本發(fā)明涉及一種快速識別肼的小分子熒光探針及其應(yīng)用，屬于有機小分子熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肼是一種非常重要的化學(xué)試劑，在化學(xué)領(lǐng)域廣泛的用于催化劑、乳化劑、醫(yī)藥中間體、紡織染料、攝影化學(xué)品等方面。同時，肼作為一種高能燃料推進劑在導(dǎo)彈、衛(wèi)星和火箭推進系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要作用。但是，肼也是一種毒性較大的物質(zhì)，可以通過呼吸和皮膚接觸進入人體，對人體的肝、腎、肺及神經(jīng)系統(tǒng)造成重大傷害。因此，一般的飲用水中的含量不可超過10ppb。因此，發(fā)展一種可以在生物體和環(huán)境中方便快捷檢測肼的方法非常重要。

目前檢測肼的常用方法有電化學(xué)法、流量檢測和化學(xué)發(fā)光法，其中熒光光譜分析法有著操作簡單、靈敏度高、選擇性好、生物相容性好等優(yōu)勢。但是都存在著波長短、無法檢測氣態(tài)肼、無法實現(xiàn)細胞成像等缺點。鑒于此，開發(fā)雙光子熒光探針可以實現(xiàn)產(chǎn)波長激發(fā)，從而檢測細胞中的肼，并且可以通過肼試紙的制備實現(xiàn)環(huán)境和氣體肼的檢測。而這一問題一直是目前亟待解決的課題。因此，通過利用萘熒光平臺，發(fā)展具有新型識別位點的雙光子肼熒光探針，具有非常重要的科學(xué)意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前有機小分子熒光探針在N₂H₄的檢測中所面臨的問題，本發(fā)明通過分子設(shè)計，合成出一種具有選擇性高的N₂H₄熒光探針。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種識別肼的小分子熒光探針，該探針分子的分子式為：C₂₀H₁₂N₂OS，它的結(jié)構(gòu)式如下：

所述熒光探針的制備方法如下：

將100.0mg化合物1與58.9mg化合物2在氮氣氛圍下加至反應(yīng)瓶中，然后將46.8mg哌啶和5.0mL乙醇/乙腈按體積比1：1組成的混合溶液一次性加至上述反應(yīng)器中，于氮氣氛圍下在加熱回流5h后，點板檢測反應(yīng)至原料消失，二氯甲烷萃取，無水Na₂SO₄干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離得到目標探針化合物，簡記為NS-N₂H₄；

所述化合物1結(jié)構(gòu)式如下：

所述化合物2結(jié)構(gòu)式如下：

上述的識別肼的小分子熒光探針的應(yīng)用，該熒光探針可以應(yīng)用于水環(huán)境和生物體系中N₂H₄的傳感檢測；所述的傳感檢測包含熒光檢測、細胞成像以及環(huán)境中肼的檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點：(1)探針的合成只需要一步就可以完成，且后處理過程相對簡單；(2)本發(fā)明實現(xiàn)了N₂H₄分子探針的選擇性快速檢測，并且選擇性好，抗其它分子干擾能力強?；谄涮禺愋院惋@著的顏色變化，該試劑可作為顯示水溶液中和生物細胞內(nèi)N₂H₄分子存在的專一性指示劑，可進行實時定性的目視比色法檢測。故而，本發(fā)明是一種簡單，快速，靈敏的N₂H₄分子特異性檢測試劑，在生物分子檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。其性能將在實施例中結(jié)合附圖給予詳細說明。

附圖說明

圖1是實施例1中探針NS-N₂H₄的¹H NMR圖譜。

圖2是探針NS-N₂H₄隨N₂H₄的加入熒光強度的變化情況。

圖3是探針NS-N₂H₄隨時間變化熒光強度變化情況。

圖4是探針NS-N₂H₄選擇性柱狀圖數(shù)據(jù)，1：none；2：Al³⁺；3：Ca²⁺；4：Co²⁺；5：Cu⁺；6：Cu²⁺；7：Mg²⁺；8：Zn²⁺；9：S^2-；10：SO₃^2-；11：Cys；12：Cl^-；13：N₂H₄。

圖5是探針NS-N₂H₄應(yīng)用于細胞中N2H4的熒光成像圖，其中a)將20μM探針DMF溶液加入到育有HeLa細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，明場成像，可以看到細胞大致的輪廓；b)將a)用藍光進行激發(fā)得到成像圖；c)將a)和b)圖成像疊加；d)將20μM探針DMF溶液加入到育有HeLa細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，加入N2H4后，明場成像，可以看到細胞大致的輪廓；e)將d)用藍光進行激發(fā)得到成像圖；f)將d)和e)圖成像疊加。

圖6是探針NS-N₂H₄在不同N₂H₄濃度下紫外燈試紙條的顏色變化情況圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限制，實施例中化合物的號碼對于上述方案中化合物的號碼。

實施例1

探針化合物NS-N₂H₄的合成

將化合物1(0.5mmol，100.0mg)與化合物2(1.1equiv，58.9mg)在氮氣氛圍下加至反應(yīng)瓶中，然后將哌啶(1.1equiv 46.8mg)和乙醇/乙腈(v/v＝1/1，5.0mL)一次性加至上述反應(yīng)器中，于氮氣氛圍下在加熱回流5h后，點板檢測反應(yīng)至原料消失，使用二氯甲烷萃取，無水Na₂SO₄干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離得到探針化合物NS-N₂H₄，硅膠顆粒大小為200-300目，產(chǎn)率為63％。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.4(s,1H),8.49(d,J＝12.4Hz,2H),8.22-8.19(m,2H),8.09(d,J＝8.0Hz,1H),7.90(dd,J＝14.4,7.6Hz,2H),7.60(t,J＝8.0Hz,3H),7.52(t,J＝7.2Hz,1H),7.23-7.16(m,2H).該探針的¹H NMR圖譜見圖1。

實施例2

探針化合物NS-N₂H₄熒光探針隨N₂H₄加入當(dāng)量的增加熒光譜圖的變化

取實施例1制備的探針NS-N₂H₄溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成1mmol/L儲備液。從儲備液中取出30μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，加入不同當(dāng)量(0-100equiv)的N₂H₄標準溶液，用PBS緩沖溶液(0.1mol/L，pH＝7.5)與DMSO體積比為2:1的溶液稀釋至3mL，以360nm為激發(fā)光，測量其熒光性質(zhì)。熒光光譜如圖2所示。由圖2可見，隨著N₂H₄加入當(dāng)量的增加熒光逐漸增強。

實施例3

探針NS-N₂H₄對隨時間變化的熒光譜圖的變化

從實施例2中熒光探針儲備液中取出30μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，加入N₂H₄(20equiv)標準溶液，用DMSO/PBS(1:2,v/v)稀釋至3mL(10μM)，測量其熒光性質(zhì)。熒光光譜如圖3所示。由圖3可見，加入探針NS-N₂H₄后，直接加入N₂H₄，隨時間的增加熒光強度迅速達到最大，實現(xiàn)了N₂H₄的檢測。

實施例4

化合物NS-N₂H₄熒光探針對不同離子的選擇性

從實施例2中熒光探針儲備液中取出30μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，分別加入等摩爾量的競爭分子標準溶液，其中一個加入等摩爾量的N₂H₄標準溶液，20min后檢測溶液的熒光發(fā)射光譜變化，由圖4可以發(fā)現(xiàn)，其他干擾離子對化合物NS-N₂H₄的熒光幾乎沒有影響，而N₂H₄溶液的加入使化合物NS-N₂H₄的熒光顯著增強。

實施例5

NS-N₂H₄熒光探針對細胞中N₂H₄熒光成像

我們將本發(fā)明探針應(yīng)用于HeLa細胞中N₂H₄的檢測進行熒光成像應(yīng)用。結(jié)果如圖5所示，具體操作步驟如下：a)將20μM探針DMF溶液加入到育有HeLa細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，明場成像，可以看到細胞大致的輪廓；b)將a)用藍光進行激發(fā)觀得到成像圖；c)將a)和b)圖成像疊加；d)將20μM探針DMF溶液加入到育有HeLa細胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，加入N₂H₄后，明場成像，可以看到細胞大致的輪廓；e)將d)用藍光進行激發(fā)觀得到成像圖；f)將d)和e)圖成像疊加。說明此熒光探針實現(xiàn)細胞中N₂H₄的檢測。

實施例6

本發(fā)明的探針作為氣態(tài)肼試紙條測試

用1mmol/mL的NS-N₂H₄溶液浸泡硅膠板，烘干制成條狀，然后放置于不同濃度肼的容量瓶的瓶口，10min后置于紫外燈下拍照。隨肼濃度增大，紫外燈下顯示硅膠板由紅色變成藍色，詳見圖6。