專利名稱：：苯磺酰氟類化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到一種苯磺酰氟類化合物及其制備方法和應(yīng)用，具體為以磺酰氟基(-S02F)作為反應(yīng)基團，以母體苯環(huán)作為發(fā)色團、以R作為輔助取代基團的新型苯磺酰氟類化合物(ANewKindofBenzeneSulfonylFluoride)及其在氨基酸和蛋白質(zhì)、肽以及含有一級氨基或二級氨基、羥基、酚羥基、巰基的化合物或其它化學物質(zhì)中的應(yīng)用。苯磺酰氟類化合物作為衍生化試劑及標記試劑不僅可以用于蛋白質(zhì)、肽結(jié)構(gòu)及氨基酸的測定、進行蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組學研究，還可以用于新藥的研究開發(fā)，亦可用作醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)診斷疑難病癥、藥效評估，也可作為國家藥檢單位、質(zhì)檢單位進行質(zhì)量監(jiān)控的標記試劑。
背景技術(shù)：
：目前在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組學研究領(lǐng)域所應(yīng)用的標記試劑中，不少產(chǎn)品的衍生化反應(yīng)溫度都在60'C-7(TC左右，較低溫度也在55'C左右，因此在衍生化反應(yīng)過程中將使蛋白質(zhì)、肽的立體構(gòu)型發(fā)生變化，導致蛋白質(zhì)、肽失去生物活性，從而難以測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)。具體還表現(xiàn)在1)某些標記試劑對于組成人體蛋白質(zhì)的某些氨基酸不能完全適用，例如，對二級氨基酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸。2)某些標記試劑在與a-氨基酸的手性中心的官能團反應(yīng)后，會產(chǎn)生內(nèi)消旋化作用，導致部分或全部立體化學信息丟失。在肽中會導致手性中心部分或全部差向異構(gòu)化失去生物活性。3)大多數(shù)現(xiàn)有標記試劑對空氣中的濕度比較敏感，釋放出腐蝕性氣體，易于水解，從而失去其衍生化的反應(yīng)活性。4)某些標記試劑與氨基酸反應(yīng)所生成的衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性低，影響后續(xù)檢測操作的正常進行，嚴重者甚至會導致錯誤的檢測結(jié)果。5)某些標記試劑由于檢測靈敏度不夠，無法檢測出超微量的已知或未知化合物。6)某些標記試劑由于合成工序繁復(fù)，導致售價昂貴，無法普及使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新型的苯磺酰氟類化合物及其制備方法和應(yīng)用，以克服已有技術(shù)的不足。本發(fā)明的分子中含有在可見光區(qū)或是在近紫外光區(qū)可以進行檢測的結(jié)構(gòu)，并且具有可以與蛋白質(zhì)、肽、氨基酸及含有一級氨基、二級氨基、羥基、酚羥基、巰基的化合物或化學物質(zhì)進行衍生化反應(yīng)的活性基團。具有在接近人體體溫(35'C-45'C左右、pH8-10左右)條件下進行衍生化反應(yīng)、不產(chǎn)生消旋化作用、產(chǎn)品本身及衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性高、儀器響應(yīng)值高、不釋放腐蝕性氣體、無放射性、無環(huán)境污染、合成方便、制造成本較低、易于在室溫下保存及運輸?shù)牡奶攸c。本發(fā)明提供的苯磺酰氟類化合物，具有通式為(I)的化合物其中，R為烷基、垸氧基、?；Ⅳ人峄?、氰基、硝基、鹵素或是它們的混合。本發(fā)明具有通式為(I)的化合物中可選擇的取代基R二4-乙基、4-叔丁基、4-鹵素、2-甲氧基、4-甲氧基、4-乙?；?、3-氰基、2-硝基、3-硝基、3-羧酸基；R-2，4-二甲基、3，5-二甲基、2-甲基-5-硝基、4-甲基-3-硝基、2-甲氧基-4-甲基、2-甲基-4-甲氧基、2,5-二甲氧基、3,4-二甲氧基、4-氟-3-硝基、2-氟-5-硝基、2-氟-4-甲基。R-2,4，6-三甲基；本發(fā)明提供的苯磺酰氟類化合物的制備方法包括的步驟在相轉(zhuǎn)移催化劑聚乙二醇400-800存在下，以本發(fā)明的前體化合物苯磺酰氯和金屬氟化物為原料，在有機溶劑中(以乙腈為溶劑，或二氧陸圜為^劑)，至少室溫條件攪拌下，進行氟代反應(yīng)1-2小時，過濾，用乙醇洗漆除去溶劑，干燥。本發(fā)明提供的苯磺酰氟類化合物應(yīng)用于蛋白質(zhì)、肽或氨基酸的衍生化反應(yīng)及其檢測；或與含有一級氨基、二級氨基、羥基、酚羥基、巰基的化合物或其它化學物質(zhì)進行衍生化反應(yīng)及其檢測。本發(fā)明提供的苯磺酰氟類化合物是具有全新分子結(jié)構(gòu)的標記試劑，它具有較低的分子量，分子量范圍在178~239、6道爾頓之間，屬于小分子化合物。較小的分子使得苯磺酰氟類化合物更易于向蛋白質(zhì)，肽分子的二級或三級結(jié)構(gòu)內(nèi)滲透，進行衍生化反應(yīng)，達到微量、超微量定性定量分析目的，即在溫和條件(35'C-45'C左右、pH8"10左右)下能夠與蛋白質(zhì)、肽、氨基酸及含有一級氨基或二級氨基、羥基、酚羥基、巰基的化合物或化學物質(zhì)進行衍生化反應(yīng)。其衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定，重復(fù)性好，儀器響應(yīng)值高，檢測靈敏度達到nmol-fmol級，使超微量的已知或未知化合物達到化學衍生化和儀器檢測的效果。苯磺酰氟類化合物溫和的衍生化反應(yīng)條件在對蛋白質(zhì)、肽進行衍生化反應(yīng)時，可以在低于蛋白質(zhì)及肽的變性溫度的條件下，在35°C-45'C左右進行衍生化反應(yīng)。在衍生化反應(yīng)中，手性中心官能團不產(chǎn)生經(jīng)由惡唑酮機制的消旋作用，使氨基酸、肽、蛋白質(zhì)及其它含有手性中心的化合物或化學物質(zhì)的立體化學性息不致丟失，保持光學純度，立體化學完整性，以及它們的生物活性，使苯磺酰氟類化合物可以在蛋白質(zhì)、肽保持其生物活性的基礎(chǔ)上推定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)，從而使苯磺酰氟類化合物在對蛋白質(zhì)及肽進行標記、定性定量檢測時與現(xiàn)有標記試劑相比較時顯示出明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明苯磺酰氟類化合物具有較好的穩(wěn)定性，不僅使其本身在室溫及干燥的環(huán)境下具有較好的穩(wěn)定性(儲藏時間在18個月以上)，其衍生化產(chǎn)物在室溫及潮濕環(huán)境中也具有較好的穩(wěn)定性。具體實施方式-實施例1:4-甲氧基苯磺酰氟CH30-C6H4-S02F的合成向容量為500ml具有攪拌器、回流冷凝器、溫度計插孔和加料口的四口圓底燒瓶中加入氟化鈉10.5g，聚乙二醇4008g和乙腈200ml。在3(TC水浴上攪拌60分鐘，直至觀察到氟化鈉微粒大小均勻。而后向上述四口燒瓶中加入含有20.6g4-甲氧基苯磺酰氯的200ml乙腈的懸浮液。在30'C溫度下繼續(xù)攪拌120分鐘后停止反應(yīng)。把氟代反應(yīng)物懸混液倒入攪拌狀態(tài)下盛有400ml蒸餾水的容量為1000ml的燒杯內(nèi)，靜置過夜。在布氏漏斗上過濾出氟代產(chǎn)物，用乙醇洗滌除去乙腈，干燥稱重，得4-甲氧基苯磺酰氟的粗產(chǎn)物14g。在乙醇溶液中重結(jié)晶，得無色結(jié)晶產(chǎn)品4-甲氧基苯磺酰氟，分子量190。將4-甲氧基苯磺酰氟用乙腈溶解，配置成濃度為1x1(T6mol/L的溶液，在UV3150紫外吸收分光光度計上測定在此濃度下的紫外-可見紫外吸收光譜。測得其最大吸收波長入m狄二270nm。實施例2:2-甲氧基4-甲基苯磺酰氟2-CH304-CH3-C6H4-S02F的合成向容量為500ml具有攪拌器、回流冷凝器、溫度計插孔和加料口的四口燒瓶中加入氟化鈉12,6g，聚乙二醇6008g和乙腈200ml。在30'C水浴上攪拌60分鐘，直至觀察到氟化鈉微粒大小均勻。而后向上述四口燒瓶中加入含有22g2-甲氧基4-甲基苯磺酰氯的200ml乙腈的懸浮液。在30'C溫度下繼續(xù)攪拌120分鐘后停止反應(yīng)。把氟代反應(yīng)物懸混液倒入攪拌狀態(tài)下盛有400ml蒸餾水的容量為1000ml的燒杯內(nèi)，靜置過夜。在布氏漏斗上過濾出氟代產(chǎn)物，用乙醇洗滌除去乙腈，干燥稱重，得2-甲氧基4-甲基苯磺酰氟粗產(chǎn)物14.2g。在乙醇溶液中重結(jié)晶，得無色結(jié)晶產(chǎn)品，分子量204。將2-f氧基4-甲基苯磺酰氟用乙腈溶解，配成濃度為"1(T6mol/L的溶液，在UV3150紫外吸收分光光度計上測定在此濃度下的紫外-可見紫外吸收光譜。測得其最大吸收波長入max=274nm。同樣實驗條件，在相轉(zhuǎn)移催化劑聚乙二醇為400-800存在下(相對苯磺酰氟類化合物中不同試劑的分子質(zhì)量取不同的相轉(zhuǎn)移催化劑聚乙二醇)，以本發(fā)明苯磺酰氟類化合物產(chǎn)物的對應(yīng)的前體化合物苯磺酰氯為原料，以金屬氟化物(氟化鈉，或氟化鋰、氟化鉀、氟化銣與氟化銫)為氟代試劑，在乙腈(或二氧陸圜，1,4-Dioxane)溶劑中，至少為室溫條件下，進行氟代反應(yīng)1-2小時，合成出本發(fā)明苯磺酰氟類化合物系列中的各種產(chǎn)品。見表1-3。由于相轉(zhuǎn)移催化劑的應(yīng)用，使得兩種互不相溶的、在反應(yīng)介質(zhì)中也難以溶解的原料一苯磺酰氯化合物和金屬氟化物在相轉(zhuǎn)移催化劑作用下得以順利反應(yīng)，從而制得產(chǎn)率較高的苯磺酰氟類化合物。表1、2、3中所列出的標記試劑均可以參照實施例1或?qū)嵤├?所示的氟代反應(yīng)條件制得。表1:A系列(SIN0R0-9AS)R所代表的基團及其化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:B系列(SINORO-9BS)R所代表的基團及其化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3:C系列(SIN0R0-9CS)R所代表的基團及其化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3:利用4-甲氧基苯磺酰氟作為標記試劑測定二級氨基酸脯氨酸、羥脯氨酸、和N-乙基甘氨酸儀器美國Waters公司高效液相色譜儀510泵，U6k進樣器，490E紫外檢測器，反相C8色譜柱。試劑脯氨酸、羥脯氨酸、N-乙基甘氨酸(Aldrich產(chǎn)品)；苯磺酰氟類化合物系列中的4-甲氧基苯磺酰氟(SINORO"9AS2，自制)；流動相準確稱取6.8g結(jié)晶醋酸鈉，加約850ml去離子水溶液，用10%醋酸溶液調(diào)pH至4.2，加去離子水至1000ml，抽濾，取此溶液770ml加色譜純乙腈230ml混勻，脫氣備用；方法①準確配制濃度為2.5Mmol/L的脯氨酸水溶液、羥脯氨酸水溶液、N-乙基甘氨酸水溶液、3，4脫氫脯氨酸水溶液(內(nèi)標)各100|jl，pH為9.3的硼酸鈉-氨氧化鈉緩沖溶液400|jl，濃度為400.0umol/L的4-甲氧基苯磺酰氟的乙腈-水(體積比為4:1)溶液100|j|。②準確吸取脯氨酸、羥基脯氨酸及N-乙基甘氨酸溶液各100yl和內(nèi)標溶液100pl，加入到400plpH為9.3的硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖溶液中，加入蒸餾水至總?cè)莘e達到1000pl。③取上述混合液500ul與100pl濃度為400.0jjmol/L4-甲氧基苯磺酰氟的乙腈-水溶液混合，將該混合液注入微型反應(yīng)管，置于38'C恒溫水浴中，保溫搖晃5分鐘后取出，用稀鹽酸調(diào)整pH到6-7,停止反應(yīng)。取出，得到四種氨基酸與4-甲氧基苯磺酰氟的衍生化產(chǎn)物(通式為4-CH30-C6H4-S02-NH-CHR-COOH)的混合液。@取適量上述四種衍生化產(chǎn)物的混合液與適量的流動相溶液混合，在高效液相色譜儀上進行分離檢測。(D經(jīng)紫外檢測器檢測，得上述四種衍生化產(chǎn)物的吸收峰值后，以3，4脫氫脯氨酸的峰面積為標準，測得脯氨酸、羥脯氨酸、和N-乙基甘氨酸的定量數(shù)據(jù)。其檢測極限達到10'9-10—12mol。實施例4:利用4-甲氧基苯磺酰氟作為標記試劑測定一級氨基酸和二級氨基酸的混合物中的二級氨基酸二級氨基酸中的脯氨酸、羥脯氨酸，N-乙基甘氨酸在尿液中異常出現(xiàn)，是生理學、病理學研究的對象。由于它們都是寡肽分子中的殘基，因此，在檢測過程中首先要把寡肽水解成氨基酸，才可以進行定量分析。由于共存于水解液中的一級氨基酸的干擾，使檢測過程復(fù)雜化。復(fù)雜的檢測程序和長時間的操作對被檢測樣的穩(wěn)定性提出更高的要求，即，在其衍生化檢測的過程中需要脯氨酸、羥脯氨酸及N-乙基甘氨酸的衍生化產(chǎn)物具有較高的穩(wěn)定性。利用苯磺酰氟類化合物不僅避免了一級氨基酸的干擾，而且提高了其衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性及檢測靈敏度。儀器美國Waters公司高效液相色譜儀510泵，U6k進樣器，490E紫外檢測器，反相C8色譜柱，Hettich離心機Mikro200。試劑3，4脫氫脯氨酸水溶液(內(nèi)標)，苯磺酰氟類化合物系列中的4-甲氧基苯磺酰氟(SINORO-9AS2，自制)；方法①樣品準備-尿液中寡肽水解向1ml尿液中加入濃度為12N的NaOH溶液1ml，導入耐溫耐壓玻璃管中，用聚四氟乙烯蓋塞緊，放在熱壓滅菌器中，在121'C，1.034bar壓力條件下加熱水解60分鐘后冷卻至室溫。按體積比為1:4的比例，向水解液中加入超純水稀釋。②向0,1ml水解液中加入適量的濃度為37。/0的濃鹽酸0.1ml把水解液中和到中性。再加入濃度為0.5mol的NaOH溶液0.8ml，濃度為0.25mol的Na2C03溶液0.8ml，使含有一級氨基酸和二級氨基酸的水解液的pH上升到9.3。③鄰苯二甲醛封閉一級氨基酸，4-甲氧基苯磺酰氟標記二級氨基酸，乙酸乙酯萃取取20pi尿肽水解液，與濃度為0.1(jmol/ml的3,4-脫氫-DL脯氨酸(內(nèi)標)20yl混合均勻。把濃度為14.9mmol/ml的鄰苯二甲醛20iJl加入到混合均勻的尿肽水解液中，在室溫下?lián)u晃3分鐘，對其水解液中的一級氨基酸進行衍生化封閉。而后加入濃度為0.285mg/100|j|的4-甲氧基苯磺酰氟的乙腈溶液20iJl,在37'C，pH9.3條件下?lián)u晃反應(yīng)5分鐘，完成其水解液中的二級氨基酸的衍生化封閉反應(yīng)后，加酸調(diào)pH到5-6終止反應(yīng)。得二級氨基酸中的脯氨酸、羥脯氨酸、N-乙基甘氨酸的4-甲氧基苯磺酰氟衍生化產(chǎn)物的混合液(其通式為4-CH30-C6H4-S02-NH-CHR-COOH)。向衍生化反應(yīng)混合液中加入體積比為1:1的乙腈與超純水混合液95|J|,混合均勻。另取40pi超純水注入衍生化反應(yīng)混合液及乙腈與超純水混合液中，使最終的水相體積達到100yl。立即向其中加入0.5ml的乙酸乙酯，并注入離心管，在轉(zhuǎn)速為8000RPM的離心機上離心分離5分鐘。從離心管下部液相吸取25pi液體注入色譜柱供進一步分離檢測用。(D高效液相色譜分離檢測色譜柱流動相由溶劑A和溶劑B組成。其中溶劑A為濃度為150mmol,pH3.0磷酸二氫鈉水溶液；溶劑B為由濃度為4%的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和容積比為4:1乙腈和水的混合液組成。溶劑A的pH用磷酸調(diào)節(jié)，在選定的梯度條件下洗脫。單柱在10分鐘內(nèi)完成分離和紫外檢測，包括洗柱時間和柱平衡時間。(D在紫外吸收波長232nm處對脯氨酸、羥脯氨酸及N-乙基甘氨酸和4-甲氧基苯磺酰氟的衍生化產(chǎn)物進行定性定量測定。檢測極限達到pmol級。檢測數(shù)據(jù)表明利用4-甲氧基苯磺酰氟作為標記試劑具有很高的靈敏度，色譜柱可以在10分鐘內(nèi)完成分離檢測。符合臨床檢測的要求。權(quán)利要求1、一種苯磺酰氟類化合物，其特征在于它具有通式為(I)的化合物其中，R為烷基、烷氧基、?；Ⅳ人峄?、氰基、硝基、鹵素或是它們的混合。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯磺酰氟類化合物，其特征在于-R-4-乙基、4-叔丁基、4-鹵素、2-甲氧基、4-甲氧基、4-乙?；?-氰基、2-硝基、3-硝基或3-羧酸基。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的苯磺酰氟類化合物，其特征在于R-4-甲氧基。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯磺酰氟類化合物，其特征在于R=2,4-二甲基、3,5-二甲基、2-甲基-5-硝基、4-甲基-3-硝基、2-甲氧基-4-甲基、2-甲基斗甲氧基、2，5-二甲氧基、3,4-二甲氧基、4-氟-3-硝基、2-氟-5-硝基或2-氟-4-甲基。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的苯磺酰氟類化合物，其特征在于R-2-甲氧基4-甲基。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯磺酰氟類化合物，其特征在于R-2，4,6-三甲基。7、權(quán)利要求1所述的苯磺酰氟類化合物的制備方法，其特征在于包括的步驟在相轉(zhuǎn)移催化劑聚乙二醇400-800存在下，以前體化合物苯磺酰氯和金屬氟化物為原料，在有機溶劑中，至少室溫條件，攪拌，進行氟代反應(yīng)1-2小時，過濾，用乙醇洗滌除去溶劑，干燥。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的有機溶劑是乙腈或二氧陸圜。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的金屬氟化物為氟化鋰、氟化鈉、氟化鉀、氟化銣或氟化銫。10、權(quán)利要求1所述的苯磺酰氟類化合物的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于蛋白質(zhì)、肽或氨基酸的衍生化反應(yīng)及其檢測；或與含有一級氨基、二級氨基、羥基、酚羥基、巰基的化合物或其它化學物質(zhì)進行衍生化反應(yīng)及其檢測。全文摘要本發(fā)明涉及到一種苯磺酰氟類化合物及其制備方法及和應(yīng)用。通式為(I)的化合物，R為烷基、烷氧基、酰基、羧酸基、氰基、硝基、鹵素或是它們的混合。以前體化合物苯磺酰氯和金屬氟化物為原料在乙腈中進行氟代反應(yīng)進行制備。以磺酰氟(-SO₂F)基作為反應(yīng)基團，以母體苯環(huán)作為發(fā)色團、以R作為輔助取代基團的新型苯磺酰氟類化合物(ANewKindofBenzenesulfonylFluoride)不僅可以用于蛋白質(zhì)、肽結(jié)構(gòu)及氨基酸的測定、進行蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組學研究，還可以用于新藥的研究開發(fā)，亦可用作醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)診斷疑難病癥、藥效評估，也可作為國家藥檢單位、質(zhì)檢單位進行質(zhì)量監(jiān)控的標記試劑。文檔編號C07C303/02GK101585787SQ20091006930公開日2009年11月25日申請日期2009年6月18日優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日發(fā)明者李壽椿申請人:李壽椿