一種玉米素核苷含量測(cè)定試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域領(lǐng)域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種玉米素核苷含量測(cè)定試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物激素(planthormone)是指在植物體特定部位合成的，并從合成部位運(yùn)往植物體其他部位對(duì)植物體整個(gè)生命活動(dòng)起顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，也被稱為植物天然激素或植物內(nèi)源激素。目前公認(rèn)的植物內(nèi)源激素共有五大類(lèi)，即生長(zhǎng)素類(lèi)、細(xì)胞分裂素類(lèi)、赤霉素類(lèi)、脫落酸、乙烯。
[0003]玉米素核苷是最活躍和普遍以天然形式存在的細(xì)胞分裂素。細(xì)胞分裂素能促進(jìn)細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的增殖，抑制根的形成，延緩衰老過(guò)程和激活基因的表達(dá)和促進(jìn)一般代謝。對(duì)成熟的植物，天然細(xì)胞分裂素在最旺盛生長(zhǎng)期具有高的激素水平。
[0004]目前市面上已有的檢測(cè)激素的方法可分為三大類(lèi)，生物鑒定法，免疫檢測(cè)技術(shù)以及高效液相檢測(cè)技術(shù)。生物鑒定法雖然簡(jiǎn)單，但對(duì)樣品的純度要求較高，需要復(fù)雜的樣品前處理，同時(shí)專一性以及重復(fù)性較差。免疫檢測(cè)的方法一來(lái)容易受到交叉反應(yīng)的干擾，二來(lái)抗體的不通用性以及制備時(shí)間較長(zhǎng)，整個(gè)時(shí)間周期很長(zhǎng)。色譜技術(shù)近些年飛速發(fā)展，在植物激素的檢測(cè)中越來(lái)越廣泛。但是現(xiàn)在市面上基于高效液相色譜的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于樣品的前處理普遍繁瑣，且損失率較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種玉米素核苷含量測(cè)定試劑盒及其方法，可快速準(zhǔn)確的測(cè)算出玉米素核苷的含量。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種玉米素核苷含量測(cè)定試劑盒，包括以下試劑:
試劑一，液體X I瓶，4°C保存，由甲醇、乙酸和蒸餾水混合而成，置于60mL試劑瓶中； 試劑二，液體X I瓶，4°C保存，由石油醚組成，置于10mL試劑瓶中；
試劑三，液體X I瓶，4°C保存，由甲醇組成，置于50mL試劑瓶中；
試劑四，液體X I瓶，4°C保存，由冰乙酸組成，置于50mL試劑瓶中；
試劑五，玉米素核苷(ZR)標(biāo)準(zhǔn)品Xl支，-20°C保存，由玉米素核苷組成，置于1.5 mL EP管中。
[0007]進(jìn)一步的，所述試劑一中，甲醇的體積為45mL，乙酸的體積為3mL，蒸餾水的體積為12mL；
進(jìn)一步的，所述試劑二中，石油醚的溫度為30-60°C，體積為10mL;
進(jìn)一步的，所述試劑三中，甲醇的體積為50mL;
進(jìn)一步的，所述試劑四中，冰乙酸的體積為50mL;
進(jìn)一步的，所述試劑五中，玉米素核苷的質(zhì)量為0.5 mg。
[0008]一種基于高效液相色譜法的玉米素核苷含量測(cè)定方法，包括以下步驟:
步驟I儀器和用品的準(zhǔn)備；
高效液相色譜儀、低速離心機(jī)、氮吹儀、溶劑抽濾裝置、有機(jī)系針頭式過(guò)濾器(50個(gè)，0.224111)、水系濾膜(0.454111)、有機(jī)系濾膜(0.454111)、(:18柱(4.6 X250 mm)、可調(diào)式移液器、樣品瓶(50個(gè)，2mL)、色譜級(jí)甲醇(500 mL)和超純水；
步驟2溶劑的除雜處理；
將500 mL超純水用0.45μπι的水系濾膜抽濾，將500 mL甲醇用0.45μπι的有機(jī)系濾膜抽濾，分別除去超純水和甲醇中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱；
步驟3流動(dòng)相的配制；
取200mL除雜后的甲醇和300mL除雜后的超純水混合，并加入3mL所述試劑四，混勻，配成流動(dòng)相；
步驟4溶劑的脫泡；
將配好的流動(dòng)相超聲20分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱；
步驟5玉米素核苷的提?。?br> 稱取0.1g樣本，放入研缽中磨碎，加入ImL預(yù)冷的所述試劑一，4°C浸提過(guò)夜后，采用離心率8000g離心10分鐘，取出上清液;殘?jiān)?.5mL所述試劑一浸提2小時(shí)，離心后取出上清液;合并兩次上清液，40°C減壓蒸發(fā)至不含有機(jī)相(約剩0.3mL水溶液)，加入0.5mL所述試劑二，萃取脫色3次，棄去上層醚相，下層40°C減壓蒸干，加入0.1mL所述試劑三，溶解混勻，采用針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后待測(cè)；
步驟6標(biāo)準(zhǔn)品的配制；
在所述試劑五中加入ImL甲醇，配成500yg /mL母液，將所述母液用甲醇分別稀釋成40yg/mL、30yg/mL、20yg /mL、10yg /mL和5yg /mL的玉米素核苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別將五組不同濃度的玉米素核苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后待測(cè)；
步驟7玉米素核苷含量測(cè)定操作步驟；
1)開(kāi)啟電腦、檢測(cè)器和栗，安裝上色譜柱，打開(kāi)軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量1yL，流速0.8 mL/min，柱溫35°C，保留時(shí)間15min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，設(shè)置完畢保存方法組；
2)啟動(dòng)輸液栗，使流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，待基線穩(wěn)定后開(kāi)始加樣；
3)分別加入五組不同濃度的玉米素核苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液10yL，在15min內(nèi)可分離玉米素核苷，玉米素核苷的保留時(shí)間為6min左右，(柱子不同，保留時(shí)間有差異)，計(jì)算五組不同濃度的玉米素核苷標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；
4)加入樣品10yL，在相應(yīng)保留時(shí)間處檢測(cè)溶液的峰面積；
步驟8玉米素核苷含量的計(jì)算；
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)計(jì)算玉米素核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品玉米素核苷含量。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:
1、采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行的玉米素核苷含量方法的樣本前處理過(guò)程簡(jiǎn)單易操作，只需石油醚萃取就可上樣檢測(cè)，大大節(jié)省了測(cè)試時(shí)間。
[0010]2、采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行的玉米素核苷含量方法的提取液成分簡(jiǎn)單，只需甲醇跟水的混合溶液(pH=3)提取，大大降低了測(cè)試成本。
[0011]3、采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行的玉米素核苷含量方法的測(cè)定步驟都是儀器自動(dòng)化操作，可以連續(xù)檢測(cè)上百樣品，讀取準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，而且每一個(gè)樣品只需十分鐘時(shí)間，相比其他方法時(shí)間大大縮短。
[0012]上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】由以下實(shí)施例詳細(xì)給出。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面將結(jié)合實(shí)施例，來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0014]—種玉米素核苷含量測(cè)定試劑盒，包括以下試劑:
試劑一，液體X I瓶，4°C保存，由45mL甲醇、3mL乙酸和12mL蒸餾水混合而成，置于60mL試劑瓶中；
試劑二，液體X I瓶，4°C保存，由10mL溫度在30-60°C的石油醚組成，置于10mL試劑瓶中；
試劑三，液體X I瓶，4°C保存，由50mL甲醇組成，置于50mL試劑瓶中；
試劑四，液體X I瓶，4°C保存，由50mL冰乙酸組成，置于50mL試劑瓶中；
試劑五，玉米素核苷(ZR)標(biāo)準(zhǔn)品X I支，_20°C保存，由0.5 mg玉米素核苷組成，置于1.5mL EP管中。
[0015]玉米素核苷在254nm下有吸收峰，可以利用高效液相色譜法測(cè)定其含量。
[0016]—種基于高效液相色譜法且利用上述試劑盒的玉米素核苷含量測(cè)定方法，包括以下步驟:
步驟I儀器和用品的準(zhǔn)備；
高效液相色譜儀、低速離心機(jī)、氮吹儀、溶劑抽濾裝置、有機(jī)系針頭式過(guò)濾器(50個(gè)，
0.224111)、