專利名稱：二甲氧基苯磺酰氯柱前衍生法分析胺基化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胺基化合物的柱前衍生化方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
柱前衍生反相高效液相色譜法(RP-HPLC)是提高分析一些不含生色基團(tuán)的胺基化合物如氨基酸等靈敏度的常用方法，目前已報(bào)道的用于柱前衍生氨基酸的試劑有很多， 但多少存在一些問題，如鄰苯二甲醛(OPA)只能與一級(jí)氨基酸發(fā)生反應(yīng)，不能檢測(cè)仲氨基酸，且衍生物不穩(wěn)定；異硫氰酸苯甲酯(PITC)衍生操作復(fù)雜，需要真空抽干衍生化后過量的溶劑；氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)需要將反應(yīng)過程中剩余的衍生化試劑萃取出以終止衍生化反應(yīng)，衍生物易發(fā)生分解；丹酰氯(Dansyl-Cl)與包括亞氨基在內(nèi)的所有氨基酸均起反應(yīng)，影響定量；二硝基氟苯(FDNB)衍生化后生成干擾副產(chǎn)物，且需要通過抽干的方法除去反應(yīng)劑[牟世芬，于泓.氨基酸分析方法的研究進(jìn)展.[J]分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展，2005， 3(33) :398-404]。二甲氧基苯磺酰氯(DMOSC)通常主要用于有機(jī)合成，未見有報(bào)道其用于柱前衍生化試劑，本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行了有關(guān)的研究，并將其開發(fā)應(yīng)用為一新型衍生化試劑，以磺酰氯基(-SO2Cl)作為反應(yīng)基團(tuán)，以苯環(huán)作為生色基團(tuán)，以二甲氧基0，5_或2，4_或3， 4-或3，5-0Me)作為助色基團(tuán)，提高氨基酸的分離檢測(cè)靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種衍生物靈敏度高，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，能同時(shí)衍生一、二級(jí)胺基化合物，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，衍生化后無需除去過量試劑，分析時(shí)間短的DMOSC 柱前衍生化方法。本發(fā)明方法包括以下內(nèi)容胺基化合物的DMOSC柱前衍生化方法，其特征是將一級(jí)或二級(jí)或一級(jí)和二級(jí)胺基化合物樣品預(yù)處理后用PH8. 0 11. 5，濃度0. 05-0. 35M的硼砂緩沖溶液配成樣品濃度為 0. 001 1. Omg/mL的溶液，加入DMOSC的甲醇或乙醇或乙腈溶液，DMOSC與胺基化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)的摩爾比為3 8 1，混勻，在25 45°C條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)10 40min 后，于冰水浴冷卻，過濾進(jìn)樣至高效液相色譜儀，采用紫外檢測(cè)器測(cè)定胺基化合物衍生物的含量。所述的衍生化反應(yīng)的最佳溫度為30 35°C，最佳時(shí)間為10 15min。按常規(guī)方法進(jìn)行高效液相檢測(cè)，進(jìn)樣前先用0. 22 μ m膜進(jìn)行過濾。本發(fā)明具有衍生化反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，能同時(shí)衍生一、二級(jí)胺基化合物，無需除去衍生化后過量試劑，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定，室溫?zé)o避光的條件下能放置 25 60天。衍生化反應(yīng)溫度低，特別適合于生物樣品的分析。


圖1是甘氨酸柱前衍生化后高效液相色譜圖，1.衍生試劑水解物；2.甘氨酸衍生產(chǎn)物。
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圖2是混合氨基酸柱前衍生化后高效液相色譜圖，1.衍生試劑水解物；2. Glu ； 3. Thr ；4. Tyr ；5. Val ；6. Tyr ；7. Phe
具體實(shí)施例方式儀器與色譜條件Summit型Dionex (戴安)高效液相色譜儀，色譜系統(tǒng)由P680 HPLC泵、UVD-170U 可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、8125型進(jìn)樣裝置和柱溫箱AT-330(天津奧特恩斯儀器有限公司) 組成。工作站美國(guó)戴安Chromeleon ；色譜條件十八烷基鍵合硅膠色譜柱規(guī)格為5 μ m， 250*4. 6mm ；流速0. 8 1. OmL/min ；柱溫25 35°C ；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 240nm ；流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(0. 02M 0. 05M，pH 5. 5 7. 5)體積比為10 5 85 20 50 30 ；進(jìn)樣量 20 μ L。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 35Μ，ρΗ 8. 1)配制濃度為0. 31mg/mL的草甘膦溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為3. 47mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在45°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)IOmin后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 5. 8,0. 05mol/L)體積比為15 5 80 ；流速1. OmL/min ；柱溫 25 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 20M，ρΗΙΟ. 7)配制濃度為1. Omg/mL的甘氨酸溶液，取該溶液 3mL與1. 5mL濃度為18. 92mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在35°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)15min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 5. 5,0. 02mol/L)體積比為20 10 70 ；流速1. OmL/min ；柱溫 30 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 30M, ρΗ 10)配制濃度為0. 23mg/mL的脯氨酸溶液，取該溶液 ImL與0. 5mL濃度為4. 72mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在28 V 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)15min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 6. 9,0. 02mol/L)體積比為18 15 67 ；流速0. 9mL/min ；柱溫 35 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 10M，ρΗ 11. 2)配制濃度為0. 41mg/mL的蛋氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為7. 80mg/mL2, 5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在40°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)20min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 6. 7,0. 03mol/L)體積比為18 5 77 ；流速1. OmL/min ；柱溫 30 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)240nm。
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實(shí)施例5實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 05M，pH 11. 5)配制濃度為0. 001mg/mL的色氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為0. 02mg/mL 3,4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙腈溶解)混合，在27°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)25min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 5,0. 02mol/L)體積比為20 50 30 ；流速1. OmL/min ；柱溫 35 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。實(shí)施例6實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 18M，pH 9. 9)配制濃度為0. 16mg/mL的酪氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為2. 92mg/mL 3，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在25 °C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)40min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 0,0. 02mol/L)體積比為10 25 65 ；流速0. 9mL/min ；柱溫 30 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)225nm。實(shí)施例7實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 05M，pH 10. 5)配制濃度為0. 28mg/mL的谷氨酸溶液，取該溶液ImL與0.5mL濃度為4.01mg/mL 3，5-二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙腈溶解)混合，在34°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)30min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 8,0. 04mol/L)體積比為12 20 68 ；流速1. OmL/min ；柱溫 25 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。實(shí)施例8實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 15M，pH 9. 8)配制濃度為0. 21mg/mL的賴氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為5. 43mg/mL 2,4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在32°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)21min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 5,0. 02mol/L)體積比為20 50 30 ；流速0. 8mL/min ；柱溫 30 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。實(shí)施例9實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 25M，pH 9. 5)配制濃度為0. 12mg/mL的蘇氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為1. 91mg/mL2，4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在37°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)ISmin后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 5,0. 03mol/L)體積比為12 20 68 ；流速1. OmL/min ；柱溫 30 0C ；檢測(cè)波長(zhǎng)240nm。實(shí)施例10實(shí)驗(yàn)步驟用硼砂緩沖溶液(0. 20M，pH 10)配制總濃度為0. 31mg/mL的氨基酸(谷氨酸Glu， 蘇氨酸Ilir，酪氨酸Tyr，纈氨酸Val和苯丙氨酸Wie)混合溶液，取該溶液2mL與ImL濃度為5. 25mg/mL2，5-二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在36°C條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)15min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，以梯度洗脫10% A不變，流動(dòng)相B比例變化8% (0-3min) ,6%^ 13% (3-8min), 13%^ 20% (8-llmin), 20 % ^ 25% (Il-Hmin)，25%—30% (14_19min)，C 磷酸鹽緩沖溶液(pH = 5. 8,0. 02mol/L)；流速 1. OmL/min ；柱溫 32 °C ；檢測(cè)波長(zhǎng) 230nm。
權(quán)利要求
1.一種胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是將一級(jí)或二級(jí)或一級(jí)和二級(jí)胺基化合物樣品預(yù)處理后用PH8. 0 11. 5，濃度0. 05 0. 35M的硼砂緩沖溶液配成樣品溶液，加入衍生化試劑二甲氧基苯磺酰氯，或簡(jiǎn)稱DM0SC，的甲醇或乙醇或乙腈溶液，混勻，在25 45°C條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)10 40min后，于冰水浴冷卻，再過濾進(jìn)樣至高效液相色譜儀， 采用紫外檢測(cè)器測(cè)定胺基化合物衍生物的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的二甲氧基苯磺酰氯試劑的反應(yīng)基團(tuán)為磺酰氯基-SO2Cl,生色基團(tuán)為苯環(huán)，助色基團(tuán)二甲氧基為2，5_或 2,4-或 3，4_ 或 3，5-0Me。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的一級(jí)或二級(jí)或一級(jí)和二級(jí)胺基化合物溶液樣品濃度范圍為0. 001 1. Omg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的二甲氧基苯磺酰氯與胺基化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)的摩爾比為3 8 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是高效液相色譜條件為十八烷基鍵合硅膠色譜柱規(guī)格為5 μ m，250*4. 6mm;流速0.8 1. OmL/min ；柱溫 25 35°C ；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 240nm ；流動(dòng)相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液體積比為 10 5 85 20 50 30。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是流動(dòng)相磷酸鹽緩沖溶液濃度為0. 02M 0. 05M, pH值為5. 5 7. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分析胺基化合物的高效液相色譜柱前衍生化方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。其過程為將一級(jí)或二級(jí)或一級(jí)和二級(jí)胺基化合物樣品用pH8.0～11.5，濃度0.05～0.35M的硼砂緩沖溶液配成樣品溶液，加入二甲氧基苯磺酰氯的甲醇或乙醇或乙腈溶液，混勻，在25～45℃條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)10～40min后，于冰水浴冷卻，過濾進(jìn)樣全高效液相色譜儀，采用紫外檢測(cè)器對(duì)胺基化合物的衍生物進(jìn)行定量分析。本發(fā)明具有衍生反應(yīng)操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，能同時(shí)衍生一、二級(jí)胺基化合物，衍生后無需除去過量試劑，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，衍生反應(yīng)溫度低，特別適合于生物樣品的分析。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102288707SQ201110125478
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者劉曉寧, 方芳, 李壽椿, 魏榮卿 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)