用PCR技術(shù)，以表達(dá)載體palI/pET_24a(+)為 模板。
[0035] 引入N577K定點(diǎn)突變的突變引物為（分別為SEQIDN0. 3、SEQIDN0. 4):
[0036] N577K-F :5' -CAGCAATAGCAAAAAAGTGGTGAAAAAGAAT-3'
[0037] N577K-R :5' -ATTCTTTTTCACCACTTTTTTGCTATTGCTG-3'
[0038] 引入S57?定點(diǎn)突變的突變引物為（分別為SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6):
[0039] S575D-F :5, -ATTATTGACAGCAATGATAAAAACGTGGTGAAA-3'
[0040] S575D-R :5' -TTTCACCACGTTTTTATCATTGCTGTCAATAAT-3'
[0041]引入K174D定點(diǎn)突變的突變引物為（分別為SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8):
[0042] K174D-F :5' -TTTTGGAAGGACGCAGATGAGGGCCAAGCGCCG-3'
[0043] K174D-R : 5 ' -CGGCGCTTGGCCCTCATCTGCGTCCTTCCAAAA-3 '
[0044] 引入E175N定點(diǎn)突變的突變引物為（分別為SEQ ID N0.9、SEQ ID NO. 10):
[0045] E175N-F : 5，-TGGAAGGACGCAAAAAATGGCCAAGCGCCGAAT-3，
[0046] E175N-R :5' -ATTCGGCGCTTGGCCATTTTTTGCGTCCTTCCA-3'
[0047] 引入G176D定點(diǎn)突變的突變引物為（分別為SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12):
[0048] G176D-F :5, -AAGGACGCAAAAGAGGATCAAGCGCCGAATAAC-3，
[0049] G176D-R : 5 ' -GTTATTCGGCGCTTGATCCTCTTTTGCGTC-3 '
[0050] PCR擴(kuò)增程序設(shè)定為：首先，94°C預(yù)變性5min;然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)：98°C變性10s， 55°C退火5s，72°C延伸7minl0s ;最后72°C延伸10min，4°C保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝 膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
[0051] PCR產(chǎn)物純化后，加入DPn I，37°C，水浴2h，降解模板，之后轉(zhuǎn)化E. coli JM109,挑 取陽性克隆，LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10h，保甘油管，送去測(cè)序。測(cè)序正確的突變體，從甘油管 接種至LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì) 胞，得到能夠表達(dá)突變體N577K、S575D、K174D、E175N和G176D的五種重組菌株。
[0052] 將它們和天然的蔗糖異構(gòu)酶分別置于45°C、pH 6. 0下保溫20min后，計(jì)算殘留的 酶活力。如圖2所示，野生的蔗糖異構(gòu)酶酶活殘留率為66. 2%，而E175N、K174D、G176D、 S57?和N577K五種突變體的酶活殘留率則分別為79. 0 %、36. 2 %、43. 3 %、66. 6 %和 63. 8%。這個(gè)結(jié)果證明了，與野生的蔗糖異構(gòu)酶相比，突變體E175N的熱穩(wěn)定性得到增強(qiáng)。
[0053] 此外，發(fā)明人在單突變基礎(chǔ)上進(jìn)一步成功的構(gòu)建了雙突變體E175N/K576D。
[0054] 引入E175N/K576D定點(diǎn)突變的突變引物為（分別為SEQ ID NO. 13、SEQ ID N0. 14) (以突變體K576D的表達(dá)載體palI/pET-24a(+)):
[0055] E175N-F : 5，-TGGAAGGACGCAAAAAATGGCCAAGCGCCGAAT-3，
[0056] E175N-R :5' -ATTCGGCGCTTGGCCATTTTTTGCGTCCTTCCA-3'
[0057] PCR擴(kuò)增程序和轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)等操作如上所述。同樣將雙突變體置于 45°C、pH 6. 0下保溫20min后，E175N/K576D的酶活殘留率達(dá)到了 97. 3% (圖2)，雙突變體 的熱穩(wěn)定性比天然酶有了更大的提高。
[0058] 兩種突變體分別命名為E175N和E175N/K576D。
[0059] (2)天然蔗糖異構(gòu)酶和兩種定點(diǎn)突變體的表達(dá)與純化：
[0060] 挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)的陽性單克隆于LB液體培養(yǎng)基（含 30 y g/mL卡那霉素）生長(zhǎng)8~10h，按5 %接種量將種子發(fā)酵液接到TB液體培養(yǎng)基（含 30yg/mL卡那霉素）；大腸桿菌在37°C搖床培養(yǎng)2h，至0D6(KI= 1.2左右，兩種突變體E175N 和E175N/K576D均加入0. 05mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā) 酵24h后，將發(fā)酵液于4°C、8000g離心15min除菌體，收集離心發(fā)酵上清液。在磁力攪拌 子低速攪拌下，向突變體發(fā)酵上清液中緩慢加入60% (NH4)2S04,4°C放置鹽析過夜。4°C、 10000g離心20min，收集沉淀。用50mmol/L pH 5. 3檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液復(fù)溶沉淀 后，在50mmol/L pH 5. 3檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中透析過夜，期間更換2-3次透析緩沖 液，通過0. 22 ym膜過濾后制成上樣樣品。采用AKTA avant蛋白純化儀進(jìn)行重組蛋白的 純化，整個(gè)純化過程溫度控制為4°C。陽離子交換色譜純化步驟：（1)平衡：用5倍體積的 50mmol/L pH 5. 3檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液平衡強(qiáng)陽離子交換色譜柱；（2)上樣：預(yù)先處 理好的樣品以lmL/min的流速上樣；（3)洗脫：包括洗脫未吸附物質(zhì)、雜蛋白和目的蛋白，流 速1. OmL/min，洗脫液為含有1M NaCl的50mmol/L pH 5. 3的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液， 進(jìn)行線性洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分批收集含蔗糖異構(gòu)酶酶活的洗脫液；洗脫過程只出 現(xiàn)一個(gè)目的蛋白洗脫峰，后續(xù)測(cè)酶活及SDS-PAGE蛋白電泳發(fā)現(xiàn)，無論是野生型，還是突變 體，峰頂收集的酶液為最純的部分。如圖3所示。
[0061]表1具有較高B因子的氨基酸殘基
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蔗糖異構(gòu)酶突變體，其特征在于，所述突變體包括在氨基酸序列如SEQIDNO.I 的基礎(chǔ)上，將第175位置的谷氨酸突變成天冬酰胺。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體還包括同時(shí)將第576位的賴 氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br>3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變體，其特征在于，所述氨基酸序列由SEQIDNO. 2所 示的核苷酸序列編碼。
4. 一種制備權(quán)利要求1-2任一所述突變體的方法，包括如下步驟： 1) 對(duì)鹿糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確定B因子較高的氨基酸，并結(jié)合Rosetta Design軟件分析確定突變成何種氨基酸可以降低B因子； 2) 設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變所用引物，以攜帶蔗糖異構(gòu)酶編碼基因的載體為模板進(jìn)行突變并構(gòu)建 兩種突變體的質(zhì)粒載體； 3) 將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞； 4) 挑選陽性克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，純化獲得蔗糖異構(gòu)酶突變體。
5. 含有權(quán)利要求1或2所述突變體的氨基酸序列的重組質(zhì)粒載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒載體，其特征在于，所述質(zhì)粒載體是pET系列、pGEX系 列、pPICZ系列、或pAN系列、或pUB中的任意一種。
7. 表達(dá)權(quán)利要求1或2所述突變體的細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是細(xì)菌、酵母或者真菌。
9. 權(quán)利要求1或2所述突變體在生產(chǎn)異麥芽酮糖或海藻酮糖或異麥芽酮糖醇方面的應(yīng) 用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將突變體用于催化蔗糖制備 異麥芽酮糖，轉(zhuǎn)化條件為pH6. 0、30°C、加酶量20U/g、底物濃度400g/L、轉(zhuǎn)化8h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性和催化效率提高的蔗糖異構(gòu)酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過對(duì)蔗糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)中B因子較高的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，即將蔗糖異構(gòu)酶175位置處的E突變成N，同時(shí)進(jìn)一步在突變體K576D的基礎(chǔ)上將175位置處的E也突變成N，得到了兩種熱穩(wěn)定性及催化效率均得到提高的蔗糖異構(gòu)酶突變體。本發(fā)明突變體E175N和E175N/K576D在45℃的半衰期比天然蔗糖異構(gòu)酶分別提高了130％、665％，催化效率Kcat/Km分別提高了38％和19％，催化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖時(shí)，突變體的異麥芽酮糖最大轉(zhuǎn)化率分別比天然酶提高了1.8％和1.6％。本發(fā)明得到的兩種突變體比天然蔗糖異構(gòu)酶更適用于在工業(yè)上的應(yīng)用。
【IPC分類】C12P7-26, C12P19-12, C12N1-15, C12N15-63, C12N9-90, C12N1-21, C12N1-19
【公開號(hào)】CN104762286
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510146238
【發(fā)明人】吳敬, 段緒果, 程勝
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年3月30日