專(zhuān)利名稱：一種從微量樣品中提取dna的試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，還 涉及從微量樣品中提取DNA的方法。
背景技術(shù)：
DNA，中文譯名為脫氧核糖核酸，是染色體的主要組成成分。DNA是最重要的生物信 息分子，可組成遺傳指令，以引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機(jī)能運(yùn)作，主要功能是貯存決定物種性狀 的幾乎所有蛋白質(zhì)和RNA分子的全部遺傳信息；編碼和設(shè)計(jì)生物有機(jī)體在一定的時(shí)空中有 序地轉(zhuǎn)錄基因和表達(dá)蛋白完成定向發(fā)育的所有程序；初步確定了生物獨(dú)有的性狀和個(gè)性以 及和環(huán)境相互作用時(shí)所有的應(yīng)激反應(yīng)。由于DNA在生物生長(zhǎng)發(fā)育中扮演如此重要的角色， 使得它成為分子生物學(xué)研究人員的重要研究對(duì)象，因此基因組DNA的分離純化就成為分子 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的技術(shù)之一。不同來(lái)源的材料因材料起始量、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其成分的不同，所提取的基因組DNA 有很大差異。因此，充足的材料起始量對(duì)提取足夠用于下游實(shí)驗(yàn)的基因組DNA非常關(guān)鍵。但 是，并非所有情況下起始材料都充足，例如法醫(yī)材料、考古材料等獲取量非常少，另外醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域中越來(lái)越傾向于通過(guò)獲取微量樣本來(lái)進(jìn)行疾病診斷，例如通過(guò)口腔拭子、漱口水、唾液 等采集口腔脫落細(xì)胞，或者采集極少量血液來(lái)進(jìn)行疾病診斷。采集微量樣本不僅減少了患 者的憂慮和痛苦，而且采集方式快速、柔和。因此，微量樣品的基因組DNA的有效提取成為 實(shí)現(xiàn)上述領(lǐng)域的目標(biāo)的關(guān)鍵性步驟。目前常用的基因組DNA分離純化方法有SDS/苯酚/氯仿抽提法、高鹽沉淀法、離 子交換法和硅介質(zhì)選擇性吸附法等，這些方法在提取各種材料的基因組DNA時(shí)具有一些本 身的優(yōu)點(diǎn)，但這些方法在提取微量樣品時(shí)面臨無(wú)法有效提取DNA、操作步驟繁瑣等缺點(diǎn)。針對(duì)以上分離純化技術(shù)的問(wèn)題，現(xiàn)在分離純化DNA大都采用離心柱法，即通過(guò)內(nèi) 嵌玻璃纖維素膜吸附從樣品中裂解出的DNA，漂洗雜質(zhì)后再將DNA洗脫下來(lái)。離心柱法雖然 能夠提取DNA并保證其純度，但是其提取DNA的量普遍不高，無(wú)法滿足法醫(yī)檢測(cè)、考古分析 和醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域的要求。此外，離心柱法使用到一些有毒試劑，如苯酚、氯仿等，不利于實(shí) 驗(yàn)人員的身體健康；同時(shí)，離心柱法在整個(gè)提取DNA的過(guò)程中耗時(shí)較多，影響了下一步分析 檢測(cè)的速度。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，采用本 試劑盒提取DNA的含量較高。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種從微量樣品中提取DNA的方法，該方法耗時(shí) 短，不使用有毒試劑，所提DNA含量和純度較高。本發(fā)明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括結(jié)合液、調(diào)節(jié)結(jié)合液和去蛋白液，所述結(jié)合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 55-50mM 的 Tris-HCl、5-25 % 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 禾Π 5 % 的 Tween20，所述調(diào)節(jié)結(jié)合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、pH6. 5-8. O 5_50mM 的Tris-HCl和5-50%的無(wú)水乙醇。本發(fā)明所述結(jié)合液主要用來(lái)進(jìn)一步裂解細(xì)胞，并且提供磁珠與基因組DNA結(jié)合的 環(huán)境；調(diào)節(jié)結(jié)合液用于促進(jìn)磁珠與基因組DNA的結(jié)合，使基因組DNA和磁珠形成磁珠-DNA 復(fù)合物，而蛋白、RNA以及其他代謝產(chǎn)物不能結(jié)合在磁珠上；去蛋白液能有效去除磁珠上殘 余的蛋白質(zhì)，并且保證基因組DNA不會(huì)損失。優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 410mM的Tris_HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優(yōu)選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙醇。本發(fā)明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒還包括預(yù)處理緩沖液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脫液，所述預(yù)處理緩沖液pH值為7. 2， 包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2P04、8mM 的 K2HPO4，所述裂解液包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 05-50mM 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2 % 的 SDS，所述磁珠 為一種核心為Fe3O4、外周包裹了 二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50 %的無(wú)水乙醇和10-50 %的異丙醇，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-50mM 的 Tris-HCl。本發(fā)明所述預(yù)處理緩沖液是一種不含核酸酶的磷酸鹽緩沖液，主要用來(lái)預(yù)處理樣 品；裂解液為DNA的提取提供了最優(yōu)的緩沖條件，既能強(qiáng)烈抑制DNase的活性，又能高效裂 解微量樣品釋放DNA ；磁珠采用Promega公司產(chǎn)品，該磁珠在磁場(chǎng)的存在下能迅速聚集，離 開(kāi)磁場(chǎng)能夠均勻分散，不出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；漂洗液可以去除磁珠上吸附的雜質(zhì)，如多糖、纖維 素、脂類(lèi)及提取過(guò)程中殘留的胍鹽、SDS等，同時(shí)保證基因組DNA不會(huì)損失；洗脫液可以有效 的將磁珠上結(jié)合的基因組DNA洗脫下來(lái)。優(yōu)選地，所述裂解液包含0. IM的NaCl、pH8. OlOmM的Tris_HCl、25mM的EDTA和 0. 5%的 SDS0優(yōu)選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25%的無(wú)水乙醇 和25%的異丙醇。優(yōu)選地，所述洗脫液為pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。本發(fā)明還提供一種從微量樣品中提取DNA的方法，包括以下步驟步驟1、將樣品進(jìn)行預(yù)處理后充分裂解，所述樣品為血液、血跡、唾液、口腔拭子、漱 口水或毛發(fā)；步驟2、向裂解后所得溶液加入結(jié)合液混勻并靜置，所得混合液加入調(diào)節(jié)結(jié)合液再 次混勻，然后與磁珠充分作用，所述結(jié)合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5_50mM的 Tris-HCl、5-25% 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 和 5% 的 Tween20，所述 調(diào)節(jié)結(jié)合液為異丙醇；步驟3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混勻，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、 pH6. 5-8. 0 5-50mM 的 Tris-HCl 和 5-50% 的無(wú)水乙醇；步驟4、漂洗所述磁珠，然后洗脫所述磁珠上結(jié)合的DNA。
優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM的Tris_HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優(yōu)選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙醇。其中，步驟2所述加入調(diào)節(jié)結(jié)合液的量為0. 5-1倍于混合液體積，優(yōu)選為0. 8倍 于混合液體積，所述靜置為在55-70°C下靜置5-15min，優(yōu)選地，所述裂解為在70°C下靜置 IOmin0其中，所述預(yù)處理采用pH值為7. 2，包含135mM的NaCl、2. 7mM的KC1、1. 5mM的 KH2PO4^SmM的K2HPO4的預(yù)處理緩沖液進(jìn)行預(yù)處理。所述預(yù)處理包括對(duì)固體樣品需要將其處 理成適合提取的體積和形狀；對(duì)液體樣品需要加入一定量預(yù)處理緩沖液補(bǔ)足至合適體積其中，其中所述裂解采用包含0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 0 5_50mM 的 Tris-HCl、 10-50mM的EDTA和0. 25-2%的SDS的裂解液進(jìn)行裂解，優(yōu)選地，采用包含0. IM的NaCl、 pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5%的 SDS 進(jìn)行裂解。其中，所述磁珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠。其中，所述漂洗采用包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的 Tris-HCl、50_200mM 的 NaCl、 10-50%的無(wú)水乙醇和10-50%的異丙醇的漂洗液進(jìn)行漂洗，優(yōu)選地，采用包含pH7. 5IOmM 的Tris-HClUOOmM的NaCl、25%的無(wú)水乙醇和25%的異丙醇進(jìn)行漂洗。其中，所述洗脫采用pH7. 0-8. 5 5_50mM的Tris-HCl進(jìn)行洗脫，優(yōu)選地，采用pH8. 0 IOmM的Tris-HCl進(jìn)行洗脫。本發(fā)明所述方法采用磁珠吸附法，通過(guò)預(yù)處理緩沖液、裂解液、結(jié)合液、調(diào)節(jié)結(jié)合 液、磁珠、去蛋白液、漂洗液、洗脫液從微量樣品中提取DNA。其中，生物磁珠是一種新型的亞 微米級(jí)或納米級(jí)的功能化載體，包括磁性顆粒和有活性基團(tuán)的超順磁性材料。生物磁珠是 分散在基液中而形成的磁性液體材料，超順磁性材料在一定條件下可以在溶液中分散，而 在外磁場(chǎng)作用下可以定向運(yùn)動(dòng)和富集。因此，生物磁珠兼具有液體的流動(dòng)性和固體磁性材 料的特點(diǎn)，在外磁場(chǎng)的作用下可以定向移動(dòng)或集中，撤去外磁場(chǎng)后稍加振蕩或抽吸又可均 勻分散于液體中，從而使固液相的分離變得十分快捷方便，通過(guò)簡(jiǎn)單的洗脫就可以得所提 DNA。本發(fā)明根據(jù)不同樣品耗時(shí)不同，微量血液樣品可以在30分鐘內(nèi)完成，血跡、唾液、 漱口水、口腔拭子等可以在60分鐘內(nèi)完成，毛發(fā)等難以裂解的樣品一般可在2小時(shí)內(nèi)完成， 相比常見(jiàn)的離心柱提取法，提取時(shí)間均不同程度縮短。采用本發(fā)明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒及方法，所提DNA含量高、純度 高，提取速度快，不采用有毒試劑。


圖1示從干血點(diǎn)中提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量 Marker，從上至下依次為 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、 2322bp ；泳道1 本發(fā)明從干血點(diǎn)中提取的DNA條帶；泳道2 離心柱法從干血點(diǎn)中提取的DNA條帶；
圖2示從唾液中提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量 Marker，從上至下依次為 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、 2322bp ； 泳道1 本發(fā)明從唾液中提取的DNA條帶；泳道2 離心柱法從唾液中提取的DNA條帶；圖3示從毛發(fā)中提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量 Marker，從上至下依次為 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、 2322bp ；泳道1 本發(fā)明從毛發(fā)中提取的DNA條帶；泳道2 離心柱法從毛發(fā)中提取的DNA條帶；
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒及其方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本 領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的試劑盒及方法已 經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本 文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明，所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括結(jié)合液、調(diào)節(jié)結(jié)合液和去蛋白液，所述結(jié)合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5-50mM 的 Tris-HCl、5-25 % 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 禾Π 5 % 的 Tween20，所述調(diào)節(jié)結(jié)合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl和5-50%的無(wú)水乙醇。本發(fā)明所述結(jié)合液主要用來(lái)進(jìn)一步裂解細(xì)胞，并且提供磁珠與基因組DNA結(jié)合的 環(huán)境；調(diào)節(jié)結(jié)合液用于促進(jìn)磁珠與基因組DNA的結(jié)合，使基因組DNA和磁珠形成磁珠-DNA 復(fù)合物，而蛋白、RNA以及其他代謝產(chǎn)物不能結(jié)合在磁珠上；去蛋白液能有效去除磁珠上殘 余的蛋白質(zhì)，并且保證基因組DNA不會(huì)損失。優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM的Tris-HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優(yōu)選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙醇。本發(fā)明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒還包括預(yù)處理緩沖液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脫液，所述預(yù)處理緩沖液pH值為7. 2， 包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2P04、8mM 的 K2HPO4，所述裂解液包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 05-50mM 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2 % 的 SDS，所述磁珠 為一種核心為Fe3O4、外周包裹了 二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50 %的無(wú)水乙醇和10-50 %的異丙醇，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-50mM 的 Tris-HCl。本發(fā)明所述預(yù)處理緩沖液是一種不含核酸酶的磷酸鹽緩沖液，主要用來(lái)預(yù)處理樣 品；裂解液為DNA的提取提供了最優(yōu)的緩沖條件，既能強(qiáng)烈抑制DNase的活性，又能高效裂解微量樣品釋放DNA ；磁珠采用Promega公司產(chǎn)品，該磁珠在磁場(chǎng)的存在下能迅速聚集，離 開(kāi)磁場(chǎng)能夠均勻分散，不出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；漂洗液可以去除磁珠上吸附的雜質(zhì)，如多糖、纖維 素、脂類(lèi)及提取過(guò)程中殘留的胍鹽、SDS等，同時(shí)保證基因組DNA不會(huì)損失；洗脫液可以有效 的將磁珠上結(jié)合的基因組DNA洗脫下來(lái)。優(yōu)選地，所述裂解液包含0. IM的NaCl、pH8. O IOmM的Tris_HCl、25mM的EDTA和 0. 5%的 SDS0優(yōu)選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25%的無(wú)水乙醇 和25%的異丙醇。優(yōu)選地，所述洗脫液為pH8. O IOmM的Tris-HCl。本發(fā)明還提供一種從微量樣品中提取DNA的方法，包括以下步驟步驟1、將樣品進(jìn)行預(yù)處理后充分裂解，所述樣品為血液、血跡、唾液、口腔拭子、漱 口水或毛發(fā)；步驟2、向裂解后所得溶液加入結(jié)合液混勻并靜置，所得混合液加入調(diào)節(jié)結(jié)合液再 次混勻，然后與磁珠充分作用，所述結(jié)合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5_50mM的 Tris-HCl、5-25% 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 和 5% 的 Tween20，所述 調(diào)節(jié)結(jié)合液為異丙醇；步驟3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混勻，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、 pH6. 5-8. O 5-50mM 的 Tris-HCl 和 5-50% 的無(wú)水乙醇；步驟4、漂洗所述磁珠，然后洗脫所述磁珠上結(jié)合的DNA。優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM的Tris_HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優(yōu)選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 525mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙其中，步驟2所述加入調(diào)節(jié)結(jié)合液的量為0. 5-1倍于混合液體積，優(yōu)選為0. 8倍 于混合液體積，所述靜置為在55-70°C下靜置5-15min，優(yōu)選地，所述裂解為在70°C下靜置 IOmin0其中，所述預(yù)處理采用pH值為7. 2，包含135mM的NaCl、2. 7mM的KC1、1. 5mM的 KH2PO4^SmM的K2HPO4的預(yù)處理緩沖液進(jìn)行預(yù)處理。所述預(yù)處理包括對(duì)固體樣品需要將其處 理成適合提取的體積和形狀；對(duì)液體樣品需要加入一定量預(yù)處理緩沖液補(bǔ)足至合適體積其中，其中所述裂解采用包含0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 0 5_50mM 的 Tris_HCl、 10-50mM的EDTA和0. 25-2%的SDS的裂解液進(jìn)行裂解，優(yōu)選地，采用包含0. IM的NaCl、 pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5% 的 SDS 進(jìn)行裂解。其中，所述磁珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠。其中，所述漂洗采用包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的 Tris-HCl、50_200mM 的 NaCl、 10-50%的無(wú)水乙醇和10-50%的異丙醇的漂洗液進(jìn)行漂洗，優(yōu)選地，采用包含pH7. 5 IOmM 的Tris-HClUOOmM的NaCl、25%的無(wú)水乙醇和25%的異丙醇進(jìn)行漂洗。其中，所述洗脫采用pH7. 0-8. 5 5_50mM的Tris-HCl進(jìn)行洗脫，優(yōu)選地，采用pH8. 0 IOmM的Tris-HCl進(jìn)行洗脫。本發(fā)明根據(jù)不同樣品耗時(shí)不同，微量血液樣品可以在30分鐘內(nèi)完成，血跡、唾液、漱口水、口腔拭子等可以在60分鐘內(nèi)完成，毛發(fā)等難以裂解的樣品一般可在2小時(shí)內(nèi)完成， 相比常見(jiàn)的離心柱提取法，提取時(shí)間均不同程度縮短。取相同質(zhì)量的干血點(diǎn)采用本發(fā)明的方法和離心柱法分別提取DNA，本發(fā)明所提 取的DNA的含量為0. 54 μ g, 0D260/0D280值為1. 78 ；離心柱法所提取的DNA的含量為 0. 19 μ g, 0D260/0D280 值為 2. 08。取相同質(zhì)量的唾液采用本發(fā)明的方法和離心柱法分別提取DNA，本發(fā)明所提取的 DNA的含量為1. 35 μ g,0D260/0D280值為1. 98 ；離心柱法所提取的DNA的含量為1. 05 μ g， 0D260/0D280 值為 2. 02。取相同質(zhì)量的毛發(fā)采用本發(fā)明的方法和離心柱法分別提取DNA，本發(fā)明所提取的 DNA的含量為3. 14 μ g，0D260/0D280值為1. 85 ；離心柱法所提取的DNA的含量為0. 81 μ g， 0D260/0D280 值為 1. 95。以上實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明從各種微量樣品中所提取的DNA總量均明顯高于離心柱法 所提取的DNA，并且其0D260/0D280值均接近于標(biāo)準(zhǔn)值1. 8，表明DNA純度較高。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1 本發(fā)明所述試劑盒本發(fā)明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括預(yù)處理緩沖液pH值為 7. 2，包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2PO4、8mM W K2HPO40 具體配制方法分別稱取 0. 8gNaCl、0. 02g KC1、0. 024g KH2P04、0. 18g K2HPO4，加 適量蒸餾水分別溶解后混合，再用HCl調(diào)pH7. 2，然后定容到100ml。裂解液0.IM 的 NaCl、pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5% 的 SDS。具 體配制方法分別量取 IM 的 Tris-HCl (pH 為 8. 0) lml.O. 5M 的 EDTA(pH 為 8. 0)5ml、5M 的 NaCl 2ml、10%的SDS 5ml，加入適量蒸餾水后定容到100ml。結(jié)合液4.5M 的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM 的 Tris_HCl、20 % 的 Ttiton-X 100、 IOmM的UreaUOmM的EDTA和5 %的Tween20。具體配制方法分別稱取53. 172g異硫氰 酸胍和0. 06g Urea,加入適量蒸餾水分別溶解，然后加入IM的Tris-HCl (pH為4. 4) 1ml、 0.5M EDTA (pH 為 8. 0) 2ml、Triton-X 10020ml、Tween20 5ml，50°C加熱攪拌溶解，然后定容 到 100ml。調(diào)節(jié)結(jié)合液分析純的異丙醇。生物磁珠核心為Fe3CV外周包裹二氧化硅，Promega公司產(chǎn)品。磁性分離架內(nèi)置磁鐵。去蛋白液6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙醇。具體配制 方法稱取57. 3g鹽酸胍，加蒸餾水充分溶解，然后加入IM的Tris-HCl (pH為7. 5) 2. 5ml、 無(wú)水乙醇37ml，定容到100ml，充分混勻。漂洗液pH7. 5 IOmM的Tris-HClUOOmM的NaCl、25%的無(wú)水乙醇和25%的異丙 醇。具體配制方法量取PH值為7. 5、濃度為IM的Tris-HCl 1ml，再量取5M的NaCl 2ml, 加入適量的蒸餾水混勻，再加入25ml的無(wú)水乙醇和25ml的異丙醇，定容到100ml，充分混勻。洗脫液pH8·0 IOmM 的 Tris-HCl。實(shí)施例2 從干血點(diǎn)中提取DNA
利用實(shí)施例1所述試劑盒從干血點(diǎn)中提取DNA。1、提取試劑預(yù)處理緩沖液pH值為 7. 2，包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2PO4、8mM 的 K2HPO4。裂解液0.IM 的 NaCl、pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 禾口 0. 5% 的 SDS。結(jié)合液4.5M 的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM 的 Tris_HCl、20% 的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。調(diào)節(jié)結(jié)合液分析純的異丙醇。生物磁珠核心為Fe3CV外周包裹二氧化硅，Promega公司產(chǎn)品。磁性分離架內(nèi)置磁鐵。去蛋白液6M的鹽酸胍、pH7. 525mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙醇。漂洗液pH7. 510mM的Tris-HCl、IOOmM的NaCl、25 %的無(wú)水乙醇和25%的異丙洗脫液pH8.0 IOmM 的 Tris-HCl。2、提取方法(1)取帶有干血點(diǎn)(直徑2mm)的濾紙放入1. 5ml離心管，加入200 μ 1組織裂解液 和20 μ 1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混勻，56°C放置30-60min，期間不斷渦旋混勻直至血 跡被洗脫下來(lái)。(2)避開(kāi)濾紙將上清移至另一 1. 5ml離心管中，加入200 μ 1結(jié)合液，立刻渦旋振蕩 充分混勻，在70°C放置lOmin，每隔2min顛倒混勻一次。(3)冷卻后加入10 μ 1磁珠及350 μ 1異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。(4)室溫孵育5min，每隔2min輕微渦旋一次。孵育完畢后將離心管置于磁性分離 架上20s，勿將離心管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(5)加入300 μ 1去蛋白液，渦旋混勻后將離心管置于磁性分離架上20s，勿將離心 管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(6)加入500 μ 1漂洗液，渦旋混勻后將離心管置于磁性分離架上20s，勿將離心管 取下直接傾倒上清，重復(fù)此步驟1-2次。最后一次漂洗結(jié)束后，用移液器小心吸盡殘液，室 溫瞭干5min。(7)加50μ 1洗脫液，渦旋混勻后56°C放置5min，期間不斷渦旋混勻，將離心管置 于磁性分離架上20s，將上清移至另一干凈離心管中，即得基因組DNA。3、所提DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)同樣取上述本發(fā)明提取方法中所述帶有干血點(diǎn)(直徑2mm)的濾紙，采用離心柱法 提取DNA，采用本發(fā)明方法提取的干血點(diǎn)DNA與離心柱法提取的干血點(diǎn)DNA進(jìn)行1 %瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)，上樣量為5 μ 1，電壓為100V，電泳時(shí)間為25min，結(jié)果參見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示， 本發(fā)明方法所提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示出單一的目的條帶，沒(méi)有出現(xiàn)雜帶， 并且條帶亮度明顯亮于離心柱法提取的干血點(diǎn)DNA，表明本發(fā)明方法提取的干血點(diǎn)DNA含 量和純度較高。4、所提DNA的含量及0D260/0D280值檢測(cè)使用分光光度計(jì)對(duì)采用本發(fā)明方法提取的干血點(diǎn)DNA與離心柱法提取的干血點(diǎn)DNA進(jìn)行含量和0D260/0D280值檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)表1。
表1 DNA的含量及0D260/0D280值檢測(cè)
材料本發(fā)明方法離心柱法DNA總量OD26O/OD28ODNA總量OD260/OD280干血點(diǎn)1.780.19μ82.08結(jié)果顯示，本發(fā)明所提取的DNA總量明顯高于離心柱法提取的DNA總量，此外本發(fā) 明所提取的DNA的0D260/0D280值與標(biāo)準(zhǔn)值(1. 8)無(wú)明顯差異，表明本發(fā)明方法提取的干 血點(diǎn)DNA含量和純度較高。實(shí)施例3 從唾液中提取DNA1、本發(fā)明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒本發(fā)明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括預(yù)處理緩沖液pH值為 7. 2，包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2PO4、8mM 的 K2HPO4。裂解液0.05M 的 NaCl、pH6. 5 5mM 的 Tris-HClUOmM 的 EDTA 禾Π 0. 25% 的 SDS。結(jié)合液3Μ的異硫氰酸胍、ρΗ3. 5 5mM 的 Tris_HCl、5% 的 Ttiton-Xl00、5mM 的 Urea、5mM 的 EDTA 禾口 5% 的 Tween20。調(diào)節(jié)結(jié)合液分析純的異丙醇。生物磁珠核心為Fe3O4、外周包裹二氧化硅，Promega公司產(chǎn)品。磁性分離架內(nèi)置磁鐵。去蛋白液2M的鹽酸胍、pH6. 5 5mM的Tris-HCl和5%的無(wú)水乙醇。漂洗液pH6. 55mM的Tris_HCl、50mM的NaCl、10%的無(wú)水乙醇和10%的異丙醇。洗脫液pH7.05mM 的 Tris-HCl。2、提取方法采用上述提取試劑從唾液中提取DNA。(1)取10 μ 1新鮮的唾液放入1. 5ml離心管，補(bǔ)加預(yù)處理緩沖液至500 μ 1，顛倒混 勻后12000rpm離心5min，棄上清。(2)加入200μ 1組織裂解液和20μ 1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分重懸沉淀， 56°C孵育15min，每隔5min渦旋混勻一次。(3)加入200 μ 1結(jié)合液，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70°C放置lOmin，每隔2min顛 倒混勻一次。(4)冷卻后加入20 μ 1磁珠及350 μ 1異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。(5)室溫孵育5min，每隔2min輕微渦旋一次。孵育完畢后將離心管置于磁性分離 架上20s，勿將離心管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(6)加入300 μ 1去蛋白液，渦旋混勻后室溫靜置l-2min，將離心管置于磁性分離 架上20s，勿將離心管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(7)加入500 μ 1漂洗液，渦旋混勻后將離心管置于磁性分離架上20s，勿將離心管 取下直接傾倒上清，重復(fù)此步驟1-2次。最后一次漂洗結(jié)束后，用移液器小心吸盡殘液，室溫瞭干5min。(8)加100 μ 1洗脫液，渦旋混勻后56°C放置5min，期間不斷渦旋混勻，將離心管置 于磁性分離架上20s，將上清移至另一干凈離心管中，即得基因組DNA。3、所提DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)同樣取上述本發(fā)明提取方法中所述新鮮唾液10μ 1，用離心柱法提取DNA，采用本 發(fā)明方法提取的唾液DNA與離心柱法提取的唾液DNA進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣 量為5 μ 1，電壓為100V，電泳時(shí)間為25min，結(jié)果參見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，本發(fā)明方法所提取的 DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示出單一的目的條帶，沒(méi)有出現(xiàn)雜帶，并且條帶亮度明顯亮于 離心柱法提取的唾液DNA，表明本發(fā)明方法提取的唾液DNA含量和純度較高。4、所提DNA的含量及0D260/0D280值檢測(cè)使用分光光度計(jì)對(duì)采用本發(fā)明方法提取的唾液DNA與離心柱法提取的唾液DNA進(jìn) 行含量和0D260/0D280值檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)表2。表2 DNA的含量及0D260/0D280值檢測(cè)
權(quán)利要求
一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括結(jié)合液、調(diào)節(jié)結(jié)合液和去蛋白液，所述結(jié)合液包含3 8M的異硫氰酸胍、pH3.5 5.5 5 50mM的Tris HCl、5 25％的Ttiton X 100、5 20mM的Urea、5 20mM的EDTA和5％的Tween20，所述調(diào)節(jié)結(jié)合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2 8M的鹽酸胍、pH6.5 8.0 5 50mM的Tris HCl和5 50％的無(wú)水乙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述結(jié)合液包含4.5M的異硫氰酸胍、 pH4. 4 IOmM 的 Tris_HCl、20 % 的 Ttiton-X IOOUOmM 的 UreaUOmM 的 EDTA 和 5 % 的 Tween20o
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7.5 25mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括預(yù)處理緩沖液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脫液，所述預(yù)處理緩沖液PH值為7. 2，包 含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2P04、8mM 的 K2HPO4,所述裂解液包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 0 5-50mM 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2 % 的 SDS，所述磁 珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50 %的無(wú)水乙醇和10-50 %的異丙醇，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-50mM 的 Tris-HCl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述裂解液包含0.IM的NaCl、pH8. 0 IOmM 的 Tris-HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5% 的 SDS，所述漂洗液包含 pH7. 5 IOmM 的 Tris-HCl、 IOOmM的NaCl、25%的無(wú)水乙醇和25%的異丙醇，所述洗脫液為pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。
6.一種從微量樣品中提取DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1、將樣品進(jìn)行預(yù)處理后充分裂解，所述樣品為血液、血跡、唾液、口腔拭子、漱口水 或毛發(fā)；步驟2、向裂解后所得溶液加入結(jié)合液混勻并靜置，所得混合液加入調(diào)節(jié)結(jié)合液再次 混勻，然后與磁珠充分作用，所述結(jié)合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5-50mM的 Tris-HCl、5-25% 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 和 5% 的 Tween20，所述 調(diào)節(jié)結(jié)合液為異丙醇；步驟3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混勻，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、 pH6. 5-8. 0 5-50mM 的 Tris-HCl 和 5-50% 的無(wú)水乙醇；步驟4、漂洗所述磁珠，然后洗脫所述磁珠上結(jié)合的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述結(jié)合液包含4.5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM 的 Tris-HCl、20% 的 Ttiton-X IOOUOmM 的 UreaUOmM 的 EDTA 禾Π 5% 的 Tween20，所 述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 525mM的Tris-HCl和37%的無(wú)水乙醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，步驟2所述加入調(diào)節(jié)結(jié)合液的量為0.5-1倍 于混合液體積。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，步驟2所述靜置為在55-70°C下作用 5-15min。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述預(yù)處理采用PH值為7.2，包含135mM的 NaCl,2. 7mM的KC1、1. 5mM的KH2P04、8mM的K2HPO4的預(yù)處理緩沖液進(jìn)行預(yù)處理，所述裂解采用包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 05_50m M 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2% 的 SDS 的裂解液進(jìn)行裂解，所述磁珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗采 用包含 pH6. 5-8. 0 5-50mM 的 Tris-HCl、50_200mM 的 NaCl、10-50% 的無(wú)水乙醇和 10-50% 的異丙醇的漂洗液進(jìn)行漂洗，所述洗脫采用PH7. 0-8. 5 5-50mM的Tris-HCl進(jìn)行洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，還公開(kāi)了一種從微量樣品中提取DNA的方法。該試劑盒包括結(jié)合液、調(diào)節(jié)結(jié)合液和去蛋白液，所述結(jié)合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3.5-5.55-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述調(diào)節(jié)結(jié)合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的無(wú)水乙醇。本發(fā)明所述試劑盒及方法提取的DNA含量和純度較高，提取速度快，不采用有毒試劑，適用于提取各種微量樣品的DNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101935646SQ20101028159
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者李艷萍 申請(qǐng)人:原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司