一種用于極微量樣品中atp含量測定的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于ATP含量檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于極微量樣品中ATP含量測定 的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物體內(nèi)能量的轉(zhuǎn)換和傳遞過程中，5'-三磷酸腺苷（Adenosine 5'-triphosphate，ATP)是一種關(guān)鍵物質(zhì)。線粒體是ATP合成的重要場所，其產(chǎn)生的ATP是細(xì)胞生 命活動主要能量來源。ATP與線粒體的功能狀態(tài)緊密相關(guān)，且作為關(guān)鍵的能量分子在細(xì)胞的 各種生理、病理過程中起著重要作用。ATP水平的改變，會影響諸多的細(xì)胞功能。通常細(xì)胞在 凋亡、壞死或處于一些毒性狀態(tài)下，ATP含量會下降；而高葡萄糖刺激等因素則有可能上調(diào) 某些類型細(xì)胞內(nèi)的ATP含量。因此，準(zhǔn)確測定細(xì)胞或組織中的ATP水平對于評估細(xì)胞或機(jī)體 狀態(tài)不可或缺。
[0003] 下面將結(jié)合申請人的研究領(lǐng)域，以卵母細(xì)胞和早期胚胎質(zhì)量評估為例，簡要介紹 ATP含量檢測的重要意義。近10年來我國育齡人群的不孕不育率逐年攀升，并且呈年輕化趨 勢。其中除部分由于器質(zhì)性病變引起的不孕外，大多數(shù)女性不孕不育都與卵母細(xì)胞質(zhì)量低 下密切相關(guān)。卵母細(xì)胞中所儲存的大量母源因子(包括代謝產(chǎn)物)在支持胚胎發(fā)育過程中起 著關(guān)鍵作用。因此評估卵母細(xì)胞/早期胚胎質(zhì)量對于防治不孕不育、自發(fā)流產(chǎn)和出生缺陷等 重大生殖疾病，進(jìn)一步提高人類輔助生殖成功率和保障女性生殖健康具有重大意義。
[0004] 其中ATP是卵母細(xì)胞和早期胚胎主要的能量來源，并且參與調(diào)控了卵母細(xì)胞的減 數(shù)分裂過程。在整個減數(shù)分裂活動中，精確的紡錘體組裝和染色體運(yùn)動是產(chǎn)生健康卵母細(xì) 胞的重要環(huán)節(jié)。若ATP供應(yīng)不足，可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟過程中出現(xiàn)紡錘體組裝缺陷，染色 體運(yùn)動和分離障礙，最終形成非整倍性的卵子。而非整倍性卵子的受精則是誘發(fā)妊娠失敗 和后代發(fā)育異常的最主要因素。特別是，最近越來越多的研究表明母源肥胖會導(dǎo)致卵母細(xì) 胞中線粒體功能障礙，ATP含量顯著下降。因此，測定卵母細(xì)胞和早期胚胎中的ATP含量對于 預(yù)防生殖疾病和降低出生缺陷風(fēng)險非常重要。
[0005] 盡管已有的方法和商業(yè)化試劑盒可以檢測組織和大量細(xì)胞內(nèi)的ATP含量，但是對 于像卵母細(xì)胞和早期胚胎這種珍貴且極微量的樣品目前還沒有合適可行的方法。因此，開 發(fā)一種能在單細(xì)胞水平檢測ATP的方法及試劑盒不僅對于基礎(chǔ)生物學(xué)研究至關(guān)重要，而且 對于相關(guān)的臨床檢測技術(shù)的改進(jìn)也很有意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 解決的技術(shù)問題:本發(fā)明提供一種用于極微量樣品中ATP含量測定的試劑盒及其 應(yīng)用
[0007] 技術(shù)方案：一種用于測定極微量樣品中ATP的試劑盒，包括溶液I、溶液II、溶液 III、試劑I、試劑II和試劑III，所述溶液I內(nèi)含:20mM TrisHCl pH8.1和0.01 wt. %牛血清白 蛋白混合液；溶液II內(nèi)含：0 . 〇〇425mol/L氫氧化鈉溶液；溶液III內(nèi)含：0.20mol/L鹽酸和 0.10M TrisHCl ρΗ6·6的混合液;試劑I內(nèi)含:60mM TrisHCl pH8.1、0.04wt·%牛血清白蛋 白、2mM氯化鎂、ImM二硫蘇糖醇、300μΜ D-葡萄糖、100μΜ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、4yg/ mL己糖激酶、2yg/mL無色葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；試劑II內(nèi)含：lOOmM Imidapril HC1 pH7.0、0.02wt. %牛血清白蛋白、7.5mMa-酮戊二酸單鈉鹽、7.5mM氫氧化鈉、25mM醋酸銨、 0.1 mM二磷酸腺苷、5mM葡萄糖-6-磷酸、20yg/mL谷氨酸脫氫酶、2yg/mL無色葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶；試劑ΠΙ內(nèi)含：50mM Imidapril HC1 pH7.0、lmM pH7.0乙二胺四乙酸、5mM氯化鎂、 30mM醋酸銨、100mM NADP、0.025U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶。
[0008] 所述試劑盒在測定極微量樣品ATP中的應(yīng)用。
[0009] 具體檢測步驟為：1)取樣品用溶液I反復(fù)清洗三次，轉(zhuǎn)移至PCR管中，加入3yL溶液 II，80°C加熱20分鐘，再加入2yL溶液III并混勻得堿性提取液；
[0010] 2)取堿性提取液5yL，加入等體積試劑I，在24°C下反應(yīng)20分鐘，再加入2yL 0.02mol/L氫氧化鈉溶液，90°C下反應(yīng)20分鐘，得ATP反應(yīng)產(chǎn)物;基本反應(yīng)原理如下：
[0011]
[0012] 3)取ATP反應(yīng)產(chǎn)物5yL，加入50yL試劑II，首先在37°C下反應(yīng)60分鐘，然后98°C加熱 5分鐘，取出并離心6s得循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物;基本反應(yīng)原理如下：
[0013]
[0014] 4)取循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物20yL，加入180yL試劑III，在24°C下作用10分鐘完成反應(yīng);基本 反應(yīng)原理如下：
[0015]
[0016] 5)最后測定NADPH吸光值，讀取并計(jì)算最終結(jié)果。
[0017] 上述樣品為細(xì)胞，數(shù)量為1~20個。
[0018]其中，步驟4可以在96孔板中進(jìn)行。
[0019]有益效果:本發(fā)明是根據(jù)極微量樣品代謝產(chǎn)物ATP的檢測方法設(shè)計(jì)了一種試劑盒， 通過應(yīng)用一系列酶促循環(huán)反應(yīng)(整個體系大概循環(huán)2000次），適宜在樣品極微量情況下，主 要用于單個或少數(shù)細(xì)胞中代謝產(chǎn)物ATP的定量。操作簡單，省時省力，避免了現(xiàn)配現(xiàn)用耗時 長的缺點(diǎn)，與傳統(tǒng)試劑盒方法相比較，所測結(jié)果更為精確，并提供了一種極為方便、有效的 ATP檢測試劑盒，以使該技術(shù)應(yīng)用于更大的基礎(chǔ)生物學(xué)研究領(lǐng)域，并且，對于臨床輔助生殖 技術(shù)的改進(jìn)也具有非常重要的意義。
【附圖說明】
[0020]圖1為采用市售試劑盒檢測不同數(shù)量卵母細(xì)胞所作ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0021] X-軸是指不同含量的ATP標(biāo)準(zhǔn)品(pmol)，Y-軸是指對應(yīng)的ATP熒光強(qiáng)度。
[0022]圖2為不同數(shù)量卵母細(xì)胞樣品組檢測得到的平均每個卵母細(xì)胞ΑΤΡ含量（單位為 pmol)統(tǒng)計(jì)圖。
[0023] X-軸是指不同數(shù)量卵母細(xì)胞樣品組，分別設(shè)計(jì)了 1、10個和20個卵母細(xì)胞三個樣品 組，Y-軸是指平均每個卵母細(xì)胞ATP含量(pmol)。
[0024]圖3為采用本發(fā)明微量方法檢測不同數(shù)量卵母細(xì)胞所作ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0025] X-軸是指不同含量的ATP標(biāo)準(zhǔn)品(pmol)，Y-軸是指對應(yīng)的ATP吸光值。
[0026] 圖4為不同數(shù)量卵母細(xì)胞樣品組檢測得到的平均每個卵母細(xì)胞ΑΤΡ含量(pmol)統(tǒng) 計(jì)圖。
[0027] X-軸是指不同數(shù)量的卵母細(xì)胞樣品組，分別設(shè)計(jì)了 1個卵母細(xì)胞、5個卵母細(xì)胞、10 個卵母細(xì)胞三個樣品組，Y-軸是指平均每個卵母細(xì)胞ATP含量(pmol)。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0029]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段， 所使用的試劑和材料均為市售產(chǎn)品。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 以測定小鼠卵母細(xì)胞中的ATP含量進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
[0032] 1.樣品準(zhǔn)備
[0033] 選擇ICR 3周齡小鼠卵母細(xì)胞作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用頸椎脫臼法處死小鼠后，無 菌35mm培養(yǎng)皿收集GV期卵母細(xì)胞，待用。
[0034] 2.ATP含量測定
[0035] 1)應(yīng)用目前市售的試劑盒檢測不同數(shù)量卵母細(xì)胞中的ATP含量
[0036]該試劑盒包含ATP檢測混合粉末，含有熒光素酶、熒光素、硫酸鎂、二硫蘇糖醇、乙 二胺四乙酸、牛血清白蛋白、三(羥甲基）甲基緩沖鹽，加50mL超純水至溶解待用;ATP分析混 合粉末，含有硫酸鎂、二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白、三(羥甲基）甲基緩沖鹽， 加入5mL超純水，渦旋直至溶解，調(diào)整pH7.8得ATP分析混合液待用;ATP標(biāo)準(zhǔn)液，1: 25的體積 比例稀釋待用;細(xì)胞裂解液(10X)，超純水10倍稀釋待用。
[0037]本試劑盒檢測法是基于熒光素酶在催化熒光素發(fā)光時必須有ATP、鎂離子等輔助 因子存在時才能發(fā)光的生物現(xiàn)象。因此，當(dāng)卵母細(xì)胞中ATP被特殊細(xì)胞裂解試劑釋放出來 后，ATP檢測試劑中的若干組分如熒光素、熒光素酶等與被測樣本反應(yīng)產(chǎn)生光子，再利用酶 標(biāo)儀捕捉、收集光子，檢測熒光強(qiáng)度。反應(yīng)原理如下：
[0038]