專利名稱：2-((雜)芳基)-苯并噁唑化合物及其衍生物、組合物以及用于穩(wěn)定和抑制甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋 ...的制作方法
在此要求美國臨時申請序列號60/573,720的優(yōu)先權(quán)，其申請日為2004年5月20日，標題為“化合物、組合物以及用于穩(wěn)定和抑制甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白錯重疊的方法”。上述申請在此通過參考而全部引入。
發(fā)明領域 在此提供了通常與蛋白錯重疊相關的化合物、組合物和方法。更具體地，在此提供了苯并噁唑化合物、組合物以及用于穩(wěn)定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白、抑制甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白錯重疊、抑制甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白纖維化和淀粉樣蛋白(anyloid)形成和治療與其相關的淀粉樣疾病的方法。

背景技術：
甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白(transthyretin，TTR)是存在于血漿和中樞脊髓液中的55kDa均四聚蛋白。TTR的功能是轉(zhuǎn)運L-甲狀腺素(T4)和全-視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)。TTR是超過20個非同源致淀粉樣蛋白之一，其可轉(zhuǎn)化為纖絲和其它聚集體從而在人體內(nèi)導致疾病病理。這些疾病似乎并非是因蛋白聚集的功能損失而引起的。實際上，聚集似乎通過尚不明確的機理引起神經(jīng)元/細胞功能障礙。
在變性病情中，限制野生型TTR四聚體解聚的速率以及快速的單體錯重疊可導致錯裝配成淀粉樣蛋白，公認將引起老年全身性淀粉樣疾病(SSA)。超過80個TTR變異體之一的解聚和錯重疊導致許多家族性淀粉樣變性，包括家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病(FAP)和家族性淀粉樣心肌病(FAC)。
TTR四聚體具有兩個C2對稱的T4-結(jié)合位點。已知T4的負協(xié)同結(jié)合穩(wěn)定了TTR四聚體并抑制了淀粉樣纖維化形成。不幸地，在人血漿中僅有低于1％的TTR具有與其結(jié)合的T4，因為相對于TTR，甲狀腺素-結(jié)合球蛋白(TBG)對于T4具有更高的親和力。因此，相對于TTR的血漿濃度(3.6-7.2μM)，T4的血漿濃度更低(0.1M)。
發(fā)明簡介 本文提供了在動力學上穩(wěn)定天然態(tài)的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白從而抑制蛋白錯重疊的化合物。蛋白錯重疊在許多疾病過程中起作用，包括甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病。通過抑制甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白錯重疊，可干預或治療這樣的疾病、緩解癥狀和/或有時可預防或治愈疾病。
本文描述了治療、預防或改善TTR淀粉樣變性的一種或多種癥狀的化合物、組合物和方法。TTR淀粉樣變性通常在5-10歲導致死亡，直至最近，仍被認為是不可治愈的。肝移植是在家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病病例內(nèi)用野生型(WT)等位基因替換疾病相關等位基因的有效方法，因為肝臟通常是致淀粉樣TTR的來源。盡管肝移植是有效的基因治療方式，但其仍存有問題。移植是復雜的，其需要對于受者和供者均進行侵入性外科手術、長期的移植后免疫抑制治療、供者短缺、成本昂貴、而且因為大量的TTR淀粉樣變性患者的疾病進程使得其不適于移植。不幸地，在某些肝移植后的家族性患者體內(nèi)心肌淀粉樣變性繼續(xù)惡化，因為WT TTR通常持續(xù)沉積。移植也不能緩解TTR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的沉積，這是由于其是由脈絡叢合成。對于多數(shù)流行的TTR疾病、老年全身性淀粉樣變性(SSA)(因為WTTTR沉積而影響到大約高達25％的80歲以上老年人)、以及對于家族性淀粉樣心肌病(包括V122I攜帶者，V122I是在3.9％非裔美國人體內(nèi)識別的突變體)，移植并不是行得通的選擇。
在一種實施方案中，用于本文組合物和方法的化合物具有式I結(jié)構(gòu)

或
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)n-C(R6)(NH2)-COOH； X是O、S或NR11； R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、COOH、CONR7R8、烷基、鹵代烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3； Het是雜芳基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代； Ar是芳基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代； R是氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基； R5是烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基或芳烷基； R6是天然存在的α-氨基羧酸的側(cè)鏈； R7和R8各自獨立選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基； R9和R10各自獨立是氫、鹵素、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基； R11是氫或烷基；以及 n是0-3的整數(shù)。
在一種實施方案中，Het是嘧啶基、吡啶基、呋喃基或噻吩基。在另一種實施方案中，Het是吡啶基。
在另一種實施方案中，R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、COOH、CONR7R8、烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3。
在一種實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH且在4、5、6或7位時，那么R1、R2和R3不是Cl、F或CF3。在另一種實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH且在4、5、6或7位時，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯。在另一種實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH且在4、5、6或7位時，那么R1、R2和R3不全是氫。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH或CONH2時，那么R1、R2和R3不是烷基、環(huán)烷基、烷氧基、COOH、其中R時烷基或OH的COOR。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH且X是NH時，那么R1、R2和R3不是4-CN。在另一種實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH時，那么R1、R2和R3不是CN。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH或CONH2，那么R1、R2和R3不是烷基、烷氧基、環(huán)烷氧基或CN。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，條件是當Y是COOH或CONH2，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、4-烷氧基或4-環(huán)烷氧基。
本文還提供了包含本文所提供化合物的藥物組合物。
還提供了穩(wěn)定組織或生物液中甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白并由此抑制錯重疊的方法。通常，該方法包括給予組織或生物液穩(wěn)定量的本文所提供的化合物，這些化合物結(jié)合甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白并通過動力學上穩(wěn)定天然態(tài)的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體而防止甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體解聚。
由此，在疾病組織中穩(wěn)定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白的方法改善了錯重疊并減輕了相關疾病的癥狀，取決于不同疾病，還可有助于治愈疾病。本文還涉及在組織和/或細胞內(nèi)抑制甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白錯重疊。錯重疊的程度，以及由此通過本方法所達到的抑制程度，可通過多種方法進行評價，比如實施例和國際專利申請?zhí)朩O2004/056315中所述的。上述參考申請在此通過參考全部引入。
本文還提供了治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣蛋白病的一種或多種癥狀的方法，該方法包括給予治療有效量的本文所提供的化合物。在一種實施方案中，該化合物通過動力學上穩(wěn)定天然態(tài)的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體而防止甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體分解。甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣蛋白病例如可以是家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性。其它的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病包括但不限于阿爾茨海默病、海綿狀腦病(Creutzfeldt Jakob病)、多發(fā)性神經(jīng)病、II型糖尿病和甲狀腺髓質(zhì)瘤(例如參見國際專利申請公開號WO 98/27972和WO95/12815)。
提供通過給予本文所提供化合物治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白介導的疾病或紊亂的一種或多種癥狀的方法。甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白介導的疾病和紊亂包括但不限于肥胖癥(例如參見國際專利申請公開號WO02/059621)。
還提供了使用本文所提供化合物或組合物穩(wěn)定TTR四聚體的方法。還提供了使用本文所提供化合物或組合物抑制TTR淀粉樣形成的方法。
還提供了本文所述任一化合物或藥物組合物在治療、預防或改三甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病(即，家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性)的一種或多種癥狀中的用途。
還提供了本文所述任一化合物或藥物組合物在制備用于治療、預防或改三甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病(如，家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性)的一種或多種癥狀的藥物中的用途。
還提供了制造品、包含包裝材料、包裝材料內(nèi)的在此提供的化合物或其藥學上可接受的衍生物，其有效地預防TTR錯重疊或者治療、預防或改善與TTR錯重疊相關或牽涉TTR錯重疊的的疾病或紊亂的一種或多種癥狀，以及指示化合物或組合物或其藥學上可接受的衍生物用于調(diào)節(jié)TTR重疊或用于治療、預防或改善與TTR錯重疊相關或牽涉TTR錯重疊的的疾病或紊亂的一種或多種癥狀的標簽。
發(fā)明詳述 A.定義 除非另有定義，本文所用的所有科技術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員常規(guī)理解的含義。所有專利、申請、公開的申請或其它公開在此通過參考全部引入。當本文某一術語具有多種定義時，除非另有說明，優(yōu)選本節(jié)中的定義。
如本文所用，甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白或TTR是55kDa的均四聚體，特征為2，2，2對稱，在二聚體-二聚體界面具有兩個同樣的漏斗型結(jié)合位點，其中甲狀腺激素(T4)可結(jié)合于血漿和CSF中。TTR通常與低于1當量的全視黃醇結(jié)合蛋白相結(jié)合。TTR是127-殘基蛋白，其在生理條件下四聚化。TTR在血漿中用作甲狀腺素的三級轉(zhuǎn)運子且在腦脊液中用作初級載體。TTR通過其與視黃醛結(jié)合蛋白的聯(lián)合也可轉(zhuǎn)運視黃醛。TTR在低pH處形成淀粉樣。
如本文所用，化合物的藥學上可接受的衍生物包括其鹽、酯、烯醇醚、烯醇酯、縮醛、縮酮、原酯、半縮醛、半縮酮、溶劑化物、水化物或前藥。這樣的衍生物可由本領域技術人員使用已知的衍生方法方便地制備。所制備的化合物可以施用于動物或人而基本無毒性作用且是藥學活性物或前藥。藥學上可接受的鹽包括但不限于胺鹽，比如但不限于N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、銨、二乙醇胺和其它羥烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、1-對-氯芐基-2-吡咯烷-1′-基甲基-苯并咪唑、二乙胺和其它烷基胺，哌嗪和三(羥甲基)氨基甲烷；金屬鹽，比如但不限于鋰鹽、鉀鹽和鈉鹽；堿土金屬鹽，比如但不限于鋇鹽、鈣鹽和鎂鹽；過渡金屬鹽，比如但不限于鋅鹽；以及其它金屬鹽，比如但不限于磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉；還包括但不限于礦酸鹽，比如但不限于鹽酸鹽和硫酸鹽；有機酸鹽，比如但不限于乙酸、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽和富馬酸鹽。其它藥學上可接受的鹽包括酸性鹽比如醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽(digluconate)、十二硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖庚酸鹽(glucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、乙二酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽與十一酸鹽；堿性鹽包括銨鹽、堿金屬鹽、比如鈉與鉀鹽、堿土金屬鹽、比如鈣與鎂鹽、有機堿鹽、比如二環(huán)己基胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺，以及與氨基酸比如精氨酸、賴氨酸形成的鹽，等等。此外，堿性含氮基團可以被比如低級烷基鹵化物季銨化，比如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯，比如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯，長鏈鹵化物比如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基鹵化物比如芐基和苯乙基溴化物等。由此可獲得水或油溶性或可分散產(chǎn)物。藥學上可接受的酯包括但不限于酸性基團的烷基、鏈烯基、炔基和環(huán)烷基酯、酸性基團包括但不限于羧酸、磷酸、亞磷酸、磺酸、亞磺酸和硼酸。藥學上可接受的烯醇醚包括但不限于式C＝C(OR)的衍生物，其中R是氫、烷基、鏈烯基、炔基或環(huán)烷基。藥學上可接受的烯醇酯包括但不限于式C＝C(OC(O)R)衍生物，R是氫、烷基、鏈烯基、炔基或環(huán)烷基。藥學上可接受的溶劑化物和水化物是化合物與一個或多個溶劑或水分子的復合物，或1-約100，或1-約10，或1-約2、3或4個溶劑或水分子。
如本文所用，治療意指緩解或有效改變疾病或紊亂的一種或多種癥狀的方式。治療還包括任何在藥學上使用本文的組合物，比如用于治療TTR介導的疾病或紊亂，或牽涉TTR包括TTR錯重疊的疾病或紊亂。
如本文所用，通過給予具體化合物或藥物組合物改善具體紊亂的癥狀是指任何的減輕，無論持久的或臨時的、持續(xù)的或暫時的，其得益于施用該組合物或與其相關。
如本文所用IC50是指一種量，在測量試驗中，具體的測試化合物達到最大應答如抑制TTR錯重疊的50％抑制率時的濃度或劑量。
如本文所用，EC50是指在某一具體應答的50％最大表達處顯示劑量-依賴應答的具體化合物濃度或量，該具體應答由具體化合物誘導、刺激或加強。
如本文所用，前藥是在體內(nèi)施用時通過一或多個步驟或過程或其它方式代謝而轉(zhuǎn)化為生物學上、藥學上或治療學上的活性化合物形式的化合物。為了制備前藥，修飾藥學上活性化合物以使得經(jīng)代謝過程將重新生成活性化合物?？稍O計前藥以改變藥物的代謝穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)運特性，從而掩蔽副作用或毒性，改善藥物氣味或改變藥物的其它特征或性質(zhì)。基于在體內(nèi)的藥物動力學過程和藥物代謝知識，本領域技術人員一旦知曉藥學上活性化合物，就可設計該化合物的前藥(例如參見，Nogrady(1985)Medicinal ChemistryA Biochemical Approach，Oxford University Press，New York，pages 388-392)。
應理解到本文所提供化合物可包含手性中心。這些手性中心可以是(R)或(S)構(gòu)型，或可以是其混合物。由此，本文所提供化合物可以是對映體純的，或是立體異構(gòu)體或非對映體混合物。對于氨基酸殘基，這些殘基可以是L-或D-形式。天然存在的氨基酸殘基的構(gòu)象通常為L。當沒有指定時，殘基為L型。如本文所用，術語“氨基酸”是指α-氨基酸，其是外消旋體、或是D-或L-構(gòu)型。氨基酸名稱前的名稱″d″(如，dAla、dSer、dVal，等)是指氨基酸的D-異構(gòu)體。氨基酸名稱前的名稱″dl″(如，dlPip)是指氨基酸的L-和D-異構(gòu)體的混合物。應理解到本文所提供化合物的手性中心可在體內(nèi)被差向異構(gòu)化。這樣，本領域技術人員將認識到給予(R)型化合物，由于化合物在體內(nèi)被差向異構(gòu)化，相當于給予其(S)型。
如本文所用，基本上純的意指通過本領域技術人員用于檢測雜質(zhì)的標準的分析方法比如薄層層析(TLC)、凝膠電泳、高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)進行測定時，足夠均勻地表現(xiàn)出不含易于檢測的雜質(zhì)，或者足夠純以至進一步純化后將檢測不出物質(zhì)的理化性質(zhì)(比如酶促和生物活性)發(fā)生改變。純化化合物以制備基本上化學純化合物的方法為本領域技術人員所知。但基本上化學純化合物可以是立體異構(gòu)體混合物。此時，進一步純化可能提高化合物的特異活性。
如本文所用，烷基、鏈烯基和炔基碳鏈，除非另有指明，包含1-20個碳原子，或1或2-16個碳原子，是直鏈或支鏈的。在某些實施方案中，2-20個碳原子的鏈烯基碳鏈包含1-5個雙鍵。在某些實施方案中，2-20個碳原子的炔基碳鏈包含1-8個三鍵，在某些實施方案中，2-16個碳原子的炔基碳鏈包含1-5個三鍵。本文的烷基、鏈烯基和炔基的實例包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、新戊基、叔戊基、異己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基(丙炔基)。如本文所用，低級烷基、低級鏈烯基和低級炔基是指含有約1或約2個碳原子、最多約6個碳原子的碳鏈。如本文所用，“鏈烯炔基(alk(en)(yn)yl)”是指包含至少一個雙鍵和至少一個三鍵的烴基。
如本文所用，“環(huán)烷基”是指飽和單-或多-環(huán)系，某些實施例方案為3-10個碳原子，某些實施方案為3-6個碳原子；環(huán)烯基和環(huán)炔基是指各自包括至少一個雙鍵和至少一個三鍵的單-或多環(huán)系。環(huán)烯基和環(huán)炔基在某些實施方案中可包含3-10個碳原子，具有環(huán)烯基，在其它實施方案中，包含4-7個碳原子和環(huán)炔基，在其它實施方案中，包含8-10個碳原子。環(huán)烷基、環(huán)烯基和環(huán)炔基的環(huán)系可由一個或兩個或多個環(huán)構(gòu)成，這些環(huán)可以以稠合、橋連或螺連的方式連接在一起?！碍h(huán)烯炔基(cycloalk(en)(yn)yl)”是指包含至少一個雙鍵和至少一個三鍵的環(huán)烷基。
如本文所用，“芳基”是指包含6-19個碳原子的芳香單環(huán)或多環(huán)基團。芳基包括但不限于比如未取代或取代的芴基(fluorenyl)、未取代或取代的苯基以及未取代或取代的萘基。
如本文所用，“雜芳基”是指例如約5-約15元單環(huán)或多環(huán)芳環(huán)系，其中在環(huán)系中有一個或多個例如1-3個原子是雜原子，即，碳以外的原子，包括但不限于氮、氧或硫。雜芳基可任選與苯環(huán)稠合。雜芳基包括但不限于呋喃基、咪唑基、嘧啶基、四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、三唑基、喹啉基和異喹啉基。
如本文所用，“雜芳鎓”基是一個或多個雜原子帶正電荷的雜芳基。
如本文所用，“雜環(huán)基”是指單環(huán)或多環(huán)非芳香環(huán)系，例如3-10元，又例如4-7元、再例如5-6元，其中在環(huán)系中的一個或多個例如1-3個原子是雜原子，即，碳以外的原子，包括但不限于氮、氧或硫。當雜原子是氮時，氮原子任選被烷基、鏈烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基烷基、酰基、胍基取代，或者氮原子可以被季銨化形成銨基，其中取代基選自上述取代基。
如本文所用，“芳烷基”是指烷基中的一個氫原子被芳基取代的烷基。
如本文所用，“雜芳烷基”是指烷基中的一個氫原子被雜芳基取代的烷基。
如本文所用，“鹵素”、“鹵原子”或“鹵化物”是指F、Cl、Br或I。
如本文所用，擬鹵素或擬鹵化物基是性能與鹵素基本相似的基團。這樣的化合物可以以與鹵化物相同的方法使用或處理。擬鹵化物包括但不限于氰化物、氰酸酯、硫氰酸酯、硒氰酸酯、三氟甲氧基和疊氮。
如本文所用，“鹵代烷基”是指其中一個或多個氫原子被鹵原子取代的烷基。這樣的基團包括但不限于氯甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟乙基。
如本文所用，“鹵烷氧基”是指其中R是鹵代烷基的RO-。
如本文所用，“亞磺?；被颉皝喠蝓；笔侵?S(O)-。如本文所用，“磺?；被颉绊炕笔侵?S(O)2-。如本文所用，“磺基”是指-S(O)2O-。
如本文所用，“羧基”是指二價基團-C(O)O-。
如本文所用，“氨基羰基”是指-C(O)NH2。
如本文所用，“烷基氨基羰基”是指其中R是烷基包括低級烷基的-C(O)NHR。如本文所用，“二烷基氨基羰基”是指其中R′和R獨立是烷基包括低級烷基的-C(O)NR′R；“羧酰胺”是指其中R′和R獨立是烷基包括低級烷基的-NR′COR。
如本文所用，“二芳基氨基羰基”是指其中R和R′獨立選自芳基包括低級芳基比如苯基的-C(O)NRR′。
如本文所用，“芳基烷基氨基羰基”是指R和R′之一選自芳基包括低級芳基比如苯基且R和R′之一是烷基包括低級烷基的-C(O)NRR′。
如本文所用，“芳基氨基羰基”是指其中R是芳基包括低級芳基比如苯基的-C(O)NHR。
如本文所用，“羥基羰基”是指-COOH。
如本文所用，“烷氧羰基”是指其中R是烷基包括低級烷基的-C(O)OR。
如本文所用，“芳氧羰基”是指其中R是芳基包括低級芳基比如苯基的-C(O)OR。
如本文所用，“烷氧”和“烷硫”是指其中R是烷基包括低級烷基的RO-和RS-。
如本文所用，“芳氧”和“芳硫”是指R是芳基包括低級芳基比如苯基的RO-和RS-。
如本文所用，“亞烷基”是指直鏈、支鏈或環(huán)狀的，例如直鏈或支鏈的，二價脂肪族烴基，例如具有1-約20個碳原子，又例如具有1-12個碳原子。在進一步的實施方案中，亞烷基包括低級亞烷基。任選沿著該亞烷基插入一個或多個氧、硫包括S(＝O)和S(＝O)2基團、或取代或未取代的氮原子包括-NR-和-N+RR-基團，其中氮取代基是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基或COR′，其中R′是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、-OY或-NYY，其中Y是氫、烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)基。亞烷基包括但不限于亞甲基(-CH2-)、亞乙基(-CH2CH2-)、亞丙基(-(CH2)3-)、甲撐二氧基(-O-CH2-O-)和乙撐二氧基(-O-(CH2)2-O-)。術語“低級亞烷基”是指具有1-6個碳原子的亞烷基。在某些實施方案中，亞烷基是低級亞烷基，包括1-3個碳原子的亞烷基。
如本文所用，“氮雜亞烷基”是指-(CRR)n-NR-(CRR)m-，其中n和m各自獨立是0-4的整數(shù)。如本文所用，“氧雜亞烷基”是指-(CRR)n-O-(CRR)m-，其中n和m各自獨立是0-4的整數(shù)。如本文所用，“硫代亞烷基”是指-(CRR)n-S-(CRR)m-、-(CRR)n-S(＝O)-(CRR)m-和-(CRR)n-S(＝O)2-(CRR)m-，其中n和m各自獨立是0-4的整數(shù)。
如本文所用，“亞鏈烯基”是指直鏈、支鏈或環(huán)狀的，例如直鏈或支鏈的，二價脂肪族烴基，例如具有2-約20個碳原子和至少一個雙鍵，又例如具有1-12個碳原子。在進一步的實施方案中，亞鏈烯基包括低級亞鏈烯基。任選沿著該亞鏈烯基插入一個或多個氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亞鏈烯基包括但不限于-CH＝CH-CH＝CH-和-CH＝CH-CH2-。術語“低級亞鏈烯基”是指具有2-6個碳原子的亞鏈烯基。在某些實施方案中，亞鏈烯基是低級亞鏈烯基，包括3-4個碳原子的亞鏈烯基。
如本文所用，“亞炔基”是指直鏈、支鏈或環(huán)狀的，例如直鏈或支鏈的，二價脂肪族烴基，例如具有2-約20個碳原子和至少一個三鍵，又例如具有1-12個碳原子。在進一步的實施方案中，亞炔烯基烯包括低級亞烯基。任選沿著該亞烯基插入一個或多個氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亞炔基包括但不限于-C≡C-C≡C-、-C≡C-和-C≡C-CH2-。術語“低級亞烯基”是指具有2-6個碳原子的亞炔基。在某些實施方案中，亞炔基是低級亞炔基，包括3-4個碳原子的亞炔基。
如本文所用，“亞鏈烯炔基”是指直鏈、支鏈或環(huán)狀的，例如直鏈或支鏈的，二價脂肪族烴基，例如具有2-約20個碳原子以及至少一個三鍵和至少一個雙鍵，又例如具有1-12個碳原子。在進一步的實施方案中，亞鏈烯炔烯基包括低級亞鏈烯炔基。任選沿著該亞鏈烯炔基插入一個或多個氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亞鏈烯炔基包括但不限于-C＝C-(CH2)n-C≡C-，其中n是1或2。術語“低級亞鏈烯炔基”是指具有高至6個碳原子的亞鏈烯炔基。在某些實施方案中，亞鏈烯炔基是低級亞炔基，包括約4個碳原子的亞鏈烯炔基。
如本文所用，“環(huán)亞烷基”是指二價的飽和的單-或多環(huán)環(huán)系，例如具有3-10個碳原子，再例如3-6個碳原子；環(huán)亞烯基和環(huán)亞炔基是指各自包括至少一個雙鍵和至少一個三鍵的二價單-或多環(huán)環(huán)系。環(huán)亞烯基和環(huán)亞炔基例如可以包含3-10個碳原子，環(huán)亞烯基例如包含4-7個碳原子以及環(huán)亞炔基例如包含8-10個碳原子。環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基和環(huán)亞炔基的環(huán)系可以由一個環(huán)或兩個或多個環(huán)構(gòu)成，這些環(huán)可以以稠合、橋連或螺連的方式連接在一起。“環(huán)亞鏈烯炔基”是指包含至少一個雙鍵和至少一個三鍵的環(huán)亞烷基。
如本文所用，“亞芳基”是指單環(huán)或多環(huán)例如單環(huán)的二價芳基，例如具有5-約20個碳原子和至少一個芳環(huán)，又例如5-12個碳原子。在其它實施方案中，亞芳基包括低級亞芳基。亞芳基包括但不限于1，2-、1，3-和1，4-亞苯基。術語“低級亞芳基”是指具有6個碳原子的亞芳基。
如本文所用，“亞雜芳基”是指二價的單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)系，例如約5-約15個環(huán)原子，其中一個或多個例如1-3個環(huán)系原子是雜原子，即，除碳外的元素，包括但不限于氮、氧或硫。術語“低級亞雜芳基”是指具有5或6個環(huán)原子的亞雜芳基。
如本文所用，“亞雜環(huán)基”是指二價的單環(huán)或多環(huán)非芳香環(huán)系，例如3-10元、例如4-7元、又例如5-6元，其中一個或多個包括1-3個環(huán)系原子是雜原子，即，除碳外的元素，包括但不限于氮、氧或硫。
如本文所用，“取代的烷基”、“取代的鏈烯基”、“取代的炔基”、“取代環(huán)烷基”、“取代的環(huán)烯基”、“取代的環(huán)炔基”、“取代的芳基”、“取代的雜芳基”、“取代的雜環(huán)基”、“取代的亞烷基”、“取代的亞鏈烯基”、“取代的亞炔基”、“取代的環(huán)亞烷基”、“取代的環(huán)亞烯基”、“取代的環(huán)亞炔基”、“取代的亞芳基”、“取代的亞雜芳基”和“取代的亞雜環(huán)基”是指各自被一個或多個取代基例如一、二、三或四個取代基取代的烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)炔基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、亞烷基、亞炔基、亞鏈烯基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、環(huán)亞炔基、亞芳基、亞雜芳基和亞雜環(huán)基，其中取代基如本文定義，例如選自Q1。
如本文所用，“烷叉基”是指二價基團，比如＝CR′R″，其與另一基團的一個原子相連，形成雙鍵。烷叉基包括但不限于甲叉基(＝CH2)和乙叉基(＝CHCH3)。如本文所用，“芳基烷叉基”是指其中R′或R″是芳基的烷叉基。環(huán)烷叉基是其中R′與R″相連形成碳環(huán)的那些基團?！半s環(huán)叉基(Heterocyclylidene)”是指其中R′和R″至少之一在鏈中包含雜原子且R′與R″相連形成雜環(huán)的那些基團。
如本文所用，“酰胺”是指二價基團-C(O)NH-?！傲虼０贰笔侵付r基團-C(S)NH-。“氧基酰胺(Oxyamido)”是指二價基團-OC(O)NH-。“硫酰胺(Thiaamido)”是指二價基團-SC(O)NH-?！岸蝓０?dithiaamido)”是指二價基團-SC(S)NH-?！半寤?Ureido)”是指二價基團-HNC(O)NH-?！傲螂寤?Thioureido)”是指二價基團-HNC(S)NH-。
如本文所用，“氨基脲(semicarbazide)”是指-NHC(O)NHNH-?！半录姿?Carbazate)”是指二價基團-OC(O)NHNH-。“異硫肼甲酸(Isothiocarbazate)”是指二價基團-OC(S)NHNH-。“磺酰肼(sulfonylhydrazide)”是指二價基團-SO2NHNH-?！磅ｋ隆笔侵付r基團-C(O)NHNH-?！芭嫉笔侵付r基團-N＝N-?！半禄笔侵付r基團-NH-NH-。
當沒有指定任何給定的取代基的數(shù)目時(如，鹵代烷基)，可以存在有一個或多個取代基。例如，“鹵代烷基”可以包括一個或多個相同或不同的鹵原子。又例如，“C1-3烷氧苯基”可以包括一個或多個相同或不同的包含一個、兩個或三個碳原子的烷氧基。
如本文所用，任何保護基、氨基酸和其它化合物的縮寫，除非另有說明，均與它們常規(guī)使用的、公認的縮寫或IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature(參見(1972)Biochem.11942-944)相一致。
B.TTR和淀粉樣蛋白病 至少某些淀粉樣蛋白病顯示了是由超過20種非同源蛋白或蛋白片段的任何之一沉積而引起的，最終導致纖絲交聯(lián)-β-層四級結(jié)構(gòu)。由正常重疊的蛋白如甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白蛋白形成淀粉樣纖絲時需要蛋白錯重疊以形成裝配-競爭中間體。甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白蛋白(TTR)淀粉樣化的過程表明引起三種不同的淀粉樣疾病--老年全身性淀粉樣變性(SSA)、家族性淀粉樣多神經(jīng)病(FAP)和家族性淀粉樣心肌病(FAC)。SSA與野生型TTR的沉積相關，而FAP和FAC則是由超過80種TTR變異體之一的淀粉樣化引起的。例如參見，Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-60；Kelly，J.W.Curr.Opin.Struct.Biol.1996，6，11-7；Liu，K.；et al.Nat.Struct.Biol.2000，7，754-7；Westermark，P.；et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87，2843-5；Saraiva，M.J.；et al.J.Clin.Invest.1985，76，2171-7；Jacobson，D.R.；et al.N.Engl.J.Med.1997，336，466-73；Buxbaum，J.N.；Tagoe，C.E.Ann.Rev.Med.2000，51，543-569以及Saraiva，M.J.Hum.Mutat.1995，5，191-6，其各自在此全部引入作為參考。
TTR是55kDa的均四聚體，特征為2，2，2對稱，在二聚體-二聚體界面具有兩個同樣的漏斗型結(jié)合位點，其中甲狀腺激素(T4)可結(jié)合于血漿和CSF中。TTR通常與低于1當量的全視黃醇結(jié)合蛋白相結(jié)合。TTR錯重疊包括四聚體解聚成單體，隨后單體內(nèi)的三級結(jié)構(gòu)改變，使得蛋白可能錯裝配，最終淀粉樣變性。FAP的可行療法采用了由肝移植介導的基因療法以使用野生型(WT)蛋白替代血液中的TTR變異體。對于多數(shù)FAC或SSA患者而言，該治療不可行，原因是多數(shù)患者超過60歲且因為他們的健康狀況和受損的心功能而無法成為肝移植的候選人。此外，與FAP相關的若干TTP變異體，在肝移植后發(fā)生了進行性淀粉樣心肌病，wt TTR在心肌組織沉積，導致死亡。肝移植療法對于約10種TTR變異體也將無效，因為該TTR由脈絡叢合成，其在柔腦脊膜中沉積淀粉樣纖絲，導致CNS疾病。因此，需要開發(fā)通用的非侵入性藥物治療策略。還需要非蛋白、非肽或非核苷的藥物。例如參見，Blake，C.C.；et al.J.Mol.Biol.1978，121，339-56；Wojtczak，A.；et al.Acta Crystallogr.，Sect.D 1996，758-810；Monaco，H.L.；Rizzi，M.；Coda，A.Science 1995，268，1039-41；Lai，Z.；Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry1996，35，6470-82；Holmgren，G.；et al.Lancet 1993，341，1113-6；Suhr，O.B.；Ericzon，B.G.；Friman，S.Liver Transpl.2002，8，787-94；Dubrey，S.W.；et al.Transplantation 1997，64，74-80；Yazaki，M.；et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，702-6；和Cornwell，C.G.III；et al.Am.J.ofmed.1983，75，618-623，各文獻通過參考在此全部引入。
C.化合物 在一種實施方案中，用于本文所提供的組合物和方法中的化合物具有式IA結(jié)構(gòu)
其中Y是COOH、四唑基、CONHOH、B(OH)2OH； X是O；以及 R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素、OH、B(OH)2或CF3。
在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中Y是COOH。在另一實施方案中，Y是四唑基、B(OH)2或CONHOH。在另一實施方案中，Y是OH。
在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素和OH。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中其中R1、R2和R3各自獨立選自氫和CF3。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1和R2各自獨立是氫且R3是CF3。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素、OH和B(OH)2。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫、Br和I。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1、R2和R3各自獨立選自鹵素和OH。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1、R2和R3各自獨立選自鹵素和B(OH)2。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1和R2各自是鹵素且R3是B(OH)2。在另一實施方案中，化合物具有式I結(jié)構(gòu)，其中R1和R2各自是鹵素且R3是H。
在另一實施方案中，化合物具有下式結(jié)構(gòu)，






在另一實施方案中，本文提供的化合物具有下式結(jié)構(gòu)
或其藥學上可接受的衍生物，其中Het、X和Y如本文其它地方定義。
在另一實施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基，其中R是氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基。在另一實施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任選被鹵素、烷基或鹵代烷基取代。在另一實施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任選被三氟甲基、氯或甲基取代。
在另一實施方案中，本文所提供化合物選自

D.化合物的制備 本文所提供的化合物可通過下面所示的和實施例中的方法制備，或通過本領域技術人員公知的其它方法制備。這些合成方法中的起始物可以是通過商業(yè)渠道獲得(如，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，USA)。
試劑和溶劑購自Aldrich，Lancaster，Acros，Combi-Blocks，Matrix和Pfaltz-Bauer。THF和CH2Cl2經(jīng)Al2O3干燥。其它溶劑和試劑由供應商提供且除非另有說明無需進一步純化即可使用。使用在硅膠60F254預鋪板上的分析型薄層色譜(TLC)采用購自EM Science的熒光顯示器監(jiān)測反應。觀察TLC板時的同時，進行UV熒光、磷鉬酸處理隨后加熱、或者鉬酸鈰銨處理隨后加熱。進行快速層析時使用EM Science的硅膠60(230-400目)。對于文中所述結(jié)論必要的新化合物的純度經(jīng)HPLC測定。進行正相HPLC時使用Waters 600泵/控制器，Waters 996光電二極管排列檢測器和WatersNovaPak硅膠柱。所用的溶劑系統(tǒng)是己烷和乙酸乙酯，洗脫梯度在30分鐘從50∶50己烷∶乙酸乙酯至0∶100己烷∶乙酸乙酯。進行反相HPLC時使用Waters 600泵/控制器，Waters 2487雙波長檢測器和Vydac蛋白和肽C18柱。溶劑系統(tǒng)A是含0.5％三氟乙酸的95∶5水∶乙腈，溶劑B是含0.5％三氟乙酸的5∶95水∶乙腈。梯度洗脫在20分鐘由100∶0 A∶B-0∶100 A∶B并于100％B維持10分鐘。在AVIV Instruments波譜儀202SF模式上進行圓二色譜。在Varian FT NMR波譜儀上以400MHz質(zhì)子頻率劑量NMR譜。除非另有說明，參照作為內(nèi)化學位移標準的CHCl3(7.26ppm)以每百萬份(ppm)為單位記錄質(zhì)子化學位移。以赫茲(Hz)為單位記錄偶合常數(shù)。除非另有說明，參照作為內(nèi)化學位移標準的CDCl3(77.23ppm)以每百萬份(ppm)為單位記錄碳化學位移。
苯并噁唑合成的一般方法 氨基羥基苯甲酸(0.2mmol)在THF(3mL)中的混合物相繼經(jīng)吡啶(500μl，0.6mmol)和所需的酰氯(0.2mmol)處理。于環(huán)境溫度攪拌反應10h，回流1h，真空濃縮，無需純化用于后面步驟中。
將對-甲苯磺酸單水合物(380.4mg，2.0mmol)加入粗反應混合物的二甲苯(5mL)溶液中，回流攪拌所得混合物過夜。12h后，將反應物冷至環(huán)境溫度，用NaOH(2mL，1N)猝滅，分離各相。水層經(jīng)HCI(1N)酸化至pH2并用EtOAc(4×3mL)萃取。合并的有機層經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。將所得殘留物溶解于MeOH∶苯(2mL；1∶4)的混合物中，于25℃用TMS-CHN2(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol)處理，通過TLC監(jiān)測反應過程(通常在0.5h后反應完全)。真空濃縮反應混合物，殘留物經(jīng)層析(10-25％EtOAc/己烷梯度)得到所需的苯并噁唑甲酯。
將苯并噁唑甲酯溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，0.07M)混合物中并用LiOH.H2O(4當量)處理。于環(huán)境溫度攪拌反應物并經(jīng)TLC監(jiān)測。反應完全后，混合物經(jīng)1N HCI酸化至pH2，用EtOAc(4×)萃取。合并的有機層經(jīng)MgS04干燥，過濾并濃縮。殘留物經(jīng)制備薄層層析(4.9％MeOH，95％CH2Cl2，0.1％HOAc)得到產(chǎn)物，為白色固體。
可供選擇地，化合物可如下所示制備。

氨基羥基苯甲酸(0.2mmol)在THF(3mL)中的混合物相繼經(jīng)吡啶(500μl，0.6mmol)和所需的酰氯(0.2mmol)處理。于環(huán)境溫度攪拌反應10h，回流1h，真空濃縮，無需純化用于后面步驟中。
將對-甲苯磺酸單水合物(380.4mg，2.0mmol)加入粗反應混合物的二甲苯(5mL)溶液中，回流攪拌所得混合物過夜。12h后，將反應物冷至環(huán)境溫度，用NaOH(2mL，1N)猝滅，分離各相。水層經(jīng)HCI(1N)酸化至pH2并用EtOAc(4×3mL)萃取。合并的有機層經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。(不必含水操作)將所得殘留物溶解于MeOH∶苯(2mL；1∶4)的混合物中，于25℃用TMS-CHN2(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol)處理，通過TLC監(jiān)測反應過程(通常在0.5h后反應完全)。真空濃縮反應混合物，殘留物經(jīng)層析(10-25％EtOAc/己烷梯度)得到所需的苯并噁唑甲酯。將苯并噁唑甲酯溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，0.07M)混合物中并用LiOH·H2O(4當量)處理。于環(huán)境溫度攪拌反應物并經(jīng)TLC監(jiān)測。反應完全后，混合物經(jīng)1N HCI酸化至pH2，用EtOAc(4×)萃取。合并的有機層經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮。殘留物經(jīng)制備薄層層析(4.9％MeOH，95％CH2Cl2，0.1％HOAc)得到產(chǎn)物，為白色固體。
可供選擇的路線 在共沸除去水的二甲苯中進行反應。含水操作后，過濾沉淀的固體并溶解于乙酸乙酯中，用己烷稀釋，攪拌30分鐘，然后濾除沉淀物并濃縮濾液至10ml，過濾固體沉淀得到純化合物為乳酪色(cream color)固體。
E.藥物組合物的配制 本文提供的藥物組合物包含在藥學上可接受的載體中的治療有效量的本文提供的一種或多種化合物，其適用于預防、治療、或緩解與甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白(TTR)錯重疊相關或牽涉TTR錯重疊的疾病或紊亂的一種或多種癥狀。與TTR錯重疊相關的疾病或紊亂包括但不限于家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病、老年全身性淀粉樣變性、阿爾茨海默病、海綿狀腦病(Creutzfeldt Jakob disease)、多發(fā)性神經(jīng)病、II型糖尿病、甲狀腺髓質(zhì)瘤和肥胖癥。適用于給予本文提供化合物的載體包括本領域技術人員已知的適用于具體給藥方式的任何載體。
此外，可將化合物配制為組合物中的單一藥學活性成分或可與其它活性成分相聯(lián)合。
組合物包含本文提供的一種或多種化合物。在一種實施方案中，這些化合物被配制在適宜的藥物制劑中，比如溶液、懸浮液、片劑、分散片、丸劑、膠囊、粉末劑、緩釋制劑或酏劑，口服或胃腸外給藥的無菌溶液或懸浮液，以及透皮補片制劑或干粉吸入劑。在一種實施方案中，使用本領域公知的技術和方法將上述化合物被配制在藥物組合物中(例如參見，AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms，F(xiàn)ourth Edition 1985，126)。
在這些組合物中，將有效濃度的一種或多種化合物或其藥學上可接受的衍生物與適宜的藥學載體相混合。如上所述，這些化合物可以被衍生為相應的鹽、酯、烯醇醚或酯、縮醛、縮酮、原酯、半縮醛、半縮酮、酸、堿、溶劑化物、水合物或配制之前的前藥。組合物中化合物的濃度，在給藥后，可有效釋放以治療、預防或改善與甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白(TTR)錯重疊相關或牽涉TTR錯重疊的疾病或紊亂的一種或多種癥狀。
在一種實施方案，將組合物配制為單一劑量給藥。配制組合物時，將一定重量的化合物溶解于、懸浮、分散或混合于所選載體中，其濃度足以減輕、預防所治療病情或緩解一種或多種癥狀。
在藥學上可接受載體內(nèi)包含的活性化合物的量足以對于所治療的患者產(chǎn)生治療有益效果而沒有不合意的副作用。通過在體外和體內(nèi)體系中測試化合物然后由此外推用于人的劑量，即可憑經(jīng)驗確定治療有效濃度。
藥物組合物中活性化合物的濃度將取決于活性化合物的吸收、滅活和排泄速率、化合物的理化特性、劑量方案、給藥量以及本領域技術人員已知的其它因素。例如，使給藥量足以緩解與TTR錯重疊相關或牽涉TTR錯重疊的疾病或紊亂的一種或多種癥狀，如本文所述。
在一種實施方案中，治療有效量將產(chǎn)生約0.1ng/ml-約50-100μg/ml的活性成分血漿濃度。在另一種實施方案中，藥物組合物將提供約0.001mg-約2000mg化合物每千克體重每天的劑量。
制備藥物劑量單位形式以提供約0.01mg、0.1mg或1mg-約500mg、1000mg或2000mg以及在一種實施方案中約10mg-約500mg活性成分或必要成分組合的每劑量單位形式。
活性成分可以一次給藥，或可分成若干較小劑量間隔給藥。應理解到，準確劑量和療程是所治療疾病的函數(shù)，可使用已知的測試法或由體內(nèi)或體外測試數(shù)據(jù)外推而憑經(jīng)驗確定。應注意，濃度和劑量值還可隨著所緩和的病情的嚴重程度而改變。還應理解到對于任何具體受試者，應根據(jù)個體需要和給藥者或監(jiān)督者的專業(yè)判斷隨著時間調(diào)整特定的劑量方案，在此闡明的濃度范圍僅是例示性的且不意在限制所要求的組合物的范圍和實踐。
在化合物的溶解度不足的情況下，可以使用增加化合物溶解度的方法。這些方法為本領域技術人員已知且包括但不限于使用輔溶劑比如二甲基亞砜(DMSO)、使用表面活性劑比如

、或在碳酸氫鈉水溶液中溶解。還可使用這些化合物的衍生物比如化合物的前藥配制有效的藥物組合物。
在混合或加入化合物時，所得混合物可以是溶液、懸浮液、乳液等。所得混合物的形式取決于大量因素，包括預期的給藥方式和化合物在所選載體或媒介內(nèi)的溶解度。有效濃度足以充分緩解疾病癥狀、所治療的紊亂或病情并可憑經(jīng)驗確定。
以單位劑型將藥物組合物提供給人和動物，比如包含適宜量化合物或其藥學上可接受衍生物的片劑、膠囊、丸劑、粉末劑、顆粒劑、無菌胃腸外溶液或懸浮液、口服溶液或懸浮液以及油-水乳劑。在一種實施方案中，藥學上有療效的活性化合物或其衍生物被配制于單位劑型或多劑型內(nèi)或以此給藥。本文所用的單位劑型是指適用于人或動物受試者的物理上分離且如本領域已知分別包裝的單位。各單位劑量包含預定量的治療活性化合物，其足以產(chǎn)生所需的療效，且與所需的藥物載體、媒介物或稀釋劑相聯(lián)合。單位劑型例如包括安瓿和注射器以及分別包裝的片劑或膠囊。單位劑型可以分份或多次給藥。多劑型是包裝在單一容器中的多個同樣的單位劑型，其以分離的單位劑型給藥。多劑型例如包括小瓶、片劑或膠囊瓶或品脫或加侖瓶。由此，多劑型是在包裝中無法分離的多個單位劑量。
液態(tài)藥學上可給藥的組合物例如可以通過溶解、分散或混合上述活性化合物與載體中任選的藥物輔料如水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等從而形成溶液或懸浮液而制備。需要時，所給藥的藥物組合物還可包含少量無毒的輔助物比如潤濕劑、乳化劑、增溶劑、pH緩沖劑等，例如乙酸鹽、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯等試劑。
制備這些劑型的實際方法對于本領域技術人員是已知的或是顯然的，例如參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，15th Edition，1975。
可制備包含0.005％-100％活性成分且余量由無毒載體構(gòu)成的劑型或組合物。本領域技術人員已知制備這些組合物的方法。所述組合物可包含0.001％-100％活性成分，在一種實施方案中為0.1-95％，在另一種實施方案中為75-85％。
1、口服給藥的組合物 口服藥物劑型是固體、凝膠或液體。固體劑型是片劑、膠囊、顆粒劑或散裝粉末劑?？诜瑒┑念愋桶▔嚎s、可咀嚼的錠劑和腸溶包衣、糖包衣或膜包衣的片劑。膠囊可以是硬或軟明膠膠囊，同時顆粒和粉末可以以非泡騰或聯(lián)合有本領域技術人員已知的其它成分的泡騰形式提供。
a.口服的固體組合物 在某些實施方案中，制劑是固體劑型，在一種實施方案中是膠囊或片劑。片劑、丸劑、膠囊、藥片等可包含一種或多種下列組分下列成分或類似性質(zhì)的化合物粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、助流劑、崩解劑、著色劑、甜味劑、增香劑、潤濕劑、催吐劑層和膜包衣。粘合劑例如包括微晶纖維素、黃蓍樹膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、凝膠溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯基吡咯烷酮、交聯(lián)聚乙烯聚吡咯烷酮、蔗糖與漿糊。潤滑劑包括滑石、淀粉、硬脂酸鎂或者鈣、石松子(lycopodium)與硬脂酸。稀釋劑例如包括乳糖、蔗糖、淀粉、高嶺土、鹽、甘露糖醇與磷酸二鈣。助流劑包括但不局限于膠體二氧化硅。崩解劑包括交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、淀粉羥基乙酸鈉、藻酸、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、皂土、甲纖維素、瓊脂與羧甲基纖維素。著色劑例如包括任何批準的經(jīng)證明是水溶性的FD和C染料及其混合物；以及懸浮于氧化鋁水合物上的水不溶性FD和C染料。甜味劑包括蔗糖、乳糖、甘露糖醇與人造的甜味劑比如糖精，以及許多噴霧干燥香料。增香劑包括從植物比如果實中提取的天然香料和能產(chǎn)生欣快感的合成化合物的混合物比如但不限胡椒薄荷與水楊酸甲酯。潤濕劑包括單硬脂酸丙二醇酯、單油酸山梨醇酐酯、二甘醇月桂酸酯與聚氧化乙烯月桂醚。催吐層包括脂肪酸、脂肪、蠟、蟲膠、氨合物蟲膠與醋酞纖維素。膜包衣包括羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇4000和乙酸酞酸纖維素。
化合物或其藥學上可接受的衍生物可在防止其接觸胃酸環(huán)境的組合物中提供。例如，組合物可以被配制于腸溶衣內(nèi)，在胃內(nèi)保持了其完整性并在腸內(nèi)釋放活性化合物。組合物還可與抗酸劑或其它這樣的成分聯(lián)合配制。
當單位劑型是膠囊時，除上述類型物質(zhì)外，其可包含液體載體比如脂肪油。此外，單位劑型可包含多種修改劑型物理形式的其它物質(zhì)，例如糖和其它腸溶試劑的包衣。這些化合物還可作為酏劑、懸浮液、糖漿、干膠片口香糖等。除了活性化合物，糖漿可包含作為甜味劑的蔗糖和某些防腐劑、染料和著色劑和芳香劑。
活性物還可與不損害所需作用的其它活性物混合，或與補充所需作用的物質(zhì)比如抗酸劑、H2阻滯劑和利尿劑。活性成分是本文所述的化合物或其藥學上可接受的衍生物。可包括更高濃度，高達98％重量份的活性成分。
在所有實施方案中，為了修改或延緩活性成分的溶解，片劑和膠囊劑可如本領域技術人員已知的方式包衣。由此，例如可用常規(guī)的腸溶可消化包衣比如水楊酸苯酯、蠟和乙酸酞酸纖維素進行包衣。
b.口服的液體組合物 液體口服劑型包括水溶液、乳劑、懸浮劑、由非泡騰顆粒再構(gòu)成的溶液和/或懸浮液。水溶液例如包括酏劑和糖漿。乳劑可以是水包油或油包水。
酏劑是澄清的、甜的或水醇制劑。用于酏劑的藥學上可接受的載體包括溶劑。糖漿可以是糖如蔗糖的濃水溶液并可包含防腐劑。乳劑是兩相體系，其中一種液體以小顆粒形式分散在另一液體中。用于乳劑的藥學上可接受的載體是非水液體、乳化劑和防腐劑。用于非泡騰顆粒再構(gòu)成液體口服劑型的藥學上可接受的物質(zhì)包括稀釋劑、甜味劑和潤濕劑。用于泡騰顆粒再構(gòu)成液體口服劑型的藥學上可接受的物質(zhì)包括有機酸和二氧化碳源。著色劑和芳香劑用于上述所有劑型中。
溶劑包括甘油、山梨醇、乙醇和糖漿。防腐劑例如包括甘油、對羥苯甲酸甲酯和丙酯、苯甲酸、苯甲酸鈉和醇。用于乳劑的非水溶液例如包括礦油和棉花籽油。乳化劑例如包括凝膠、阿拉伯膠、黃蓍膠、皂土和表面活性劑比如聚氧化乙烯單油酸山梨醇酐酯。懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、果膠、黃蓍膠、硅酸鎂鋁與阿拉伯膠。
甜味劑包括蔗糖、糖漿、甘油和人造甜味劑比如糖精。潤濕劑包括單硬脂酸丙二醇酯、單油酸山梨醇酐酯、二甘醇月桂酸酯和聚氧化乙烯月桂基醚。有機酸包括檸檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氫鈉和碳酸鈉。著色劑包括批準的經(jīng)證明是水溶性的FD和C染料及其混合物。芳香劑包括從植物如果實提取的天然香料和產(chǎn)生欣快味覺的合成化合物的摻合物。
對于固體劑型，在例如碳酸丙烯、植物油或甘油三酯中溶液或懸浮液是包封在明膠膠囊內(nèi)的一種實施方案。該溶液及其制劑和包封，公開于美國專利號4,328,245、4,409,239和4,410,545中。對于液體劑型，例如在丙二醇中的溶液可經(jīng)足量的藥學上可接受的液體載體如水稀釋從而便于測量給藥。
可供選擇地，制備液體或半固體口服制劑時，可將活性化合物或鹽溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)和其它這樣的載體中，并在硬或軟明膠膠囊殼中包封這些溶液或懸浮液。其它有用的制劑包括美國專利號RE28,819和4,358,603中闡述的那些。簡言之，這些制劑包括但不限于包含本文提供的化合物、二烷基化單-或多-亞烷基二醇，包括但不限于1，2-二氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750指聚乙二醇的大約平均分子量，一種或多種抗氧化劑比如丁酸化的羥基甲苯(BHT)、丁酸化的羥基茴香醚(BHA)、沒食子酸丙酯、維生素E、氫醌、羥基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、腦磷脂、抗壞血酸、馬來酸、山梨醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯、二硫代氨基甲酸酯。
其它制劑包括但不限于包括藥學上可接受的縮醛的含水醇溶液。用于這些制劑的醇是任何藥學上可接受的水混溶溶劑，其具有一個或多個羥基，包括但不限于丙二醇和乙醇?？s醛包括但不限于低級烷基醛的二(低級烷基)縮醛比如乙醛二乙基縮醛。
2、注射劑、溶液和乳劑 此處還涉及胃腸外給藥，在一種實施方案中的特征為皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。注射劑可被制備為常規(guī)形式，為液體溶液或懸浮液，適于在注射前在液體中形成溶液或懸浮液的固體形式，或為乳劑。注射劑、溶液和乳劑還包含一種或多種賦形劑。適宜的賦形劑例如是水、鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇。此外，需要時，所給予的藥物組合物還可包含少量非毒性輔助物比如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其它這樣的物質(zhì)如乙酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和環(huán)糊精。
在此還涉及緩慢釋放或延遲釋放系統(tǒng)的植入劑，從而維持恒定水平的劑量(例如參見美國專利號3,710,795)。簡言之，將本文提供的化合物分散于固體惰性基質(zhì)內(nèi)，如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、可塑的或不可塑的聚氯乙稀、可塑的尼龍、可塑的聚亞乙基對苯二酸、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡膠、聚二甲基硅烷、硅酮碳酸酯共聚物、親水聚合物比如丙烯酸和甲基丙烯酸酯的水凝膠、膠原、交聯(lián)聚乙烯醇和交聯(lián)部分水解的聚乙酸乙烯酯，其被外圍的聚合膜如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡膠、聚二甲基硅烷、氯丁橡膠、氯化的聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯與乙酸乙烯酯、亞乙烯基氯化物、乙烯和丙烯的共聚物、聚乙烯對苯二酸鹽離聚物、丁基橡膠表氯醇橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和在體液中不溶的乙烯/乙烯基氧基乙醇共聚物所包圍。這些化合物以控釋速率步驟擴散通過外部的聚合物膜。包含在這些胃腸外組合物中的活性化合物的百分比高度取決于其特定形式以及化合物的活性和受試者的需要。
組合物的胃腸外給予包括靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)給藥。胃腸外給藥的制劑包括便于注射的無菌溶液、便于恰在使用前與溶劑相混合的無菌干燥可溶產(chǎn)品比如凍干粉，包括皮下片、便于注射的無菌懸浮液、便于恰在使用前與媒介物相混合的無菌干燥不溶產(chǎn)品和無菌乳劑。溶液可以是水溶液或非水溶液。
如果靜脈內(nèi)給藥，適宜的載體包括生理鹽水或磷酸緩沖鹽水(PBS)，包含增稠劑和增溶劑的溶液比如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
藥學上可接受的用于腸胃外制劑的載體包括含水媒介物、非水媒介物、抗微生物劑、等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮和分散劑、乳化劑、多價螯合劑或者螯合劑及其它藥學上可接受的物質(zhì)。
含水媒介物的實例包括氯化鈉注射液、林格注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射、葡萄糖與乳酸鹽林格注射液。非水的腸胃外媒介物包括植物源的固定油類、棉子油、玉米油、芝麻油與花生油。必須將抑菌或抑霉劑濃度的抗微生物劑加入到被包裝在成倍劑量容器內(nèi)的腸胃外制劑中，包括石炭酸或者甲酚、汞制劑、苯甲醇、氯代丁醇、對-羥基苯甲酸甲酯或丙酯、硫柳汞、氯芐烷銨與氯化芐乙氧銨。等滲劑包括氯化鈉與葡萄糖。緩沖劑包括磷酸鹽與檸檬酸鹽?？寡趸瘎┌蛩釟溻c。局部麻醉藥包括鹽酸普魯卡因。懸浮與分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素與聚乙烯吡咯烷酮。乳化劑包括聚山梨醇酯85(TWEEN 80)。金屬離子的多價螯合劑或者螯合劑包括乙二胺四乙酸。藥物載體還包括用于水溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇與丙二醇；以及用于pH調(diào)整的氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或者乳酸。
調(diào)整藥學活性化合物的濃度以使得注射劑提供有效量從而產(chǎn)生所需的藥理作用。準確劑量取決于患者或動物的年齡、體重和病情，這是本領域已知的。
將單位劑量的胃腸外制劑包裝于安瓿、小瓶或帶針頭的注射劑中。胃腸外給藥的所有劑型必須是無菌的，如本領域已知和實踐的那樣。
如所舉例說明的，包含活性化合物的無菌水溶液的靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)灌注是有效的給藥方式。另一實施方案是無菌水溶液或油溶液或懸浮液，其包含必要的活性物從而產(chǎn)生所需藥理學作用。
注射劑被設計為局部和全身給藥。在一種實施方案中，治療有效劑量被配制為包含至少約0.1％w/w高至約90％w/w或更高的濃度，在某些實施方案中給予所治療的組織超過1％w/w的活性物質(zhì)。
化合物可以以微粉化或其它適當形式懸浮，或可經(jīng)衍生以產(chǎn)生溶解性更佳的活性產(chǎn)物或產(chǎn)生前藥。所得混合物的形式取決于許多因素，包括預期的給藥方法和化合物在所選載體或媒介物中的溶解度。有效濃度足以緩解病情的癥狀并可憑經(jīng)驗確定。
3、凍干粉 本文還關注凍干粉，其可重構(gòu)成溶液、乳劑和其它混合物給藥。它們還可重構(gòu)并被配制為固體或凝膠。
制備無菌、凍干粉時，在適宜溶劑中溶解本文提供的化合物或其藥學上可接受的衍生物。溶劑可包含改善穩(wěn)定性的賦形劑或者其它藥理學成分粉末或由粉末制備的重構(gòu)溶液?？捎玫馁x形劑包括但不限于葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖和其它適宜的試劑。在一種實施方案中，于約中性pH處，溶劑還可包含緩沖劑比如檸檬酸鹽、磷酸鈉或鉀或本領域技術人員已知的其它緩沖劑。隨后無菌過濾溶液并接著在本領域技術人員已知的標準條件下凍干就提供了所需的劑型。在一種實施方案中，所得溶液將被分配于小瓶內(nèi)從而凍干。各小瓶將包含單一劑量或多級的化合物。凍干粉可在適當條件下儲存，比如于約4℃至室溫。
該凍干粉與注射用水重構(gòu)成用于胃腸外給藥的制劑。為了重構(gòu)，將凍干粉加入無菌水或其它適宜載體中。準確量取決于所需的化合物。該量可憑經(jīng)驗確定。
4、局部給藥 如局部和全身給藥所述制備局部混合物。所得混合物可以是溶液、懸浮液、乳劑等等并可以被配制為乳劑、凝膠劑、膏劑、乳劑、溶液、酏劑、洗液、懸浮液、酊劑、糊劑、泡沫、氣霧劑、沖洗劑(irrigation)、噴霧劑、栓劑、繃帶、皮膚補片或者任何其它適于局部給藥的制劑。
可將化合物或其藥學上可接受的衍生物配制為局部施用的氣霧劑，比如吸入劑(例如參見美國專利號4,044,126、4,414,209和4,364,923，其公開給予適用于治療炎癥疾病特別是哮喘的甾類的氣霧劑)。這些給予呼吸道的制劑可以是氣霧劑或噴霧溶液的形式，或可以是單獨或與其它惰性載體比如乳糖相混合的用于吹入的微粉粉末。此時，制劑的顆粒，在一種實施方案中直徑低于50微米，在一種實施方案中低于10微米。
化合物可被配制為局部(local or topical)施用，比如以凝膠、乳劑和洗劑的形式局部施用于皮膚和粘膜，比如眼中，以及施用于眼或腦池內(nèi)(intracisternal)或脊柱內(nèi)施用。局部給藥涉及透皮給藥以及眼或粘膜給藥或吸入治療。還可給予單獨的或與其它藥學上可接受賦形劑相混合的活性化合物的鼻腔溶液。
這些溶液，特別是預期用于眼科的那些，可以被配制為0.01％-10％等滲溶液、pH約為5-7，含有適當鹽。
5、用于其它給藥途徑的組合物 本文還涉及其它的給藥途徑比如包括離子電滲療法和電泳裝置的透皮補片、口腔和直腸給藥。
透皮補片，包括離子電滲療法(iotophoretic)和電泳裝置為本領域技術人員已知。例如，這些補片公開于美國專利號6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中。
例如，用于直腸給藥的藥物劑型是全身效果的直腸栓劑、膠囊和片劑。本文所用的直腸意指用于插入直腸的固體，其在體溫處熔融或軟化從而釋放一種或多種藥理上或治療上有效的活性成分。用于直腸的藥學上可接受的物質(zhì)是基質(zhì)或媒介物以及提高熔點的試劑?；|(zhì)例如包括可可油(可可脂)、甘油-明膠、碳蠟(聚乙二醇)和脂肪酸單-、二-和甘油三酯的適當混合物?？墒褂枚喾N基質(zhì)的聯(lián)合。提高栓劑熔點的試劑包括鯨油和蠟。直腸栓劑可通過壓制法或模鑄法制備。直腸栓劑的重量，在一種實施方案中為約2-3gm。
使用同樣的藥學上可接受物質(zhì)并通過與配制口服制劑相同的方法制造用于直腸給藥的片劑和膠囊。
6、靶向制劑 本文所提供的化合物或其藥學上可接受的衍生物還可被配制為靶向所治療受試者身體的具體組織、受體或其它區(qū)域。許多這樣的靶向方法為本領域技術人員公知。所有這樣的靶向方法在此意在用于本組合物。靶向方法的非限制性實例例如參見美國專利號6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。
在一種實施方案中，脂質(zhì)體懸浮液，包括靶向組織的脂質(zhì)體，比如靶向腫瘤的脂質(zhì)體，還可適用作藥學上可接受的載體。還可根據(jù)本領域技術人員已知的方法制備。例如，脂質(zhì)體可如美國專利號4,522,811所述制備。簡言之，脂質(zhì)體比如多層囊泡(MLV′s)可通過在燒瓶內(nèi)干燥鴨蛋磷脂酰膽堿和腦磷脂酰絲氨酸(7∶3摩爾比)而形成。將本文提供化合物加入到不含二價陽離子的磷酸緩沖鹽水(PBS)中溶液并振動燒瓶直至脂膜分散。洗滌所得囊泡以除去未包封的化合物、離心成球，然后再懸浮于PBS中。
7、制造品 化合物或藥學上可接受的衍生物可被包裝成制造品，其包含包裝材料、包裝材料內(nèi)的在此提供的化合物或其藥學上可接受的衍生物，其有效地預防TTR錯重疊或者治療、預防或改善與TTR錯重疊相關或牽涉TTR錯重疊的的疾病或紊亂的一種或多種癥狀，以及指示化合物或組合物或其藥學上可接受的衍生物用于調(diào)節(jié)TTR重疊或用于治療、預防或改善與TTR錯重疊相關或牽涉TTR錯重疊的的疾病或紊亂的一種或多種癥狀的標簽。
在此提供的制造品包含包裝材料。用于包裝藥品的包裝材料也為本領域技術人員所知。例如參見美國專利號5,323,907、5,052,558和5,033,252。藥物包裝材料例如包括但不限于泡包裝、瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶容器、注射器、瓶子和適于所選制劑以及預期的給藥和治療方式的任何包裝材料。在此涉及這里提供的化合物和組合物的大量制劑，其作為對于其中涉及TTR錯重疊作為介導或有助于癥狀或病因的任何疾病或紊亂的許多療法。
F.化合物活性的評價 使用了許多體外測試來評價化合物穩(wěn)定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體或預防纖絲形成的能力。這些測試包括纖絲形成測驗、血漿選擇性測驗、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白化合物復合物三維結(jié)構(gòu)的確定(如，通過X-射線結(jié)晶圖)、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體解聚或纖絲形成的動力學、以及例如通過離心或熱量測定而確定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白化合物相互作用的化學計量和能量。體外測驗的例示性細節(jié)示于實施例中。
用于篩選法中的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白可以是野生型甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白或甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白突變體，比如天然存在的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白突變體，其在病因上與出現(xiàn)甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病比如家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病或家族性淀粉樣心肌病相關。例示性的天然存在的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白突變體包括但不限于V122I、V30M、L55P(突變體的命名描述了相對于野生型在所述氨基酸位置的取代基，例如參見Saraiva et al.(2001)Hum.Mut.17493-503)。
對于有效抵抗TTR淀粉樣變性的化合物，其必須強烈地選擇性結(jié)合TTR，由此在血漿中其在所有其它血漿蛋白存在下區(qū)分出TTR。由此，使用兩種測驗評價化合物。第一種測驗是停滯纖絲形成測驗，已進行過深入描述。在該測驗中，以3.6或7.2μM將測試化合物加入3.6μM的TTR溶液中。在這兩種濃度下，有足夠的測試化合物負載于TTR的一個或兩個結(jié)合位點。然后通過將pH降低至4.4(在此pH下，TTR淀粉化形成的速率最大)而將溶液置于致淀粉樣條件下。72h后，測量了TTR溶液(其與TTR聚集相關)與測試化合物(T測試)的濁度并與不含任何測試化合物的溶液(T對照)進行了比較。抑制纖絲形成的程度根據(jù)含有和不含測試化合物的濁度差異而計算 抑制率＝(T對照-T測試)/(T對照)×100％ 高抑制率表明化合物活性很強。
第二種測驗是由本實驗室新近開發(fā)的抗體俘獲法，從而測量測試化合物在人血漿內(nèi)在存在所有其它血漿蛋白下與TTR相結(jié)合的能力。在該測驗中，將測試化合物溶解于10.8μM人血漿中(約3倍TTR濃度)并培育24h。然后使用結(jié)合于瓊脂糖樹脂的多克隆TTR抗體免疫沉淀TTR和任何結(jié)合的小分子。洗滌樹脂后，在高pH下解聚抗體-TTR復合物，由在HPLC中它們的峰面積確定TTR相對于測試化合物的化學計量。
在第一種測驗中的高活性可以定義為在7.2μM處＞90％抑制和在3.6μM處＞60％抑制。在第二種測驗中，其定義為＞1測試化合物結(jié)合于每當量TTR四聚體。
G.化合物和組合物的使用方法 還提供了在組織或生理液體內(nèi)穩(wěn)定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白并由此抑制錯重疊的方法。通常，方法涉及給予組織或生理液體穩(wěn)定量的本文提供的化合物，結(jié)合于甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白并通過動力學穩(wěn)定天然態(tài)的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體而防止甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體解聚。
由此，在疾病組織內(nèi)穩(wěn)定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白的方法改善了錯重疊并減輕了相關疾病的癥狀，根據(jù)疾病的不同情況可以有助于治愈該疾病。在此還慮及在組織和/或細胞內(nèi)已知甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白錯重疊。錯重疊的程度和由此本發(fā)明化合物所達到的抑制程度可通過多種方法評價，比如在實施例和國際專利申請?zhí)朩O2004/056315中描述的那些。上述參考的申請文件在此通過參考而全部引入。
在此還提供了治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病的一種或多種癥狀的方法，該方法涉及給予治療有效量的在此提供的化合物。在一種實施方案中，化合物通過動力學穩(wěn)定天然態(tài)的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體而防止甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體解聚。甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病例如可以是家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性。其它的甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病包括但不限于阿爾茨海默病、海綿狀腦病(Creutzfeldt Jakob disease)、多發(fā)性神經(jīng)病、II型糖尿病和甲狀腺髓質(zhì)瘤(例如參見國際專利申請公開號WO 98/27972和WO95/12815)。
提供了通過給予在此提供的化合物而治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白介導的疾病或紊亂的一種或多種癥狀的方法。甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白介導的疾病和紊亂包括但不限于肥胖癥(例如參見國際專利申請公開號WO02/059621)。
還提供了使用在此提供的化合物或組合物穩(wěn)定TTR四聚體的方法。還提供了使用在此提供的化合物或組合物抑制TTR淀粉樣形成的方法。
在此還提供了在此所述的任何化合物或藥物組合物用于治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病(如家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性)的一種或多種癥狀的用途。
在此還提供了在此所述的任何化合物或藥物組合物在制造用于治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病(如家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性)的一種或多種癥狀的藥物中的用途。
H.聯(lián)合療法 在此提供了化合物和組合物可以作為單一療法或與其它活性成分相聯(lián)合而給藥。例如，化合物和組合物可以與已知用于治療淀粉樣變性和淀粉樣紊亂的其它化合物相聯(lián)合，包括但不限于國際專利申請公開號WO98/27972、WO 02/059621和WO 95/12815以及W02004/056315中公開的那些。用于聯(lián)合療法的其它活性成分包括但不限于

和批準用于治療淀粉樣變性的其它產(chǎn)品，淀粉樣變性包括但不限于家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性、阿爾茨海默病、海綿狀腦病(Creutzfeldt Jakob disease)、多發(fā)性神經(jīng)病、II型糖尿病和甲狀腺髓質(zhì)瘤。用于聯(lián)合療法的其它活性成分包括但不限于批準用于肥胖癥的產(chǎn)品。
僅是為了舉例說明的目的提供了下面的實施例，并非意在限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
步驟1
將SOCl2(15ml)加入2-氯-4-甲氧基苯甲酸(.285gm)中并在攪拌條件下于90℃回流3小時。真空蒸發(fā)反應混合物并用于進一步的反應。
得到(粗品)--.313gm。
步驟2
將4-氨基-3-羥基苯甲酸(.234gm)、T.H.F(15ml)和吡啶(.37ml)的混合物加入粗酰氯(.313gm)中并于80℃回流過夜。將反應混合物傾入水中，然后用乙醚萃取并蒸發(fā)得到酰胺。
得到--.8gm。
步驟3
將酰胺(.8gm)溶解于聯(lián)苯基醚(25ml)中，向其中加入PTSA(68mg)，在回流條件下于220℃回流過夜。一旦反應完成，通過過濾收集產(chǎn)物并用己烷和乙醚洗滌。
得到--.405gm。
步驟4
將酸(.405gm)溶解于15ml T.H.F中，向溶液中加入.424ml的T.M.S-CHN2并在攪拌條件下保持過夜。反應混合物經(jīng)快速色譜法用5％己烷的乙酸乙酯溶液純化。
得到--.107gm。
步驟5
將甲基酯(.090gm)溶解于10ml的T.H.F∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)中，向其中加入LiOH.H2O(0.048gm)并攪拌4小時。一旦反應完成，稀釋反應混合物并用1N HCl酸化，用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗滌并真空濃縮。得到淺黃色固體。
得到--.084gm。
收率％--97.67％。
終化合物 顏色-淺黃色 狀態(tài)-固體 重量-84gm。
實施例2
步驟1
將2-氯-4-羥基苯甲酸(.5gm)溶解于DMF(10ml)中，向其加入K2CO3(1.201克)然后攪拌下于0℃下加入溴芐(.688ml)(逐滴)，保持1小時。反應完成后，加入水并用乙酸乙酯萃取，鹽水溶液洗滌，硫酸鈉干燥并真空濃縮。此后經(jīng)快速層析純化，用己烷.乙酸乙酯溶液(5％)洗脫。
得到--.930gm。
步驟2
將二芐基酯(.5克)溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)10ml中。向其加入LiOH.H2O(.24克)，室溫攪拌4小時，一旦完成，反應混合物經(jīng)水稀釋并用1N HCl酸化，乙酸乙酯萃取，鹽水溶液洗滌，真空濃縮得到淺黃色固體。
得到--.157gm。
步驟3
將亞硫酰氯加入酸中，隨后加入一滴DMF，在回流條件下于80℃攪拌4小時。真空蒸發(fā)反應物，粗酰氯用于進一步反應。
步驟4
4-氨基-3-羥基苯甲酸(.122克)的THF(15ml)溶液相繼經(jīng)吡啶(.19ml)處理。將酰氯溶解于THF中，于0℃逐滴加入上述混合物中，室溫攪拌過夜，真空蒸發(fā)，粗產(chǎn)物用于進一步反應。
得到--.485克。
步驟5
將酰胺(.485克)溶解于DPE中，向其加入PTSA(10摩爾％)，于200-220℃回流3小時。得到含有所需產(chǎn)物與副產(chǎn)物混合物的固體。
得到--.430克。
步驟6
將酸(.430克)溶解于DMF(20ml)中，向其加入K2CO3(.57克)，然后在攪拌下于0℃逐滴加入溴芐(.35ml)并保持1小時，反應完成后，加入水，用乙酸乙酯萃取，鹽水溶液洗滌，硫酸鈉干燥并真空濃縮。此后，使用7％己烷的乙酸乙酯溶液將粗產(chǎn)物經(jīng)快速層析純化。
得到--.469克。
步驟7
將二芐基酯(.170克)溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)中，向其加入LiOH.H2O(.061克)，室溫攪拌4小時。一旦完成，反應混合物經(jīng)水稀釋并用1N HCl酸化，經(jīng)乙酸乙酯萃取。用鹽水洗滌，真空濃縮。其經(jīng)乙酸乙酯洗滌，結(jié)果得到白色固體。
得到--.044克。
終化合物 顏色-白色 熔點-226.2℃ 重量-43mg。
實施例3
4-(4-氰基-苯甲酰氨基)-3-羥基-苯甲酸的制備
向攪拌著的3-氨基-4-羥基苯甲酸(0.185g，0.0012摩爾)和吡啶(0.287g，0.00363摩爾)的18.5ml干燥THF溶液中加入4-氰基苯甲酰氯(0.2g，0.0012摩爾)，該溶液在氮氛下于室溫攪拌10小時，然后回流3小時。反應混合物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，殘留物在水中形成淤漿，過濾得到酰胺(0.18g)，其無需進一步純化而用于下一步驟。
2-(4-氰基-苯基)-苯并噁唑-5-羧酸的制備
在裝有DEAN-STARCK儀的單頸RB燒瓶中，將上述酰胺懸浮于30ml二甲苯中，加入40mg對甲苯磺酸。然后于160℃回流反應混合物12小時。于冷卻過濾RM。使殘留物在乙醚中形成淤漿，再次過濾。然后在1.5N HCl中攪拌殘留物30分鐘并在乙酸乙酯中萃取，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到0.045g純標題化合物。
實施例4
4-羥基-3-(4-三氟甲氧基-苯甲酰氨基)-苯甲酸的制備
向攪拌著的3-氨基-4-羥基苯甲酸(0.136，0.00089摩爾)和吡啶(0.211g，0.00267摩爾)的13ml干燥THF溶液中加入4-三氟甲氧基苯甲酰氯(0.2g，0.00089摩爾)，在氮氛中室溫攪拌該溶液10小時，然后回流3小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應混合物，殘留物在水中形成淤漿，過濾得到酰胺(0.175g)，其無需進一步純化用于下一步驟。
2-(4-三氟甲氧基-苯基)-苯并噁唑-5-羧酸的制備
在裝有DEAN-STARCK儀的單頸RB燒瓶中，將上述酰胺懸浮于30ml二甲苯中，加入40mg對甲苯磺酸。然后于160℃回流反應混合物12小時。于冷卻過濾RM。使殘留物在乙醚中形成淤漿，過濾得到純標題化合物(70mg)。
實施例5
步驟1
將硝基化合物溶解于甲醇中并加入SnCl2.2H2O，加熱回流，在2小時內(nèi)反應完全。徹底濃縮溶劑，加入冷水，用乙酸乙酯洗滌。用碳酸氫鹽溶液堿化水層，用乙酸乙酯萃取。有機層分別經(jīng)D.M.水和鹽水溶液洗滌。經(jīng)Na2SO4洗滌并濃縮。
屬性固體 收率％82.8％ 純度91.64％。
步驟2
氨基羥基苯甲腈(步驟1)的THF溶液相繼經(jīng)吡啶和酰氯處理。室溫攪拌反應混合物14小時，真空濃縮，無需純化用于下一步驟。
步驟3
將PTSA.H2O加入粗酰胺(步驟2)的二甲苯溶液中，回流攪拌所得混合物過夜。16小時后，冷至室溫，真空濃縮。殘留物經(jīng)層析(5-10％EtOAc/己烷)得到所要的環(huán)化氰基產(chǎn)物 屬性白色固體 收率％53％ 純度100％。
步驟4
將苯甲腈(步驟3)化合物和NH4Cl置于DMF中。將混合物冷至0℃，在5-6分鐘內(nèi)按份加入NaN3。反應混合物于0℃攪拌5分鐘，于室溫攪拌15分鐘。將反應混合物于40℃加熱1h，然后在3h內(nèi)緩慢升至90℃。反應混合物于90℃攪拌20h，然后冷至0-5℃。反應物經(jīng)水猝滅，用1N HCl調(diào)節(jié)pH至2，用EtOAc萃取。合并的有機層經(jīng)水洗滌，干燥，濃縮得到膠狀物，真空下徹底干燥2h得到淺棕色固體。固體經(jīng)5％己烷∶EtAc混合物洗滌，干燥。
屬性淺棕色固體 收率％60.9％ 純度99.8％。
實施例6
步驟1
將硝基化合物溶解于甲醇中并加入SnCl2.2H2O，加熱回流，在2小時內(nèi)反應完全。徹底濃縮溶劑，加入冷水，用乙酸乙酯洗滌。用碳酸氫鹽溶液堿化水層，用乙酸乙酯萃取。有機層分別經(jīng)D.M.水和鹽水溶液洗滌。經(jīng)Na2SO4洗滌并濃縮。
屬性固體 收率％82.8％ 純度91.64％。
步驟2
將氨基羥基苯甲腈的THF溶液相繼經(jīng)吡啶和所需的酰氯處理。室溫攪拌反應混合物14小時，真空濃縮，加入乙酸乙酯，用1％HCl和鹽水洗滌。經(jīng)Na2SO4干燥，濃縮。
屬性固體 收率％66％ 純度88.9％。
步驟3
將PTSA.H2O加入粗反應混合物的二甲苯溶液中，回流攪拌所得混合物過夜。16小時后，冷至室溫，真空濃縮。殘留物經(jīng)層析(5-10％EtOAc/己烷)得到所要的環(huán)化的氰基產(chǎn)物。
屬性白色固體 收率％30.4％ 純度97.2％。
步驟4
將苯甲腈(步驟3)化合物和NH4Cl置于DMF中。將混合物冷至0℃，在5-6分鐘內(nèi)按份加入NaN3。反應混合物于0℃攪拌5分鐘，于室溫攪拌15分鐘。將反應混合物于40℃加熱1h，然后在3h內(nèi)緩慢升至90℃。反應混合物于90℃攪拌20h，然后冷至0-5℃。反應物經(jīng)水猝滅，用1N HCl調(diào)節(jié)pH至2，用EtOAc萃取。合并的有機層經(jīng)水洗滌，干燥，濃縮得到膠狀物，真空下徹底干燥2h得到淺棕色固體。固體經(jīng)5％己烷∶EtAc混合物洗滌，干燥。
屬性淺棕色固體 收率％48％ 純度99.8％。
實施例7
4-[(6-氯-吡啶-3-羰基)-氨基]-3-羥基-苯甲酸的制備
向攪拌著的4-氨基-3-羥基苯甲酸(0.490g，0.0032摩爾)和吡啶(0.76g，0.0096摩爾)的50ml干燥THF溶液中加入6-氯煙酰氯(0.56g，0.0032摩爾)，氮氛下于室溫攪拌溶液10小時，然后回流3小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應混合物，使殘留物在水中形成淤漿，過濾得到酰胺(0.8g)，其無需進一步純化而用于下一步驟。
2-(6-氯-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制備
在裝有DEAN-STARCK儀的單頸RB燒瓶中，將上述酰胺懸浮于75ml二甲苯中，加入150mg對甲苯磺酸。然后在5小時內(nèi)將反應混合物逐步加熱至160℃，保持此溫度12小時。于冷卻過濾反應混合物。使殘留物在乙醚中形成淤漿，過濾得到粗產(chǎn)物，其經(jīng)制備HPLC純化得到純標題化合物。
0.2g粗化合物得到0.55g純產(chǎn)物。
實施例8
3-羥基-4-[(2-甲基-吡啶-3-羰基)-氨基]-苯甲酸
將2-甲基煙酰氯(0.2g，0.00128摩爾)溶解于30ml干燥的DCM，氮氛下于0℃將N，N′-二異丙基乙胺(0.994g，0.00769摩爾)緩慢加入酰氯溶液中。于0℃將4-氨基-3-羥基苯甲酸(0.196g，0.00128摩爾)的10ml干燥THF溶液緩慢加入上述溶液中。該溶液于0℃攪拌30分鐘，然后室溫攪拌過夜。然后用100ml乙酸乙酯稀釋反應混合物，攪拌30分鐘。經(jīng)C鹽床濾除沉淀的焦油物，有機相經(jīng)4×20ml水洗滌，2×10ml鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗酰胺(140mg)，其無需進一步純化而用于環(huán)化步驟。
2-(2-甲基-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制備
將粗酰胺溶解于10ml DMSO中，加入40mg對甲苯磺酸。然后將溶液置于微波輻射，短脈沖15分鐘。然后將反應混合物冷至室溫，傾入攪拌的冰水中。水相經(jīng)4×50ml乙酸乙酯萃取。有機相經(jīng)2×20ml水洗滌，鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗產(chǎn)物(100mg)，其經(jīng)制備HPLC純化。
200mg的粗2-(2-甲基-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸經(jīng)制備HPLC純化得到20mg純產(chǎn)物。
實施例9
4-[(2，6-二氯-吡啶-4-羰基)-氨基]-3-羥基-苯甲酸
將2-甲基煙酰氯(0.2g，0.00128摩爾)溶解于30ml干燥的DCM中，于0℃氮氛下將N，N′-二異丙基乙胺(0.994g，0.00769摩爾)緩慢加入酰氯溶液中。于0℃將4-氨基-3-羥基苯甲酸(0.196g，0.00128摩爾)的10ml干燥THF緩慢加入上述溶液中。該溶液于0℃攪拌30分鐘，然后室溫攪拌過夜。然后用100ml乙酸乙酯稀釋反應混合物，攪拌30分鐘。經(jīng)C鹽床濾除沉淀的焦油物，有機相經(jīng)4×20ml水洗滌，2×10ml鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗酰胺(140mg)，其無需進一步純化而用于環(huán)化步驟。
2-(2，6-二氯-吡啶-4-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制備
在裝有DEAN-STARCK儀的單頸RB燒瓶中，將上述酰胺懸浮于25ml二甲苯中，加入40mg對甲苯磺酸。然后在5小時內(nèi)將反應混合物逐步加熱至160℃，保持此溫度12小時。過濾冷卻的反應混合物。使殘留物在乙醚中形成淤漿，過濾得到0.65g純產(chǎn)物。
本文提供的其它化合物已通過對于上述實施例的些微修改而制備，這些修改在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。這些化合物如下示，給出了觀測的熔點。

實施例10 使這里提供的化合物進行停滯纖絲形成測驗?；衔锝?jīng)P2O5干燥過夜并溶解于DMSO中至終濃度7.2mM以提供初級儲備液(10×儲備液)。通過使用DMSO 5倍稀釋初級儲備液制備二級儲備液，終濃度為1.44mM(2×儲備液)。如下測量在抑制劑(1.44mM)存在下酸介導的TTR(3.6μM)的淀粉樣形成向可使用的UV管中加入495μL 0.4mg/mL WT TTR蛋白在10mM磷酸鈉、100mM KCl和1mM EDTA(pH7.6)中溶液以及5μL 1.44mM二級儲備抑制劑的DMSO溶液(2×儲備液)?；旌衔锝?jīng)渦混并培育30分鐘(25℃)，此時使用500μL的200mM乙酸、100mM KCl和1mM EDTA(pH4.2)將pH降低至4.4。將最終的1mL溶液渦混并無需振動于37℃培育72h。72h后，渦混各管以懸浮任何存心的纖絲，于350和400nm處使用紫外-可見分光光度計測量懸浮液的濁度。通過各TTR加抑制劑樣品的濁度相對于相同方式制備的樣品但不含抑制劑的觀察濁度比值、乘以100得到纖絲形成百分比。如上使用1×二級儲備液進行使用等摩爾抑制劑和TTR濃度(3.6μM)的纖絲形成測驗。通過使用DMSO 10倍稀釋7.2mM 10x初級儲備液制備1×儲備液，最終濃度為0.72mM并用于上述纖絲形成測驗。進行所有測驗時一式三份，使用野生型TTR測驗所有化合物。在測試不含WT TTR的溶液的濁度的試驗過程中，發(fā)現(xiàn)所有化合物是可溶的，確認了濁度是TTR淀粉樣形成結(jié)果。
通過抗體俘獲/HPLC法評價了血漿中潛在抑制劑與TTR相結(jié)合的化學計量。向1.5-mL埃彭道夫管(eppendorf tube)中加入1.0mL人血漿和7.5μL的1.44mM待評價抑制劑的DMSO溶液。于37℃培育溶液并輕微振動24h。將1∶1凝膠∶TSA(Tris鹽水)的猝滅瓊脂糖凝膠淤漿(125μL)加入溶液中，并于4℃輕微振動1h。離心(16,000×g)溶液，將上清液分為400μL的兩份，然后將其加入200μL不同樣品的抗-TTR抗體-結(jié)合瓊脂糖的1∶11凝膠∶TSA淤漿。于4℃輕微振動溶液20分鐘，離心(16,000×g)，除去上清液。在4℃下，凝膠經(jīng)TSA/0.05％皂角苷(3×，10分鐘每次)洗滌，隨后在4℃下，經(jīng)1mLTSA(2×，10分鐘每次)洗滌。離心(16,000×g)樣品，除去最終的洗液，加入155μL 100mM三乙胺，pH11.5，來洗脫TTR并結(jié)合來自抗體的抑制劑。于4℃輕微振動30分鐘后，離心(16,000×g)洗脫樣品，除去包含TTR和抑制劑的145μL上清液。然后如前所述通過反相HPLC分析上清液。例如參見Purkey，H.E.；Dorrell，M.I.；Kelly，J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，5566-71，其通過參考在此全部引入。
通過連接的單體在脲中的伸展評價了TTR四聚體解聚的動力學。緩慢的四聚體解聚無法通過遠-UV CD光譜學檢測，但其與前述可被遠-UV CD方便檢測的快速(快500,000-倍)伸展步驟相關。評價TTR四聚體(3.6μM)解聚動力學作為抑制劑的函數(shù)時，將3.6μL待測抑制劑的1mM溶液(乙醇)加入到69μL WT TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸鈉，100mM KCl，1mMEDTA，pH7.0)，向其加入127.4μL磷酸緩沖液。對于抑制劑濃度(7.2μM)為TTR濃度(3.6μM)兩倍時，將7.2μL待測抑制劑的1mM溶液(乙醇)加入到69μL WT TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸鈉，100mM KCI，1mM EDTA，pH7.0)中，向其加入123.8μL磷酸緩沖液。將100μL蛋白-待測抑制劑溶液加入600μL 10.3μM脲和300μL磷酸緩沖液中，最終的脲濃度為6.5M。渦混溶液，在下列間隔采集圓二色譜0、5、8、23、46、71、95、118、144和168h。制備包含7.2μL乙醇而非抑制劑的對照品用于比較，在上述同樣的時間點采集波譜。在220-213nm采集CD譜，每0.5nm掃描，平均時間為10妙。各波長掃描一次。振幅值在220-213nm之間進行平均從而確定在整個試驗期間β-片層的損失程度。
接著在pH4.4處通過濁度測量酸-介導的纖絲形成的速率?；衔锝?jīng)P2O5干燥過夜并溶解于DMSO中至終濃度7.2mM以提供初級儲備液(10×儲備液)。通過使用DMSO 5倍稀釋初級儲備液制備二級儲備液，終濃度為1.44mM(2×儲備液)。采用7.2μM的抑制劑濃度與3.6μM的TTR(四聚體)按照如下所述進行纖絲形成測定向可使用的UV管中加入495μL 0.4mg/mL WTTTR蛋白在10mM磷酸鈉、100mM KCl和1mM EDTA(pH7.6)的溶液以及5μL 1.44mM二級儲備抑制劑的DMSO溶液(2×儲備液)?；旌衔锝?jīng)渦混并培育30分鐘(25℃)，此時使用500μL 200mM乙酸、100mM KCl和1mM EDTA(pH4.2)將pH降低至4.4。將最終的1mL溶液渦混并無需振動于37℃培育。溶液經(jīng)渦混并于350和400nm處測量濁度。在下列間隔收集UV波譜酸化后的0、4、8、24、48、72、96、120、144、168和192h。制備包含5μl DMSO的對照品用于比較，在上述同樣的時間點采集波譜。在讀數(shù)之前制備10組各抑制劑溶液以防止試管干擾。獲得UV吸光度后拋棄與時間點相應的試管。使用1×二級抑制劑儲備液如上進行應用等摩爾(3.6μM)TTR和抑制劑濃度的纖絲形成測驗，儲備液如下通過使用DMSO10倍稀釋7.2mM 10×初級儲備液制備終濃度為0.72mM的儲備液，用于上述的纖絲形成測驗。在整個試驗過程中，發(fā)現(xiàn)所有化合物是可溶的，確認了濁度是TTR淀粉樣形成結(jié)果。
使用濁度測驗評價作為TTR淀粉樣纖絲抑制劑的所述化合物。酸化經(jīng)抑制劑預培育(25℃，30分鐘)的TTR引發(fā)了WT TTR淀粉樣變性，酸化時加入緩沖劑使得pH突變至4.4。培育各混合物72h后(37℃)，于350和400nm使用UV-可見分光光度計測量濁度。將所有的淀粉樣纖絲形成數(shù)據(jù)歸一化為不存在抑制劑時的WT TTR淀粉樣變性，其被指定為100％纖絲形成。由此，5％纖絲形成對應于在72h后抑制了95％WT TTR纖絲形成的化合物。首先于7.2μM的濃度評價各潛在的抑制劑，相應的TTR四聚體濃度為3.6μM。將纖絲形成低于15％的化合物于等于TTR(3.6μM)的濃度再次進行評價以選擇具有最高效力的抑制劑。在這些條件下纖絲形成低于40％是良好抑制劑的特征，而40-70％指示了適度的化合物。
對在等于TTR(3.6μM)的濃度保持了纖絲形成低于50％的抑制劑進行了進一步的評價，評價它們在血漿全部其它蛋白中選擇性結(jié)合TTR的能力。單一的500mg劑量后20h二氟尼柳的血液濃度可超過30μM，或相同劑量后4h可超過300μM。盡管該高水平的延遲血漿濃度表明了出色的生物利用度，但選擇性更好的抑制劑將允許更低的劑量和潛在的更少副作用；因此，將人血漿與終濃度為10.8M的該亞組抑制劑一起培育(人血漿中TTR的濃度約為5μM)。然后用樹脂-結(jié)合的抗體俘獲TTR，用TSA溶液(tris鹽水)/0.05％皂角苷洗滌固定的TTR三次，隨后用TSA洗滌兩次。使用100mM三乙胺(pH11.5)從樹脂上解離TTR-抑制劑復合物，通過反相HPC分析確定存在的抑制劑相對于TTR的化學計量。每一TTR四聚體可結(jié)合最多2當量抑制劑。
材料和方法 甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白抗體的純化以及與皂角苷的結(jié)合 制備、純化抗體并與瓊脂糖偶聯(lián)。該樹脂作為TAS(10mM Tris，pH8.0/140mM NaCl/0.025％NaN3)中的1∶1淤漿儲存。此外，通過向樹脂而不是抗體偶聯(lián)200mM Tris，pH8.0而制備猝滅的瓊脂糖。
人血漿的制備 在Scripps General Clinical Research Center′s Normal Blood-DrawingProgram從健康志愿者體內(nèi)抽取全血并移至50mL錐管管中。于25℃，在裝備有浮桶式轉(zhuǎn)頭的Sorvall RT7臺式離心機內(nèi)于3000RPM(1730×g)離心試管10min以除去殘留的細胞。加入疊氮鈉得到0.05％溶液。血漿于4℃儲存?zhèn)溆谩?br> 甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白和結(jié)合化合物的免疫沉淀 向2mL的埃彭道夫管內(nèi)加入1.5mL人血漿和7.5μL待測化合物的2.16mM DMSO溶液。該溶液于37℃培育24h。將1∶1樹脂/TSA淤漿(187μL)的猝滅瓊脂糖加入該溶液中并于4℃輕微振動1h。離心(16,000×g)溶液，將上清液分成各400μL的3份。將其各自加入200μL 1∶1樹脂/TSA淤漿的抗-甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白抗體-結(jié)合的瓊脂糖并于4℃輕微振動20分鐘。離心(16,000×g)樣品，除去上清液。樹脂于4℃經(jīng)1mL TSA/0.05％皂角甙(Acros)(3×10分鐘)洗滌，再于4℃經(jīng)1mL TSA(2×10分鐘)洗滌。離心(16,000×g)樣品，除去最終洗液，加入155μL 100mM三乙胺、pH11.5以稀釋TTR并結(jié)合抗體的小分子。于4℃輕微振動30分鐘后，離心樣品(16,000×g)，除去145μL包含TTR和抑制劑的上清液。
甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白和結(jié)合化合物的HPLC分析和定量 將來自TTR抗體珠(145μL)的上清洗脫液樣品置于Waters 71P自動取樣器上。進樣的135μL各樣品在Keystone 3cm C18反相柱上分離，在8分鐘內(nèi)使用40-100％B梯度(A94.8％H2O/5％乙腈/0.2％TFA；B94.8％乙腈/5％H2O/0.2％TFA)，由Waters 600E多溶劑遞送系統(tǒng)控制。于280nm使用Waters 486可調(diào)吸收度檢測器檢測，積分各峰給出TTR和小分子的面積。為了確定各物質(zhì)的量，在HPLC上注射已知量的四聚TTR或化合物。積分各峰使用Kaleidagraph(Synergy Software)線性回歸數(shù)據(jù)創(chuàng)建標準曲線。使用該標準曲線確定血漿樣品中存在的各物質(zhì)的摩爾數(shù)。計算小分子與蛋白的比值以得到血漿中結(jié)合于TTR的小分子的化學計量。
甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣纖絲形成測驗 以720μM的濃度將化合物溶解于DMSO中。將5μL待測化合物的溶液加入到0.5mL 7.2μM TTR在10mM磷酸鹽pH7.6、100mM KCl、1mMEDTA緩沖劑的溶液中，允許化合物與TTR一起培育30分鐘。加入495μL0.2mM乙酸鹽pH4.2、100mM KCl、1mM EDTA，所得終蛋白和抑制劑濃度各自為3.6μM，pH為4.4。然后于37℃培育混合物72h，此后渦混試管3秒，于400nm測量光密度。通過歸一化不含抑制劑的TTR的各光密度確定纖絲形成的程度，定義為100％纖絲形成。還測試不含TTR時各化合物的對照溶液，于400nm處幾乎沒有吸收。
結(jié)晶和X-射線數(shù)據(jù)采集 在懸滴試驗中，由相對于2M硫酸銨平衡的5mg/ml(在100mM KCl，100mM磷酸鹽，pH7.4，1M硫酸銨)蛋白溶液獲得重組TTR結(jié)晶。用10倍摩爾過量的配體浸泡結(jié)晶從而確保兩個結(jié)合位點完全飽和，從而制備TTR·配體復合物。使用1∶1丙酮∶水溶液作為浸泡劑。使用偶聯(lián)了RU200旋轉(zhuǎn)陽極X-射線發(fā)生器的DIP2030b成像板體系(MAC Science，Yokohama，Japan)采集收據(jù)。將結(jié)晶置于作為冷保護劑的巴拉東油(paratone oil)中冷卻至120K進行衍射試驗。所有TTR·配體復合物的結(jié)晶與包含晶胞大小a＝43

、b＝86

、和c＝65

的apo晶型同形。它們屬于P21212空間組，在其不對稱單元包含一半的同四聚體。數(shù)據(jù)經(jīng)DENZO和SCALEPACK還原。
結(jié)構(gòu)確定與優(yōu)化 將來自蛋白數(shù)據(jù)庫(登錄號1BMZ)的TTR的蛋白原子坐標用作優(yōu)化原生型TTR和TTR-配體復合物的起始模型，使用CNS程序經(jīng)分子動力學和能量最小化優(yōu)化。根據(jù)在經(jīng)化合物浸泡或同時共結(jié)晶的TTR結(jié)晶上采集的衍射數(shù)據(jù)，計算圖譜。對于TTR與化合物的復合物，所得圖譜揭示了配體在TTR四聚體的兩個結(jié)合區(qū)的大概位置，峰高超過了5-9r.m.s。為了進一步改善小分子的電子密度并除去模型偏差，將模型進行若干循環(huán)的彎曲/振動方案(warp/shake protocol)，其導致圖譜的顯著改善，尤其是使抑制劑的圖譜顯著改善。使用這些圖譜進行后續(xù)模型匹配，將配體分子置于密度中。在所有的三種情況中，通過程序Insight II(Accelrys)計算的抑制劑最小能量構(gòu)型與圖譜最佳擬合。由于沿著結(jié)合通道的二重晶體學對稱軸，必須施用統(tǒng)計學擾亂模型，在四聚TTR的兩個結(jié)合位點任一之中產(chǎn)生兩種配體結(jié)合方式?；跓o偏差的電子密度圖加入水分子。由于在最終圖譜中缺乏可解釋的電子密度，在最終模型中不包括9個N-末端和三個C-末端殘基。
因為本領域技術人員顯然可進行修改，在此要求的主題意在僅通過附錄的權(quán)利要求進行限制。
權(quán)利要求
1.式I化合物或其藥學上可接受的衍生物
其中
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；
X是O、S或NR11；
R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、CONR7R8、烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3；
Het是雜芳基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代；
Ar是芳基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代；
R是氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
R5是烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基；
R6是天然存在的α-氨基羧酸的側(cè)鏈；
R7和R8各自獨立選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
R9和R10各自獨立是氫、鹵素、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
R11是氫或烷基；以及
n是0-3的整數(shù)；
條件是(i)當Y是COOH且在4、5、6或7位時，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯；(ii)當Y是COOH且在4、5、6或7位且X是O時，那么R1、R2和R3不全是氫；(iii)Y是COOH或CONH2且X是O時，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、3-環(huán)烷基、4-烷氧基、4-環(huán)烷氧基、2-或4-COOH、4-COOR，其中R是烷基、2-或4-OH；以及(iv)當Y是COOH且X是NH時，那么R1、R2和R3不是4-CN。
2.權(quán)利要求1的化合物，具有式IA結(jié)構(gòu)
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中
Y是COOH、四唑基、CONHOH、B(OH)2或OH；
X是O；以及
R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素、OH、B(OH)2或CF3。
4.權(quán)利要求1-3任一項的化合物，其中Y是COOH。
5.權(quán)利要求1-3任一項的化合物，其中Y是四唑基、B(OH)2或CONHOH。
6.權(quán)利要求1-3任一項的化合物，其中Y是OH。
7.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素和OH。
8.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫和CF3。
9.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素和OR5。
10.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1和R2各自獨立是氫且R3是CF3。
11.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素和B(OH)2。
12.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立選自氫、F、Br和I。
13.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立選自鹵素和OH。
14.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立選自鹵素和B(OH)2
15.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1和R2各自是鹵素且R3是OH。
16.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1和R2各自是鹵素且R3是B(OH)2。
17.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中R1和R2各自是鹵素且R3是氫。
18.權(quán)利要求1-17任一項的化合物，其為下式之一
19.權(quán)利要求1-6任一項的化合物，其中Het是嘧啶基、吡啶基、呋喃基或噻吩基。
20.具有下列結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求19的化合物或其藥學上可接受的衍生物
21.權(quán)利要求19或20的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代，其中R是氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基芳基或雜芳基。
22.權(quán)利要求19-21任一項的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任選被鹵素、烷基或鹵代烷基取代。
23.權(quán)利要求19-22任一項的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任選被三氟甲基、氯或甲基取代。
24.權(quán)利要求1-23任一項的化合物，選自
25.藥物組合物，含有權(quán)利要求1-24任一項的化合物和藥學上可接受的載體。
26.藥物組合物，含有藥學上可接受的載體和式I化合物或其藥學上可接受的衍生物
其中
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；
X是O、S或NR11；
R1、R2和R3各自獨立選自氫、鹵素、OH、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、CONR7R8、烷基、鹵代烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH、CF3或NR7R8；
Het是雜芳基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代；
Ar是芳基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代；
R是氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
R5是烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基；
R6是天然存在的α-氨基羧酸的側(cè)鏈；
R7和R8各自獨立選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
R9和R10各自獨立是氫、鹵素、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
R11是氫或烷基；以及
n是0-3的整數(shù)；
條件是(i)當Y是COOH且在4、5、6或7位時，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯；(ii)當Y是COOH且在4、5、6或7位且X是O時，那么R1、R2和R3不全是氫；(iii)當Y是COOH或CONH2且X是O時，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、3-環(huán)烷基、4-烷氧基、4-環(huán)烷氧基或4-環(huán)烷氧基；以及(iv)當Y是COOH且X是NH時，那么R1、R2和R3不是4-CN。
27.配制成單一劑量給藥的權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的藥物組合物。
28.穩(wěn)定組織內(nèi)或生理液體內(nèi)甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白的方法，包括給予權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物。
29.抑制甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白錯重疊的方法，包括用權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物接觸甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白。
30.治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病的一種或多種癥狀的方法，包括給予權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物。
31.通過動力學穩(wěn)定原生態(tài)甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體而防止該甲狀腺素四聚體解聚的方法，包括用權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物接觸四聚體。
32.權(quán)利要求30的方法，其中甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病是家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年全身性淀粉樣變性。
33.權(quán)利要求32的方法，其中疾病是阿爾茨海默病、海綿狀腦病、多發(fā)性神經(jīng)病、II型糖尿病和甲狀腺髓質(zhì)瘤。
34.治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白介導的疾病或紊亂的一種或多種癥狀的方法，包括給予權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中疾病是肥胖癥。
36.穩(wěn)定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白四聚體的方法，包括用權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物接觸四聚體。
37.抑制TTR淀粉樣形成的方法，包括給予權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物。
38.用于治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病的一種或多種癥狀時的權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物。
39.權(quán)利要求1-24任一項的化合物或權(quán)利要求25-27任一項的藥物組合物在制造用于治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣疾病的藥物中的用途。
全文摘要
提供了用于穩(wěn)定甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白以及用于治療、預防或改善甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白介導疾病的一種或多種癥狀的化合物、組合物和方法。在一種實施方案中，這些化合物是苯并噁唑及相關化合物，其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；X是O、S或NR11；Het是雜芳基，任選被鹵素、OR、烷基或鹵代烷基取代；且其中R、R1-R3、R5-R8和R11如申請中定義。
文檔編號A61K31/428GK101198598SQ200580024488
公開日2008年6月11日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者理查德·拉伯迪尼爾 申請人:弗爾德里克斯制藥股份有限公司