之間。
[0019]基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測(cè)咪唑乙煙酸的酶聯(lián)免疫試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標(biāo)板Xl塊；
(2)標(biāo)準(zhǔn)液X6 瓶:(ImL/ 瓶)O ng/mL、0.5 ng/mL、1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、13.5 ng/mL、40.5ng/mL ；
(3)抗體工作液7 mL ；
(4)酶標(biāo)二抗工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)終止液7 mL ；
(8)10X濃縮稀釋液 40 mL;
(9)10X濃縮洗滌液 40 mL;
本發(fā)明的試劑盒用于檢測(cè)樣品中咪唑乙煙酸殘留量時(shí)，通過(guò)以下步驟實(shí)施:樣品預(yù)處理、用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)、分析結(jié)果。
[0020](I)樣品預(yù)處理
稱量20 g研磨過(guò)濾后的樣品加入40 mL乙腈-甲醇溶液，在密封的容器里混合，震蕩潤(rùn)旋I min ;室溫離心4000r/min以上，1min ;耳又Iml上清液;以1:9的比例稀釋上清液,混勻待測(cè)。
[0021](2)用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中咪唑乙煙酸殘留量
取包被有咪唑乙煙酸抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ?7孔到對(duì)應(yīng)的微孔中；加入酶標(biāo)二抗工作液，50μ?7孔，然后加入咪唑乙煙酸抗體工作液，50μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ L/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；加入底物液A 50 PL/孔，底物液B 50 μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15 min ;加入終止液50 μ?/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；對(duì)比待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值大小，定量分析待測(cè)樣品中咪唑乙煙酸殘留量。
[0022](3)分析結(jié)果
百分吸光度值的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0-O ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。
[0023]以咪唑乙煙酸的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。將樣本的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中咪唑乙煙酸的實(shí)際濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，包括咪唑乙煙酸酶標(biāo)板、咪唑乙煙酸標(biāo)準(zhǔn)品、咪唑乙煙酸抗體工作液、咪唑乙煙酸酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮樣品稀釋液和濃縮洗滌液。2.檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，包括以下步驟:咪唑乙煙酸酶標(biāo)板的制備、咪唑乙煙酸標(biāo)準(zhǔn)品的制作、咪唑乙煙酸單克隆抗體及其工作液的制備、咪唑乙煙酸酶標(biāo)二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮樣品f布釋液的制備。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的咪唑乙煙酸包被抗原是將咪唑乙煙酸半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將咪唑乙煙酸抗原稀釋成1:20000比例，100 μ L/孔，37°C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L /孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ L /孔，37°〇放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的咪唑乙煙酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為O ng/mL、0.5 ng/mL、1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、13.5ng/mL、40.5ng/mL。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的咪唑乙煙酸抗體工作液是采用咪唑乙煙酸人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:50000比例制備。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的咪唑乙煙酸酶標(biāo)二抗工作液用酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋成1:5000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氣脲的梓檬酸-磷酸氣二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。7.權(quán)利要求2所述的檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，基于抗原抗體進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)，該方法包括以下步驟: (1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液工作液中； (2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻； (3)取包被有咪唑乙煙酸抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ L /孔到對(duì)應(yīng)的微孔中； (4)加入咪唑乙煙酸酶標(biāo)二抗工作液，50μ L /孔，然后加入咪唑乙煙酸抗體工作液，50μ L /孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ； (5)小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μL /孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)； (6)加入底物液A50 μ L /孔,底物液B 50 μ L /孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25 °C避光環(huán)境中反應(yīng)15min ； (7)加入終止液50μ L /孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))； (8)以標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中咪唑乙煙酸的含量。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述處理后的樣品是經(jīng)過(guò)以下處理的樣品: (1)配制乙腈-水溶液(體積比為1:1); (2)研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過(guò)一個(gè)20目的濾網(wǎng))；(3)稱量20g研磨過(guò)濾后的樣品加入40 mL乙腈-水溶液，樣品稀釋比為1:2(w/v)； (4)在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin ；(5)室溫離心4000r/min以上，1min;取Iml上清液到離心管中，50 ~60 °〇水浴氮?dú)獯蹈桑? (6)加入ImL稀釋后的樣品稀釋液充分振蕩混合30 S，混勻待測(cè)。
【專利摘要】本發(fā)明為檢測(cè)咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的制備及其檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的檢測(cè)。咪唑乙煙酸檢測(cè)試劑盒的原理是固相間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)，把提取的樣品、酶標(biāo)二抗工作液和抗體工作液加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)孔中，孵育一段時(shí)間后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里將會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，加入終止液，顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。顯色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中咪唑乙煙酸的含量成反比例關(guān)系。該方法可直接用于檢測(cè)農(nóng)作物（豆科類）中的咪唑乙煙酸含量。
【IPC分類】G01N33/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105572297
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410531005
【發(fā)明人】洪霞, 戴蔚蔚
【申請(qǐng)人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2014年10月10日