丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖蛋白特異性英光檢測技術(shù)，具體地說是丹醜脫及其衍生物在糖蛋白 特異性英光檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)糖基化修飾在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有至關(guān)重要的作用，作為最主要和普遍 的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，目前已知哺乳動物蛋白質(zhì)中至少有二分之一發(fā)生了糖基化，該 些糖蛋白廣泛分布于組織、細(xì)胞、體液中，特別是在細(xì)胞膜表面、體液等中含量豐富，糖基化 對于蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸和定位等都起著重要作用，并參與受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞載附 等諸多重要的生物過程。糖蛋白數(shù)量變化或糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。不但 目前已知的很多疾病的診斷標(biāo)志物是糖蛋白，而且通過國際標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的藥物中，糖蛋白也 占到較高的比例。
[0003]目前糖蛋白檢測領(lǐng)域試劑盒主要集中于外國的生物試劑公司，且多數(shù)產(chǎn)品均W高 附加值的價格在市場銷售，價格高昂，不利于生物技術(shù)基礎(chǔ)研究的發(fā)展。尤其國內(nèi)利用現(xiàn)有 的生物試劑進(jìn)行生物實驗成本居高不下，無法實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與實驗共同發(fā)展。本發(fā)明開發(fā) 的丹醜脫及其衍生物英光染色方法靈敏度接近Pro-QEmerald488染色法，是一種靈敏、便 捷、特異的糖蛋白英光檢測技術(shù)，有較好的基礎(chǔ)與臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供丹醜脫及其衍生物在糖蛋白特異性英光檢測中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的丹醜脫相關(guān)化合物是指W丹醜脫陰離子為母核的軸鹽、鐘鹽和饋鹽 等。
[0006] 丹醜脫母核為：
[0007]
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了應(yīng)用丹醜脫進(jìn)行糖蛋白特異性英光檢測 的方法包括如下步驟：
[0009] 1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后含蛋白質(zhì)樣品的凝膠置于固定液中固定10~60min，棄 固定液。
[0010] 優(yōu)選的固定時間為30min，固定液可W是含有40%己醇和10%己酸的水溶液；
[0011] 2)在高楓酸溶液里氧化10~40min，其中高楓酸溶液為含重量體積比0. 1~1% 的高楓酸及按體積比0. 5~5 %的己酸水溶液。然后用按體積比0. 5~5 %的己酸水溶液沖 洗2~5次，每次1~lOmin;優(yōu)選的氧化時間為20min，優(yōu)選的氧化液組成為含重量體積比 0. 5 %的高楓酸及按體積比3 %的己酸水溶液；氧化后優(yōu)選的洗脫次數(shù)為3次，每次5min，優(yōu) 選的洗脫液組成為體積比為3%的己酸溶液。
[0012] 3)加入染色液5~60min，其中染色液為含重量體積比0. 001~0. 02%的丹醜脫 或其衍生物及按體積比0. 5~5%的己酸水溶液。優(yōu)選的染色時間為30min，優(yōu)選的染色液 組成為含重量體積比0. 006%的丹醜脫及按體積比3%的己酸水溶液；
[0013] 4)加入洗脫液，洗脫液組成為體積比0. 5~5. 0%的己酸水溶液，洗脫1~3次， 每次5~20min。優(yōu)選的洗脫次數(shù)為2次，每次lOmin，優(yōu)選的洗脫液組成為按體積比3%的 己酸水溶液。
[0014] 5)檢測，可在激光掃描儀下觀察染色后的糖蛋白。
[0015] 前期研究表明該技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1)靈敏度高；丹醜脫糖蛋白特異性英光檢測法靈敏度同Pro-QEmerald488靈敏度 相當(dāng)；
[0017] 2)操作簡單迅速：操作步驟少，可在2個小時內(nèi)完成；
[0018] 3)重現(xiàn)性好；受溫度、搖床擺動頻率等外部條件影響較?。?br>[001引 4)可逆性好；容易脫色；
[0020] W質(zhì)譜兼容性好：由于丹醜脫英光檢測法不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，所W可與 MLDI-T0F等質(zhì)譜儀高度兼容；
[0021] 6)使用安全；采用毒性低的染料，提高實驗操作的安全性，對環(huán)境污染?。?br>[002引 7)成本低。
【附圖說明】
[0023]圖1.丹醜脫的化學(xué)結(jié)構(gòu)；
[0024]圖2.在一向SDS-PA(iE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色法檢測蛋白 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品效果的比較。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色 法，（C)SYPRORuby全蛋白英光染色法。Pro-Q血erald糖蛋白英光染色法和SYPR0Ruby 全蛋白英光染色法均按照文獻(xiàn)記載操作。采用Sigma公司的8種不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為樣 品；Transferrin(糖蛋白），BSA(非糖蛋白），IgG(糖蛋白），0VA(糖蛋白），a1-acid glycoprotein(糖蛋白），a-casein(非糖蛋白），目-casein(非糖蛋白），avidin(糖蛋 白），在圖中用斜體字表示糖蛋白。帶1，100化g;帶2,50化g;帶3,25化g;帶4,125ng;帶 5,64ng;帶 6, 32ng;帶 7,16ng;帶 8,8ng;帶 9,4ng;帶 10, 2ng。
[0025]圖3.在一向SDS-PAGE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色方法檢測實際 樣品效果的比較。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色法，（C) SYPR0Ruby全蛋白英光染色法。Pro-Q血erald糖蛋白英光染色法和SYPR0Ruby全蛋白英光 染色法均按照文獻(xiàn)記載操作；采用提取的人血清總蛋白為樣品。帶l，5000ng;帶2,2500ng; 帶 3,1250ng;帶 4,625ng;帶 5,31化g;帶 6,160ng;帶 7,80ng;帶 8,40ng;帶 9,20ng;帶 10， lOng。
[0026] 圖4.在二向SDS-PAGE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色方法檢測實際 樣品效果的比較。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色法，（C) SYPR0Ruby全蛋白英光染色法。分離樣品為大鼠肝臟總蛋白；IPG膠條長13cm，P冊-10;分 離膠的濃度為11.4% ;樣品上樣量為25yg/膠條。
[0027] 圖5.在一向SDS-PAGE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色方法針對糖蛋 白染色特異性的考察。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色 法，（C)SYPRORuby全蛋白英光染色法。用PNGaseF去除標(biāo)準(zhǔn)蛋白a1-acidglycoprotein 及人血清總蛋白中N-鏈糖。帶1，人血清總蛋白；帶2,去N-鏈糖后人血清總蛋白；帶3， a1-acidglycoprotein;帶 4,去N-鏈糖后a1-acidglycoprotein;帶 5,PNGaseF酶。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，該些實施例僅用于說明 本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 實施例1丹醜脫糖蛋白特異性英光染色
[0030] 圖1是丹醜脫的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0031] 丹醜脫糖蛋白英光染色法采用如下述步驟進(jìn)行：
[0032] 1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)樣品凝膠置于40%己醇和10%己酸水溶液中固 定30min，棄固定液；
[0033] 2)在高楓酸溶液里氧化20min，其中高楓酸溶液為含重量體積比0. 5%的高楓酸 及按體積比3%的己酸水溶液。然后用按體積比3%的己酸水溶液沖洗3次，每次5min;
[0034] 3)加入染色液染色30min，其中染色液為含重量體積比0. 006%的丹醜脫及按體 積比