4H-[1]-苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢測(cè)法 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢測(cè)技術(shù)，具體地說是4H-[1]-苯并吡喃[4， 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢測(cè)法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)糖基化修飾在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有至關(guān)重要的作用，作為最主要和普遍 的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，目前已知哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)中至少有二分之一發(fā)生了糖基化，這 些糖蛋白廣泛分布于組織、細(xì)胞、體液中，特別是在細(xì)胞膜表面、體液等中含量豐富，糖基化 對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸和定位等都起著重要作用，并參與受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞載附 等諸多重要的生物過程。糖蛋白數(shù)量變化或糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。不但 目前已知的很多疾病的診斷標(biāo)志物是糖蛋白，而且通過國際標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的藥物中，糖蛋白也 占到較1?的比例。
[0003] 分離純化及鑒定是糖蛋白研究的重要步驟，是下一步結(jié)構(gòu)分析得以實(shí)施的基礎(chǔ)。 目前凝膠上蛋白質(zhì)染色主要分為預(yù)染及后染兩類。前者在電泳前對(duì)樣品進(jìn)行處理，使染料 特異性地與樣品內(nèi)糖蛋白相結(jié)合，經(jīng)電泳分離之后即可在相應(yīng)激發(fā)波長下進(jìn)行觀察，后染 主要對(duì)電泳后的蛋白凝膠進(jìn)行特異性染色。
[0004] 目前糖蛋白檢測(cè)領(lǐng)域試劑盒主要集中于后染，且多數(shù)產(chǎn)品均以高附加值的價(jià)格在 市場(chǎng)銷售，價(jià)格高昂，不利于生物技術(shù)基礎(chǔ)研究的發(fā)展。尤其國內(nèi)利用現(xiàn)有的生物試劑進(jìn)行 生物實(shí)驗(yàn)成本居高不下，無法實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與實(shí)驗(yàn)共同發(fā)展。糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢測(cè) 技術(shù)鮮有報(bào)道。本發(fā)明開發(fā)的4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物熒 光預(yù)染檢測(cè)方法靈敏度接近Pro-Q Emerald488染色法，是一種靈敏、便捷、特異的糖蛋白熒 光預(yù)染檢測(cè)技術(shù)，有較好的基礎(chǔ)與臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供4H-[1]_苯并吡喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物 在糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的4H-[1]_苯并吡喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼相關(guān)化合物是指以 4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼陰離子為母核的鈉鹽、鉀鹽和銨鹽等。
[0007] 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼母核為：
[0008]
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了應(yīng)用4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻 吩-2-甲酸酰肼進(jìn)行糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢測(cè)的方法包括如下步驟：
[0010] 1)在l-20yL含0.5-10yg蛋白樣品（不足l-20yL用重蒸水補(bǔ)足）中加入 0. 005-0. 05M高碘酸水溶液1-20 μ L，置于避光處進(jìn)行氧化反應(yīng)5-30min ;優(yōu)選的樣品體積 為10 μ L，優(yōu)選的高碘酸摩爾濃為0. 03M，體積為10 μ L，優(yōu)選的反應(yīng)時(shí)間是IOmin ;
[0011] 2)在反應(yīng)液中加入0. 1-0. 3Μ抗壞血酸l-ΙΟμ L，搖勻反應(yīng)0. 5-5min ;優(yōu)選的抗壞 血酸摩爾濃度是〇. 24M，體積為5 μ L，優(yōu)選的反應(yīng)時(shí)間是Imin ;
[0012] 3)在反應(yīng)液中加入4Η-[1]_苯并批喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物按重 量體積比1-5%二甲基亞砜溶液1-5以1^，371：環(huán)境下反應(yīng)1〇-5〇1^11 ;優(yōu)選的4!1-[1]-苯并 吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物溶液為含重量體積是2%，體積為2. 5 μ L，優(yōu)選 的反應(yīng)時(shí)間是30min ;
[0013] 4)在反應(yīng)液中加入10-50 μ L3X蛋白質(zhì)上樣緩沖液，搖勻；優(yōu)選的體積為30 μ L ;
[0014] 5)電泳，觀察。
[0015] 前期研究表明該技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1)靈敏度高：4Η-[1]-苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特異性熒光預(yù) 染檢測(cè)法靈敏度同Pro-Q Emerald488靈敏度相當(dāng)；
[0017] 2)操作簡(jiǎn)單迅速：省去后染必需的固定等操作步驟，可在40min內(nèi)完成；電泳結(jié)束 后即可觀察；
[0018] 3)重現(xiàn)性好：受溫度、搖床擺動(dòng)頻率等外部條件影響較?。?br>[0019] 4)可逆性好：容易脫色；
[0020] 5)質(zhì)譜兼容性好：由于4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼熒光預(yù)染檢 測(cè)法不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，所以可與MALDI-T0F等質(zhì)譜儀高度兼容；
[0021] 6)使用安全：采用毒性低的染料，提高實(shí)驗(yàn)操作的安全性，對(duì)環(huán)境污染小；
[0022] 7)成本低。
【附圖說明】
[0023] 圖I. 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化學(xué)結(jié)構(gòu)；
[0024] 圖2中（A-D)為在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對(duì)Sigma公司的八種不同標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)樣品選擇性及靈敏度比較。（A)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒 光預(yù)染檢測(cè)法，（B)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè)法檢 測(cè)后用SYPRORuby全蛋白熒光染色法檢測(cè)，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測(cè)。帶1，1000 ng;帶2， 500ng ;帶 3,250ng ;帶 4,125ng ;帶 5,64ng ;帶 6,32ng ;帶 7,16ng ;帶 8,8ng ;帶 9,4ng ;帶 10, 2ng。Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法、SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法均按照文獻(xiàn)記 載操作；圖中名稱用斜體字表示為糖基化蛋白質(zhì)。
[0025] (E-H)在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對(duì)提取的人血清樣品選擇性及靈敏 度比較。（E)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè)法， (F)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè)法檢測(cè)后用SYPRO Ruby全蛋白突光染色法檢測(cè)，（G)Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，（H)Pro-Q Emerald糖 蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測(cè)。帶l，5000ng;帶2,2500ng;帶 3,1250ng ;帶 4,625ng ;帶 5, 320ng ;帶 6,160ng ;帶 7,80ng ;帶 8,40ng ;帶 9, 20ng ;帶 10, 10ng。Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法、SYPRO Ruby全蛋白突光染色法均按照文獻(xiàn)記載 操作。
[0026] 圖3.二向SDS-PAGE膠上，（A) 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋 白熒光預(yù)染檢測(cè)法，（B)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè) 法檢測(cè)后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測(cè)。分離樣品為人血清總蛋白；IPG膠條長13 厘米，PH4-7 ;分離膠的濃度為11. 4% ;樣品上樣量為25 μ g/膠條。
[0027] 圖4.比較在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對(duì)去糖基化樣品選擇性，樣品為用 PNGaseF去除N-鏈糖后的人血清總蛋白。帶TP，人血清總蛋白；帶DP，去N-鏈糖后人血清 總蛋白；Pre-S組為4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè)法， Pre-S+SR組為4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè)法檢測(cè) 后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測(cè)，Pro-Q組為Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法， Pro-Q+SR組為Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測(cè)。
[0028] 圖5.在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對(duì)富集后糖基化蛋白選擇性比較，樣品為 使用糖基化富集試劑盒從人血清總蛋白中富集出的糖蛋白。帶TP，未富集的人血清總蛋 白；帶Con A Enriched Glycoproteins,使用糖基化富集試劑盒從人血清總蛋白中富集出 的糖蛋白；SR組為SYPRO Ruby全蛋白熒光檢測(cè)法，Pre-S組為4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b] 噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè)法，Pre-S+SR組為4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻 吩-2-甲酸酰肼糖蛋白熒光預(yù)染檢測(cè)法檢測(cè)后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測(cè)， Pro-Q組為Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，Pr〇-Q+SR組為Pro-Q Emerald糖蛋白突光 染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030] 實(shí)施例1 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢 測(cè)法
[0031] 圖1是4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0032] 圖2-5是4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特異性熒光預(yù)染檢 測(cè)法數(shù)據(jù)圖。
[0033] 實(shí)驗(yàn)采用下述步驟進(jìn)行：
[0034] 1)在10 μ L含0· 5-10 μ g蛋白樣品（不足10 μ L用重蒸水補(bǔ)足）中加入0· 03M高 碘酸水溶液10 μ L，置于避光處進(jìn)行氧化反應(yīng)10min ;
[0035] 2)在反應(yīng)液中加入0. 24M抗壞血酸5 μ L，搖勻反應(yīng)Imin ;
[0036] 3)在反應(yīng)液中加入2% 4Η-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物 2.5以1^，371：環(huán)境下反應(yīng)3〇1^11;
[0037] 4)在反應(yīng)液中加入30 μ L3X上樣緩沖