宮頸細胞保存及dna快速提取一體試劑盒和提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明設(shè)及宮頸細胞和病毒微生物DNA 快速提取方法及保存提取一體試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是中國女性第二大常見的惡性腫瘤，研究證明，超過99%的宮頸癌都與人 乳頭瘤病毒化PV)相關(guān)，同時宮頸癌還是唯一病因明確，可早期發(fā)現(xiàn)早期預(yù)防的癌癥，因此 對HPV的篩查對預(yù)防宮頸癌有著重要意義。HPV的檢測過程都要設(shè)及宮頸樣本的采樣、保 存、運輸及DNA的提取。同時，由于HPV檢測多數(shù)是用于臨床檢測，因此簡單的實驗操作和 對儀器設(shè)備更少的依賴是HPV檢測用DNA提取試劑盒必須擁有的一個特點。
[0003] 目前宮頸細胞多使用液基細胞保存液進行保存，液基細胞保存液可W保證細胞形 態(tài)的完整性，用于后期的病理檢測。但是液基細胞學(xué)中加有甲醇、甲醒等固定液，其對DNA 有較強的破壞性，對后期的PCR等檢測有著較為嚴重的影響。而且甲醒和甲醇都具有一定 毒性，對操作人員的健康也存在著一定的危害。另外，目前大部分保存液都需要在干冰或冰 盒的保護下進行運輸，運樣也無疑增加了運輸成本和工作量。
[0004] 目前使用DNA提取試劑盒進行DNA的提取工作一般主要分為裂解、洗涂和洗脫等 幾個步驟，而對DNA產(chǎn)量最為關(guān)鍵的步驟為裂解步驟，如果裂解的時間較短，會導(dǎo)致DNA產(chǎn) 量過低，從而使得后期檢測的靈敏度下降，目前一般是將細胞樣本置于裂解液中，并于一定 溫度下解育10~15min，在解育期間還需顛倒混勻幾次，W保證裂解的充分進行，裂解步驟 較為繁瑣，

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu) 點。
[0006] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種宮頸細胞保存及DNA快速提取一體試劑盒，其保 護液可對置于其中的宮頸樣本DNA穩(wěn)定性進行長時間的保持，W保證臨床檢驗質(zhì)量，且在 DNA的后續(xù)提取時無需裂解步驟，操作簡便快捷。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的是通過提供一種DNA提取的方法，其利用簡單的取液器和離 屯、機設(shè)備即可進行DNA的提取，且提取快速，得到的DNA純度高，保證了后續(xù)的PCR檢驗結(jié) 果的準確性。
[0008] 為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的運些目的和其它優(yōu)點，提供了一種宮頸細胞保存及DNA快 速提取一體試劑盒，其包括細胞保存液、第一洗涂液、第二洗涂液、洗脫液及DNA純化柱；
[0009] 其中，所述細胞保存液含有2~3mol/L鹽酸脈或硫氯酸脈、5~50mmol/L的 Tris-HCl、l~lOmmol/L的邸TA和 5 ~7. 5v/v%的Trixon-100。
[0010] 其中，細胞保存液中的化ixon-100可破壞細胞膜，并解聚胞內(nèi)與DM結(jié)合的蛋白， 較高濃度鹽酸脈或硫氯酸脈的加入可進一步破壞核蛋白的二級結(jié)構(gòu)，并使胞內(nèi)的核酸酶失 活，不但利于DM的提取，且可防止其在后期膽存過程中的降解。此外，邸ΤΑ的添加也可通 過馨合金屬離子，抑制核酸酶對DNA的降解作用，Tris-肥1緩沖液的添加可提高DNA在膽 存過程中的穩(wěn)定性。將采集的宮頸樣本置于本發(fā)明細胞保存液中l(wèi)Omin左右，即可實現(xiàn)樣 本DNA與其余物質(zhì)的分離，且DNA在細胞保存液中的室溫儲存時間可長達一周W后依然維 持較高的穩(wěn)定性，有效避免的樣本在運輸過程中可能會發(fā)生降解或污染而對檢測結(jié)果的可 靠性和敏感性所帶來的影響，此外在后續(xù)DNA的提取步驟也不再需要繁瑣的裂解工作，顯 著降低了DNA提取時間，提高了提取效率。
[0011] 優(yōu)選的是，其中，所述DM純化柱包括硅膠膜柱及套設(shè)于所述硅膠膜柱外部的集 液管，其中硅膠膜可對DNA進行特異性的吸附，再經(jīng)后續(xù)洗涂除雜和洗脫步驟，即可得到高 質(zhì)量的dm。
[0012] 優(yōu)選的是，其中，所述第一洗涂液含有50~60v/v%的乙醇、0. 1~Imol/L的鹽酸 脈或硫氯酸脈、10~lOOmmol/L的化is-HCl和1~lOmmol/L的邸TA，用于去除硅膠膜和 DNA表面的蛋白質(zhì)、糖、脂類等物質(zhì)，其中鹽酸脈或硫氯酸脈的可溶解蛋白，適當(dāng)濃度的添加 提局蛋白的去除效率。
[0013] 優(yōu)選的是，其中所述第二洗涂液含有65~80v/v%的乙醇、10~lOOmmol/L的 Tris-HCl和1~lOmmol/L的邸TA，用W去除硅膠膜和DNA表面的鹽等雜質(zhì)。
[0014] 其中第一和第二洗涂液中均添加有乙醇，其目的主要是維持DNA的沉淀狀態(tài)，W 保證DNA與硅膠膜的緊密結(jié)合，防止在去除雜質(zhì)的時候部分DNA的損失。
[0015] 優(yōu)選的是，其中，所述洗脫液含有10~lOOmmol/L的Tris-HCl和1~lOmmol/L 的邸TA，用W有效得將吸附于硅膠膜上的DM洗脫下來，可得到較高的DM洗脫濃度。
[0016] 本發(fā)明的目的還可W進一步由應(yīng)用所述試劑盒的DNA提取方法來實現(xiàn)，該方法包 括如下步驟：
[0017] 1)將采集的宮頸細胞放入加有所述細胞保存液的保存管內(nèi)混合均勻，得到細胞樣 本液；
[0018] 2)取200~500ul所述細胞樣本液，加入150~250ul的無水乙醇混合均勻后，置 入所述DNA純化柱，離屯、Imin，棄去集液管中的濾液，其中在樣本DNA溶液中加入一定比例 的乙醇可提高DNA與硅膠膜的結(jié)合能力；
[0019] 3)向所述DNA純化柱中加入500~750ul所述第一洗涂液，離屯、Imin，棄去集液 管中的濾液；
[0020] 4)向所述DNA純化柱中加入500~750ul所述第二洗涂液，離屯、Imin，棄去集液 管中的濾液；
[0021] 5)將所述DNA純化柱內(nèi)的硅膠膜柱置于新的集液管內(nèi)，加入50~200ul洗脫液， 依次靜置Imin和離屯、Imin后，集液管中的液體即為提取得到的DNA。
[0022] 優(yōu)選的是，其中，所述步驟1)中宮頸細胞采用宮頸刷進行采集取樣，所述細胞保 存液的體積為0.8~1.2ml。 陽02引優(yōu)選的是，其中，所述步驟2)~5)中離屯、的速度均高于1000化pm，W保證DNA表 面雜質(zhì)去除的效果。
[0024] 優(yōu)選的是，其中，所述步驟2)~5)中離屯、的溫度均為室溫，降低了對儀器的依賴 及儀器成本。
[00巧]優(yōu)選的是，其中，所述步驟5)中靜置的溫度為室溫。
[00%] 本發(fā)明至少包括W下有益效果：
[0027] (1)本發(fā)明試劑盒中的保存液可室溫保存宮頸樣本DNA-周W上，有效提高了采 集樣本在運輸過程中質(zhì)量的穩(wěn)定性，從而可W保證后續(xù)PCR檢驗的準確性；
[00測 似本發(fā)明后續(xù)DNA的提取中不需要繁瑣的裂解工作，整個提取步驟在lOminW內(nèi) 即可完成，顯著提高了DNA提取的效率，且提取得到的DNA純度高，避免了雜質(zhì)對PCR檢驗 的干擾，保證了檢驗結(jié)果的可靠性；
[0029] (3)本發(fā)明的保存提取操作只設(shè)及到移液器和離屯、機兩種實驗儀器，對儀器依賴 性低。
[0030] 本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本 發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，W令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說 明書文字能夠據(jù)W實施。
[0032] 應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含及"包括"術(shù)語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0033] < 實例1〉
[0034] 采用某婦幼保健院宮頸細胞采樣結(jié)果，將宮頸刷采集到的宮頸細胞置于1ml的 細胞保存液中混合均勻得到細胞樣本液，其中所述細胞保存液組分為：2mol/L鹽酸脈、 5mmol/L的T;ris-HCl、5mmol/L的邸ΤΑ和5v/v%的Trixon-lOO,其余為去離子水。樣本義 集后室溫運輸2天后隨機抽取1例樣本進行提取，提取試劑組分如下：
[0035] 其中第一洗涂液含有50v/v%的乙醇、Imol/L的硫氯酸脈、lOmmol/L的Tris-肥1 和5mmol/L的邸TA;第二洗涂液含有65v/v%的乙醇、lOOmmol/L的Tris-HCl和Immol/L的 邸TA;洗脫液含有l(wèi)Ommol/L的Tris-HCl和lOmmol/L的邸TA。
[0036] DNA提取步驟如下：
[0037] 1)取250ul所述細胞樣本液，加入150ul的無水乙醇混合均勻后，置入所述DNA純 化柱，10000巧m離屯、Imin，棄去集液管中的濾液；
[00測。向所述DNA純化柱中加入500ul所述第一洗涂液，1000化pm離屯、Imin，棄去集 液管中的濾液；
[0039] 3)向所述DNA純化柱中加入750ul所述第二洗涂液，15000巧m離屯、Imin，棄去集 液管中的濾液；
[0040] 4)將所述DNA純化柱內(nèi)的硅膠膜柱置于新的集液管內(nèi)，加入50ul洗脫液，依次室 溫靜置Imin和1200化pm離屯、Imin后，集液管中的液體即為提取得到的DNA。
[0041] 為驗證本實例提取試劑盒的效率，取相同樣本，采用市售某品牌DNA提取試劑盒 對該樣本進行重復(fù)提取。該試劑盒首先加入蛋白酶K和RNA酶后解育2分鐘，同時裂解10 分鐘。
[0042] 提取完畢后進行巧光定量PCR實驗，其中PCR Mastermix體積為20ul，臨床樣本 DNA體積為lOul，45個循環(huán)，實驗結(jié)果見表1。
[0043] < 實例 2〉
[0044] 采用另一婦幼保健院宮頸細胞采樣結(jié)果，將宮頸刷采集到的宮頸細胞置于0. 8ml 的細胞保存液中混合均勻得到細胞樣本