本申請(qǐng)涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物，及其制備方法和它們?cè)诳鼓[瘤藥物中的用途。

背景技術(shù)：

順鉑(cis-diaminedichloroplatinum(II),cDDP)和其他鉑類(lèi)抗腫瘤劑在惡性腫瘤治療中具有良好的療效。順鉑作用于含氮堿基與DNA雙鏈形成鏈內(nèi)交聯(lián)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Wong,E.；Giandomenico,C.M.Current status of platinum-based antitumor drugs.Chem.Rev.1999,99,2451-2466)。由于鉑類(lèi)抗癌藥物在治療過(guò)程中具有嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性，使得研究者致力于尋找高效、低毒的金屬抗癌藥物(Alama,A.；Tasso,B.；Novelli,F.；Sparatore,F.Organometallic compounds in oncology:implications of novel organotins as antitumor agents.Drug Discov.Today 2009,14,500-508)。

肼基二硫代甲酸酯的席夫堿衍生物作為硫-氮螯合劑被廣泛應(yīng)用。這些衍生物能與銅、鋅、鎳或鈀形成穩(wěn)定的金屬配合物，并表現(xiàn)出良好的生物活性。例如，Ali等合成了多種金屬離子[M＝Ni²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺]的吲哚啉-2-酮縮氨基硫脲衍生物的配合物(見(jiàn)下式a和b)，但未報(bào)道其生物活性(Ali,M.A.；Hj Abu Bakar,H.J.；Mirza,A.H.；Smith,S.J.；Gahan,L.R.；Bernhardt,P.V.Preparation,spectroscopic characterization and X-ray crystal and molecular structures of nickel(II),copper(II)and zinc(II)complexes of the Schiff base formed from isatin and S-methyldithiocarbazate(Hisa-sme).Polyhedron 2008,27,71-79.)。

本課題組曾合成了一系列的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物，其對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116、乳腺癌MCF-7細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抗增殖活性[曹勝利，許興智，廖薊，馬麗，丁盼盼，林慧慧，高曼，N-取代的吲哚-2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯及其制備方法和用途，專利號(hào)ZL201410459107.2]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)的發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物，該化合物對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116、乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞具有優(yōu)異的抗增殖作用。

本申請(qǐng)的目的是提供一種吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物。

本申請(qǐng)的另一個(gè)目的是提供上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的制備方法。

本申請(qǐng)的又一個(gè)目的是提供包含上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的藥用組合物。

本申請(qǐng)的再一個(gè)目的是提供上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物或包含其的藥用組合物作為抗腫瘤藥物的用途或在制備抗腫瘤藥物中的用途。

具體地說(shuō)，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物，如通式(I)所示：

其中，式(I)中R₁為-NR₂(R₃)，這里，R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫或未取代的C1-C4烷基，或R₂和R₃及其所連接的氮原子一起形成含至少一個(gè)氮原子的未取代的四至七元雜環(huán)、或取代的四至七元雜環(huán)；這里，所述取代的四至七元雜環(huán)是指該雜環(huán)被任意個(gè)未取代的C1-C4烷基、未取代的C1-C4烷氧基、未取代的苯基或未取代的C1-C4烷氧羰?；〈?；這里，所述的未取代的C1-C4烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基；所述未取代的C1-C4烷氧基選自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基；所述未取代的C1-C4烷氧羰?；x自甲氧羰?；?、乙氧羰?；?、正丙氧羰?；?、異丙氧羰酰基、正丁氧羰酰基、異丁氧羰?；蚴宥⊙豸术；?；

R₄、R₅、R₆和R₇各自獨(dú)立地選自氫、未取代的C1-C4烷基、未取代的C1-C4烷氧基、鹵素、硝基、或羥基；這里，所述未取代的C1-C4烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基；所述未取代的C1-C4烷氧基選自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基；所述鹵素選自氟、氯、溴或碘；

優(yōu)選地，R₄、R₅、R₆和R₇各自獨(dú)立地選自氫、甲基、甲氧基、氟、氯、溴、碘、硝基、或羥基；更優(yōu)選地，R₄、R₅和R₆其中一個(gè)為甲基、甲氧基、氟、氯、溴、碘、硝基、或羥基，而R₄、R₅和R₆中其余兩個(gè)以及R₇都為氫；或者，R₅和R₇各自獨(dú)立地選自甲基、甲氧基、氟、氯、溴、碘、硝基、或羥基，而R₄和R₆都為氫；

優(yōu)選地，R₁為含至少一個(gè)氮原子的未取代的四至七元雜環(huán)或者取代的四至七元雜環(huán)；這里，所述含至少一個(gè)氮原子的未取代的四至七元雜環(huán)選自四氫吡咯烷、嗎啉、哌啶、或哌嗪；所述取代的四至七元雜環(huán)選自2-甲基哌啶、4-甲基哌啶、4-甲基哌嗪、4-苯基哌嗪、或4-叔丁氧羰?；哙?。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，本申請(qǐng)?zhí)峁┑氖?I)化合物為下列式(II)化合物：

其中，R₁在式(II)化合物中的定義與在式(I)化合物中的定義相同，R₅為氟、甲基或甲氧基。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，本申請(qǐng)?zhí)峁┑氖?I)化合物為下列式(III)化合物：

其中，R₄、R₅、R₆和R₇在式(III)化合物中的定義與在式(I)化合物中的定義相同。

在本申請(qǐng)的一種實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊环N上述通式(I)化合物，其選自下列化合物：

雙(((Z)-((E)-(1-(2-(二乙基氨基)乙基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物1)；

雙(((Z)-((E)-(1-(2-(4-(叔丁氧羰?；?哌嗪-1-基)乙基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物2)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物3)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物4)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(2-甲基哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物5)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物6)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-嗎啉乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物7)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物8)；

雙(((Z)-((E)-(1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)甲基)硫基)鉑(配合物9)；

雙(((Z)-((E)-(4-溴-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物10)；

雙(((Z)-((E)-(4-氯-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物11)；

雙(((Z)-((E)-(5-溴-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物12)；

雙(((Z)-((E)-(5-氯-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物13)；

雙(((Z)-((E)-(5-氟-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物14)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物15)；

雙(((Z)-((E)-(1-(2-嗎啉基乙基)-5-硝基-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物16)；

雙(((Z)-((E)-(6-溴-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物17)；

雙(((Z)-((E)-(6-氯-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物18)；

雙(((Z)-((E)-(5,7-二溴-1-(2-嗎啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物19)；

雙(((Z)-((E)-(1-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物20)；

雙(((Z)-((E)-(1-(2-(二乙基氨基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物21)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物22)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物23)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(2-甲基哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物24)；

雙(((Z)-((E)-(1-(2-(4-(叔丁氧羰酰基)哌嗪-1-基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物25)；

雙(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(哌嗪-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物26)；

雙(((Z)-((E)-(1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物27)；或

雙(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(4-苯基哌嗪-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亞基)亞肼基)(甲硫基)甲基)硫基)鉑(配合物28)。

另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳缤ㄊ?I)所示的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的制備方法，包括如下步驟：

式(I′)化合物與1,5-環(huán)辛二烯二氯化鉑(摩爾比：2:1)反應(yīng)，得到式(I)化合物

這里，取代基R₁、R₄、R₅、R₆和R₇在式(I′)化合物中的定義與在式(I)化合物中的定義相同。

本申請(qǐng)?zhí)峁┑娜缤ㄊ?I)所示的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的制備方法，其中，式(I′)化合物可以采用中國(guó)專利ZL201410459107.2描述的方法制備。

在本申請(qǐng)?zhí)峁┑娜缤ㄊ?I)所示吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的制備方法中，優(yōu)選地，式(I′)化合物與1,5-環(huán)辛二烯二氯化鉑在乙醇中回流1-10小時(shí)反應(yīng)，得到式(I)化合物。

采用X-射線衍射可以測(cè)定吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)附圖1和2)。

第三方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N包含上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的藥用組合物。該藥用組合物包括藥理學(xué)上有效量的式(I)化合物和藥學(xué)上可接受的輔料。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，這些輔料都是已知的，例如，生理鹽水，明膠，阿拉伯樹(shù)膠，乳糖，微晶纖維素，淀粉，改性淀粉，纖維素，改性纖維素，羥乙酸鈉，磷酸氫鈣，硬脂酸鎂，滑石，膠體二氧化硅等。

此外，所述組合物還可進(jìn)一步地包含：穩(wěn)定劑，潤(rùn)濕劑，乳化劑，甜味劑，香味劑，緩沖劑等。

本申請(qǐng)?zhí)峁┑陌鲜鲞胚徇?2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯衍生物的鉑配合物的藥用組合物，根據(jù)需要，能夠配制成用于口服給藥的固體或液體形式，如片劑、丸劑、口服液等；用于非腸道給藥的無(wú)菌溶液、懸浮液或乳液形式，噴霧劑等，例如，注射劑。

具體地，，注射劑配方可以為：

制備方法：

將40g甘露醇、50g山梨醇加入1600mL注射用水中，攪拌溶解；將10g本申請(qǐng)的配合物加入上述溶液中，攪拌溶解；使用4％的磷酸氫二鈉溶液調(diào)體系的pH值為4.15；加注射用水至2000mL，加入活性炭，50℃保溫?cái)嚢?0min，過(guò)濾脫炭；用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，灌封。121℃，15min高溫濕熱滅菌。

第四方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松鲜鲞胚徇?2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物或包含其的藥用組合物作為抗腫瘤藥物或在制備抗腫瘤藥物中的用途。

具體地，本申請(qǐng)的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物或包含其的藥用組合物可用于治療乳腺癌、或結(jié)腸癌等。

本申請(qǐng)的發(fā)明人測(cè)定了本申請(qǐng)的配合物14、15及其配體I′a、I′b對(duì)HCT-116、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的抗增殖活性，結(jié)果表明配合物和配體均表現(xiàn)出良好的體外抗腫瘤活性，令人驚奇地是配合物的活性明顯優(yōu)于配體，而且配合物的體外抗腫瘤活性比臨床使用的順鉑活性更好。

實(shí)驗(yàn)證明，本申請(qǐng)的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物或包含其的藥用組合物具有抗腫瘤活性，對(duì)人乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)、結(jié)腸癌(HCT-116)細(xì)胞的增殖具有抑制作用，可作為抗腫瘤藥物或作為抗腫瘤活性成分用于抗腫瘤藥物組合物。用藥的參考劑量為0.1-10mg/kg體重，使用方法為口服或靜脈注射。

附圖說(shuō)明

圖1表示的是本申請(qǐng)的配合物14的晶體結(jié)構(gòu)。

(A)有原子標(biāo)示的化合物14的晶體結(jié)構(gòu)圖。鍵長(zhǎng)：Pt1-S1Pt1-S3Pt1-N2Pt1-N6(B)化合物14的晶體結(jié)構(gòu)的側(cè)面圖，其中虛線表示兩相鄰吲哚啉-2-酮環(huán)中心間的距離。

圖2表示的是本申請(qǐng)的配合物15的晶體結(jié)構(gòu)。

化合物15中含Pt1原子的單核結(jié)構(gòu)(A)及含Pt2原子的單核結(jié)構(gòu)(B)。鍵長(zhǎng)：Pt1-S1Pt1-S3Pt1-N2Pt1-N6Pt2-S5Pt2-S7Pt2-N9Pt2-N13

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)示例性說(shuō)明本申請(qǐng)的實(shí)施方案，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在本申請(qǐng)的教導(dǎo)下，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施方案進(jìn)行的改進(jìn)，仍屬于本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例中使用的化合物原料的來(lái)源是：1,5-環(huán)辛二烯二氯化鉑購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司，其它試劑和原料為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純?cè)噭?/p>

實(shí)施例中使用的人乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)、結(jié)腸癌(HCT-116)細(xì)胞來(lái)自首都師范大學(xué)DNA損傷應(yīng)答北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

熔點(diǎn)用XT5B或X-4型精密顯微熔點(diǎn)儀(控溫型)測(cè)定(北京福凱儀器有限公司)，溫度未校正。核磁共振氫譜、碳譜(¹H，¹³C NMR)用Varian NMR system 600MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀測(cè)定，TMS為內(nèi)標(biāo)。紫外-可見(jiàn)光譜用Perkin Elmer Lambda 750紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。熒光用SpectraMax M5多功能微板讀板儀(Molecular Devices,USA)測(cè)定。電噴霧高分辨質(zhì)譜(ESI-HRMS)用Thermo Scientific LTQ Orbitrap Discovery質(zhì)譜儀測(cè)定。

本申請(qǐng)的配合物的晶體X-射線衍射數(shù)據(jù)是在室溫293K環(huán)境下，利用Bruker SMART APEXII CCD單晶衍射分析儀，在45KV、35mA的工作條件下收集的。兩數(shù)據(jù)包通過(guò)專業(yè)SMART和SAINT軟件還原，及SADABS軟件的經(jīng)驗(yàn)吸收矯正后，采用直接法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，利用SHELXTL軟件包的全矩陣最小二乘法精修，并對(duì)所有非氫原子做各向異性修正。最終的晶體學(xué)數(shù)據(jù)及所涉及的精修參數(shù)列于表1和表2。

主要抗體

實(shí)施例1

配合物14的配體I′a和配合物15的配體I′b的合成

參照本課題組已建立的實(shí)驗(yàn)方法(中國(guó)專利ZL201410459107.2)，合成配體I′a、I′b，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，數(shù)據(jù)如下：

(Z)-N′-(5-氟-1-(2-嗎啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亞基)肼基二硫代甲酸甲酯(配體I′a)

產(chǎn)率:52％,黃色固體,mp 183-185℃.¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:2.52(br s,4H,morpholine-H),2.63(t,J＝6.6Hz,2H,morpholine-CH₂),2.68(s,3H,SCH₃),3.66(t,J＝4.2Hz,4H,morpholine-H),3.87(t,J＝6.6Hz,2H,indolin-2-one-CH₂),6.85(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H,indolin-2-one 7-H),7.10(td,J＝9.0,3.0Hz,1H,indolin-2-one 6-H),7.42(dd,J＝7.2,3.0Hz,1H,indolin-2-one 4-H),13.80(s,1H,NH).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ:17.73,37.33,53.66(2C),55.34,66.85(2C),108.93(d,J＝25.7Hz),110.13(d,J＝8.0Hz),117.78(d,J＝24.3Hz),120.92(d,J＝8.9Hz),132.07,139.31(d,J＝1.4Hz),159.39(d,J＝241.2Hz),160.76,202.47.UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:251,397.ESI-HRMS m/z:C₁₆H₂₀FN₄O₂S₂([M+H]⁺)計(jì)算值:383.1012；實(shí)測(cè)值:383.1007。

(Z)-N′-(5-甲氧基-1-(2-嗎啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亞基)肼基二硫代甲酸甲酯(配體I′b)

產(chǎn)率:34％,黃色固體,mp 147-149℃.¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:2.56(br s,4H,morpholine-H),2.65(br s,2H,morpholine-CH₂),2.68(s,3H,SCH₃),3.70(br s,4H,morpholine-H),3.84(s,3H,OCH₃),3.88(br s,2H,indolin-2-one-CH₂),6.85(br s,1H,indolin-2-one 7-H),6.94(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H,indolin-2-one 6-H),7.24(d,J＝2.4Hz,1H,indolin-2-one 4-H),13.86(s,1H,NH).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ:17.66,37.22,53.66(2C),55.37,55.95,66.87(2C),106.76,110.10,117.63,120.38,133.23,137.16,156.33,160.78,202.17.UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:250,398.ESI-HRMS m/z:C₁₇H₂₃N₄O₃S₂([M+H]⁺)計(jì)算值:395.1212；實(shí)測(cè)值:395.1206。

配合物14、15的合成

將化合物I′a或I′b(1.0mmol)溶于熱的無(wú)水乙醇(20mL)中，分批加入1,5-環(huán)辛二烯二氯化鉑(0.19g,0.5mmol)，加熱回流反應(yīng)4小時(shí)。趁熱過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，殘余物用乙醇重結(jié)晶得配合物14或15。將其分別溶于二氧六環(huán)/甲醇(4:1,v/v)的混合液中，室溫下緩慢揮發(fā)溶劑，得到用于X-射線衍射分析的單晶。配合物14、15的晶體學(xué)參數(shù)、鍵長(zhǎng)和鍵角數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。

1)配合物14

收率:64％,棕色固體,mp>300℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:2.84(s,6H,2SCH₃),2.97(m,8H,morpholine-H),3.10(m,4H,morpholine-CH₂),3.58(m,8H,morpholine-H),3.88(m,4H,indolin-2-one-CH₂),7.31(br s,2H,indolin-2-one 4-H),7.55(td,J＝8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 6-H),7.42(dd,J＝8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 7-H).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:18.89(2C),40.36(2C),51.58(4C),56.38(2C),63.62(4C),111.61(d,J＝7.6Hz,2C),116.40(d,J＝27.3Hz,2C),119.96(d,J＝9.8Hz,2C),121.61(d,J＝19.8Hz,2C),139.73(2C),149.49(d,J＝3.2Hz,2C),158.44(d,J＝237.75Hz,2C),162.33(2C),192.15(2C).UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:266,395,508.ESI-HRMS m/z:C₃₂H₃₇F₂N₈O₄S₄Pt([M+H]⁺)計(jì)算值:958.1436；實(shí)測(cè)值:958.1431。

2)配合物15

產(chǎn)率:77％,棕色固體,mp>300℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:2.86(s,6H,2SCH₃),2.91(m,8H,morpholine-H),3.01(m,4H,morpholine-CH₂),3.63(m,8H,morpholine-H),3.82(s,6H,2OCH₃),3.90(m,4H,indolin-2-one-CH₂),7.22(d,J＝8.4Hz,2H,indolin-2-one 7-H),7.25(dd,J＝8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 6-H),7.94(d,J＝2.4Hz,2H,indolin-2-one 4-H).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:19.07(2C),40.40(2C),51.52(4C),52.40(2C),56.19(2C),63.56(4C),111.23(2C),114.72(2C),119.93(2C),121.38(2C),137.40(2C),150.32(2C),155.81(2C),162.25(2C),190.83(2C).UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:274,392,509.ESI-HRMS m/z:C₃₄H₄₃N₈O₆S₄Pt([M+H]⁺)計(jì)算值:982.1836；實(shí)測(cè)值:982.1831。

表1.配合物14和15的晶體學(xué)數(shù)據(jù)及精修參數(shù)

^a R₁＝Σ||Fo|–|Fc||/Σ|Fo|.^bwR₂＝{Σ[w(Fo²–Fc²)²]/Σ[w(Fo²)²]}^1/2.

表2.配合物14和15的鍵長(zhǎng)和鍵角數(shù)據(jù)

實(shí)施例2

本申請(qǐng)的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的鉑配合物的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

配合物14、15的抗增殖活性

采用MTS比色法，測(cè)試了配合物14、15及其相應(yīng)配體I′a、I′b對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116和人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株的抗增殖活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可看出，鉑配合物14、15、配體I′a、I′b對(duì)所測(cè)的三種細(xì)胞系均表現(xiàn)出一定的抗增殖活性。與配體I′a、I′b相比，配合物14、15具有更強(qiáng)的活性，尤其配合物14的活性是相應(yīng)配體I′a的的8倍，表明與Pt(II)配位導(dǎo)致抗增殖活性顯著增強(qiáng)。此外，配合物14、15對(duì)測(cè)試的三種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性明顯優(yōu)于臨床抗癌藥物順鉑(cDDP)。

表3.化合物I′a、I′b和14、15對(duì)HCT-116、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的抗增殖活性

配合物14、15和配體I′a、I′b對(duì)細(xì)胞周期的影響

順鉑(cis-diaminedichloroplatinum(II),cDDP)在惡性腫瘤治療中具有良好的療效，它主要通過(guò)作用于含氮堿基與DNA雙鏈形成鏈內(nèi)交聯(lián)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。考慮到HCT-116和MCF-7比MDA-MB-231細(xì)胞系對(duì)測(cè)試化合物更敏感，但MCF-7細(xì)胞黏連生長(zhǎng)不易吹打成單個(gè)細(xì)胞，因此，本申請(qǐng)的發(fā)明人選用了HCT-116細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)考察了配合物14、15及其配體I′a、I′b對(duì)HCT-116細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。在IC₅₀的濃度下處理HCT-116細(xì)胞24h，與陽(yáng)性對(duì)照順鉑類(lèi)似，經(jīng)配合物14、15處理之后也觀察了到明顯的sub-G1峰，而配體的sub-G1信號(hào)非常弱。與另一陽(yáng)性對(duì)照Taxol處理得到的結(jié)果類(lèi)似，經(jīng)配體I′a、I′b處理24h的HCT-116細(xì)胞，其G2/M期的比例有所增加。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，配合物14、15能夠誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且與配體對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制有所不同。

配合物15和配體I′b對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本申請(qǐng)的配合物是否具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，本申請(qǐng)的發(fā)明人采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析了不同濃度的配合物15處理HCT-116細(xì)胞不同時(shí)間后，觀察多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]的裂解。發(fā)現(xiàn)，HCT-116細(xì)胞經(jīng)配合物15處理后，PARP1裂解片段隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、濃度的增加而明顯增加，處理10h后裂解的PARP1印跡非常明顯。因此，又選擇處理HCT-116細(xì)胞10h，同時(shí)觀察配合物和配體對(duì)細(xì)胞PARP1的裂解情況。發(fā)現(xiàn)經(jīng)配體I′b處理后HCT-116細(xì)胞中PARP1蛋白幾乎不受影響。PARP1的裂解片段是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本申請(qǐng)的配合物15能夠引起細(xì)胞的凋亡，而配體I′b似乎并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

配合物14導(dǎo)致細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

為了能夠更加直觀的看到細(xì)胞凋亡的整個(gè)過(guò)程，采用活細(xì)胞熒光成像技術(shù)，通過(guò)向活細(xì)胞中轉(zhuǎn)入能夠表達(dá)熒光蛋白的基因，讓其在細(xì)胞中表達(dá)，即可通過(guò)熒光顯微系統(tǒng)觀察到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。讓帶熒光標(biāo)記的微管蛋白(α-tubulin)和組蛋白(H2A)在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)，能夠直觀的看到微管(紅色)和細(xì)胞核(綠色)不同時(shí)間的變化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，在IC₅₀的濃度下，經(jīng)配合物14處理后，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮，染色質(zhì)最后凝聚在一起，表明配合物14能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

配合物14、15和配體I′a、I′b與DNA的相互作用

溴化乙啶(ethidium bromide,EB)常作為探針用于檢測(cè)DNA的結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于小分子與DNA的作用研究和抗腫瘤藥物的篩選。EB在溶液中的熒光強(qiáng)度較弱，但當(dāng)它專一性的嵌入DNA的堿基對(duì)之間后熒光強(qiáng)度大大增加。當(dāng)DNA分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，結(jié)合到堿基對(duì)之間的EB又會(huì)游離出來(lái)，發(fā)生熒光淬滅。當(dāng)藥物分子與DNA發(fā)生作用時(shí)，通過(guò)體系中檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化即可辨別藥物與DNA是否發(fā)生作用。

為了探討配合物是否與順鉑一樣通過(guò)作用于DNA而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)EB探針?lè)肿痈?jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)配合物14、15及其配體I′a、I′b與DNA結(jié)合能力。結(jié)果表明增加配合物的濃度，熒光強(qiáng)度明顯降低，熒光淬滅，表示配合物的確能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DNA。

配合物的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)中所涉及到的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

常用試劑的配制、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTS assay)、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)方法，參見(jiàn)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)(Ding,P.P.；Gao,M.；Mao,B.B.；Cao,S.L.；Liu,C.H.；Yang,C.R.；Li,Z.F.；Liao,J.；Zhao,H.；Li,Z.；Li,J.；Wang,H.；Xu X.Synthesis and biological evaluation of quinazolin-4(3H)-one derivatives bearing dithiocarbamate side chain at C2-position as potential antitumor agents.Eur.J.Med.Chem.2016,108,364-373)。

細(xì)胞周期(Cell cycle profiles)

⑴流式分析前的細(xì)胞處理與固定：將細(xì)胞按合適濃度接種于六孔盤(pán)中，待細(xì)胞貼壁后給藥，根據(jù)不同需要及化合物的性質(zhì)處理不同時(shí)間。

⑵加藥處理完畢后，將細(xì)胞收集于離心管中離心(4℃，1000g，離心1min，翻轉(zhuǎn)EP管再離心一次)，棄上清液，加1mL PBS吹打重懸細(xì)胞，按上述方法離心棄上清液。

⑶固定細(xì)胞：加300μL置于冷浴中的PBS重懸細(xì)胞，再加等量無(wú)水乙醇充分混勻，冰浴片刻。重復(fù)加入300μL乙醇兩次，使乙醇的終濃度為75％。冰浴30min后置于4℃層析柜保存，可保存兩周。

⑷將固定好的細(xì)胞在4℃,1000g，離心2min，棄上清液，涼置樣品，使乙醇盡可能的揮干。

⑸用1mL 0.1％PBST洗兩次，用l×的PBS緩沖液稀釋RNase A(10mg/mL,l:100)和PI(2mg/mL,1:200)，每個(gè)樣品加400μL RNase A和PI染色劑染色；

⑹37℃水浴30min，每隔10分鐘搖動(dòng)樣品管，使沉淀的細(xì)胞懸浮，使其與PI充分接觸。

⑺流式檢測(cè)樣品，測(cè)樣前注意避光保存。上樣前用500目的篩過(guò)濾到EP管中，過(guò)濾時(shí)頂住篩一次性吹出去。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

⑴將待檢測(cè)的細(xì)胞系按合適的濃度(根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明說(shuō)計(jì)數(shù))接種在6孔盤(pán)中，培養(yǎng)過(guò)夜。

⑵準(zhǔn)備混合液：37℃預(yù)熱三無(wú)培養(yǎng)基(無(wú)血清和抗生素)，然后取三無(wú)培養(yǎng)基97μL，轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6 3μL混合均勻，室溫靜置10min。

⑶將帶有熒光蛋白基因的質(zhì)粒(1μg)加入另一EP管中，10min后，將準(zhǔn)備好的混合液加入已放入質(zhì)粒的新EP管中，混合均勻，室溫靜置15min。

⑷除去6孔盤(pán)細(xì)胞中的舊培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞一遍，加入新鮮的完全培養(yǎng)基(2mL每孔)。15min后，將靜置好的混合液加入到相應(yīng)的6孔盤(pán)，充分搖勻。

⑸將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于37℃、CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24-48h后，熒光顯微鏡觀察下觀察熒光蛋白表達(dá)并拍照。