利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明適用于酵母篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，包括：選取產(chǎn)量、總糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物；將重金屬污染區(qū)能源作物提取總糖；以該總糖為原料配制成酵母培養(yǎng)液；利用重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)酵母菌進(jìn)行篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株；利用產(chǎn)量、總糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)重金屬耐受性高的酵母菌株進(jìn)一步篩選，獲得最優(yōu)酵母。本發(fā)明還提供一種利用本發(fā)明的酵母篩選方法得到的酵母生產(chǎn)乙醇的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酵母篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法和生物乙醇的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]能源和人類(lèi)的活動(dòng)息息相關(guān)，沒(méi)有了能源，人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展就無(wú)從談起，現(xiàn)代社會(huì)文明就無(wú)法繼續(xù)。生物燃料乙醇作為一種可再生的新型能源，因?yàn)闊o(wú)污染、用途廣，其重要性日益凸顯。目前，我國(guó)普遍采用木薯、甘蔗、甜高粱、農(nóng)作物秸桿等非糧作物生產(chǎn)燃料乙醇，其中，甘蔗和木薯是經(jīng)濟(jì)效益最顯著的非糧經(jīng)濟(jì)作物。發(fā)展以甘蔗和木薯等能源作物作為原料生產(chǎn)乙醇，可以緩解“能源與人爭(zhēng)糧”的現(xiàn)象，但不可忽略的是，存在著“能源與糧爭(zhēng)地”的局面。
[0003]我國(guó)目前礦區(qū)累計(jì)破壞的土地面積達(dá)500萬(wàn)公頃，復(fù)墾率僅為12%，受礦山污染的耕地面積達(dá)2000萬(wàn)公頃，約占耕地面積的1/6。這些土壤不適于種植糧食作物，但經(jīng)改良后種植非食用性的能源作物——能源甘蔗、能源木薯、能源薯蕷卻有極大的可行性。大面積存在的礦區(qū)重金屬污染土壤和邊緣化土壤，為發(fā)展燃料乙醇等生物質(zhì)能源提供了大量可利用的土地資源。對(duì)礦區(qū)重金屬污染土壤合理利用，是打破“能源與糧爭(zhēng)地”局面最有效的措施。
[0004]酵母菌種是乙醇發(fā)酵的核心所在，因此酵母菌種的篩選研究就尤其重要，目前對(duì)酵母菌的篩選方法有:
[0005](I)誘變篩選法。這是通過(guò)傳統(tǒng)誘變技術(shù)處理酵母的原始菌株，對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行篩選目的菌株。
[0006](2)細(xì)胞融合法。主要是利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，該技術(shù)可克服細(xì)胞壁的天然屏障，排除接合型的限制，實(shí)現(xiàn)多基因重組，并且可以直接采用生產(chǎn)性能好的菌株作為親株。原生質(zhì)體融合技術(shù)是國(guó)內(nèi)外選育優(yōu)良酵母比較常用的研究方法，如日本三井造船株式會(huì)社選育酵母菌株AM12。
[0007](3)基因工程技術(shù)。目前，該技術(shù)成為世界研究的熱點(diǎn)，主要包括基因工程改造法，外源基因?qū)霕?gòu)建工程菌，基因敲除技術(shù)等。袁振宏等(2006)采用基因?qū)氲姆椒?，將?shù)干畢赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖醇脫氫酶基因xyl2,及休哈塔假絲酵母(CandidaShehatae)木糖還原酶基因xyll轉(zhuǎn)入釀酒酵母(S.cerevisiae),構(gòu)建成木糖發(fā)酵的釀酒酵母重組工程菌。史文慧等(2002)和趙麗娟等(2005)通過(guò)基因敲除技術(shù)，使酵母ADH2基因失活，不利用乙醇做碳源，提高乙醇利用率。
[0008]上述酵母篩選方法均利用復(fù)雜的技術(shù)和設(shè)備實(shí)現(xiàn)，操作成本高，因此開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便易行的且具有針對(duì)性的酵母篩選方法將有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種生物乙醇的制備方法。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0012]選取產(chǎn)量、總糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物；
[0013]利用該重金屬污染區(qū)能源作物提取總糖；
[0014]以提取的總糖為原料配制成酵母培養(yǎng)液；
[0015]利用重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)待篩選的酵母菌進(jìn)行重金屬耐受性篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株；
[0016]利用產(chǎn)量、總 糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)重金屬耐受性高的酵母菌株進(jìn)一步篩選，選取發(fā)酵效率最高的酵母菌種，該發(fā)酵效率通過(guò)發(fā)酵液中糖轉(zhuǎn)化率和乙醇含量體現(xiàn)。
[0017]以及，一種生物乙醇的制備方法，包括采用酵母對(duì)重金屬污染區(qū)能源作物發(fā)酵獲取乙醇的步驟，其中，所述酵母是經(jīng)上述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法獲得。
[0018]本發(fā)明的篩選酵母方法利用生長(zhǎng)于重金屬污染區(qū)的能源作物對(duì)酵母菌進(jìn)行篩選，該方法充分利用了生長(zhǎng)于重金屬污染區(qū)的能源作物，該方法篩選出的酵母菌可將作物中的糖分充分轉(zhuǎn)化為乙醇，有利于恢復(fù)重金屬污染土地的生態(tài)恢復(fù)并促進(jìn)燃料乙醇的生產(chǎn)，該篩選方法操作簡(jiǎn)便，成本低，針對(duì)性強(qiáng)。
[0019]本發(fā)明的生物乙醇的制備方法，能充分利用重金屬污染區(qū)作物，且其中使用的酵母具有較強(qiáng)針對(duì)性，該制備方法具有高的乙醇轉(zhuǎn)化率，實(shí)現(xiàn)了資源的優(yōu)化配置。
【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]本發(fā)明實(shí)施例提供一種利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，包括以下步驟:
[0022](I)選取產(chǎn)量、總糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物；
[0023](2)利用步驟(I)的所述兩類(lèi)重金屬污染區(qū)能源作物提取總糖；
[0024](3)以提取的所述總糖為原料配制成酵母培養(yǎng)液；
[0025](4)利用步驟所述重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)待篩選的酵母菌進(jìn)行重金屬耐受性篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株；
[0026](5)利用所述產(chǎn)量、總糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)步驟(4)中篩選出的重金屬耐受性高的酵母菌株進(jìn)一步篩選，選取發(fā)酵效率最高的酵母菌種，所述發(fā)酵效率通過(guò)發(fā)酵液中糖轉(zhuǎn)化率和乙醇含量體現(xiàn)。
[0027]具體地，在步驟(I)中的重金屬污染區(qū)可以為礦山污染土壤，也可以為邊際化土壤，該能源作物為甘蔗、木薯或薯蕷。
[0028]在步驟(I)中，當(dāng)能源作物為甘蔗時(shí)，甘蔗選取的方法如下:[0029]用游標(biāo)卡尺和直尺量取甘蔗植株的直徑和株高；提取甘蔗汁，采用錘度計(jì)直接測(cè)定甘蔗汁錘度，采用旋光儀測(cè)定經(jīng)澄清過(guò)濾后的蔗汁的轉(zhuǎn)光度；上述指標(biāo)為甘蔗的生理指標(biāo)，可以用來(lái)衡量甘蔗的產(chǎn)量。同時(shí)利用DNS還原法測(cè)定甘蔗汁中總糖含量。采用現(xiàn)有重金屬含量測(cè)定方法測(cè)定蔗渣和蔗汁中總重金屬含量，測(cè)量的該重金屬為鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)。
[0030]當(dāng)能源作物為木薯或薯蕷時(shí)，其選取的方法如下:
[0031]測(cè)量木薯或薯蕷的塊莖重量；在將木薯或薯蕷液化糖化后用DNS法測(cè)量總糖。DNS即二硝基水楊酸，該測(cè)量方法是利用堿性條件下，二硝基水楊酸(DNS)與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系的原理，用比色法測(cè)定還原糖含量。因其顯色的深淺只與糖類(lèi)游離出還原基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)，而對(duì)還原糖的種類(lèi)沒(méi)有選擇性，故DNS方法適合用在多糖(如纖維素、半纖維素和淀粉等)水解產(chǎn)生的多種還原糖體系中。采用現(xiàn)有重金屬含量測(cè)定方法測(cè)定木薯或薯蕷塊莖中總重金屬含量，測(cè)量的該重金屬為鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)。
[0032]在所述能源作物為甘蔗時(shí)，步驟(2)中提取總糖的方法為取甘蔗榨汁，總糖包含于該甘蔗汁中；在所述能源作物為木薯或薯蕷時(shí)，取木薯或薯蕷的塊莖粉碎，加入水中高溫糊化，然后加入糖化酶糖化，所得溶液含有總糖。
[0033]在步驟(3)中，當(dāng)該重金屬污染區(qū)能源作物為甘蔗時(shí)，該酵母培養(yǎng)液的配制方法為:提取后的甘蔗汁為含有總糖的溶液，向該甘蔗汁中加入其體積0.1-0.2%的尿素，用磷酸把pH調(diào)至3.3-3.6，90°C滅菌1-1.5h。
[0034]當(dāng)該重金屬污染區(qū)能源作物為木薯或薯蕷時(shí)，該酵母培養(yǎng)液的配制方法為:將木薯或薯蕷淀粉液化糖化，制得含有總糖的溶液，向該溶液中加入0.25-0.5%的尿素，用磷酸把 pH 調(diào)至 4.5-5.0，90°C滅菌 `1-1.5h。
[0035]在步驟(4)中的酵母菌重金屬耐受性試驗(yàn)為選取5株以上的工業(yè)酵母菌，該酵母可應(yīng)用任何適用于發(fā)酵的菌株，在具體實(shí)施例中可使用薛瓦酵母(S.chevalieri)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、威爾酵母(S.wiIIianus)等，但不限于上述酵母。以步驟(I)中的重金屬含量最高的作物提取的總糖提取物進(jìn)行培養(yǎng)篩選，該總糖提取物中含有鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)等重金屬，通過(guò)糖轉(zhuǎn)化率和乙醇產(chǎn)量選取耐受性高的3-5株菌株。
[0036]該步驟(4)中，將篩選得到的耐受性高的3-5酵母菌株分別接種至酵母培養(yǎng)液中的接種量為5-10%，優(yōu)選的接種量為10%。
[0037]本發(fā)明的篩選酵母方法利用生長(zhǎng)于重金屬污染區(qū)的能源作物對(duì)酵母菌進(jìn)行篩選，該方法充分利用了生長(zhǎng)于重金屬污染區(qū)的能源作物，該方法篩選出的酵母菌可將作物中的糖分充分轉(zhuǎn)化為乙醇，有利于恢復(fù)重金屬污染土地的生態(tài)恢復(fù)并促進(jìn)燃料乙醇的生產(chǎn)，該篩選方法操作簡(jiǎn)便，成本低，針對(duì)性強(qiáng)。
[0038]本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種生物乙醇的制備方法，包括提取能源作物的總糖獲得溶液，向該溶液中加入酵母進(jìn)行發(fā)酵，獲得乙醇，其中，所述酵母是經(jīng)上文所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法獲得。
[0039]本發(fā)明實(shí)施例的生物乙醇的制備方法，能充分利用重金屬污染區(qū)作物，且其中使用的酵母具有較強(qiáng)針對(duì)性，該制備方法具有高的乙醇轉(zhuǎn)化率，實(shí)現(xiàn)了資源的優(yōu)化配置。[0040]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0041]實(shí)施例1甘蔗相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)
[0042]1.植株產(chǎn)量及含糖量檢測(cè)
[0043]在礦山污染土壤中，種植耐受重金屬、高光合量和高生物量的甘蔗品種。種植一年后計(jì)算五米行長(zhǎng)甘蔗數(shù)及10株甘蔗重量，分別用游標(biāo)卡尺和直尺量取甘蔗樣品的直徑和株高，每個(gè)樣品取十個(gè)重復(fù)。以此分析比較甘蔗產(chǎn)量。
[0044]采用錘度計(jì)直接測(cè)定蔗汁錘度；采用旋光儀測(cè)定經(jīng)澄清過(guò)濾后的蔗汁的轉(zhuǎn)光度；采用分光光度法測(cè)定蔗汁糖分:在酸性介質(zhì)中，蔗糖將磷鑰黃還原成磷鑰藍(lán)，磷鑰藍(lán)最大吸收波長(zhǎng)為820nm，利用比色法可測(cè)定甘蔗中的蔗糖含量；利用還原糖與DNS的顯色反應(yīng)在520nm測(cè)定吸光值，由還原糖的量與光吸收值呈線(xiàn)性關(guān)系，利用比色法可測(cè)定甘蔗中的還原 糖含糖量。
[0045]2.蔗汁重金屬含量測(cè)定
[0046]取200mL燒杯，經(jīng)稀硝酸浸泡過(guò)夜，并用雙蒸水沖洗干凈,量取甘蔗汁樣品IOmL加入該燒杯中。加入硝酸30mL，混合均勻，蓋上表面皿，過(guò)夜。在通風(fēng)櫥中，往燒杯中加入IOmL高氯酸，然后放在電熱板上加熱，110°C，煮到澄清透明直到剩余f2mL，冷卻，加水定容到50mL。以原子吸收分光光度計(jì)(YXF-1201型)上分別檢測(cè)溶液中鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)的含量。
[0047]3.蔗渣重金屬含量測(cè)定
[0048]準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0Og磨碎甘蔗樣品于瓷坩堝中加熱，先在電爐上炭化完全后，放入馬福爐內(nèi)(600°C)灰化(6h)。冷卻后取出，加入5mL2mol/L的HCl溶液溶解，然后轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用去離子水(或雙蒸水)沖洗坩堝，將洗液轉(zhuǎn)移至該容量瓶中，然后定容至50mL。用定量濾紙過(guò)濾后，取濾液在原子吸收分光光度計(jì)(YXF-1201型)上分別檢測(cè)溶液中鋅(Zn) JIf(Cu)Jg(Cd)Jg(Pb)的含量。
[0049]4.甘蔗汁總糖的測(cè)定
[0050]取甘蔗汁樣品5mL加入錐形瓶中，再向錐形瓶中加入6mol/L HCl溶液15mL，置沸水浴中加熱30min，冷卻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。加去離子水定容至50mL，然后過(guò)濾。吸取ImL濾液，加去離子水定容至50mL，得稀釋溶液，備用。
[0051]取上述稀釋溶液0.5mL加入試管中，再加入二硝基水楊酸(DNS)溶液0.5mL,該濃度為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在沸水浴中加熱5min，冷卻后再加入蒸餾水4mL。將混合均勻，用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的空白管(I號(hào)管)溶液調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定它們?cè)?40nm的吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其相應(yīng)的含糖量(μ g)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在此不再贅述。
[0052]5.測(cè)量結(jié)果
[0053]測(cè)量結(jié)果如表1-4所示。
[0054]表1:不同甘鹿品種的產(chǎn)量
【權(quán)利要求】
1.一種利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，包括以下步驟: 選取產(chǎn)量、總糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物； 利用所述重金屬污染區(qū)能源作物提取總糖； 以提取的所述總糖為原料配制成酵母培養(yǎng)液； 利用所述重金屬含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)待篩選的酵母菌進(jìn)行重金屬耐受性篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株； 利用所述產(chǎn)量、總糖含量高的重金屬污染區(qū)能源作物對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)液對(duì)所述重金屬耐受性高的酵母菌株進(jìn)一步篩選，選取發(fā)酵效率最高的酵母菌種，所述發(fā)酵效率通過(guò)發(fā)酵液中糖轉(zhuǎn)化率和乙醇含量體現(xiàn)。
2.如權(quán)利要求1所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述耐受性高的酵母菌株分別接種至所述酵母培養(yǎng)液中的接種量為5%-10%。
3.如權(quán)利要求1所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區(qū)能源作物為甘蔗、木薯或薯蕷。
4.如權(quán)利要求3所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區(qū)能源作物為甘蔗，所述酵母培養(yǎng)液的配制方法:向含有所述總糖的甘蔗汁中加入所述甘蔗汁0.1-0.2%的尿素，并將pH調(diào)至3.3-3.6，90°C滅菌1-1.5h。
5.如權(quán)利要求3所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區(qū)能源作物為木薯或薯蕷，所述酵母培養(yǎng)液的配制方法:將所述木薯或薯蕷的總糖提取物糖化，再向糖化后的溶液中加入所述溶液0.25-0.5%的尿素，并將pH調(diào)至4.5-5.00
6.如權(quán)利要求1所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬耐受性試驗(yàn)中的重金屬為鋅、銅、鎘和鉛。
7.如權(quán)利要求1所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區(qū)為礦山污染土壤區(qū)或邊際化土壤區(qū)。
8.—種生物乙醇的制備方法，其特征在于，包括采用酵母對(duì)重金屬污染區(qū)能源作物發(fā)酵獲取乙醇的步驟，其中，所述酵母是經(jīng)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的利用重金屬污染區(qū)能源作物篩選酵母方法獲得。
【文檔編號(hào)】C12N1/16GK103451143SQ201310041520
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月1日
【發(fā)明者】朱睿, 謝君, 劉艷霖 申請(qǐng)人:深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院