專利名稱：AtNRT1.8基因增強(qiáng)農(nóng)作物對重金屬或鹽脅迫的抗性的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物工程和植物改良基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及 AtNRTI. 8基因在增強(qiáng)作物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性中的用途，以及通過轉(zhuǎn)入所述基 因來改進(jìn)植物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性的方法及轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
重金屬鎘污染對植物造成毒害的重要原因在于顯著抑制重要的氮吸收同化過程， 導(dǎo)致植物體缺氮，體內(nèi)蛋白質(zhì)降解，因此對于作物的一個直接后果就是嚴(yán)重減產(chǎn)。此外，重 金屬在作物可食用部位比如稻米內(nèi)的積累，也會導(dǎo)致安全品質(zhì)的下降，對于食用這些受污 染的食品的人或動物造成極大的安全危害。其中最為著名的公害事件就是上世紀(jì)發(fā)生在日 本的“痛痛病”事件，原因就在于居民長期食用鎘污染的大米導(dǎo)致骨骼松軟易碎。改革開放以來，中國的工業(yè)得到迅速發(fā)展，但環(huán)保措施相對滯后，導(dǎo)致了包括重金 屬在內(nèi)的嚴(yán)重環(huán)境污染。據(jù)10年前的不完全統(tǒng)計(jì)，我國受重金屬污染的耕地面積近2000 萬公頃，約占總耕地面積的1/5，受重金屬污染的糧食達(dá)1200萬噸，而由于重金屬污染導(dǎo)致 的糧食減產(chǎn)也在1000萬噸之上。國家環(huán)?？偩值谋O(jiān)測表明重金屬污染在我國有不斷惡化 白勺趨勢(http://www. sepa. gov. cn/natu/yjsp/) 0因此，分離并闡明調(diào)控植物重金屬抗性的關(guān)鍵基因，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育重金 屬抗性作物，將在生產(chǎn)上產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。我國農(nóng)業(yè)面臨的另外一個嚴(yán)重問題是由于長期灌溉導(dǎo)致的鹽漬化脅迫，如何提高 作物對鹽的抗性能力對于提高產(chǎn)量，解決中國的糧食安全也具有重大的意義。AtNRTI. 8基因(AGI編號At4g21680)屬于NRT1基因家族，也稱作P0T/PTR基因 家族，在模式植物擬南芥中共有53個家族成員(見Tsay YF的綜述，F(xiàn)EBSLetters，2007， 581 :2290-2300)，主要編碼低親和力硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也發(fā)現(xiàn)有部分成員編碼寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白。AtNRTI. 8基因序列及其結(jié)構(gòu)如圖1所示。然而，本領(lǐng)域中尚未有任何涉及AtNRTI. 8基因與植物(尤其是作物)對重金屬、 鹽或干旱脅迫的抗性之間關(guān)系的研究或報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是明確AtNRTI. 8基因與作物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性之 間的關(guān)系，為增強(qiáng)作物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性提供了一種新的途徑。本發(fā)明的另 一目的是提供具有增強(qiáng)的重金屬、鹽或干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法及轉(zhuǎn)基因植 物。在本發(fā)明的第一方面，提供AtNRTI. 8基因或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽在增強(qiáng)植物 對重金屬的抗性、對鹽脅迫的抗性或?qū)Ω珊档目剐灾械挠猛?。在一個優(yōu)選例中，所述AtNRTI. 8基因是擬南芥AtNRTI. 8基因。
在另一優(yōu)選例中，所述植物是雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選作物。在另一個優(yōu)選例中，所述植物選自禾本科植物、錦葵科棉屬植物、十字花科蕓苔 屬植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或傘形科植物，優(yōu)選擬南芥、棉花、油菜、水稻、玉 米、小麥、大麥或高粱，更優(yōu)選水稻、玉米、小麥、大麥、擬南芥或棉花，最優(yōu)選為水稻、玉米、 小麥、擬南芥或棉花。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)或多肽的序列選自(a) SEQ ID NO 3 -M(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 增強(qiáng)植物對重金屬或鹽脅迫的抗性的活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述AtNRTl. 8基因是編碼本發(fā)明所述蛋白質(zhì)或 多肽的序列。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述AtNRTl. 8基因選自(i)SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 ；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(ii)限定的序列雜交且具有增強(qiáng)植物對重金屬或鹽脅迫的 抗性的活性的分子。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述增強(qiáng)植物對重金屬的抗性表現(xiàn)為降低植物
中的重金屬含量。在一個優(yōu)選例中，所述增強(qiáng)植物對重金屬的抗性表現(xiàn)為沒有重金屬污染、重金屬 污染較相同條件下種植的非轉(zhuǎn)基因植物降低。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述重金屬、鹽脅迫或干旱包括由以下物質(zhì)或情 況引起的脅迫鎘、鉛、汞、砷、銅、鉻、銻、錫、鋅、鋇、鉍、鎳、鈷、錳、鐵、釩、氯化鈉、硫酸鈉、碳 酸鈉、碳酸氫鈉或缺水。在一個優(yōu)選例中，所述重金屬脅迫或鹽脅迫優(yōu)選為鎘脅迫、鉛脅迫、汞脅迫、砷脅 迫、氯化鈉脅迫、硫酸鈉脅迫，碳酸鈉脅迫，碳酸氫鈉脅迫。在一個優(yōu)選例中，所述降低植物重金屬含量優(yōu)選為降低鎘、鉛、汞、砷的含量。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種載體，所述載體含有AtNRTl. 8基因。在一個優(yōu)選例中，所述載體中含有擬南芥AtNRTl. 8基因。在一個優(yōu)選例中，所述AtNRTl. 8基因的序列選自(i) SEQ ID N0:1(對應(yīng)于圖1 中的序列)、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 5 ；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有增強(qiáng)植物對重金屬或鹽脅迫的 抗性的活性的分子。在一個優(yōu)選例中，所述載體選自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒或哺乳動物細(xì)胞病毒，優(yōu)選 pEGFP-l、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301 或 pHB。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有 本發(fā)明所述的載體。在一個優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞、低等真核細(xì)胞或高等真核細(xì)胞，優(yōu) 選細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞，更優(yōu)選大腸桿菌、鏈霉菌、農(nóng)桿菌、酵母菌，最優(yōu)選農(nóng)桿 菌，所述農(nóng)桿菌包括但不限于EHA105、SOUP 1301或C58。在本發(fā)明的第四方面中，提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括
(1)用含有AtNRTl. 8基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞細(xì)胞、組織或器官；(2)選擇轉(zhuǎn)入AtNRTl. 8基因的植物細(xì)胞、組織或器官；和(3)將步驟⑵中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株，其中，所得的轉(zhuǎn)基因植物對重金屬或鹽脅迫的抗性較未轉(zhuǎn)化的植物有所增強(qiáng)。在一個優(yōu)選例中，所述構(gòu)建物為含有AtNRTl. 8基因的載體或宿主細(xì)胞。在另一個優(yōu)選例中，步驟(2)的植物細(xì)胞、組織或器官中的染色體上整合了 AtNRTl. 8 基因。在另一個優(yōu)選例中，所述方法包括以下具體步驟(a)提供含有AtNRTl. 8基因的載體；(b)提供攜帶步驟(a)中的載體的宿主細(xì)胞；(c)將植物細(xì)胞或組織與步驟(b)中的宿主細(xì)胞接觸，從而使AtNRTl. 8基因轉(zhuǎn)入 植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(d)選擇轉(zhuǎn)入AtNRTl. 8基因的植物細(xì)胞、組織或器官；和(e)將步驟(d)中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株，其中所述轉(zhuǎn)基因植物對重金屬或鹽脅迫的抗性較未轉(zhuǎn)化的植物有所增強(qiáng)。在另一個優(yōu)選例中，所述AtNRTl. 8基因?yàn)閿M南芥AtNRTl. 8基因。在另一個優(yōu)選例中，所述植物選自禾本科植物、錦葵科棉屬植物、十字花科蕓苔 屬植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或傘形科植物，優(yōu)選擬南芥、棉花、油菜、水稻、小 麥、大麥、玉米或高粱，更優(yōu)選水稻、玉米、小麥、大麥、擬南芥或棉花，最優(yōu)選為水稻、玉米、 小麥、擬南芥或棉花。在一個優(yōu)選例中，所述制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，還包括將用本發(fā)明前述任一種方 法獲得的轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物或其它轉(zhuǎn)基因植物雜交，從而獲得包含AtNRTl. 8基 因的雜交后代，所述雜交后代對重金屬或鹽脅迫的抗性較未轉(zhuǎn)化的植物有所增強(qiáng)。在一個優(yōu)選例中，雜交用的植物在分類上屬于同一科或不同科植物，優(yōu)選為同一 科植物。所述植物優(yōu)選為禾本科植物、錦葵科棉屬植物、十字花科蕓苔屬植物、菊科植物、茄 科植物、唇形科植物或傘形科植物，優(yōu)選擬南芥、棉花、油菜、水稻、小麥、大麥、玉米或高粱， 更優(yōu)選水稻、玉米、小麥、大麥、擬南芥或棉花，最優(yōu)選為水稻、玉米、小麥、擬南芥或棉花。在另一個優(yōu)選例中，所述雜交后代具有穩(wěn)定的遺傳性狀。在本發(fā)明的第五方面中，提供了用本發(fā)明所述方法制得的轉(zhuǎn)基因植物的用途，所 述轉(zhuǎn)基因植物用于生產(chǎn)沒有重金屬污染的農(nóng)產(chǎn)品、重金屬污染較相同條件下種植的非轉(zhuǎn) 基因植物降低的農(nóng)產(chǎn)品、耐重金屬脅迫作物、耐鹽脅迫作物或耐干旱脅迫作物。在一個優(yōu)選例中，所述重金屬、鹽或干旱脅迫包括由以下物質(zhì)或情況弓I起的脅迫 鎘、鉛、汞、砷、銅、鉻、銻、錫、鋅、鋇、鉍、鎳、鈷、錳、鐵、釩、氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉 或缺水。在另一個優(yōu)選例中，所述重金屬脅迫或鹽脅迫優(yōu)選為鎘脅迫、鉛脅迫、汞脅迫、砷 脅迫、氯化鈉脅迫、硫酸鈉脅迫、碳酸鈉脅迫或碳酸氫鈉脅迫。在另一優(yōu)選例中，所述作物為擬南芥、棉花、油菜、水稻、小麥、大麥、玉米或高粱， 更優(yōu)選水稻、玉米、小麥、大麥、擬南芥或棉花。在本發(fā)明的第六方面中，提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含AtNRTl. 8基因。
在一個優(yōu)選例中，所述轉(zhuǎn)基因植物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性有所增強(qiáng)。在另一個優(yōu)選例中，所述AtNRTl. 8基因的序列選自編碼選自下組的蛋白質(zhì)或多 肽的序列(a) SEQ ID NO 3 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個 或幾個氨基酸且具有增強(qiáng)植物對重金屬或鹽脅迫的抗性的活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或 多肽。在一個優(yōu)選例中，所述AtNRTl. 8基因選自(i) SEQ ID NO 1 (對應(yīng)于圖1中的序列)、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO :5 ；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序 列雜交且具有增強(qiáng)植物對重金屬或鹽脅迫的抗性的活性的分子。在另一個優(yōu)選例中，所述植物是雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選作物。在另一個優(yōu)選例中，所述植物選自禾本科植物、錦葵科棉屬植物、十字花科蕓苔 屬植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或傘形科植物，優(yōu)選擬南芥、棉花、油菜、水稻、小 麥、大麥、玉米或高粱，更優(yōu)選水稻、玉米、小麥、大麥、擬南芥或棉花，最優(yōu)選為水稻、玉米、 小麥、擬南芥或棉花。應(yīng)理解的是，本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言 是顯而易見的。


圖1 =AtNRTl. 8基因序列及其結(jié)構(gòu)。其中，大寫部分為基因的外顯子，小寫部分為 外顯子之間的內(nèi)含子。圖2 =AtNRTl. 8基因在逆境(stresses)中的表達(dá)。其中，圖2A 用不同濃度Cd對 根進(jìn)行不同時間處理后的AtNRTl. 8表達(dá)水平；圖2B、C和D為用各種脅迫處理6小時后， AtNRTl. 8的表達(dá)。其中，圖2B中的“S”表示莖；“L”表示葉；“R”根。圖2C中的“JA”表示 茉莉酸處理的樣品；“SA”表示水楊酸；“Na”表示NaCl，；“Cu”表示用銅處理的樣品；“Zn” 表示用鋅處理的樣品；“Ctl”表示對照。圖2D中的“ACC”表示1-氨基環(huán)丙烷基羧酸，它是 乙烯生成的前體，用ACC來處理植物和用乙烯ETH來處理植物有類似的效果；“R”代表根， “L”代表葉。圖3 爪蟾卵母細(xì)胞注射法研究AtNRTl. 8基因的體外轉(zhuǎn)運(yùn)活性的電生理分析結(jié) 果。其中，“noinj 〃表示未經(jīng)注射的樣品。圖4 =AtNRTl. 8基因在擬南芥中的表達(dá)和定位。其中圖4A-4E為通過⑶S染色直 接拍照或者切片獲得；圖4F-4M為通過基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞和使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法 轉(zhuǎn)化擬南芥野生型WS，然后在共聚焦顯微鏡下拍照獲得。圖 5 =AtNRTl. 8 基因?qū)χ参?Cd 抗性的調(diào)控(50uM Cd+50mM NO3O。圖 6 =AtNRTl. 8 基因?qū)χ参?NaCl 抗性的調(diào)控(50mM NaCl+50mM NO3O。圖7 :Cd在AtNRTl. 8基因突變體(nrtl. 8、0E-1)和對應(yīng)野生型(WS、Col 0)中蓮 座葉和果莢中的積累。圖8 =AtNRTl. 8基因調(diào)控硝酸鹽在重金屬鎘脅迫條件下的再分配。圖9 =AtNRTl. 8基因?qū)χ参锟购档恼{(diào)控。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人對AtNRTl. 8基因的結(jié)構(gòu)、定位和功能等進(jìn)行了長期而深入的研究，通過逆境因子誘導(dǎo)表達(dá)分析、基因編碼蛋白質(zhì)或多肽的定位和功能分析、突變體表型研究等，證 明了 AtNRTl. 8基因與植物的重金屬、鹽或干旱抗性之間存在著密切的關(guān)系，該基因的高表 達(dá)可增強(qiáng)植物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，發(fā)明人的研究表明AtNRTl. 8基因編碼NO3-(主要的氮肥形式)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 其表達(dá)能夠受重金屬、鹽脅迫、干旱等逆境誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因植株對重金屬、鹽脅迫、干旱的抗性明 顯提高。因此該基因在提高作物對重金屬、鹽等逆境脅迫能力方面具有較大的應(yīng)用潛力。AtNRTl. 8基因及編碼的蛋白質(zhì)或多肽在本發(fā)明中，術(shù)語“AtNRTl.8蛋白或多肽”或“AtNRTl.8基因編碼的蛋白質(zhì)或多 肽”指由本發(fā)明的AtNRTl. 8基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽，該定義中也包括具有提高植物的重 金屬或鹽脅迫抗性的上述蛋白質(zhì)或多肽的變異形式。所述AtNRTl. 8基因編碼的蛋白質(zhì)或 多肽的序列可選自(a)SEQ ID NO 3 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或 添加一個或幾個氨基酸且具有增強(qiáng)植物對重金屬或鹽脅迫的抗性的活性的由(a)衍生的 蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重 組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本 發(fā)明中AtNRTl. 8蛋白或多肽優(yōu)選由擬南芥AtNRTl. 8基因或其同源基因或家族基因編碼。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50 個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個 以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或 相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的AtNRTl. 8 蛋白質(zhì)或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有增強(qiáng)植物重金屬或鹽脅迫 抗性的活性?？刹捎幂椛浠虮┞队谡T變劑下來產(chǎn)生隨機(jī)誘變，也可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知 的分子生物學(xué)技術(shù)來獲得上述(b)中的蛋白質(zhì)或多肽?？衫镁幋a所述蛋白質(zhì)或多肽的編 碼序列來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，并觀察該轉(zhuǎn)基因植物的性狀是否有所改良來篩選和鑒別所得蛋 白質(zhì)或多肽。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。該術(shù)語還包括AtNRTl. 8蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo) 突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與AtNRTl. 8蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、 以及利用抗AtNRTl. 8蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含 AtNRTl. 8蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 AtNRTl. 8蛋 白的可溶性片段。通常，該片段具有AtNRTl. 8蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至 少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最 佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
如本文所用，術(shù)語“AtNRTl. 8基因”或“植物AtNRTl. 8基因”可互換使用，均是指 一種編碼本發(fā)明所述的AtNRTl. 8蛋白或多肽的序列，其與擬南芥AtNRTl. 8基因序列(參 見SEQ ID NO 1)可高度同源或在嚴(yán)格條件下與所述基因序列雜交的分子或與上述分子高 度同源的家族基因分子，所述基因的表達(dá)對植物的重金屬或鹽脅迫抗性具有一定的改善作用。 現(xiàn)有技術(shù)中已公開了 AtNRT 1. 8及其同源基因的序列，包括但不限于AGI編號At4g2l680，見 Tsay YF 的綜述(FEBS Letters, 2007, 581 2290-2300) ；GenBank Accession :NM_118288、GenBank Accession :AK118142。這些本領(lǐng)域已知的基因均包括在 本發(fā)明中。本發(fā)明的AtNRTl. 8 基因可選自(i)SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO 4 禾口 SEQ ID NO :5(其分別對應(yīng)于 MATDB AGI code :At4g21680 (http//mips, gsf. de/proi/ plant/isf/athal/index. isp)、At4g21680 編碼區(qū)、GenBank Accession :NM_118288 禾口 GenBank Accession =AK 118142)；或(ii)在嚴(yán)格條件下與⑴限定的序列雜交且具有改良 作物種子性狀的活性的分子。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和 洗脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu) 選是95%以上時才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的AtNRTl. 8基因核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法 或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是 開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所 制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。應(yīng)理解，本發(fā)明的AtNRTl. 8基因優(yōu)選獲自擬南芥，獲自其它植物的與擬南芥 AtNRTl. 8基因高度同源(如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、 75%以上、80%以上，更優(yōu)選85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它 基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知 的，如 BLAST。植物及其對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性如本文所用，所述的“植物”沒有特別的限制，包括(但不限于)禾本科植物、錦葵 科棉屬植物、十字花科蕓苔屬植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或傘形科植物等。優(yōu)選 所述植物為作物。如本文所用，術(shù)語“作物”是指在糧、棉、油等農(nóng)業(yè)和工業(yè)中具有經(jīng)濟(jì)價值的植物， 其經(jīng)濟(jì)價值可體現(xiàn)在該植物的種子、果實(shí)、根、莖、葉等有用部位上。作物包括但不限于雙 子葉植物或單子葉植物。優(yōu)選的單子葉植物為禾本科植物，更優(yōu)選水稻、小麥、大麥、玉米、 高粱等。優(yōu)選的雙子葉植物包括但不限于錦葵科棉屬植物、十字花科蕓苔屬植物等，更優(yōu) 選棉花、油菜等。如本文所用，術(shù)語“重金屬脅迫”是指指植物在含有高濃度重金屬的土壤或者水體中生長時，其生長發(fā)育受到抑制，甚至死亡的現(xiàn)象。造成重金屬脅迫的重金屬包括(但不 限于)鎘、鉛、汞、砷、銅、鉻、銻、錫、鋅、鋇、鉍、鎳、鈷、錳、鐵或釩。本發(fā)明的AtNRTl. 8基因 或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽可增強(qiáng)植物對重金屬的抗性，該抗性的提高可表現(xiàn)為與未經(jīng)所述 基因、蛋白質(zhì)或多肽處理的對照植物相比所述植物中(優(yōu)選地上部分)的重金屬含量降 低、沒有重金屬污染、在重金屬存在下的生長發(fā)育未受影響或受影響程度降低。如本文所用，術(shù)語“鹽脅迫”是指指植物在含有高濃度鹽分的土壤或者水體中生長時，其生長發(fā)育受到抑制，甚至死亡的現(xiàn)象。造成鹽屬脅迫的鹽類包括(但不限于)氯 化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉。本發(fā)明的AtNRTl. 8基因或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽可增 強(qiáng)植物對鹽脅迫的抗性，該抗性的提高可表現(xiàn)為與未經(jīng)所述基因、蛋白質(zhì)或多肽處理的對 照植物相比所述植物在高濃度鹽分存在下的生長發(fā)育未受影響或受影響程度降低、或可 在更高的鹽濃度下存活。如本文所用，術(shù)語“干旱脅迫”是指植物在缺水的土壤或者其它干旱環(huán)境中生長 時，其生長發(fā)育受到抑制，甚至死亡的現(xiàn)象。本發(fā)明的AtNRTl. 8基因或其編碼的蛋白質(zhì)或 多肽可增強(qiáng)植物對干旱脅迫的抗性，該抗性的提高可表現(xiàn)為與未經(jīng)所述基因、蛋白質(zhì)或多 肽處理的對照植物相比所述植物在缺水條件下的生長發(fā)育未受影響或受影響程度降低、 或可在更干旱的條件下存活。載體、宿主及轉(zhuǎn)基因棺物本發(fā)明還涉及包含AtNRTl. 8基因的載體，以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主 細(xì)胞，以及通過轉(zhuǎn)基因獲得高表達(dá)AtNRTl. 8的轉(zhuǎn)基因植物。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984 ；224 1431)，可利用本發(fā)明的編碼序列 可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的AtNRTl. 8蛋白。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼AtNRTl.8蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷 酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明中，術(shù)語“載體”與“重組表達(dá)載體”可互換使用，指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、 噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其它載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi) 復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟 動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含AtNRTl. 8編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/ 翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù) 等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體 還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明中優(yōu)選使用pEGFP-l、pBI121、 PCAMBIA1300、pCAMBIA130UpCAMBIA2301 或 pHB。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌， 鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用農(nóng)桿菌作為宿主 細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將 會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用 于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增 強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。 本發(fā)明中術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”、“轉(zhuǎn)化子”或“轉(zhuǎn)化植物”可互換使用，均指通過常規(guī) 轉(zhuǎn)基因的方法獲得的轉(zhuǎn)入本發(fā)明AtNRTl. 8基因并穩(wěn)定高表達(dá)AtNRTl. 8蛋白或多肽的細(xì) 胞、器官、組織或植株。轉(zhuǎn)化植物可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得抗病性提高的植物。獲得的轉(zhuǎn)化子 可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用 的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生 長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì) 胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
I=I O本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)提供了 AtNRTl. 8基因及其編碼的蛋白質(zhì)或多肽的新用途，其可用于有效提高 植物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性；(2)提供了具有改良重金屬、鹽或干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物，為糧、棉、油等生產(chǎn) 和加工提供了優(yōu)良原料和產(chǎn)品；(3)提供了改善植物重金屬、鹽或干旱脅迫抗性的新途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常 規(guī)條件(例如可參照如Sambrook等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，英文名稱為《Molecular Cloning :A Laboratory Manual》，第三版，2001, Cold Spring Harbor Laboratory press) 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1. M^MM^^m^ (Stress)因子對AtNRTl. 8某因的調(diào)控作用發(fā)明人通過基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)AtNRTl. 8在53個POT基因家族成員里受鎘誘導(dǎo)最為強(qiáng)烈(數(shù)據(jù)未出示)。本實(shí)施例中所用的AtNRTl. 8基因的序列如圖1所示。為了確證該基因受鎘誘導(dǎo)是否如基因芯片所示，并進(jìn)一步揭示其是否受其它逆境 因子誘導(dǎo)，進(jìn)行了 Northern雜交試驗(yàn)(試驗(yàn)方法經(jīng)典的植物分子生物學(xué)中的Northern雜 交，參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第532-552頁)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明=AtNRTl. 8基因受鎘的誘導(dǎo)表達(dá)具有時間和濃度依賴效應(yīng)(見 圖2A)，而且基本不受鎘脅迫的次生效應(yīng)滲透脅迫和氧化脅迫調(diào)控(如圖2B所示，PEG是一 種高滲透劑，可以對植物造成滲透脅迫，AtNRTl. 8基因高表達(dá)植株不表現(xiàn)抗?jié)B透的功能)。 除了鎘以外，AtNRTl. 8基因還受重金屬銅(Cu)和鋅(Zn)的誘導(dǎo)表達(dá)(圖2C)。此外，AtNRTl. 8基因受逆境信號分子乙烯(ACC，1-氨基環(huán)丙烷羧酸，其為乙 烯合成前體物質(zhì)；乙烯是多種逆境的信號分子，很多逆境下，植物乙烯會高表達(dá))強(qiáng)烈誘導(dǎo) 表達(dá)，也受JA (茉莉酸)誘導(dǎo)。實(shí)施#![ 2. AtNRTl. 8某因編碼內(nèi)向型低,親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Nitrate transporter)AtNRTl. 8基因?qū)儆赑TR基因家族，同時也叫做NRTl家族或者POT家族。由于該家 族基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)既編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也編碼寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此為了檢測AtNRTl. 8 基因編碼蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，發(fā)明人通過爪蟾卵母細(xì)胞注射的方式研究了 AtNRTl. 8基因的 體外轉(zhuǎn)運(yùn)活性。試驗(yàn)方法將AtNRTl. 8基因的編碼序列及兩端的UTR序列亞克隆到pGEMHE載體， 通過體外轉(zhuǎn)錄成cRNA，注射到爪蟾卵母細(xì)胞(獲自首都師范大學(xué))，進(jìn)行電生理分析(電壓 鉗購自Dagan公司，型號為TEV-200A V0LTAGECLAMP)。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明=AtNRTl. 8基因編碼蛋白特異性轉(zhuǎn)運(yùn)N03_，而且是一個內(nèi)向型低親和力 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。術(shù)語“內(nèi)向型低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”是指該基因編碼的蛋白可以從細(xì)胞質(zhì)外向細(xì) 胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)NO”而且只對高濃度的NO3-有活力，在低濃度NO3-條件下轉(zhuǎn)運(yùn)能力很差。實(shí)施例3. AtNRTl. 8基因在擬南芥中的表達(dá)及定位確定基因的組織表達(dá)特征和亞細(xì)胞定位情況，對于明確基因的作用機(jī)理具有重要 的提示作用。為此，發(fā)明人進(jìn)一步研究了 AtNRTl. 8基因在擬南芥中的表達(dá)及定位情況。參照Dawar Hussain 等，The Plant Cell《植物細(xì)胞》，第 16 卷，1327-1339 所記 載的方法，將基因的啟動子區(qū)域與報告基因GUS融合，或者基因的編碼框與報告基因GFP融 合，用于轉(zhuǎn)化擬南芥或者洋蔥表皮細(xì)胞。原位雜交分別用AtNRTl. 8的正向序列和反向序列 與組織本生的mRNA雜交。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示⑶S組化分析顯示，AtNRTl. 8基因的表達(dá)主要在植物的維管系統(tǒng)表達(dá)， 而且位于中柱內(nèi)，原位雜交得到相同的結(jié)論(圖4A-E)，印證了 AtNRTl. 8的中柱特異表達(dá) 模式。進(jìn)一步的切片分析表明該基因的表達(dá)位于木質(zhì)部薄壁細(xì)胞(圖4B-C)，提示該基因 可能參與NO3-的長途轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)一步利用GFP與AtNRTl. 8基因的融合蛋白定位分析表明無 論是洋蔥細(xì)胞瞬時表達(dá)還是在擬南芥體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)都將AtNRTl. 8定位于細(xì)胞質(zhì)膜(圖 4F-M)，結(jié)合該基因編碼內(nèi)向型NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的事實(shí)，推測AtNRTl. 8可能起著從木質(zhì)部卸載 NO3-的作用。
實(shí)施例4. AtNRTl. 8某因轉(zhuǎn)某因棺株對重金屬脅泊、鹽脅泊的杭件為了明確AtNRTl. 8在植物體內(nèi)的具體生理作用，發(fā)明人分別研究了該基因的基 因敲除突變體和過量表達(dá)突變體在重金屬和鹽脅迫逆境條件下的表型。突變體的抗性表型觀察和統(tǒng)計(jì)根系的發(fā)育情況的方法如下將WS和nrtl. 8，以及 Col O和OE-I (其中，nrtl. 8突變體為AtNRTl. 8功能缺失的突變體、WS為野生型、Col O為 另一種常用野生型，OE-I為AtNRTl. 8過量表達(dá)突變體(35S :POT1/Col 0)種子滅菌后， 播種于在1/4PNS培養(yǎng)基(按照如下文獻(xiàn)中的配方配制Richard N. Arteca和Jeannette M. Arteca,A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically, 水培種植擬南芥的新方法，PHYSI0L0GIA PLANTARUM 108 188-193. 2000)上，在4°C冰箱春 化2天，然后置于人工氣候室(16h/8h光周期，22°C )中培養(yǎng)5天。挑取生長狀態(tài)較為相近的幼苗，轉(zhuǎn)移至分別含有50uM Cd、Pb、Hg或As的重金屬和 50mM NO3-的4種1/4PNS培養(yǎng)基上，每個株系選取8顆苗，并標(biāo)記好它們此時在培養(yǎng)基上的 位置。轉(zhuǎn)移后的植株在平板上繼續(xù)生長10天后，觀察它們的生長情況，并統(tǒng)計(jì)它們在10天 內(nèi)主根長度的增加值，并拍照記錄。鹽脅迫處理中的表型變化研究采用上述類似實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。與上述方法不同的是脅迫試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基為含有50mM NO3-和50mM NaCl或Na2CO3的1/4PNS培養(yǎng)基。結(jié)果顯示=AtNRTl. 8功能缺失的nrtl. 8突變體相對于野生型WS對鎘脅迫更加敏 感(圖5)，而相對應(yīng)的是，過量表達(dá)突變體(35S :P0Tl/Col 0)相對于野生型對照(Col 0)對于鎘的抗性明顯提高，對應(yīng)的根長增加值見圖5。采用Pb、Hg或As重金屬進(jìn)行的試驗(yàn) 也獲得了相似的結(jié)果。上述結(jié)果表明=AtNRTl. 8基因調(diào)控植物對重金屬的抗性能力，該基 因的過量表達(dá)可提高植物對重金屬的抗性。同時，在鹽脅迫處理中也觀察到類似的表型，對應(yīng)的根長增加值見(圖6)。這表明 AtNRTl. 8可能在更廣泛意義上對植物對于多種逆境的抗性起著調(diào)節(jié)作用。實(shí)施例5.重金屬脅迫下，AtNRTl. 8對植物重金屬分布的影響前述實(shí)施例的研究結(jié)果表明，AtNRTl. 8基因影響植物對重金屬的抗性，發(fā)明人進(jìn) 一步研究了 AtNRTl. 8基因是否也會影響重金屬在植物體內(nèi)的分布，這對提高該基因的應(yīng) 用價值非常重要。采用了電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)來測定突變體中Cd的含量，具體方法 如下1)使 AtNRTl. 8 基因突變體(nrtl. 8、OE-1)和對應(yīng)野生型(WS、Col 0)在 1/2MS 平板上生長5天后，轉(zhuǎn)移至1/4PNS液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4周；2)把它們轉(zhuǎn)移至含有20uM Cd的1/4PNS液體培養(yǎng)基上處理3天，準(zhǔn)備取材；3)材料先使用超純水洗一次，5分鐘，然后使用25mM的CaCl2 (pH值為5. O左右) 清洗材料2次，每次4分鐘，最后再使用超純水洗一次，5分鐘；4)將取好的材料置于80°C的烘箱中，烘干24h ；待徹底干燥后，稱取干重，每個突 變體和野生型都重復(fù)稱重3次；5)把稱重后的材料置于ICP測量管中，記錄干重，然后往管中加入超純級別的 70%濃硝酸1ml，過夜消解；6)第二天，在95°C水浴鍋中消煮30分鐘左右，直至看不到可見的沉淀；
7)往ICP測量管中加入13ml的超純水，使徹底消解后的溶液總體積達(dá)到14ml，即 稀釋14倍。中加超純水稀釋至14ml，即稀釋14倍，然后使用ICP-MS (購自perkinelmer公 司型號為ELAN DRC-e測量所含Cd的量。ICP-MS的測定結(jié)果顯示AtNRTl. 8的確影響植物Cd脅迫下Cd在植物體內(nèi)的分 布，在WS和nrtl. 8中，在蓮座葉和果莢中，WS中Cd的含量都低于nrtl. 8。而在過表達(dá)株 系中，AtNRTl. 8的這種影響更為明顯，在過表達(dá)株系OE-I中，其在地上部分果莢和蓮座葉 中的含量都顯著低于對照Col 0(圖7)。在其它過表達(dá)株系中也觀察到類似的ICP表型。采用同樣的方法，以Pb、Hg或As重金屬進(jìn)行的試驗(yàn)也獲得了相似的結(jié)果。AtNRTl. 8基因的這種功能對提高農(nóng)作物的食品安全性有很大的幫助。實(shí)施例6. AtNRTl. 8某因?qū)O,=在重金屬鎘脅泊條件下再分配的調(diào)控為了解AtNRTl. 8到底是如何調(diào)控植物對逆境的抗性能力，發(fā)明人分析了鎘脅迫 條件下植物體內(nèi)NO3-在植物體內(nèi)的再分配情況。采用HPLC法測量植物組織中的NO3-含量，具體方法如下(I)AtNRTl. 8突變體nrtl. 8和OE-I以及對應(yīng)的野生型WS、Col O材料使用1/4PNS 液體培養(yǎng)基或者含有20 μ M Cd的1/4PNS液體培養(yǎng)基處理3d后，分地上部分和地下部分取 材；(2)每份材料使用超純水清洗4次，每次2分鐘；(3)使用吸水紙吸干殘留在組織上的水份，然后于天平上稱重，記錄各個樣品的鮮 重值，置于1. 5ml的印pendorf管中；(4)按照30ul/mg比例，往其中加入超純水；(5)使用沸水煮20分鐘，然后置于液氮中速凍，-80°C冰箱中過夜；(6) 20800g離心材料5分鐘；收集上清至干凈的印pendorf管中；(7)使用0. 45um的濾膜過濾上清，然后將每個樣品稀釋20倍，使用HPLC(Agilent， 1200series,色譜柱為 PARTISIL 10SAX(strong anion exchange)column(Whatman, Clifton，NJ)，測量樣品；HPLC 的測定條件為流動相45mM-50mM KH2PO4-H3PO4(pH2. 9-3. 0)；流速lmL/ min ；柱溫:30°C ；檢測波長:210nm ；檢測范圍:50pmol-200pmol (5 μ L-500 μ L)；出峰時間 Smin左右；每針的設(shè)置時間是13分鐘。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示在沒有鎘脅迫的情況下，nrtl. 8與野生型對照WS之間 的NO3-含量無論在葉中還是根中，都沒有顯著差別；而在鎘脅迫條件下，二者地上部位的 NO3-含量都有所下降，但相互間沒有明顯差別，在地下部位的根中，野生型中的N03_明顯高 于突變體nrtl. 8，這主要是由于野生型根中NO3-含量上升所致。結(jié)合前面的試驗(yàn)結(jié)果，可以推斷由于在鎘脅迫條件下，AtNRTl. 8基因在根中被誘導(dǎo)表達(dá)，使得木質(zhì)部導(dǎo)管中較高濃度的NO3-釋放出來，回到周圍的根細(xì)胞內(nèi)，從而有效減 輕由于鎘脅迫導(dǎo)致的根NO3-濃度下降。實(shí)施例7. AtNRTl. 8基因轉(zhuǎn)基因植株對干旱的抗性取Ws、nrtl. 8、Col 0、0E-1 (AtNRTl. 8 過量表達(dá)突變體(35S :P0T1/Col 0))、 0E-18 (AtNRTl. 8過量表達(dá)突變體另一株系)的成熟種子，春化3天，播至1/2MS平板培養(yǎng)6 天，再移至三合土、蛭石，分別澆等量的水、含6mM NH4NO3的培養(yǎng)液。18天之后將NH4NO3處理的植株分兩部分，一部分澆NH4NO3 (濃度為6mM)，另一部分改澆(NH4) 2S04 (濃度為6mM)。 10天后選取離體葉片稱量，計(jì)算失水量。每種植株取長勢大體相同的葉片6片，在0、30min、 60min、120min、180min稱量葉片鮮重，3個平行。失水量(％ ) = (W-Wi)/Wi* 100%。初步 實(shí)驗(yàn)證明Ws的失水量比nrtl. 8低，即Ws比nrtl. 8更抗旱。0E-18、OE-I的失水量比Col O 低，即 0E-18、OE-I 比 Col O 抗旱。 取Ws、nrtl. 8、Col 0、0Ε_1、0Ε_18五種植株的成熟種子，春化3天，播至V2MS平 板培養(yǎng)6天，再移至三合土，每組設(shè)置6個平行樣品。在正常灌溉21天后進(jìn)行干旱處理，并 觀察植株是否有抗旱表型。觀察表型發(fā)現(xiàn)OE-I、0Ε-18比Col O抗旱，且OE-I抗旱能力更 強(qiáng)一點(diǎn)(參見圖9)。
_3] 實(shí)施例8. AtNRTl. 8轉(zhuǎn)某因水稻對重金屬脅泊、鹽脅泊及干旱的杭件將AtNRTl. 8亞克隆到水稻表達(dá)質(zhì)粒中，進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)基因，從而獲得抗性水稻轉(zhuǎn)基 因植株。對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生理分析(方法同實(shí)施例4和實(shí)施例7)，以觀察轉(zhuǎn)入AtNRTl. 8 的植株是否能提高水稻對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻成熟胚操作程序一、轉(zhuǎn)化菌液準(zhǔn)備(1)第一天上午從-80°C保存的菌種中挑取少許于5mlYEP(Rif+Kan)液體培養(yǎng) 基，28 °C 培養(yǎng)，1 OOrpm。(2)第二天上午從含有農(nóng)桿菌的YEP培養(yǎng)液中吸取1 2ml，轉(zhuǎn)入25 50mlAB (Rif+Kan50)液體培養(yǎng)基，28°C，lOOrpm，4 小時后至 0D600 = 0. 5 左右。二、共培養(yǎng)第二天下午測0D600值，菌液離心5000rpm，15min,菌體沉淀懸浮于AAM(ASIOO) 至菌液0D600 = 0. 4 0. 6將菌液倒入裝有水稻愈傷的三角瓶中，使愈傷浸泡其中20分鐘， 并不時搖晃；用無菌紙吸干菌液，把已浸泡過的愈傷組織轉(zhuǎn)移到墊有一層無菌濾紙的含有 2. 5% Phytagel的NBD(ASIOO)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 3天。每個培養(yǎng)皿再加ImlAAM(ASlOO) 培養(yǎng)液充分濕潤無菌濾紙。三、篩選將愈傷組織用無菌濾紙吸干(換一次濾紙)，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷(45 天左右，中間換一次篩選培養(yǎng)基)(暗培養(yǎng))。篩選所用培養(yǎng)基第一次篩選NBD+Cef700ul+Hyg25mg/L ；第二次篩選 NBD+Cef500ul+Hyg50mg/L。四、預(yù)分化將篩選生長的水稻愈傷轉(zhuǎn)至預(yù)分化培養(yǎng)基(含有0. 45% Phytagel的NB(pH = 5. 7，無 2，4-D) +Car250+BAP2mg/L+NAAlmg/L+ABA5mg/L)，培養(yǎng) 10 天。五、分化將經(jīng)過預(yù)分化的水稻愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基(含有0. 45% Phytagel的l/2MS(pH = 5. 7 5. 8) +蔗糖20g/L)上分化成苗(光照，15-30天)。六、生根將綠色小苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(含有0. 45% Phytagel的l/2MS(pH = 5. 7 5. 8) + 蔗糖20g/L)上生根。
水稻愈傷組織培養(yǎng)(1)剝?nèi)シN皮；(2) 75%酒精消毒1 2分鐘；(3)無菌水沖洗2 3次；
(4)次氯酸鈉消毒20 30分鐘(無菌水次氯酸鈉=3 1 4 1)(5)無菌水沖洗4 5次；(6)無菌濾紙吸干；⑵接入NBD培養(yǎng)基；(8)7 10天后切取愈傷組織轉(zhuǎn)入相同培養(yǎng)基，1 2周后繼代一次，即可進(jìn)行轉(zhuǎn) 化。對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生理分析的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入AtNRTl. 8的水稻植株對于重金屬 脅迫(尤其是鎘、鉛、汞或砷)、鹽脅迫(尤其是NaCl或Na2CO3)以及干旱的抗性均有所提
尚ο在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>AtNRTl. 8基因增強(qiáng)農(nóng)作物對重金屬或鹽脅迫的抗性的應(yīng)用<130)090797<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2037<212>DNA<213>人工序列<400>1atggatcaaa aagttagaca gtttgaggtt tgcactcaag acggtagcgt tgatcgtcac 60ggcaatccag ctatccgagc taataccggc aaatggctca ctgctattct cattctaggt 120aatgattctc tctctctttc tctctatata taccactgtt ctttgtctta aagtgttgtg 180ttttggattc taaagaaatg ggtttttggt tgatatagtg aatcaaggac tagctacgct 240tgcgttcttc ggtgtaggag tgaatttggt tctgtttctg actcgagtga tgggacaaga 300caatgcagaa gcggctaata atgttagtaa atggacagga actgtctata tcttctcttt 360gcttggtgct ttcctcagtg actcttattg gggacgttac aagacttgtg ctatctttca 420agcaagtttc gttgcagtaa gtgtcttcaa cactgctctg tctttttcta gggtttgttt 480ctttaacaat aagttaacat gttttaatgg attatagggg ttgatgatgt tatctttatc 540tactggtgcg ttattgcttg aaccaagtgg ttgtggagtt gaagattcgc cgtgtaagcc 600tcattcgacg tttaagacgg ttctgtttta tctgtcggtg tatctaatcg cgttagggta 660
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ctc act get att ctc att cta gtg aat caa gga cta get acg ctt gcg144Leu Thr Ala lie Leu lie Leu Val Asn Gln Gly Leu Ala Thr Leu Ala
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65707580Thr Val Tyr lie Phe Ser Leu Leu Gly Ala Phe Leu Ser Asp Ser Tyr859095Trp Gly Arg Tyr Lys Thr Cys Ala lie Phe Gln Ala Ser Phe Val Ala100105110Gly Leu Met Met Leu Ser Leu Ser Thr Gly Ala Leu Leu Leu Glu Pro115120125Ser Gly Cys Gly Val Glu Asp Ser Pro Cys Lys Pro His Ser Thr Phe130135140Lys Thr Val Leu Phe Tyr Leu Ser Val Tyr Leu lie Ala Leu Gly Tyr145150155160Gly Gly Tyr Gln Pro Asn lie Ala Thr Phe Gly Ala Asp Gln Phe Asp165170175Ala Glu Asp Ser Val Glu Gly His Ser Lys lie Ala Phe Phe Ser Tyr180185190Phe Tyr Leu Ala Leu Asn Leu Gly Ser Leu Phe Ser Asn Thr Val Leu195200205Gly Tyr Phe Glu Asp Gln Gly Glu Trp Pro Leu Gly Phe Trp Ala Ser210215220Ala Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Val Leu Phe Leu lie Gly Thr Pro225230235240Lys Tyr Arg His Phe Thr Pro Arg Glu Ser Pro Trp Ser Arg Phe Cys245250255Gln Val Leu Val Ala Ala Thr Arg Lys Ala Lys lie Asp Val His His260265270Glu Glu Leu Asn Leu Tyr Asp Ser Glu Thr Gln Tyr Thr Gly Asp Lys275280285Lys lie Leu His Thr Lys Gly Phe Arg Phe Leu Asp Arg Ala Ala lie290295300Val Thr Pro Asp Asp Glu Ala Glu Lys Val Glu Ser Gly Ser Lys Tyr305310315320Asp Pro Trp Arg Leu Cys Ser Val Thr Gln Val Glu Glu Val Lys Cys325330335Val Leu Arg Leu Leu Pro lie Trp Leu Cys Thr lie Leu Tyr Ser Val340345350Val Phe Thr Gln Met Ala Ser Leu Phe Val Val Gln Gly Ala Ala Met355360365Lys Thr Asn lie Lys Asn Phe Arg lie Pro Ala Ser Ser Met Ser Ser370375380
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AtNRT1.8基因或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽在增強(qiáng)植物對重金屬的抗性、對鹽脅迫的抗性或?qū)Ω珊档目剐灾械挠猛尽?br> 2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白質(zhì)或多肽的序列選自(a)SEQ ID NO 3 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有增強(qiáng) 植物對重金屬或鹽脅迫的抗性的活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述AtNRTl.8基因是編碼權(quán)利要求2所述 蛋白質(zhì)或多肽的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述AtNRTl.8基因選自(i)SEQID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 ；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(ii)限定的序列雜交且具有增強(qiáng)植物對重金屬或鹽脅迫的抗性 的活性的分子。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述增強(qiáng)植物對重金屬的抗性表現(xiàn)為降低 植物中的重金屬含量。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述重金屬、鹽脅迫或干旱包括由以下物質(zhì) 或情況引起的脅迫鎘、鉛、汞、砷、銅、鉻、銻、錫、鋅、鋇、鉍、鎳、鈷、錳、鐵、釩、氯化鈉、硫酸 鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或缺水。
7.一種載體，所述載體含有AtNRTl. 8基因。
8.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求7所述的載體。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(1)用含有AtNRTl.8基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞細(xì)胞、組織或器官；(2)選擇轉(zhuǎn)入AtNRTl.8基因的植物細(xì)胞、組織或器官；和(3)將步驟(2)中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株，其中，所得的轉(zhuǎn)基因植物對重金屬或鹽脅迫的抗性較未轉(zhuǎn)化的植物有所增強(qiáng)。
10.用權(quán)利要求9所述方法制得的轉(zhuǎn)基因植物的用途，所述轉(zhuǎn)基因植物用于生產(chǎn)沒有 重金屬污染的農(nóng)產(chǎn)品、重金屬污染較相同條件下種植的非轉(zhuǎn)基因植物降低的農(nóng)產(chǎn)品、耐重 金屬脅迫作物、耐鹽脅迫作物或耐干旱脅迫作物。
全文摘要
本發(fā)明涉及AtNRT1.8基因增強(qiáng)農(nóng)作物對重金屬、鹽脅迫或干旱脅迫的抗性的應(yīng)用。具體涉及AtNRT1.8基因或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽在增強(qiáng)植物對重金屬、鹽或干旱脅迫的抗性中的用途。本發(fā)明還提供了利用AtNRT1.8基因增強(qiáng)植物對重金屬、鹽或干旱脅迫抗性的基因工程方法，含有AtNRT1.8基因的載體和宿主細(xì)胞，制備轉(zhuǎn)基因植物的方法和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的方法可使得植物對于重金屬、鹽、干旱脅迫的抗性提高，對于提高農(nóng)作物產(chǎn)量和性狀具有積極作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK101818168SQ200910046650
公開日2010年9月1日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者龔繼明 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院