丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光預染檢測法中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖蛋白特異性熒光預染檢測技術，具體地說是丹酰肼及其衍生物在糖 蛋白特異性熒光預染檢測法中的應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白質(zhì)糖基化修飾在生命科學研究領域具有至關重要的作用，作為最主要和普遍 的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，目前已知哺乳動物蛋白質(zhì)中至少有二分之一發(fā)生了糖基化，這 些糖蛋白廣泛分布于組織、細胞、體液中，特別是在細胞膜表面、體液等中含量豐富，糖基化 對于蛋白質(zhì)的折疊、運輸和定位等都起著重要作用，并參與受體激活、信號轉導、細胞載附 等諸多重要的生物過程。糖蛋白數(shù)量變化或糖鏈結構的改變，都可能導致疾病發(fā)生。不但 目前已知的很多疾病的診斷標志物是糖蛋白，而且通過國際標準認證的藥物中，糖蛋白也 占到較1?的比例。
[0003] 分離純化及鑒定是糖蛋白研究的重要步驟，是下一步結構分析得以實施的基礎。 目前凝膠上蛋白質(zhì)染色主要分為預染及后染兩類。前者在電泳前對樣品進行處理，使染料 特異性地與樣品內(nèi)糖蛋白相結合，經(jīng)電泳分離之后即可在相應激發(fā)波長下進行觀察，后染 主要對電泳后的蛋白凝膠進行特異性染色。
[0004] 目前糖蛋白檢測領域試劑盒主要集中于后染，且多數(shù)產(chǎn)品均以高附加值的價格在 市場銷售，價格高昂，不利于生物技術基礎研究的發(fā)展。尤其國內(nèi)利用現(xiàn)有的生物試劑進 行生物實驗成本居高不下，無法實現(xiàn)經(jīng)濟效益與實驗共同發(fā)展。糖蛋白特異性熒光預染檢 測技術鮮有報道。本發(fā)明開發(fā)的丹酰肼及其衍生物熒光預染檢測方法靈敏度接近Pr 0-Q Emerald488染色法，是一種靈敏、便捷、特異的糖蛋白熒光預染檢測技術，有較好的基礎與 臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光預染檢測中的應 用。
[0006] 本發(fā)明所述的丹酰肼相關化合物是指以丹酰肼陰離子為母核的鈉鹽、鉀鹽和銨鹽 等。
[0007] 丹酰肼母核為：
[0008]
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了應用丹酰肼進行糖蛋白特異性熒光預染 檢測的方法包括如下步驟：
[0010] 1)在l-20yL含0.5-10yg蛋白樣品（不足l-20yL用重蒸水補足）中加入 0. 005-0. 05M高碘酸水溶液1-20 μ L，置于避光處進行氧化反應5-30min ;優(yōu)選的樣品體積 為10 μ L，優(yōu)選的高碘酸摩爾濃為0. 03M，體積為10 μ L，優(yōu)選的反應時間是IOmin ;
[0011] 2)在反應液中加入0. 1-0. 3Μ抗壞血酸l-ΙΟμ L，搖勻反應0. 5-5min ;優(yōu)選的抗壞 血酸摩爾濃度是〇. 24M，體積為5 μ L，優(yōu)選的反應時間是Imin ;
[0012] 3)在反應液中加入丹酰肼或其衍生物按重量體積比1-5%二甲基亞砜溶液 1-5 μ L，37°C環(huán)境下反應10_50min ;優(yōu)選的丹酰肼或其衍生物溶液為含重量體積是2%，體 積為2. 5 μ L，優(yōu)選的反應時間是30min ;
[0013] 4)在反應液中加入10-50 μ L3X蛋白質(zhì)上樣緩沖液，搖勻；優(yōu)選的體積為30 μ L ;
[0014] 5)電泳，觀察。
[0015] 前期研究表明該技術有如下優(yōu)點：
[0016] 1)靈敏度高：丹酰肼糖蛋白特異性熒光預染檢測法靈敏度同Pr0-Q Emerald488 靈敏度相當；
[0017] 2)操作簡單迅速：省去后染必需的固定等操作步驟，可在40min內(nèi)完成；電泳結束 后即可觀察；
[0018] 3)重現(xiàn)性好：受溫度、搖床擺動頻率等外部條件影響較??；
[0019] 4)可逆性好：容易脫色；
[0020] 5)質(zhì)譜兼容性好：由于丹酰肼熒光預染檢測法不影響蛋白質(zhì)結構，所以可與 MALDI-T0F等質(zhì)譜儀高度兼容；
[0021] 6)使用安全：采用毒性低的染料，提高實驗操作的安全性，對環(huán)境污染??；
[0022] 7)成本低。
【附圖說明】
[0023] 圖1.丹酰肼的化學結構；
[0024] 圖2中（A-D)為在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對Sigma公司的八種不同標準蛋 白質(zhì)樣品選擇性及靈敏度比較。（A)丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法，（B)丹酰肼糖蛋白熒 光預染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白熒 光染色法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測。 帶 1，1000 ng ;帶 2,500ng ;帶 3,250ng ;帶 4,125ng ;帶 5,64ng ;帶 6,32ng ;帶 7,16ng ;帶 8， 8ng;帶9,4ng;帶10, 2ng。Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法、SYPRO Ruby全蛋白突光染 色法均按照文獻記載操作；圖中名稱用斜體字表示為糖基化蛋白質(zhì)。
[0025] (E-H)在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對提取的人血清樣品選擇性及靈敏度比 較。（E)丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法，（F)丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白突光染色法檢測，（G)Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，（H)Pro-Q Emerald糖 蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測。帶l，5000ng;帶2,2500ng;帶 3,1250ng ;帶 4,625ng ;帶 5, 320ng ;帶 6,160ng ;帶 7,80ng ;帶 8,40ng ;帶 9, 20ng ;帶 10, 10ng。Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法、SYPRO Ruby全蛋白突光染色法均按照文獻記載 操作。
[0026] 圖3.二向SDS-PAGE膠上，㈧丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法，⑶丹酰肼糖蛋白 熒光預染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白 熒光染色法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢 測。分離樣品為人血清總蛋白；IPG膠條長13厘米，pH4-7 ;分離膠的濃度為11. 4% ;樣品 上樣量為25 μ g/膠條。
[0027] 圖4.比較在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對去糖基化樣品選擇性，樣品為用 PNGase F去除N-鏈糖后的人血清總蛋白。帶TP，人血清總蛋白；帶DP，去N-鏈糖后人血 清總蛋白；Pre-S組為丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法，Pre-S+SR組為丹酰肼糖蛋白熒光預 染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測，Pro-Q組為Pro-Q Emerald糖蛋白 熒光染色法，Pro-Q+SR組為Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒 光染色法檢測。
[0028] 圖5.在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對富集后糖基化蛋白選擇性比較，樣品為使 用糖基化富集試劑盒從人血清總蛋白中富集出的糖蛋白。帶TP，未富集的人血清總蛋白； 帶Con A Enriched Glycoproteins,使用糖基化富集試劑盒從人血清總蛋白中富集出的糖 蛋白；SR組為SYPRO Ruby全蛋白熒光檢測法，Pre-S組為丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法， Pre-S+SR組為丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢 測，Pro-Q組為Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，Pr〇-Q+SR組為Pro-Q Emerald糖蛋白突 光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明 本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。
[0030] 實施例1丹酰肼糖蛋白特異性熒光預染檢測法
[0031] 圖1是丹酰肼的化學結構式。
[0032] 圖2-5是丹酰肼糖蛋白特異性熒光預染檢測法數(shù)據(jù)圖。
[0033] 實驗采用下述步驟進行：
[0034] 1)在10 μ L含0· 5-10 μ g蛋白樣品（不足10 μ L用重蒸水補足）中加入0· 03M高 碘酸水溶液10 μ L，置于避光處進行氧化反應10min ;
[0035] 2)在反應液中加入0. 24Μ抗壞血酸5 μ L，搖勻反應Imin ;
[0036] 3)在反應液中加入2%丹酰肼或其衍生物2.5111^，371：環(huán)境下反應3〇1^11 ;
[0037] 4)在反應液中加入30 μ L3X上樣緩沖液，搖勻