它用于實施本發(fā)明的核酸，不論是RNA、cDNA、基因組DNA、載體、病毒或是其雜交體，都可以通過基因工程、擴增和/或重組表達的方法從多種來源分離獲得?？墒褂萌魏沃亟M表達系統(tǒng)，除了哺乳動物細胞之外還包括，例如細菌、酵母、昆蟲或植物系統(tǒng)。
或者，這些核酸可用已知的化學合成方法體外合成，例如下面所記載的方法Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444(1997)；Frenkel，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.19373-380(1995)；Blommers，Biochemistry 337886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.6890(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.221859(1981)；U.S.Patent No.4,458,066。隨后，或者通過合成互補鏈，并在合適條件下退火使鏈結合，或通過使用DNA聚合酶及合適的引物序列來加入互補鏈的方法可以獲得雙鏈DNA片段。
核酸操作技術，如在序列中生成突變，亞克隆，探針標記，測序，雜交等技術均詳細記載于科學和專利文獻中。參見，例如Sambrook，ed，Molecular Cloninga Laboratory manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc，New York(1997)；Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
核酸、載體、衣殼、多肽等可采用本領域技術人員眾所周知的任一種方法來分析和定量。這些方法包括，例如分析生物化學方法，如，NMR，分光光度測定法，放射成像法，電泳，毛細管電泳，高效液相色譜(HPLC)，薄層層析(TLC)和超擴散層析(hyperdiffusionchromatography)；多種免疫方法，例如流體或凝膠沉淀素反應，免疫擴散，免疫電泳，放射免疫試驗(RIA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，免疫螢光試驗，Southern分析，Northern分析，點印跡分析法，凝膠電泳(例如SDS-PAGE)，RT-PCR，定量PCR，其它核酸或靶物質或信號放大方法，放射性標記，閃爍計數和親和層析。
寡核苷酸引物用于擴增編碼嗅覺CNG通道亞基的核酸。此處描述的核酸同樣可用擴增技術進行克隆或定量測量。使用示例性的簡并引物對序列，本領域普通技術人員可選擇和設計適用的寡核苷酸擴增引物。擴增方法在本領域中是熟知的，包括，例如聚合酶鏈反應，PCR(PCR Protocols，a Guide to Methods and Applications，ed.Innis.Academic Press，NY，(1990)和PCR Strategies，ed.Innis，Academic Press，NY，(1995))，連接酶鏈反應(LCR)(參見，例如Wu，Genomics 4560，(1989)；Landegren，Science 2411077，(1988)；Barringer，Gene 89117，(1990))；轉錄擴增(參見，例如Kwoh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173，(1989))；和，自我維持序列復制(參見，例如Guatelli，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874，(1990))；Q-β復制酶擴增(參見，例如Smith，J.Clin.Microbiol.351477，(1997))；自動化Q-β復制酶擴增試驗(參見，例如Burg，Mol.Cell.Probes 10257，(1996))和其它RNA聚合酶介導的技術(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；同樣參見Berger，Methods Enzymol.152307，(1987)；Sambrook；Ausubel；U.S.專利Nos.4,683,195和4,683,202；Sooknanan，Biotechnology 13563，(1995)。
一經擴增，即根據本領域已知的方法，使用常規(guī)分子生物學方法將核酸單獨或以文庫形式按照所需克隆到任意一個載體上；體外擴增核酸的克隆方法已被描述于，例如U.S.專利No.5,426,039中。為協(xié)助擴增序列的克隆，可將限制性酶切位點“置于PCR引物對中。
設計簡并引物對的范例是本領域眾所周知的。例如可由http//blocks.fhcrc.org/codehop.html處獲得COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer CODEHOP)策略計算機程序，該程序可直接連接到BlockMaker多序列比對位點進行雜合引物預測，其由一組相關蛋白質序列開始。(參見，例如Rose，Nucl.Acids Res.261628，(1998)；Singh，Biotechniques 24318，(1998))。
合成寡核苷酸引物對的方法是本領域眾所周知的。可以使用“天然”堿基對或合成堿基對。例如，使用人工核苷酸堿基能提供操作引物序列、產生更加復雜的擴增產物混合物的多樣途徑。人工核苷酸堿基多種家族通過內部鍵旋轉，能夠采取多種氫鍵取向，從而提供簡并分子識別的手段。這些類似物摻入PCR引物的單一位點將導致擴增引物復雜文庫的產生。參見，例如Hoops，Nucleic Acids Res.254866，(1997)。非極性分子同樣可用來模仿天然堿基的形狀。腺嘌呤的非氫鍵結合形狀模擬物可以對胸腺嘧啶非極性形狀模擬物有效的和選擇性的復制(參見，例如Morales，Nat.Struct.Biol.5950，(1998))。例如兩個簡并堿基可以是嘧啶堿基6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c][1，2]嗪-7-酮或嘌呤堿基N6-甲氧基-2，6二氨基嘌呤(參見，例如Hill，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 954258，(1998))。本發(fā)明簡并引物的范例摻入了核苷酸類似物5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2’-脫氧-胞嘧啶和3’-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(參加上述，序列中的術語“P”)。這種嘧啶類似物與嘌呤，包括A和G殘基形成氫鍵。
編碼嗅覺CNG通道亞基的核酸通過使用簡并引物對擴增(例如PCR)適當核酸序列而生成。擴增的核酸可以是來自任何細胞或組織的基因組DNA或來自表達嗅覺受體的細胞，例如嗅覺神經元或嗅上皮的mRNA或cDNA 從嗅覺細胞中分離DNAs的方法是本領域眾所周知的，如上所述(組成型表達或誘導性表達人類嗅覺CNG通道的細胞可以用于篩選能阻斷或調節(jié)嗅覺感受的化合物)。例如，可用嗅覺標記蛋白(OMP)鑒定細胞，嗅覺標記蛋白是一種豐富的胞漿內蛋白質，其幾乎只在成熟的嗅覺感覺神經元內表達(參見，例如Buiakova，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939858，(1996)).Shirley，Eur.J.Biochem.32485，(1983)記載了適用于體外嗅覺機制生物化學研究的大鼠嗅覺制劑。成年大鼠嗅覺受體神經元的培養(yǎng)物則記載于Vargas，Chem.Senses 24211，(1999)中。同樣，U.S.專利No.5,869,266中公開了培養(yǎng)人類嗅覺神經元用作神經毒性試驗和篩選。Murrell，J.Neurosci.198260，(1999)則公開了對增味劑響應的培養(yǎng)基中分化的表達嗅覺受體的細胞，其通過鈣流入來進行檢測。
包含編碼人類CNG通道亞基序列的雜合蛋白質的編碼序列同樣可與轉位序列相融合。這些核酸序列同樣可以被操作性的連接至轉錄或翻譯控制元件中，例如轉錄和翻譯起始序列、啟動子和增強子、轉錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列和其它對DNA轉錄成RNA有用的序列等。在重組表達盒、載體和轉基因生物構建過程中，可以利用啟動子片段指導在所有組織中表達目的核酸。嗅覺細胞特異的轉錄元件同樣可用于表達融合多肽受體，包括例如M4嗅覺受體編碼區(qū)上游的6.7kb的區(qū)域。該區(qū)域足以指導野生型區(qū)域限制的嗅上皮中的表達以及內源性嗅覺受體的神經元內表達(Qasba，J.ONeurosci.18227，(1998))。受體基因在感覺上皮的整個區(qū)域性限制區(qū)域內的小亞群神經元中正常表達。轉錄和翻譯控制元件可從天然來源分離，從諸如ATCC或GenBank文庫的來源獲得，或通過合成或重組方法制備。
融合蛋白，具有C-末端或，更優(yōu)選的，N-末端的轉位序列，同樣可包含此處所述的轉位基元(motif)。但是，這些融合蛋白還可包含額外的元件，如用于蛋白檢測、純化或其它用途。促進檢測和純化的結構域包括，如金屬螯合肽如聚組氨酸列串、或組氨酸-色氨酸組件或其它允許在固定金屬上純化的結構域等；麥芽糖結合蛋白；可以在固定的免疫球蛋白上進行純化的蛋白A結構域；或FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)中使用的結構域(Immunex Corp，Seattle WA)。
在轉位結構域(為了有效的胞漿膜表達)和新翻譯多肽的其余部分之間，包含一個可裂解連接物序列如Xa因子(參見，例如Ottavi，Biochimie 80289，(1998))、枯草桿菌蛋白酶識別基元(參見，例如Polyak，Protein Eng.10615，(1997))、腸激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等，對促進純化可能有利。例如，一個構建體可以包括一條編碼多肽(與6個組氨酸殘基連接，后跟一個硫氧還蛋白、腸激酶裂解位點(參見，例如Williams，Biochemistry 341787，1995)和一個氨基末端轉位結構域)的核酸序列。組氨酸殘基可促進檢測和純化，而腸激酶裂解位點提供了從剩余融合蛋白中純化目的蛋白的手段。有關編碼融合蛋白的載體技術和融合蛋白應用的技術在科學和專利文獻中已有詳盡描述，參見，例如Kroll，DNA Cell.Biol.12441，(1993)。
包含嗅覺結合結構域編碼序列的表達載體，不管是單獨表達載體形式還是其文庫形式，都可以引入細胞的基因組或胞漿或細胞核，并通過科學和專利文獻中詳盡描述的多種常規(guī)方法表達所述載體。參見，例如Roberts，Nature 328731，(1987)；Berger，如前；Schneider，Protein Expr.Purif.643510，(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。生物試劑和試驗器材廠家提供的產品信息也會提供有關生物學方法的信息。載體可從天然來源分離，從諸如ATCC或GenBank文庫的來源獲得，或通過合成或重組方法制備。
核酸可在細胞內穩(wěn)定或瞬時表達(例如游離型表達系統(tǒng))的表達盒、載體或病毒中表達。選擇標記物可以整合到表達盒和載體中，從而賦予轉化細胞和序列以可選擇的表型。例如，選擇標記物可以編碼游離型維持和復制，所以就不必整合至宿主基因組中了。例如，標記物可編碼抗生素抗性(氯霉素、卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素)或除草劑抗性(例如chlorosulfuron或Basta)，以選擇轉化了目的DNA序列的細胞(參見，例如Blondelet-Rouault，Gene 190315，(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281992，(1997))。由于賦予對如新霉素或潮霉素這樣的底物抗性的可選擇性標志基因僅能用于組織培養(yǎng)，故化學抗性基因同樣可用作體內和體外的選擇性標記物。
本發(fā)明不但包括DNA和具有特定氨基酸序列的蛋白質，還同樣包括DNA片段，特別是，例如40、60、80、100、150、200或250個核苷酸、或更多核苷酸的片段，以及例如10、20、30、50、70、100或150個氨基酸或更多氨基酸的蛋白質片段。
本發(fā)明還包括嵌合蛋白質，其包含此處公開的至少一種感覺受體人類CNG通道亞基中的至少10、20、30、50、70、100或150個氨基酸或更多的序列，和任選的其它多肽，例如另一受體亞基或報告多肽。嵌合受體在本領域眾所周知，制備嵌合受體的技術和不同受體的結構域和片段的選擇及界定也是本領域眾所周知的。因此，本領域技術人員的知識可以很容易的用于這種嵌合受體的制備。使用這種嵌合受體可以提供例如一種在此特別描述的受體的嗅覺選擇性特征，并與另一受體的信號傳導特征相耦聯(lián)，如現(xiàn)有技術實驗系統(tǒng)中使用的一種已知的受體。
此處公開的與人類嗅覺CNG亞基基本上相同的多態(tài)變體、等位基因、和種間同源體可以使用根據圖1中包含的序列所構建的核酸探針進行分離?；蛘?，通過檢測能與感覺受體來源的多肽產生的抗血清或純化抗體發(fā)生免疫反應的表達同源物(該抗血源或純化抗體同樣可以識別和選擇性結合到感覺受體同源物上)，表達文庫可用于分離感覺受體和其多態(tài)變體、等位基因和種間同源體。
表達本發(fā)明的人類CNG通道亞基片段，或變體的宿主細胞也處在本發(fā)明范圍之內。為了獲得克隆的基因或核酸，例如編碼CNG亞基片段或其變體的cDNAs的高水平表達，通常將目的核酸序列亞克隆至含有指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子(若對于編碼蛋白質的核酸分子來說，還含有翻譯起始的核糖體結合位點)的表達載體中。適用的原核和真核表達系統(tǒng)是本領域眾所周知的，并記載于如Sambrook等中。
可以使用任何已知的將外源核苷酸序列引入宿主細胞的方法。這些方法包括使用磷酸鈣轉染、polybrene、原生質體融合、電穿孔、脂質體、微注射、質粒載體、病毒載體和其它任何已知的將克隆基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質引入宿主細胞的方法(參見，例如Sambrook等)。唯一必要的是，特定遺傳工程方法能夠成功地將至少一條核酸分子引入到能表達目的嗅覺受體、片段或變體的宿主細胞中。
將表達載體引入到細胞中后，被轉染的細胞在適合目的受體、片段或變體表達的條件下培養(yǎng)，然后使用標準技術從培養(yǎng)物中回收目的受體、片段或其變體。此類技術的實例是本領域眾所周知的，參見，例如WO 00/06593，此處將其以與本公開內容具有一致性的方式引用。
感覺受體多肽的免疫檢測 除了使用核酸雜交技術檢測人類嗅覺CNG亞基基因和基因表達以外，同樣可以使用免疫試驗檢測感覺受體，例如鑒定嗅覺受體細胞以及感覺受體家族成員的變體。免疫試驗可用以定性或定量分析感覺受體。此技術應用的總體概述參見Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual(1988)。
針對人CNG嗅覺亞基的抗體 產生可以與人類嗅覺CNG亞基家族成員特異性反應的單克隆抗體和多克隆抗體的方法是本領域技術人員已知的(參見，例如Coligan，Current Protocols in Immunology，1991；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，2d ed.，1986；Harlow和Lane，如前；以及Kohler和Milstein，Nature，256495，1975)。此類技術包括通過從噬菌體或類似載體的重組抗體文庫中選擇抗體來制備相應抗體，以及通過免疫家兔或小鼠來制備單克隆抗體和多克隆抗體(參見，例如Huse等，Science，2461275，1989；Ward等，Nature，341544，1989)。
許多免疫原可用于產生與特定嗅覺CNG亞基家族成員特異性反應的抗體。例如重組CNG通道亞基蛋白質，或其抗原性片段，可用此處描述的方法分離。重組蛋白可用上面描述的方法在真核或原核細胞中表達，和使用本領域已知的方法純化。重組蛋白質是優(yōu)選的用于產生單克隆或多克隆抗體的免疫原?；蛘撸瑥拇颂幑_的序列衍生的合成肽，與載體蛋白質綴合后可用作免疫原。天然產生的蛋白質可以純凈的或非純凈的形式使用。產物然后被注射進能夠產生抗體的動物。可得到單克隆或多克隆抗體，用于后續(xù)測量蛋白質的免疫試驗。
產生多克隆抗體的方法為本領域技術人員眾所周知。使用佐劑(例如弗氏佐劑)和周期性強化的標準免疫程序，小鼠、倉鼠、大鼠、豚鼠、家兔、山羊或雞可被蛋白質免疫。然后可以通過采血和確定與感覺受體反應滴度來監(jiān)測動物對免疫原制備物的免疫反應。當獲得合適的針對免疫原的抗體高滴度后，可采集動物血液并制備抗血清。如有需要，可以通過抗血清進一步分級分離來富集與所述蛋白質反應的抗體(參見Harlow和Lane，如前)。
可通過本領域技術人員熟知的各種技術得到單克隆抗體。簡單地講，通常通過與骨髓瘤細胞融合，使目的抗原免疫的動物脾細胞永生化(參見Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol，6511，1976)。永生化的另一個方法包括使用E-B病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、反轉錄病毒、或本領域已知的其它方法。對由單個永生化細胞形成的克隆篩選，選出能夠產生針對抗原具有所需特異性和親和性的抗體的克隆。通過多種技術可以提高這些細胞產生單克隆抗體的產量，包括注射到脊椎動物宿主的腹膜腔內。或者，按照Huse等，Science，2461275，(1989)所概述的一般方法，通過篩選人B細胞的DNA文庫，可以分離編碼單克隆抗體或其結合片段的DNA序列。
通常收集單克隆抗體或多克隆血清并在免疫試驗中用免疫原滴定，例如固相免疫試驗，其中免疫原固定在固相支持物上。通常，選擇具有104或更高滴度的多克隆抗血清，并使用競爭結合免疫試驗，測試它們與非感覺受體蛋白質、或甚至其它感覺受體家族成員、或其它生物體的其它相關蛋白質的交叉反應。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體一般結合的Kd會至少大約0.1mM，更經常地至少大約1pM，可選地至少大約0.1pM或更好，并且可選地0.01pM或更好。
一旦得到人類CNG亞基特異性抗體，各嗅覺CNG通道亞基蛋白質可用一系列免疫試驗方法來檢測。有關免疫學和免疫試驗程序的綜述，參見Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr eds.，7th ed.，1991)。而且，本發(fā)明的免疫試驗可以由幾種形式來完成，這些形式在Enzyme Immunoassay(Maggio，ed.，1980)以及Harlow和Lane，(如前)中詳述。
免疫學結合試驗 CNG通道亞基蛋白質可用任何一個已知的免疫學結合試驗檢測和/或定量(參見，例如U.S.專利Nos.4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。對于一般性免疫試驗的綜述，參見細胞生物學方法細胞生物學中的抗體(Methods in Cell BiologyAntibodies in Cell Biology，volume 37，Asai，ed.1993)；Basicand Clinical Immunology(Stites & Terr，eds，7th ed，1991)。免疫學結合試驗(或免疫試驗)通常使用能夠特異性與所選蛋白質或抗原(本專利申請中是感覺受體家族成員或其抗原性子序列)結合的抗體?？贵w(例如抗感覺受體)可以使用本領域技術人員已知的多種手段和如上所述的各種方法產生。
免疫試驗也經常使用標記物，其可特異性地結合和標記抗原抗體復合物。標記物本身可能是包含抗體/抗原復合物的一個部分。因此，標記物可以是標記的感覺受體多肽或標記的抗感覺受體抗體?；蛘撸瑯擞浳锟梢允且粋€第三部分，如第二抗體，其能夠特異性地結合抗體/感覺受體復合物(第二抗體通常特異性結合產生第一抗體的物種的抗體)。其它能夠特異結合免疫球蛋白質恒定區(qū)的蛋白質，如蛋白質A或蛋白質G同樣可用作標記物。這些蛋白質表現(xiàn)出與許多物種的免疫球蛋白恒定區(qū)強烈的非免疫原性反應活性(參見，例如Kronval等，J.Immunol，1111401，1973；Akerstrom等，J.Immunol，1352589，1985)。可用可檢測部分修飾標記物，如生物素，其可與另外的分子特異結合，如鏈霉親和素。多種可檢測部分為本領域技術人員所熟知。
貫穿整個試驗，每結合一個試劑都需要孵育和/或漂洗步驟。孵育步驟從5秒鐘到幾個小時，可選地從大約5分鐘到大約24小時。但是孵育時間將取決于試驗形式、抗原、溶液體積、濃度等。一般情況下試驗在環(huán)境溫度下進行，盡管它們可以在一個溫度范圍內進行，如10℃到40℃。
非競爭試驗形式 檢測樣品中蛋白質的免疫試驗既可以是競爭性的也可以是非競爭性的。非競爭性免疫試驗直接測定抗原量。例如在一個優(yōu)選的“夾心(sandwich)”試驗中，抗感覺受體抗體可直接結合在其固定的固相基質上。這些固定化抗體然后可捕獲試驗樣品中的任何CNG通道亞基蛋白質。嗅覺通道亞基蛋白質因此被固定，然后結合標記物，例如帶有標記的第二抗嗅覺通道亞基抗體?；蛘撸摰诙贵w可能沒有標記，但是它可以結合標記了的第三抗體，該第三抗體對產生第二抗體的物種的抗體具有特異性。該第二抗體或第三抗體通常用可檢測部分修飾，例如生物素，其可和另外的分子特異性結合，如鏈霉親和素，以提供可檢測部分。
競爭性試驗形式 在競爭性試驗中，通過測量用樣品中存在的未知的CNG通道亞基蛋白質從抗CNG通道亞基抗體中去除(競爭去除)已知的外加的(外源的)感覺受體蛋白質的量，間接測量樣品中存在的CNG通道亞基蛋白質。在一個競爭性試驗中，將已知量的CNG通道亞基蛋白質加入到樣品中，樣品然后與能特異結合蛋白質亞基的抗體接觸。與抗體結合的外源通道亞基蛋白質的量與樣品中通道亞基蛋白質的濃度成反比。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，抗體被固定在一個固相基質上。與抗體結合的蛋白質的量可以通過測量亞基/抗體復合物中的蛋白質的量，或通過測量剩余未形成復合物的蛋白質的量來確定。通過提供標記的感覺受體分子可以檢測蛋白質的量。
半抗原抑制試驗是另一種優(yōu)選的競爭性試驗。在這個試驗中已知通道亞基蛋白質固定在固相基質上。將已知量的抗感覺受體抗體加入樣品中，樣品然后與固定的感覺受體接觸。抗CNG通道亞基抗體結合到已知的固定化CNG亞基蛋白質的量與樣品中存在的CNG通道亞基蛋白質的量成反比。同樣，固定化抗體的量可以通過檢測抗體固定化部分或溶液中剩余抗體部分來檢測?？贵w被標記時可直接檢測，或隨后加入一個如上所述的特異結合抗體的標記部分進行間接檢測。
交叉反應測定 競爭結合形式的免疫試驗也可用來測定交叉反應。例如由在此公開的核酸序列至少部分編碼的蛋白質可以固定在固相支持物上。蛋白質(例如CNG亞基蛋白質和其同源物)加入到試驗體系中，與固定的抗原競爭結合抗血清。將加入蛋白質的與固定蛋白質競爭結合抗血清的競爭能力，與在此公開的核酸序列編碼的CNG通道亞基多肽與自己競爭的能力相比較。使用標準計算法計算上述蛋白質的交叉反應百分比。與每一個上述加入蛋白質交叉反應小于10％的抗血清被選擇出來并富集。通過加入特定蛋白質，例如遠源同源物進行免疫吸收，交叉反應抗體可任選地從富集抗血清中去除。另外，含有可用于鑒定感覺受體家族成員并代表保守序列的氨基酸序列的肽，可用于測定交叉反應性。
免疫吸收的和富集的抗血清然后用于進行如上述的競爭結合免疫試驗，以比較第二蛋白質(該蛋白質被認為可能是嗅覺CNG通道亞基家族成員的等位基因或多態(tài)變體)和免疫原蛋白質(即由在此公開的核酸序列編碼的CNG通道亞基蛋白質)。為了實現(xiàn)這個比較，該兩種蛋白質都要在一個寬范圍濃度內進行試驗，并確定抑制抗血清與固定的蛋白質50％結合需要的每一種蛋白質的量。如果抑制50％結合需要的第二蛋白質量小于在此公開的核酸序列所編碼的蛋白質抑制50％結合需要量的10倍，那么該第二蛋白質就被認為能夠特異性地結合由感覺受體免疫原產生地多克隆抗體。
其它試驗形式 Western印跡(免疫印跡)分析可用于檢測和定量樣品中存在的嗅覺CNG通道亞基蛋白質。該技術一般包括通過基于分子量的凝膠電泳分離樣品蛋白質、將分離開的蛋白質轉移到合適的固相支持物上(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜或衍生尼龍膜)、將樣品與特異結合感覺受體蛋白質的抗體孵育?？笴NG通道亞基多肽抗體然后特異性地與固相支持物上地CNG通道亞基多肽結合。這些抗體可能直接被標記，或隨后通過使用特異結合抗CNG通道亞基的標記抗體而被檢測(例如標記的綿羊抗小鼠抗體) 其它的試驗形式包括脂質體免疫試驗(LIA)，其利用設計成結合特定分子(如抗體)，并釋放出封裝好的試劑或標志物的脂質體。釋放出的試劑然后可利用標準技術檢測(參見Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev，534，1986)。
非特異結合的降低 本領域技術人員應當領會，免疫試驗中經常希望降低非特異性的結合。特別是當試驗涉及固定在固相基質上的抗原或抗體時，希望降低非特異結合固相基質的量。降低非特異結合的手段為本領域眾所周知。一般來講，該技術涉及使用蛋白質性質的組合物來包被基質。特別是象牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、明膠這樣的組合物被廣泛應用，最優(yōu)選的方案是使用奶粉。
標記物 試驗中使用的特定標記物或可檢測基團不是本發(fā)明的關鍵因素，只要它不顯著影響試驗中抗體的特異性結合即可?？蓹z測基團可以是任何具有可檢測的物理或化學性質的物質。這類可檢測標記在免疫試驗領域發(fā)展完善，并且在通常情況下，這些方法中有用的大多數標記物都可以應用于本發(fā)明，因此，標記物是指任何能用光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學的、光學的或化學的手段檢測到的組分。本發(fā)明有用的標記物包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅(Texasred)羅丹明等)、放射標記物(如3H、125I、35S、14C、33P或32P)、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、和顯色標記物如膠體金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯烯、聚丙烯、乳膠等)。
按照本領域已知的方法，標記物可以直接或間接耦聯(lián)至試驗中目的組分上。如上所述，根據所需要的靈敏度、與化合物綴合的難易度、所需穩(wěn)定性、現(xiàn)有儀器、和廢物處理規(guī)定，可以使用各種各樣的標記物。
非放射標記物通常使用間接法標記。一般來講，配基分子(如生物素)共價結合至分子上。該配基然后結合另外一個分子(如鏈霉親和素)，該分子本身可被檢測到或共價連接至一個信號系統(tǒng)如可檢測酶、熒光化合物、或化學發(fā)光化合物上。配基和它們的靶標可以與識別感覺受體蛋白質的抗體、或識別抗感覺受體的二抗以任意適合的組合使用。
分子也可以直接綴合至信號產生化合物上，例如與酶或熒光團綴合。作為標記物的目的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化酶、特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、傘形酮等?；瘜W發(fā)光化合物包括螢光素(luciferin)，和2，3-二氫二氮雜萘二酮類(dihydrophthalazinediones)，例如魯米諾(luminol)?？赡苁褂玫亩喾N標記或信號發(fā)生系統(tǒng)參見U.S.專利No.4,391,904的綜述。檢測標記物的方法本領域眾所周知。因此，例如當標記物是放射標記物時，檢測手段包括閃爍計數器或感光膜放射自顯影。當標記物是熒光標記物時，可以通過合適波長的光激發(fā)熒光團并檢測產生的熒光來探測。熒光可以肉眼觀察，通過感光膜，或通過電子檢測器如電荷耦聯(lián)裝置(CCDs)或光電倍增器等檢測。類似地，在提供酶的合適底物后，可以通過檢測反應產物來檢測酶標記物。最后，簡單的顯色標記物可以通過簡單觀察與標記物相關的顏色來檢測。因此，在一系列試紙條(dipstick)試驗中，綴合的金通常顯示粉紅色，而各種綴合的小珠顯示各自小珠本身的顏色。
一些試驗形式不需要使用標記的組分。例如凝集試驗可用于檢測靶抗體存在與否。在該試驗中，抗原包被顆粒與包含靶抗體的樣品發(fā)生凝集。在該形式中，組分均無需標記，通過肉眼簡單觀測就能判定靶抗體的有無。
熒光偏振試驗 在另一實施方案中，基于熒光偏振(“FP”)的試驗可用于檢測和監(jiān)測配體結合。熒光偏振試驗是測量平衡結合、核酸雜交、和酶活性的實驗室通用技術。熒光偏振試驗是均一性的，因為它不需要分離步驟如離心、過濾、層析、沉淀或電泳等。這些試驗在溶液中直接實時進行，不需要一個固定化階段。偏振值可重復測量，在加入試劑后測量速度非?？?，所以不會破壞樣品。一般情況下，本技術可用于測量低至皮摩爾(picomolar)到微摩爾(micromolar)水平熒光基團(fluorophores)的偏振值。本節(jié)描述了怎樣簡單定量地用熒光偏振測量本發(fā)明增味劑與受體的結合。
當熒光標記分子被平面偏振光激發(fā)，就發(fā)出具有一定偏振程度的光，偏振程度與其分子旋轉成反比。大的熒光標記分子在激發(fā)態(tài)(對于熒光素來說為4納秒)保持相對穩(wěn)定，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振保持相對恒定。小的熒光標記分子在激發(fā)態(tài)快速旋轉，在激發(fā)和發(fā)射之間的光的偏振變化顯著。因此，小分子偏振值較低而大分子偏振值較高。例如一個熒光素標記的單鏈寡核苷酸具有相對較低的偏振值，但當它與互補鏈雜交后就具有較高的偏振值。當使用FP來檢測和監(jiān)測可能激活或抑制本發(fā)明感覺受體的增味劑結合作用時，可以使用熒光標記的味覺元或自發(fā)熒光味覺元。
1.熒光偏振(P)被定義為 其中II是與激發(fā)光平面平行的發(fā)射光強度，Int⊥是與激發(fā)光平面垂直的發(fā)射光強度。P，作為一個光強度的比值，是一個無量綱數字。例如Beacon和Beacon 2000TM系統(tǒng)可以與這些試驗結合使用。這類系統(tǒng)通常用毫偏振單位(millipolarization unit)來表達偏振值(1偏振單位＝1000mP單位)。
分子旋轉和尺寸之間的關系由Perrin方程式描述，JolleyJ.Anal.Toxicol.5，236，(1981)中給出了關于這一方程式的詳盡的解釋。概括地講，Perrin方程式認為偏振與旋轉弛豫(rotationalrelaxation)時間直接成正比關系，該時間是一個分子旋轉過大約68.5°角所需要的時間。旋轉弛豫時間按下列方程式與粘度(η)、絕對溫度(T)、分子體積(V)、和氣體常數(R)有關 旋轉弛豫時間對于小分子如熒光素非常小(≈1納秒)，對于大分子如免疫球蛋白非常大(≈100納秒)。如果粘度和溫度保持恒定，旋轉弛豫時間(進而偏振)與分子體積直接相關。分子體積的變化可能是由于與其它分子的相互作用、解離、聚合、降解、雜交或熒光標記分子的構象變化等引起。例如熒光偏振已被用于測量大分子熒光素標記的聚合物的酶促裂解，如用蛋白酶、DNA酶和RNA酶引起的裂解。它也同樣被用于測量蛋白質/蛋白質相互作用、抗體/抗原結合、和DNA/蛋白質結合的平衡結合作用。
固相和可溶性高通量試驗 在高通量試驗中，在一天內篩選多達幾千個不同調節(jié)子或配體是可能的。特別是，微孔板的每一個孔都可以用于進行針對選擇的潛在調節(jié)子的單獨的試驗，或者如果是觀察濃度或孵育時間效果，每5-10個孔可以測試一個調節(jié)子。因此，一個標準微孔板可以試驗大約100個(例如96個)調節(jié)子。如果使用1536孔板，那么一個板可以輕松分析1000到大約1500個不同的化合物。每天可以分析幾個不同的板。使用本發(fā)明的整合系統(tǒng)，使篩選高達大約6,000-20,000種不同化合物成為可能；最近又發(fā)展了試劑操作的微流體方法。
目的分子可以直接或間接通過共價或非共價鍵如經由一個標簽(tag)結合到固態(tài)組分上。標簽可以是多種組分的任何一種。一般來講，將可結合標簽的分子(標簽結合物)固定在一個固相支持物上，通過標簽和標簽結合物的相互作用，標簽化了的目的分子(如目的味覺傳導分子)就連接在了固相支持物上。
根據文獻描述的已知分子相互作用，可以使用許多標簽和標簽結合物。例如當一個標簽具有天然結合物時，例如生物素、蛋白A或蛋白G，它就可以與適當的標簽結合物(親和素、鏈霉親和素、中性親和素(neutravidin)、免疫球蛋白的Fc區(qū)等)結合使用。針對具有天然結合物的分子如生物素的抗體也可被廣泛應用，并是合適的標簽結合物(參見，SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue，SIGMA，St.Louis MO)。
類似地，任何半抗原或抗原性化合物都可與適當抗體結合形成標簽/標簽結合物對。幾千種特異性抗體都已商業(yè)化并且文獻中還描述了許多其它地抗體。例如在一個常見方法中，標簽是第一抗體，標簽結合物是特異性識別第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原作用外，受體-配體相互作用也可以作為合適的標簽和標簽結合物對。例如細胞膜受體激動劑和拮抗劑(例如細胞受體-配體相互作用如轉鐵蛋白、c-kit、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整聯(lián)蛋白家族、選擇蛋白家族等，例如參見，Pigott & Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I 1993)。類似地，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如阿片劑、類固醇等)、細胞內受體(例如介導各種小配體作用地物質，包括類固醇、甲狀腺激素、類視黃醇和維生素D、和肽)、藥物、凝集素、糖、核酸(線性和環(huán)狀聚合物構型)、寡糖、蛋白質、磷脂和抗體都可以與不同細胞受體相互作用。
合成聚合物如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲類、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫化物、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯(polyacetates)同樣可以形成合適的標簽或標簽結合物。許多其它的標簽/標簽結合物對同樣對于在此描述的試驗系統(tǒng)十分有益，在瀏覽本公開內容后這將變得十分明顯。
一般接頭如肽、聚醚等同樣可以作為標簽，并且包括多肽序列，例如大約5到200個氨基酸的聚甘氨酸序列。這類彈性接頭對于本領域技術人員來說是已知的。例如聚(乙二醇)接頭可以從Shearwater Polymers(Huntsville，AL)得到。這些接頭可選地具有酰胺鍵、巰基鍵或異功能鍵等。
標簽結合物可以使用現(xiàn)有的各種方法固定到固相基質上。通常固相基質的全部或部分暴露于化學試劑(將能與標簽結合物的一部分發(fā)生反應的化學基團固定到表面)中以完成其衍生或功能化。例如適合附著在長鏈部分上的基因可包括胺、羥基、硫羥和羧基基團。氨基烷基硅烷和羥烷基硅烷可用于一系列表面的功能化，例如玻璃表面。構建此類固相生物聚合物陣列的方法在文獻中均有詳細描述。例如參見，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149，(1963)(描述了如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102259，(1987)(描述了在針上固相組分的合成)；Frank & Doring，Tetrahedron 446031，(1988)(描述了在纖維素盤上合成多種肽序列)；Fodor等，Science 251767，(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39718，1993；和Kozal等，Nature Medicine，2753，(1996)(均描述了固定在固相基質上的生物聚合物陣列)。固定標簽結合物至基質的非化學方法包括其它常用方法，如加熱、UV輻射交聯(lián)等。
如前所述，構建表達根據本發(fā)明的功能性CNG通道的細胞系，所述通道在增味劑刺激后通過cAMP的增加或通過cAMP或cGMP的類似物得到活化。例如，在一個實施方案中，高通量的基于平板的CNG試驗將通過在孔中加入刺激因子來發(fā)生和活化。其實例包括通過使用能夠刺激腺苷酸環(huán)化酶的化合物如毛喉素、或通過使用能夠阻斷磷酸二酯酶的化合物如IMBX或通過使用膜可透過性cAMP和cGMP的類似物。
在另一高通量篩選方案中，細胞可透過性cAMP或cGMP可借助內部VV照射的快速光分解來傳遞以完成該變化。
基于細胞的功能試驗 在優(yōu)選的實施方案中，至少一個CNG通道亞基多肽在真核細胞中表達。該CNG通道可在任何真核細胞中表達，如HEK-293細胞。細胞內這類通道的活化可以用，如基于細胞內Ca2+的變化來檢測。
通過比較用潛在的抑制子或活化子處理過的樣品或試驗物和未用試驗化合物處理過的對照樣品，從而分析調節(jié)程度。這類試驗可以在存在已知的能夠通過增加細胞內cAMP或cGMP水平而活化CNG通道的增味劑的情況下實施，且該增味劑依賴性活化作用的調節(jié)被監(jiān)測。對照樣品(未用活化子或抑制子處理)的感覺受體相對活性值被指定為100。當感覺受體活性值相對于對照為大約90％，可選地50％，可選地25-0％時，就獲得抑制作用。當通道活性值相對于對照為110％，可選地150％、200-500％或1000-2000％時，就獲得活化作用。
離子流量變化可通過確定表達感覺受體蛋白質的細胞或膜的離子極化(即電勢)變化來評價。確定細胞極化變化的一個手段就是用電壓-鉗(voltage-clamp)和膜片鉗(patch-clamp)技術，例如“細胞附著(cell-attached)”模式、“內-外(inside-out)”模式和“全細胞(whole cell)”模式(參見，例如Ackerman等，NewEngl.J.Med，3361575，(1997))測量電流變化，從而檢測極化的變化。全細胞電流可用已知的標準方法很方便地測量到。其它已知的試驗包括用放射標記的或熒光探針的電壓敏感性染料(參見，例如Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol，8867，(1988)；Gonzales & Tsien，Chem.Biol，4269，(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth，25185，(1991)；Holevinsky等，J.MembraneBiology，13759，(1994))或鈣敏感性染料如fluo-3、fluo-4或fura-2測量離子流的試驗。一般地，待測化合物地存在濃度為從1pM到100mM。
在另一個實施方案中，可測量轉錄水平用于評價待測化合物對信號傳導的影響?？蓪珻NG通道亞基蛋白質的宿主細胞與待測化合物接觸足夠長的時間以實現(xiàn)任何相互作用，然后測量基因表達水平。實現(xiàn)這些相互作用的時間憑經驗確定，例如執(zhí)行一個時間進程實驗并且測量轉錄水平作為時間的函數。轉錄量可以使用本領域技術人員已知的合適的方法測量。例如通道亞基蛋白質的mRNA的表達可以通過Northern印跡檢測或利用免疫試驗鑒定其多肽產物來檢測。或者，可使用利用報告基因的基于轉錄的試驗，參見U.S.專利No.5,436,128中的描述，在此引用作為參考。報告基因可以是，例如氯霉素乙酰轉移酶、熒光素酶、’3-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。此外，通過附著在第二報告子如綠色熒光蛋白后，目的通道亞基蛋白質可以間接用作報告子(參見，例如Mistili & Spector，Nature Biotech.15961，(1997))。
然后將轉錄量與在缺少待測化合物的相同細胞內的轉錄量相比較，或者與缺少目的通道亞基蛋白質的基本相同細胞的轉錄量相比較?；鞠嗤募毎梢詮挠糜谥苽渲亟M細胞的相同細胞衍生而來，但是未被引進異源DNA修飾。轉錄量的任何差異意味著待測化合物在一定程度上改變了CNG通道的活性。
表達人類嗅覺CNG通道亞基的轉基因非人類動物 表達一種或多種本發(fā)明CNG通道亞基序列，特別是人類嗅覺CNG通道序列的非人類動物同樣可用于試驗。這種表達可用于確定試驗化合物在體內是否可以特異性地激活哺乳動物嗅覺CNG通道，其通過以下步驟實現(xiàn)將用編碼嗅覺CNG通道地核酸穩(wěn)定或瞬時轉染的非人類動物與待測化合物接觸，并確定該動物是否通過抑制或激活CNG通道而對待測化合物起反應。
感染/表達單獨或作為文庫形式的核酸和載體的手段為本領域眾所周知。各種各樣的個體細胞、器官或整個動物的參數可用多種手段來測量。例如紀錄來自主嗅球或副嗅球的由刺激引起的波(嗅球反應)就是一種定量測量穩(wěn)定嗅覺反應的有用手段。當電極置于嗅球表面時，就可以在幾天的時間里記錄穩(wěn)定的反應(參見，例如Kashiwayanagi，Brain Res.Protoc.1287，(1997))。在本研究中，通過四電極組從正對鼻中隔的內鼻甲骨上的嗅上皮中記錄嗅電圖。四電極組沿一個鼻甲骨的背-到-腹軸固定，或置于四個鼻甲骨的相應位置，并向骨頂端移動聚集在一起。同樣參見，Scott，J.Neurophysiol.771950，(1997)；Scott，J.Neuro-physiol.752036，(1996)；Ezeh，J.Neurophysiol.732207，(1995)。在其它系統(tǒng)中，鼻上皮中的熒光變化可用染料di-4-ANEPPS進行測量，該染料用于大鼠鼻中隔和鼻甲的內側表面(參見，例如Youngentob，J.Neuro-physiol.73387，(1995))。細胞外的鉀活性(aK)的測量同樣可在體內實施。鉀活性的增加可在粘液和鼻上皮的近端中測量(參見，例如Khayari，Brain Res.5391，(1991) 本發(fā)明的嗅覺CNG通道序列例如可通過使用感染劑，例如腺病毒表達載體傳遞至動物鼻上皮中表達。重組腺病毒介導的并使用綠色熒光蛋白作為標記物的重組基因在嗅上皮中的表達已記載于，例如Touhara，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 964040，(1999)中。該內源CNG通道能保持功能和呈現(xiàn)野生型(天然)活性。在其它情況下，當希望通過引入外源雜合受體而抑制所有內源CNG通道活性時，優(yōu)選使用基因敲除系。構建非人類轉基因動物的方法，特別是構建轉基因小鼠的方法，以及選擇和制備用于生成轉化細胞的重組構建體的方法是本領域眾所周知的。
構建“敲除”細胞和動物基于的前提是，通過將打斷待抑制基因的一部分DNA序列的新DNA序列引入到基因組中，可以降低或完全消除哺乳動物細胞中特定基因的表達水平。同樣，“基因誘捕插入(gene trap insertion)”可用于破壞宿主基因，小鼠胚胎干細胞(ES)可用于產生敲除的轉基因動物(參見，例如Holzschu，Transgenic Res697，(1997))。異源序列的插入通常由互補核酸序列間的同源重組實現(xiàn)。異源序列是待修飾靶基因的一部分，例如外顯子、內含子或轉錄調節(jié)序列，或任何可影響靶基因表達水平的基因組序列；或其組合。多能胚胎干細胞中通過同源重組的基因打靶可以允許對目的基因組序列進行精確修飾。任何技術都可用于產生、篩選、繁殖敲除動物，例如參見Bijvoet，Hum.Mol.Genet.753，(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75208，(1997)；Tojo，Cytotechnology 19161，(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48167，(1995)；Longo，Transgenic Res.6321，(1997)；U.S.專利Nos.5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。
本核酸文庫同樣可用于產生“敲除”的人類細胞及其后代的試劑。
調節(jié)子 作為嗅覺CNG通道的調節(jié)子測試的化合物可以是任何小的化學化合物或生物學實體如蛋白質、糖、核酸或脂。通常，試驗化合物是小的化學分子和肽?；旧先魏位瘜W化合物都可以作為本發(fā)明試驗中的潛在調節(jié)子或配體，盡管在大多數情況下使用了溶解于水溶液或有機溶液(特別是基于DMSO的)中的化合物。通過自動化試驗步驟，及從任何方便的來源中提供化合物用于試驗，這些試驗可用于篩選大的化學文庫，這些試驗通常是平行方式進行(例如在機器化試驗中可以微量滴定板上的微量滴定方式進行)。應當認識到有很多化學化合物供應商，包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，F(xiàn)luka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs，Switzerland)等。
在一個優(yōu)選的實施例中，高通量篩選方法涉及提供包含大量潛在治療性化合物(潛在調節(jié)子或配體化合物)的組合化學或肽文庫。然后在一種或多種上述試驗中篩選這類“組合化學文庫”或“配體文庫”，來鑒定那些顯示所需要特征活性的文庫成員(特定化學種類或亞類)。如此鑒定的化合物可以作為常規(guī)的“引導化合物(leadcompounds)”或本身就可作為潛在或真正的治療劑。
組合物文庫是不同化學化合物(由化學合成或生物合成產生的)的集合，通過大量化學“構造部件(building blocks)”如試劑組合而成。例如線性組合化學文庫如多肽文庫是由一系列化學構造部件(氨基酸)用各種可能方式以指定化合物長度(即多肽化合物中氨基酸的數目)組合而形成。通過這種化學構造部件的組合混合可以合成出數百萬個化學化合物。
組合化學文庫的制備和篩選為本領域技術人員眾所周知。這類組合化學文庫包括肽文庫，但不局限于肽文庫(參見，例如U.S.專利No.5,010,175；Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487，(1991)；和Houghton等，Nature 35484，(1991))。同樣可用其它產生化學多樣文庫的化學物質，這些化學物質包括，但不局限于類肽(例如WO 91/19735)，編碼的肽(例如WO 93/20242)，隨機生物寡聚體(WO 92/00091)，苯并二氮雜卓(例如U.S.專利No.5,288,514)，異聚物(diversomers)，例如乙內酰脲、苯并二氮雜卓以及二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.906909，(1993))。插烯(vinylogous)多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568，(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽性肽模仿物(nonpeptidalpeptidomimetics)(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217，(1992))，小分子化合物文庫的類似的有機合成(Chen等，J.Amer.Chem.Soc，1162661，(1994))，寡聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等，Science 2611303，(1993))，肽基磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658，(1994))，核酸文庫(Ausubel，Berger和Sambrook，均如前)，肽核酸文庫(U.S.專利No.5,539,083)，抗體文庫(Vaughn等，Nature Biotechnology 14309，(1996)和WO97/00271)，糖類文庫(Liang等，Science 2741520，(1996)和U.S.專利No.5,593,853)，有機小分子文庫(苯并二氮雜卓，Baum，C & EN，page 33，Jan 18，(1993))；噻唑烷酮(thiazolidinones)和metathiazanones，U.S.專利No.5,549,974；pynrolidines，U.S.專利Nos.5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，U.S.專利No.5,506,337；苯并二氮雜卓，U.S.專利No.5,288,514等。
制備組合文庫的裝置已經商品化(參見，例如357 MPS，390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville，KY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，9050Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，許多組合文庫本身也已經商品化(參見，例如ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc，St.Louis，MO；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；MartekBiosciences；Columbia，MD；等)。
施用新的嗅覺調節(jié)子(增強子或阻斷子)組合物 感覺調節(jié)子可被直接施用給哺乳動物(例如人類)以在體內調節(jié)感覺感知。施用可采取任何用于引入調節(jié)化合物與欲治療的組織(例如鼻或舌)進行最終接觸的正常途徑。嗅覺調節(jié)子可采用任何適用的方式來施用，選擇性地與合適的載體一起施用。施用所述調節(jié)子的適用方法對本領域技術人員來說是眾所周知的并可得到的，盡管可采用超過一種途徑來施用特定組合物，一種特定途徑通常提供比其它途徑更直接和更有效反應。可接受的載體至少部分由所施用組合物中的特定組分來確定(例如，穩(wěn)定感覺物)，以及由施用組合物的特定方法來確定。因此，本發(fā)明的藥物組合物可采用非常多的適用劑型(參見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.1985)。
感覺調節(jié)子，單獨地或與其它適用組分組合，可被制成氣霧劑形式(即，它們可被“霧化”)從而借助吸入得以施用。氣霧劑可被置于合適的加壓推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等，該推進劑能或不能導致感覺感知。其它可能的劑型包括干燥或液體形式、粉劑或片劑、極性(如，水)或非極性(如，醇)溶劑的溶液、乳劑或懸液、乳膏劑，膠劑、洗劑和糖漿。
施用的合適劑型包括水和非水溶液、等滲滅菌溶液(其可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和能使劑型等滲的溶質)，和水和非水滅菌懸液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在本發(fā)明的實施中，組合物可通過，如口腔、局部、靜脈內，腹膜內、膀胱內或鞘內的途徑來施用?；蛘?，組合物通過口腔或鼻腔的途經施用。化合物劑型可為密封容器，如安瓿和小藥水瓶中的單位劑量或多劑量形式。溶液和懸液可用前述的滅菌粉末、顆粒和片劑來制備。調節(jié)子還可以作為制備的藥物、食品或化妝品的組成部分來施用。特別的，令人厭惡的氣味或味道(例如，分別是硫味或苦味)可能就不會被感知到，因為其效果通過下列途徑被減弱了，即通過加入能阻斷同源配體與受體間結合的競爭性配體從而阻斷了感覺配體和感覺受體間的結合，或通過抑制或減弱信號傳導。相反的，令人愉快的氣味或味道可被模擬或增強。原發(fā)(primary)感覺是優(yōu)選的，因為活化細胞亞群很小而其效果限于投射入大腦的特定區(qū)域。但是僅能結合少量嗅覺受體(例如，具有小于5個不同配體結合結構域)的新嗅覺元(olfactory)或其組合物同樣是有用的。
對哺乳動物(如，人類)的施用劑量應足以在施用期間于個體內產生有益的效果。該劑量應由所使用的特定感覺調節(jié)子的效力和個體的狀態(tài)，以及體重或所治療區(qū)域的表面積來確定。劑量的大小同樣應由與特定化合物或載體在特定個體內施用時所伴隨的任何副作用的存在，特性和范圍來確定。在醫(yī)生確定要施用的調節(jié)子的有效量的過程中，其或許會評估該感覺調節(jié)子的循環(huán)血漿中的水平、調節(jié)子毒性和抗調節(jié)子抗體的生成。通常，調節(jié)子對一般哺乳動物的劑量當量為，大約1ng/kg至10mg/kg。施用時，感覺調節(jié)子的施用速率可根據調節(jié)子的ED50確定，以及所施用的不同濃度抑制子對哺乳動物的質量和總體健康所造成的副作用來確定。施用可通過單次或分次劑量完成。
試劑盒 人類嗅覺CNG基因，或其片段或變體是法醫(yī)學、親子鑒定中和為檢驗分離細胞中信號傳導而鑒定表達所述通道的細胞的有力工具。能夠特異性地與oCNG通道核酸雜交地嗅覺CNG通道家族成員特異性試劑，和特異性結合CNG通道亞基蛋白質地特異性試劑，例如抗CNG通道亞基抗體，可用于檢驗細胞表達和信號傳導調節(jié)。例如一個或多個家族成員特異性試劑可用于檢測與遺傳性嗅覺缺失相關聯(lián)的多態(tài)性或用于檢測等位排斥。
確定樣品中oCNG通道家族成員DNA和RNA是否存在的核酸試驗包括本領域眾所周知的許多技術，例如Southern分析、Northern分析、點印跡、RNA酶保護、S1分析、擴增技術如PCR和原位雜交。例如在原位雜交中，靶核酸從它的細胞內環(huán)境中釋放出來，以便能在細胞內進行雜交，同時保持細胞形態(tài)，利于隨后的解釋和分析。以下文章提供了原位雜交的概述Singer等，Biotechniques，4230-250(1986)；Haase等Methods in Virology，vol.Vll，pp.189-226(1984)；和Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach(Names等，eds.(1987)。另外，通道亞基蛋白質可以使用如上描述的各種免疫試驗技術來檢測。測試樣品通常同時與陽性對照(例如表達重組感覺受體蛋白質的樣品)和陰性對照比較。
本發(fā)明同樣提供了篩選嗅覺CNG通道新調節(jié)子的試劑盒。這些試劑盒可以從現(xiàn)成材料和試劑，及任一上述產品中制備。例如這些試劑盒可以包含以下材料的任何一種或多種CNG通道編碼核酸或蛋白質，反應試管、測試CNG通道活性的指南等。根據本發(fā)明可以制備多種試劑盒和組分，這取決于試劑盒的特定用戶和用戶的特殊需求。
下列實施例用以說明本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明范圍的任何限制。
實施例 實施例1克隆人類嗅覺CNG通道亞基 在本發(fā)明之前，人類嗅覺CNG通道亞基的序列是未知的。但是，對人類嗅覺神經元的電生理學分析卻顯示出其與大鼠通道具有功能相似性(Thurauf等，(1996))，而我們在人類DNA數據庫中鑒定了三個大鼠亞基的直向同源物(圖1-4)。我們使用RT-PCT確定了在人類嗅覺上皮mRNA中存在OCNC1和OCNC2，而這兩個亞基的全長cDNAs已經通過對從商品獲得的cDNA與來自基因組DNA的5’編碼外顯子的聯(lián)合PCR擴增而得到克隆。在人類OCNC1編碼序列的側翼加入5’端Asc I和3’端Not I酶切位點，將該OCNC1 Asc I-Not I片段克隆入pEAK10表達載體(Edge Biosystems)以生成質粒SAV1931。在5’Asc I位點整合3個核苷酸的連接子序列以引入優(yōu)化的翻譯起始位點GGCGCGCCgccATG(SEQ ID NO8)，其中Asc I位點和起始ATG為大寫字母，3個核苷酸的連接子為小寫字母。
3’Not I位點直接加于終止密碼子之后。人類OCNC2用類似方法克隆以生成質粒SAV1976。人類β1b同樣克隆以生成質粒SAV2498；但是，分隔5’Asc I位點和起始ATG的3核苷酸連接子被刪掉。
實施例2建立針對人類嗅覺CNG通道的高通量試驗平臺 采用基于脂質的方案，對HEK-293T細胞瞬時轉染克隆的人類嗅覺CNG通道亞基。通過共轉染RFP表達載體來監(jiān)測轉染率，一般大于70％。24小時后，收獲細胞并轉移至96孔板上。在另一個24小時后，用熒光鈣或者膜電位染料對細胞染色1小時，漂洗，然后轉移至應用板上流體學(on-board fluidics)的FLIPR自動化熒光板讀取器上。
與模擬轉染的細胞不同，用嗅覺CNG通道亞基轉染的細胞在毛喉素刺激后，顯示出增高的熒光性。而且，毛喉素效應的數量級為亞基依賴性的OCNC1單獨產生活性CNG通道，OCNC2(較小的程度)和β1b(較大的程度)強化OCNC1活性(圖5)。膜電位染料能提供比鈣染料更好的信噪比；但，無論使用上述何種染料對高通量篩選來說都是足夠有力的(圖6和7)。
實施例3發(fā)展基于CNG通道的GPCRs熒光試驗 Rich等(2001)構建并表征了cAMP敏感性增強的鼠OCNC1CNG通道的一種突變體形式。我們制成了相應的hOCNC1[C460W/E583M]突變體(SEQ ID NO4)-其由質粒SAV2480攜帶-并發(fā)現(xiàn)其與β1b聯(lián)合能增加cAMP敏感性和并具有強有力的活性(圖8)。該增加的敏感性顯示了此人類嗅覺CNG通道變體可以作為cAMP生物傳感器發(fā)揮作用，且可以發(fā)展出對GPCRs以及其它調節(jié)cAMP水平的蛋白質的基于完整細胞的熒光試驗。
HEK-293細胞轉染OCNC1[C458W/E581 FM]、OCNC2和β1b以及被丁子香酚活化激活的小鼠嗅覺受體mOREG(Kajiya等，2001)。轉染細胞接種在多孔板上。48小時后，用鈣染料對細胞染色1小時，隨后漂洗，用熒光顯微技術監(jiān)測其對丁子香酚刺激的反應。丁子香酚引起轉染細胞內熒光的增加；這一反應可能反映出由mOREG引發(fā)的內源性Gs和腺苷酸環(huán)化酶的依賴丁子香酚的活化作用，因為與單獨轉染CNG通道或單獨轉染mOREG的細胞相比較，可以確定這些反應具有CNG通道依賴性和mOREG依賴性(圖9)。
實施例4開發(fā)穩(wěn)定表達人類嗅覺CNG通道亞基OCNC1、OCNC2和β1b的細胞系 用三種人類嗅覺CNG通道亞基采用基于脂質的方案轉染HEK-293細胞。轉染72小時后加入適當選擇性抗生素，并在選擇步驟后3-5周的時間內回收單克隆。通過瞬時轉染mOREG基因來篩選克隆活性，并在mOREG配體丁子香酚刺激后監(jiān)測鈣離子流入。
鈣成像試驗顯示了對丁子香酚具有反應性的轉染了人類CNG通道亞基的細胞的一些克隆。相反的，模擬轉染細胞不具有可檢測的對丁子香酚的反應。在超過20代后，表達和活性仍保持穩(wěn)定。而且，穩(wěn)定表達人類嗅覺CNG亞基的細胞對丁子香酚刺激具有更高的敏感性(圖10)。因此，該構建的細胞系適用于針對CNG介導的鈣傳輸的基于細胞的試驗。
實施例5建立穩(wěn)定表達人類嗅覺CNG通道亞基OCNC1[C458W/E581 M]和β1b的細胞系 用兩種人類嗅覺CNG通道亞基OCNG1和β1b采用基于脂質的方案轉染HEK-293細胞。轉染72小時后加入適當選擇性抗生素，并在選擇步驟后3-5周的時間內回收單克隆。通過在細胞內瞬時轉染mOREG基因，并在用mOREG配體丁子香酚刺激后監(jiān)測鈣離子流入來篩選克隆活性。
鈣成像試驗顯示了對丁子香酚具有反應性的轉染了人類CNG通道亞基的細胞的一些克隆。相反的，模擬轉染細胞不具有可檢測的對丁子香酚的反應。在超過20代后，表達和活性仍保持穩(wěn)定。與轉染野生型CNG亞基的細胞相反，轉染OCNC1[C458W/E581 M]的細胞顯示出對丁子香酚顯著性的更高的反應。因此，該構建的細胞系適用于針對CNG介導的鈣傳輸的基于細胞的試驗。而且，該增高的敏感性使得細胞可用于對低親和性激動劑或拮抗劑的篩選。
實施例6建立對穩(wěn)定表達的人類嗅覺CNG通道亞基的高通量 試驗平臺 在實驗前24小時，將穩(wěn)定表達人類嗅覺CNG通道的HEK-293細胞接種于FLIPR成像平板內，其中在平板上預先用基質凝膠(matrigel)涂覆了。用熒光鈣染料對所述細胞染色1小時，漂洗，轉移至應用板上流體力學的FLIPR自動化熒光板讀取器。與其親本細胞不同，穩(wěn)定表達人類嗅覺CNG通道亞基的細胞在用異丙腎上腺素(isopeteranol)刺激β2受體后，表現(xiàn)出增高的熒光(圖11a)。而且該細胞在用腺苷酸環(huán)化酶活化子毛喉素刺激后，同樣顯示出增高的熒光(圖11b)。因此，該基于細胞的試驗可用于高通量的應用。
實施例7建立對活性增強的、穩(wěn)定表達的人類嗅覺CNG通道的高通量試驗平臺 在實驗前24小時，將穩(wěn)定表達活性增強的人類嗅覺CNG通道的HEK-293細胞接種于FLIPR成像平板內，其中在平板上預先用基質凝膠涂覆了。用熒光鈣染料對所述細胞染色1小時，漂洗，轉移至應用板上流體力學的FLIPR自動化熒光板讀取器。與其親本細胞和轉染了野生型CHG亞基的細胞不同，穩(wěn)定表達活性增強的人類嗅覺CNG通道亞基的細胞在用腺苷酸環(huán)化酶活化子毛喉素刺激后，顯示出增高的熒光(圖11b)。而且該細胞表現(xiàn)出與用異丙腎上腺素刺激β2受體后野生型CNG亞基相同的熒光(圖11a)。因此，該基于細胞的試驗可用于高通量的應用，特別是涉及低親和性激動劑和拮抗劑的應用。
雖然通過實施例的方式對本發(fā)明進行了表述，但應將其理解為此處使用的詞匯只是說明性的詞匯，而并非具有限制性含義的詞匯。在所附的權利要求的范圍內，在不超出本發(fā)明的更寬方面的范圍和精神的情況下，可以作出改變。盡管此處引用特定手段、材料和實施方式對本發(fā)明進行描述，但應將其理解為本發(fā)明并不限于這些特定的公開。本發(fā)明可以擴展至所附權利要求內全部的等效結構、手段和用途。
參考文獻1.Abe等(1992)J.Biol.Chem.26713361-3682.Ache B.W.和Zhainazarov，A.(1995)Dualsecond-messenger pathways in olfactory transduction.Curr.Opin.Neurobiol.5，461-466.
3.Adler，E.，Hoon，M.A，Mueller，K.L.，Chandrashekar，J.，Ryba，N.J.P.，和Zuker，C.S.(2000)A novel family of mammaliantaste receptors.Cell 100，693-7024.Bakalyar，H.A.和Reed R.R.(1990)Identification ofa specialized adenylyl cyclase that may mediate odorantdetection.Science 250，1403-14065.Belluscio，L.，Gold，G.H.，Nemes，A.和Axel，R.Micedeficient in G(olf)are anosmic.Neuron 20，69-816.Bonigk，W，Bradley，J.，Muller，F(xiàn).，Sesti，F(xiàn).，Boekhoff，I.，Ronnett，G.V.，Kaupp，U.B.，和Frings，S.(1999)The nativerat olfactory cyclic nucleotide-gated channel is composed ofthree distinct subunits.J.Neurosci.19，5332-53477.Bradley，J.，Li，J.，Davidson，N.，Lester，H.A.，和Zinn，K.(1994)Heteromeric olfactory cyclic nucleotide-gatedchannelsa subunit that confers increased sensitivity to cAMP.Proc.Natl.Acad.Sci.91，8890-88948.Breer，H.(1993)Second messenger signaling in olfaction.Ciba Found.Symp.179，97-1099.Broillet，M.-C.(2000)A single intracellular cysteineresidue is responsible for the activation of the olfactorycyclic nucleotide-gated channel by NO，J.Biol.Chem.275(2)15135-14110.Brown，R.L，Haley，T.L，West，K.A.，和Crabb，J.W.(1999)Pseudechetoxina peptide blocker of cyclicnucleotide-gated ion channels.Proc.Natl.Acad.Sci.96，754-75911.Brunet，L.J，Gold，G.H.，和Ngai，J.(1996)Generalanosmia caused by trageted disruption of the mouse olfactorycyclic nucleotide-gated cation channel.Neuron 17，681-69312.Buck，L.和Axel，R.(1991)A novel multigene family mayencode odorant receptorsa molecular basis for odorrecognition.Cell 65，175-18713.Chen，T.Y.，Peng，Y.W，Dhallan，R.S.，Ahamed，B.，Reed，R.R.，和Yau，K.W.(1993)A new subunit of the cyclicnucleotide-gated cation channel in retinal rods.Nature362，764-76714.Chess，A，Simon，I.，Cedar，H.，和Axel，R.(1994)Allelic inactivation regulates olfactory receptor geneexpression.Cell 78，823-83415.Dhallan，R.S.，Yau，K.W.，Schrader，K.A.，和Reed，R.R.(1990)Primary structure and functional expression of acyclic nucleotide-activated channel from olfactory neurons.Nature 347，184-18716.Hirono，J.，Sato，T.，Tonoike，M.，Takebayashi，M.(1992)Simultaneous recording of[Ca2+]i increases in isolatedolfactory receptor neurons retaining their original spatialrelationship in intact tissue.J.Neurosci.Methods 42，185-19417.Hockerman，G.H.，Peterson，B.Z.，Sharp，E.，Tanada，T.N.，Scheuer，T.，和Catterall，W.A.(1997)Construction ofa high-affinity receptor site for dihydropyridine agonists andantagonists by single amino acid substitutions in a non-L-typecalcium channel.Proc.Natl.Acad.Sci.94.14906-1491118.Gold，G.H.(1999)Controversial issues in vertebrateolfactory transduction.Ann.Rev.Physiol.61，857-87119.Fuchs，T，Glusman，G.，Horn-Saban，S.，Lancet，D.，和Pilpel，Y.(2001)The human olfactory subgenomefrom sequenceto structure and evolution.Hum.Genet.108，1-1320.Jones，D.T.和Reed，R.R.(1989)Golfan olfactoryneuron specific-G protein involved in odorant signaltransduction.Science 244，790-79521.Kayija，K，Inaki，K.Tanaka，M.，Haga，T.，Kataoka，H.和Touhara，K.(2001)Molecular bases of odor discriminationReconstitution of olfactory receptors that recognizeoverlapping sets of odorants，J.Neurosci.21(16)6018-25.
22.Kurahashi，T.，Lowe，G.，和Gold，G.H.(1994)Suppression of odorant responses by odorants in olfactoryreceptor cells.Science 265，118-12023.Liman，E.R.和Buck，L.B.(1994)A second subunit ofthe olfactory cyclic nucleotide-gated channel confers highsensitivity to cAMP.Neuron 13，611-62124.Ma，M.和Shepherd，G.M.(2000)Functional mosaicorganization of mouse olfactory receptor neurons.Proc.Natl.Acad.Sci.97，12869-1287425.Malnic，B.，Hirono，J.，Sato，T.，和Buck，L.B.(1999)Combinatorial receptor codes for odors.Cell 96，713-72326.Matsunami，H.，Montmayeur，J.P.，和Buck，L.B.(2000)A family of candidate taste receptors in human and mouse.Nature404，601-60427.Meyer，M.R，Angele，A.，Kremmer，E.，Kaupp，U.B.和Muller，F(xiàn).(2000)A cGMP-signaling pathway in a subset ofolfactory sensory neurons，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(19)10595-600.
28.Murphy，C.(1993)Nutrition and chemosensory perceptionin the elderly.Crit.Rev.Food Sci.Nutr.33，3-1529.Nakamura，T.和Gold，G.H.(1987)A cyclicnucleotide-gated conductance in olfactory receptor cilia.Nature 325，442-44430.Nakayasu，C.，Kanemura，F(xiàn).，Hirano，Y.，Shimizu，Y.，和Tonosaki，K.(2000)Sensitivity of the olfactory sense declineswith the aging in senescence-accelerated mouse(SAM-P1).Physio.Behav.70，135-13931.Qu，W.，Zhu，X.O.，Moorhouse，A.J.，Bieri，S.，Cunningham，A.M.，和Barry，P.H.(2000)ion permeation andselectivity of wild-type recombinant rat CNG(rOCNC1)channelsexpressed in HEK293 cells.J.Membrane Biol.178，137-15032.Ressler，K.J，Sullivan，S.L.，和Buck，L.B.(1994)Information coding in the olfactory system evidence for astereotyped and highly organized epitope map in the olfactorybulb.Cell 79，1245-125533.Rich，T.C.，Tse，T.E.，Rohan，J.G.，Schaak，J.，和Karpen，J.W.(2001)In vivo assessment of localphophodiesterase activity using tailored cyclicnucleotide-gated channels as cAMP sensors.J.Gen.Physio.118，63-7834.Rolls，B.J.(1993)Appetite，hunger，and satiety inthe elderly.Crit.Rev.Food Sci.Nutr.33，39-4435.Sautter，A.，Zong，X.，Hofman，F(xiàn).，和Biel，M.(1998)A isoform of the rod photoreceptor cyclic nucleotide-gatedchannel beta subunit expressed in olfactory neurons.Proc.Natl.Acad.Sci.95，4696-470136.Schiffman，S.S.(1993)Perception of taste and smellin elderly persons.Crit.Rev.Food Sci.Nutr.33，17-2637.Schiffman，S.S.(1997)Taste and smell losses in normalaging and disease.JAMA 278，1357-136238.Thurauf，N.，Gjuric，M，Kobal，G.，和Hatt，H.(1996)Cyclic nucleotide-gated channels in identified human olfactoryreceptor neurons.Eur.J.Neurosci.8，2080-208939.Touhara，K.，Sengoku，S，Inaki，K.，Tsuboi，A.，Hirono，J，Sato，T.，Sakano，H，和Haga，T.(1999)Functionalidentification and reconstitution of an odorant receptor insingle olfactory neurons.Proc.Natl.Acad.Sci.96，4040-404540.Vassar，R.，Chao，S.K.，Sitcheran，R.，Nunez，J.M，Vosshall，L.B.，和Axel，R.(1994)Topographic organizationof sensory projections to the olfactory bulb.Cell79，981-99141.Wong，S.T.，Trinh，K.，Hacker，B.，Chan，G.C.，Lowe，G.，Gaggar，A，Xia，Z.，Gold，G.H.，和Storm，D.R.(2000)Disruption of the type Ill adenylyl cyclase gene leads toperipheral and behavioral anosmia in transgenic mice.Neuron27，487-49742.Zagotta，W.N.和Siegelbaum，S.A.(1996)Structure andfunction of cyclic nucleotide-gated channels.Ann.Rev.Neurosci.19，235-26343.Zufall，F(xiàn).和Leinders-Zufall，T.(2000)The cellularand molecular basis of odor adaptation.Chem.Senses 25，473-48權利要求
1.分離的核苷酸序列，其編碼人類OCNC1嗅覺CNG通道亞基，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO1具有至少約95％的相同性，或編碼與SEQ ID NO1所編碼的多肽有至少約90％序列相同性的多肽。
2.權利要求1中的核苷酸序列，其包含在1374位的突變，該突變導致半胱氨酸轉換為色氨酸，和/或在1741和1742位上的突變，該突變導致谷氨酸轉換為甲硫氨酸。
3.權利要求2中的核苷酸序列，其包含所述兩種替代突變。
4.權利要求3中的核苷酸序列，其包含于SEQ ID NO4中或編碼與SEQ ID NO4所編碼的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。
5.由權利要求1、2、3或4中核苷酸序列所編碼的多肽。
6.分離的表達序列，其包含權利要求1、2、3或4中的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作性地與轉錄和翻譯調節(jié)序列相連。
7.包含權利要求1、2、3或4中至少一個序列的表達載體。
8.包含權利要求7中表達載體的宿主細胞。
9.分離的核苷酸序列，其編碼人類OCNC2嗅覺CNG通道亞基，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO2具有至少約95％的相同性，或編碼與SEQ ID NO2所編碼的多肽有至少約90％序列相同性的多肽。
10.由權利要求9中核苷酸序列所編碼的多肽。
11.分離的表達序列，其包含權利要求9中的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作性地與轉錄和翻譯調節(jié)序列相連。
12.包含權利要求9或11中序列的表達載體。
13.包含權利要求12中表達載體的宿主細胞。
14.分離的核苷酸序列，其編碼人類β1b嗅覺CNG通道亞基，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO3具有至少約95％的相同性，或編碼與SEQ ID NO3所編碼的多肽有至少約90％序列相同性的多肽。
15.由權利要求14中核苷酸序列所編碼的多肽。
16.分離的表達序列，其包含權利要求14中的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作性地與轉錄和翻譯調節(jié)序列相連。
17.包含權利要求14或16中序列的表達載體。
18.包含權利要求17中表達載體的宿主細胞。
19.包含權利要求7中表達載體(OCNC1)和權利要求12中表達載體(OCNC2)的宿主細胞。
20.包含權利要求7中表達載體(OCNC1)和權利要求17中表達載體(β1b)的宿主細胞。
21.包含權利要求12中表達載體(OCNC2)和權利要求17中表達載體(β1b)的宿主細胞。
22.包含權利要求7、12和17中表達載體(OCNC1，OCNC2和β1b)的宿主細胞。
23.權利要求8、13、18、19、21或22中的宿主細胞，其選自MDCK、HEK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、SWISS3T3和CHO。
24.權利要求23中的宿主細胞，其為HEK293或HEK293T細胞。
25.權利要求8、13、18、19、21或22中的宿主細胞，其穩(wěn)定或瞬時地表達至少一種人類嗅覺CNG亞基。
26.權利要求25中的宿主細胞，其穩(wěn)定或瞬時地表達人類OCNC1、OCNC2和β1b。
27.一種基于哺乳動物細胞的高通量試驗方法，其用以表征和篩選人類嗅覺環(huán)核苷酸門控(CNG)通道的推定的調節(jié)子，該方法包括將測試細胞與至少一種推定的調節(jié)子化合物相接觸，所述細胞表達人類OCNC1，OCNC2和/或β1b或這三個亞基中每一亞基的變體、片段或功能性等效物，且該細胞用膜電位熒光染料進行預加載，和監(jiān)測存在推定的調節(jié)子時測試細胞內的熒光變化，并與不存在該調節(jié)子時的變化相比，從而確定人類嗅覺CNG通道的調節(jié)程度。
28.權利要求27中的試驗方法，其中測試細胞選自MDCK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、Swiss3T3和CHO細胞。
29.權利要求27中的試驗方法，其中所述細胞為HEK293細胞。
30.權利要求29中的試驗方法，其中所述HEK293細胞為HEK293T細胞。
31.權利要求27中的試驗方法，其中所述方法用于根據熒光的可檢測改變而鑒定能夠特定地調節(jié)CNG活性的化合物。
32.權利要求30中的試驗方法，其中所述測試細胞接種于多孔檢測平板的孔上。
33.權利要求32中的試驗方法，其中通過在所述多孔檢測平板的孔內加入所述推定的調節(jié)子而使所述測試細胞與推定的調節(jié)子相接觸。
34.權利要求33中的試驗方法，其中所述細胞用膜電位染料加載，該染料能使熒光變化可被檢測到。
35.權利要求34中的試驗方法，其中所述測試細胞表達人類OCNC1、人類OCNC2和人類β1b亞基中的每一種。
36.權利要求32中的試驗方法，其中所述亞基分別由SEQ ID NO1或4；2和3，或其片段，或與其雜交并編碼功能性CNG亞基的DNA序列所編碼。
37.權利要求36中的試驗方法，其中所述亞基由SEQ ID NO1或4編碼。
38.權利要求31中的試驗方法，其中用熒光板讀取器監(jiān)測熒光變化。
39.權利要求31中的試驗方法，其中用電壓成像板讀取器監(jiān)測熒光變化。
40.權利要求31中的試驗方法，其中膜電位染料選自MolecularDevices Membrane Potential Kit(目錄號R8034)，Di-4-ANEPPS(吡啶鎓，4-(2-(6-(二丁胺)-2-萘基)乙烯基)-1-(3-硫代丙基))-，氫氧化物，內鹽)，DiSBACC4(2)(bis-(1，2-dibarbituricacid)-trimethine oxanol)，DiSBAC4(3)(bis-(1，3-dibarbituricacid)-trimethine oxanol)，CC-2-DMPE(Pacific BlueTM1，2-dietradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolmine，triethylammonium salt)和SBFI-AM(1，3-Benzenedicarboxylicacid，4，4’-[1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane-7，13-diylbis(5-methoxy-6，12-benzofurandiyl)]bis-，tettrakis[(acetyloxy)methyl]ester；(Molecular probes)。
41.權利要求34中的測試方法，其中所述熒光染料為鈣敏感性熒光染料。
42.權利要求41中的測試方法，其中通過使用自動化成像設備完成所述方法。
43.權利要求42中的試驗方法，其中所述設備為熒光板讀取器(FLIPR)。
44.權利要求42中的試驗方法，其中所述設備為電壓成像板讀取器(VIPR)。
45.權利要求42中的試驗方法，其中所述染料為fluo-3(Molecular Probes)或“mix and read”(Molecular Devices)。
46.權利要求34中的測試方法，其中所述膜電位熒光染料為熒光鈉染料。
47.鑒定能夠調節(jié)嗅覺CNG通道活性的化合物的試驗方法，包括將根據權利要求8、13、18或22任一項的測試細胞與推定的CNG通道活性調節(jié)子相接觸，并根據整個細胞或細胞膜的電生理學測量中可檢測的改變來鑒定調節(jié)子。
48.權利要求47中的試驗方法，其中所述測試細胞為真核細胞。
49.權利要求47中的試驗方法，其使用分離的測試細胞膜。
50.權利要求47中的試驗方法，其中使用腺苷酸環(huán)化酶活化子以提高細胞內cAMP。
51.權利要求47中的試驗方法，其中使用鳥苷酸環(huán)化酶活化子以提高細胞內cGMP。
52.權利要求47中的試驗方法，其中使用磷酸二酯酶抑制子來提高細胞內cAMP或cGMP。
53.權利要求47中的試驗方法，其中使用膜可透過性環(huán)核苷酸類似物以激活嗅覺CNG通道。
54.權利要求47中的試驗方法，其中使用G-蛋白-耦聯(lián)受體、腺苷酸或鳥苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶或其它能夠調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質，以提高或降低細胞內cAMP或cGMP。
55.權利要求47中的試驗方法，其用于鑒定能夠激活人類嗅覺CNG通道的分子。
56.權利要求47中的試驗方法，其用于鑒定能夠調節(jié)G-蛋白-耦聯(lián)受體、腺苷酸或鳥苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶或其它能夠調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質的分子。
57.權利要求47中的試驗方法，其中所述人類嗅覺CNG通道調節(jié)子用于調節(jié)人和其它哺乳動物的嗅覺。
58.權利要求47中的試驗方法，其中所述化合物用于調節(jié)人和其它哺乳動物的其它CNG通道。
59.包含一個或多個表達載體的宿主細胞，所述表達載體編碼多肽，所述多肽由下列核苷酸序列所編碼編碼人類OCNG1嗅覺CNG通道亞基的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO1或SEQ ID NO4具有至少95％的序列相同性；編碼人類OCNC2嗅覺CNG通道亞基的核苷酸序列，其與SEQ ID NO2具有至少95％的序列相同性；和編碼人類β1b嗅覺CNG通道亞基的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO3具有至少95％的序列相同性。
60.權利要求59中的宿主細胞，其中所述表達為穩(wěn)定的。
61.權利要求59中的宿主細胞，其中所述OCNC1序列包含于SEQ IDNO4中。
62.權利要求61中的宿主細胞，其中所述表達為穩(wěn)定的。
63.權利要求61或62中的宿主細胞，其中所述細胞為真核細胞
64.權利要求63中的宿主細胞，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
65.權利要求64中的宿主細胞，其中所述細胞為人類細胞。
66.權利要求65中的宿主細胞，其中所述細胞為HEK 293細胞。
67.監(jiān)測環(huán)核苷酸激活的離子運輸的方法，包括a)將權利要求59或61中的細胞與提高細胞內環(huán)核苷酸水平的化合物相接觸；和b)監(jiān)測細胞內離子濃度的變化。
68.權利要求67中的方法，其中所述環(huán)核苷酸選自cAMP或cGMP。
69.權利要求67中的方法，其中所述化合物為腺苷酸環(huán)化酶的活化子。
70.權利要求69中的方法，其中所述化合物為毛喉素。
71.權利要求67中的方法，其中所述化合物為G-蛋白質的活化子。
72.權利要求71中的方法，其中所述化合物為異丙腎上腺素。
73.權利要求67中的方法，其中監(jiān)測陽離子水平。
74.權利要求73中的方法，其中所述離子選自鈣或鈉。
75.監(jiān)測受體介導的環(huán)核苷酸激活的離子運輸的方法，包括a)將權利要求59或61中的細胞與結合受體并激活G-蛋白質的化合物相接觸；和b)監(jiān)測細胞內離子濃度的變化。
76.權利要求75中的方法，其中所述受體為內源性表達的。
77.權利要求76中的方法，其中所述受體為β2腎上腺素能受體。
78.權利要求75中的方法，其中所述受體通過瞬時轉染引入所述細胞內。
79.權利要求78中的方法，其中所述受體為穩(wěn)定表達的。
80.權利要求78中的方法，其中所述受體為嗅覺受體。
81.權利要求79中的方法，其中所述受體為嗅覺受體。
82.權利要求80中的方法，其中所述受體為mOREG.。
83.權利要求81中的方法，其中所述受體為mOREG。
84.權利要求47中的方法，其中所述人類嗅覺CNG通道調節(jié)子用作“藥理學探針”，以表征細胞內CNG通道的數量和組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的核酸序列，所述核酸序列編碼人類嗅覺環(huán)核苷酸門控(CNG)通道亞基，以及相應多肽。本發(fā)明進一步涉及CNG通道在表征，篩選和鑒定能夠調節(jié)人類嗅覺CNG通道的化合物中的應用。更具體的，本發(fā)明涉及在細胞中，優(yōu)選哺乳動物細胞中，表達人類嗅覺CNG通道，以及所述細胞在基于細胞的高通量檢定法中的應用，以鑒定增強或阻斷人類嗅覺CNG功能的化合物。激活嗅覺CNG通道的化合物將增強嗅覺并可被用于制備對嗅覺功能減退個體來說更適口的食品。相反的，抑制嗅覺CNG通道的化合物將抑制嗅覺并可被用于阻斷調節(jié)子。此外，本發(fā)明涉及基于細胞的嗅覺CNG通道檢定法在鑒定G－蛋白質耦聯(lián)受體(GPCRs)和其它能調節(jié)環(huán)核苷酸水平的蛋白質的調節(jié)子中的應用。
文檔編號C12N15/09GK1541223SQ02813640
公開日2004年10月27日 申請日期2002年7月8日 優(yōu)先權日2001年7月6日
發(fā)明者M·T·佐勒, 徐紅, L·斯塔斯采夫斯基, B·莫耶, A·普羅寧, J·E·阿德勒, G·瑟溫特, N·卡勒瑪拉斯, M T 佐勒, 共煞蛩夠, 弈, 章昀 , 綠, 阿德勒 申請人:塞諾米克斯公司