專(zhuān)利名稱(chēng)：一種脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微流控通道反應(yīng)器中脂肪酶催化在線可控選擇性合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，屬于微流控技術(shù)與生物催化選擇性合成蔗糖酯等非離子型表面活性劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微流控學(xué)(Microfluidics)是在微米級(jí)結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體的技術(shù)與科學(xué)，是近十年來(lái)迅速崛起的新交叉學(xué)科。當(dāng)前，微流控學(xué)的發(fā)展已大大超越了原來(lái)的主要為分析化學(xué)服務(wù)的目的，而正在成為整個(gè)化學(xué)學(xué)科、生命科學(xué)、儀器科學(xué)乃至信息科學(xué)新一輪創(chuàng)新研究的重要技術(shù)平臺(tái)。自1997年Harrison課題組發(fā)表了首篇在微流控芯片微反應(yīng)器中合成化合物的文獻(xiàn)后，微流控芯片反應(yīng)器已成功地用于多種有機(jī)合成反應(yīng)，并展示了廣泛的應(yīng)用前景。隨著微流控芯片中微混合、微反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展，在芯片中進(jìn)行合成反應(yīng)已經(jīng)成為微流控芯片領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。同常規(guī)化學(xué)反應(yīng)器相比，微通道反應(yīng)器不僅具有使反應(yīng)物間的擴(kuò)散距離大大縮短，而且傳質(zhì)速度快；反應(yīng)物配比 、溫度、反應(yīng)時(shí)間和流速等反應(yīng)條件容易控制，副反應(yīng)較少；需要反應(yīng)物用量甚微，不但能減少昂貴、有毒、有害反應(yīng)物的用量，反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的環(huán)境污染物也極少，是一種環(huán)境友好、合成研究新物質(zhì)的技術(shù)。蔗糖脂肪酸酯作為一種蔗糖衍生物，是一種性能優(yōu)良的安全、無(wú)毒、無(wú)異味、無(wú)污染、對(duì)人體無(wú)任何副作用無(wú)刺激、穩(wěn)定性好、可完全生物降解的多元醇型非離子表面活性劑。它能有效地降低水的表面張力，在潤(rùn)濕力、分散力、增溶性、發(fā)泡力、乳化力、去污力等方面具有優(yōu)良的性能。同時(shí)，還具有殺蟲(chóng)抑菌性能。因此，它的適應(yīng)性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣。目前已被廣泛地用于食品工業(yè)、日用化工、醫(yī)藥工業(yè)、紡織、農(nóng)牧等領(lǐng)域，特別是用作食品工業(yè)中的乳化劑、分散劑、起泡劑、潤(rùn)濕劑和清潔劑；日用化工中的化妝品、洗滌劑等。蔗糖酯一般為白色粉狀、塊狀或蠟狀固體，有時(shí)也以無(wú)色或微黃色粘稠狀或樹(shù)脂狀液體形式存在，無(wú)毒、不刺激皮膚與粘膜。食入人體內(nèi)，可水解為可食用脂肪酸和蔗糖，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，參與人體的新陳代謝，具有乳化、分散、潤(rùn)濕、起泡、粘度調(diào)節(jié)、防止老化和防止晶析等性能，易溶于乙醇、丙醇、氯仿、丙二醇等有機(jī)溶劑中，無(wú)明顯熔點(diǎn)，在50°C以上即開(kāi)始熔化，在溫水中分散或溶解，在冷水中的溶解度較小，在弱酸弱堿下穩(wěn)定，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿下易發(fā)生水解。至今蔗糖酯的合成有溶劑法、微乳化法、水溶劑法、酶法和無(wú)溶劑法等。但現(xiàn)有方法存在著或多或少的缺陷。微乳化法和水溶劑法都需大量的皂作乳化劑，產(chǎn)品精制困難，色澤較深，而且水溶劑法還有產(chǎn)率低的缺點(diǎn)。無(wú)溶劑法雖然反應(yīng)時(shí)間短，不使用任何溶劑，符合綠色化學(xué)的發(fā)展要求，但是由于無(wú)溶劑法合成的脂肪酸酯的轉(zhuǎn)化率低，蔗糖酯的單酯含量低，產(chǎn)品成本高，限制了它們的應(yīng)用。溶劑法由于溶劑DMSO、DMF等易燃、有毒，產(chǎn)品純化較難，因此不宜應(yīng)用于食品級(jí)蔗糖酯的生產(chǎn)。因此開(kāi)發(fā)高效的蔗糖酯的合成方法具有十分重要的實(shí)際意義。目前，有較多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)有機(jī)介質(zhì)中蔗糖酯的酶催化合成進(jìn)行了研究，先后報(bào)道了叔丁醇體系以及叔丁醇與DMSO混合溶劑體系(4: I)中脂肪酶催化多種二糖的酯化。與傳統(tǒng)的溶劑法相比，混合溶劑體系采用無(wú)毒的或毒性較小的叔戊醇作為反應(yīng)介質(zhì)，大大減少了有毒溶劑的使用，適用于開(kāi)發(fā)各種具有應(yīng)用價(jià)值的蔗糖酯產(chǎn)品。但是該方法往往需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間(24h)，且反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率與選擇性不高，后續(xù)分離困難。因此我們研究了微流控通道反應(yīng)器中脂肪酶催化選擇性合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種微流控通道反應(yīng)器中脂肪酶催化選擇性合成蔗糖-6-月桂酸酯的新工藝，具有反應(yīng)時(shí)間短、選擇性高及產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，所述方法采用微流控通道反應(yīng)器，所述的微流控通道反應(yīng)器包括注射泵、注射器、反應(yīng)通道和產(chǎn)物收集器，所述注射器安裝于注射泵中，通過(guò)一個(gè)接口與反應(yīng)通道入口連接，所述產(chǎn)物收集器通過(guò)一個(gè)接口與反應(yīng)通道出口連接，所述反應(yīng)通道內(nèi)徑為0.8 2.4mm,反應(yīng)通道長(zhǎng)為0.5 1.0m ;所述方法包括:以摩爾比為1: 8-12的鹿糖與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5-1.0g脂肪酶LipozymeTLIM為催化劑，以叔戊醇和二甲亞砜(DMSO)的混合溶劑為反應(yīng)溶劑，將原料和反應(yīng)溶劑置于注射器中，將脂肪酶Lipozyme TLIM均勻填充在反應(yīng)通道中，在注射泵推動(dòng)下使原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道中進(jìn)行?；磻?yīng)，控制?；磻?yīng)溫度為40-55°C，?；磻?yīng)時(shí)間為20-35min，通過(guò)產(chǎn)物 收集器在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)后處理得到蔗糖_6_月桂酸酯。本發(fā)明采用的微流控通道反應(yīng)器中，所述注射器數(shù)目可以是一個(gè)或多個(gè)，視具體反應(yīng)需求而定。比如，當(dāng)使用兩個(gè)注射器時(shí)，可采用T型或Y型接口使不同的反應(yīng)物從兩個(gè)入口引入，匯流進(jìn)入公共的反應(yīng)通道，通過(guò)微通道的中反應(yīng)物分子接觸與碰撞幾率增大，使兩股反應(yīng)液流在公共的反應(yīng)通道中混合并進(jìn)行反應(yīng)。所述的微流控通道反應(yīng)器還包括恒溫箱，所述的反應(yīng)通道置于恒溫箱中，以此可以有效控制反應(yīng)溫度。所述的恒溫箱可以根據(jù)反應(yīng)溫度要求自行選擇，比如水浴恒溫箱等。本發(fā)明對(duì)于反應(yīng)通道的材質(zhì)不限，推薦使用綠色、環(huán)保的材質(zhì)，如硅膠管；對(duì)于反應(yīng)通道的形狀最好為曲線形，可以保證反應(yīng)液勻速穩(wěn)定的通過(guò)。本發(fā)明在實(shí)施過(guò)程中，可先用叔戊醇和DMSO的混合溶劑(叔戊醇:DMS0 = 4: I)溶解蔗糖，其用量只要保證蔗糖能充分溶解即可，并裝于注射器中備用；僅用無(wú)毒的叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝于另一注射器中備用；然后在注射泵(例如PHD2000注射泵)推動(dòng)下使反應(yīng)原料按比例混合通入反應(yīng)通道中進(jìn)行反應(yīng)。因此，本發(fā)明相比于常規(guī)的搖床反應(yīng)，可以將有毒的DMSO的使用量降至最低。本發(fā)明中，所述的脂肪酶Lipozyme TLIM使用諾維信(novozymes)公司生產(chǎn)的商品，其是一種由微生物制備的、1，3位置專(zhuān)用、食品級(jí)脂肪酶(EC3.1.1.3)在顆粒硅膠上的制劑。它是從Thermomyces Ianuginosus得到的、用一種基因改性米曲霉(Aspergillusoryzae)微生物經(jīng)過(guò)深層發(fā)酵生產(chǎn)的。進(jìn)一步，所述蔗糖與月桂酸乙烯酯的摩爾比優(yōu)選為1: 9 11，最優(yōu)選為1: 11。
進(jìn)一步，所述酰化反應(yīng)溫度優(yōu)選為50 55°C，最優(yōu)選為52 °C。進(jìn)一步，所述?；磻?yīng)時(shí)間優(yōu)選為25 30min，最優(yōu)選為30min。本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物可以在線收集，所得反應(yīng)液可以通過(guò)常規(guī)后處理方法即可獲得蔗糖-6-月桂酸酯。所述常規(guī)后處理方法可以是:所得反應(yīng)液減壓蒸餾除去溶劑，用200-300目硅膠濕法裝柱，洗脫試劑為氯仿:甲醇=10: 1，樣品用少量洗脫試劑溶解后濕法上柱，收集洗脫液，同時(shí)TLC跟蹤洗脫進(jìn)程，將得到的含有單一產(chǎn)物的洗脫液合并蒸干，可以得到白色的單酯晶體，即為蔗糖-6-月桂酸酯。本發(fā)明中，雖然蔗糖中有8個(gè)性能相近的羥基，但在微流控微通道反應(yīng)器中脂肪酶催化選擇性合成蔗糖-6-月桂酸酯具有較高的轉(zhuǎn)化率和選擇性，二酯的轉(zhuǎn)化率很低，幾乎沒(méi)有，通過(guò)柱層析分離得到的單酯的含量可達(dá)98%。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR確證。這表明微流控微通道反應(yīng)器中蔗糖-6-月桂酸酯的酶促選擇性合成具有很好的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及選擇性，能實(shí)現(xiàn)高的單酯化率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明微流控通道反應(yīng)器中選擇性合成蔗糖-6-月桂酸酯，該法不僅大大地縮短了反應(yīng)時(shí)間，而且具有高的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)選擇性；同時(shí)降低了 DMSO的使用量，具有環(huán)保優(yōu)勢(shì)。

圖1為實(shí)施例采用的微流控通道反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此:本發(fā)明實(shí)施例使用的微流控通道反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)參考圖1，包括一個(gè)注射泵(未顯示)、兩個(gè)注射器I和2、反應(yīng)通道3、水浴恒溫箱(5，僅顯示其平面示意圖)和產(chǎn)物收集器4 ;兩個(gè)注射器I和2安裝于注射泵中，通過(guò)一個(gè)Y型接口與反應(yīng)通道3入口連接，所述反應(yīng)通道3置于水浴恒溫箱5中，通過(guò)水浴恒溫箱5控制反應(yīng)溫度，所述的反應(yīng)通道3的內(nèi)徑
2.4mm,管長(zhǎng)lm，所述反應(yīng)通道3出口通過(guò)一接口與產(chǎn)物收集器4連接。實(shí)施例1:蔗糖-6-月桂酸酯的合成參照?qǐng)D1,將鹿糖(0.4mmol)溶解在IOmL(叔戍醇:DMSO = 4: I (v/v))的混合溶劑中，月桂酸乙烯酯(4.4mmol)溶解在IOmL叔戊醇中，然后分別裝于IOmL注射器中備用。0.87g脂肪酶Lipozyme TUM均勻填充于反應(yīng)通道中，在PHD2000注射泵推動(dòng)下，兩路反應(yīng)液分別以IOjyLmirT1的流速通過(guò)“Y”接頭進(jìn)入反應(yīng)通道中進(jìn)行?；磻?yīng)，通過(guò)水浴恒溫箱控制反應(yīng)器溫度在52°C，反應(yīng)液在反應(yīng)通道內(nèi)連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)30min，通過(guò)產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，減壓蒸餾除去溶劑，用200-300目硅膠濕法裝柱，洗脫液為氯仿:甲醇=10: 1，柱高35cm，柱直徑4.5cm，樣品用少量洗脫劑溶解后濕法上柱，洗脫液收集流速2mL/min-1,同時(shí)TLC跟蹤洗脫進(jìn)程，將得到的含有單一產(chǎn)物的洗脫液合并蒸干，可以得到白色的晶體。通過(guò)HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物選擇性，結(jié)果為:蔗糖轉(zhuǎn)化率為92%，蔗糖-6-月桂酸酯選擇性(蔗糖-6-月桂酸酯含量/生成的蔗糖酯總含量)為98%。核磁表征結(jié)果如下:
蔗糖-6-月桂酸酯:1H-NMR(DMS0-d6,δ，ppm):5.18-5.14 (m，3H，蔗糖的 2 β _0H，3 a -OH 和 4 β -OH)，5.03 (d，1H，J = 5.5Hz，蔗糖的 3 ' β -OH)，4.90 (s，1H，蔗糖的4' a -OH)，4.83-4.80 (t，1H，J = 6.5Hz，蔗糖的 5' β -OH)，4.58 (d，1H，J = 8.0Hz，蔗糖的I， β -OH)，4.41-4.39 (t，1H，J = 5.0Hz，蔗糖的 Ha -6 a )，4.24 (d，1H，J = 10.5Hz，蔗糖的氏-6 0)，4.04-3.99(111，1!1，蔗糖的!1-5 3)，3.92-3.86(111，2!1，蔗糖的!1-5' a 和Ha-P a),3.73(d，lH，J = 6.0Hz，蔗糖的 Hb-1' a )，3.60-3.47 (m，4H，蔗糖的 H_3 ' a , H_4 ' β ,Ha-6 ' β 和 Hb-6 ' β )，3.35 (m，1H，蔗糖的 H_3 β )，3.22-3.19 (m，1H，蔗糖的 H_2 β )，
3.09-3.04 (m, 1H,蔗糖的 H_4 β )，2.31-2.29 (m, 2H, a_CH2)，1.52-1.50(t，2H，J = 7.0Hz,β -CH2)，1.25 (m, 16H, n_CH2)，0.86(t，3H，J = 7.0Hz, CH3).
實(shí)施例2-5改變微流控通道反應(yīng)器的溫度，其他同實(shí)施例1，反應(yīng)結(jié)果如表I所示:表1:溫度對(duì)反應(yīng)的影響
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，其特征在于所述方法采用微流控通道反應(yīng)器，所述的微流控通道反應(yīng)器包括注射泵、注射器、反應(yīng)通道和產(chǎn)物收集器，所述注射器安裝于注射泵中，通過(guò)一個(gè)接口與反應(yīng)通道入口連接，所述產(chǎn)物收集器通過(guò)一個(gè)接口與反應(yīng)通道出口連接，所述反應(yīng)通道內(nèi)徑為0.8 2.4mm,反應(yīng)通道長(zhǎng)為0.5 1.0m ;所述方法包括:以摩爾比為1: 8-12的蔗糖與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5-1.0g脂肪酶Lipozyme TLIM為催化劑，以叔戊醇和二甲亞砜的混合溶劑為反應(yīng)溶劑，將原料和反應(yīng)溶劑置于注射器中，將脂肪酶Lipozyme TUM均勻填充在反應(yīng)通道中，在注射泵推動(dòng)下使原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道中進(jìn)行酰化反應(yīng)，控制酰化反應(yīng)溫度為40-55°C，酰化反應(yīng)時(shí)間為20-35min，通過(guò)產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)后處理得到蔗糖_6_月桂酸酯。
2.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，其特征在于:所述的方法包括下列步驟:先用體積比為4: I的叔戊醇和DMSO的混合溶劑溶解蔗糖，裝于注射器中備用；用叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝于另一注射器中備用；然后在注射泵推動(dòng)下使反應(yīng)原料按比例混合通入反應(yīng)通道中進(jìn)行反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，其特征在于:所述微流控通道反應(yīng)器包括恒溫箱，所述反應(yīng)通道置于恒溫箱中。
4.如權(quán)利要求2所述的脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，其特征在于:所述微流控通道反應(yīng)器包括恒溫箱，所述反應(yīng)通道置于恒溫箱中。
5.如權(quán)利要求1 4之一所述的脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，其特征在于:所述蔗糖與月桂酸乙烯酯的摩爾比為9 11: 1，所述?；磻?yīng)溫度為50 55°C，所述?；磻?yīng)時(shí)間為25 30min。
6.如權(quán)利要求1 4之一所述的脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，其特征在于:所述蔗糖與月桂酸 乙烯酯的摩爾比為11: 1，所述酰化反應(yīng)溫度為52°c，所述?；磻?yīng)時(shí)間為30min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種脂肪酶催化在線合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，所述方法為以摩爾比為1∶8-12的蔗糖與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5-1.0g脂肪酶Lipozyme TLIM為催化劑，以叔戊醇和DMSO的混合溶劑為反應(yīng)溶劑，將脂肪酶Lipozyme TLIM均勻填充在微流控通道反應(yīng)器的反應(yīng)通道中，所述微流控通道反應(yīng)器的管路內(nèi)徑為0.8-2.4mm，管長(zhǎng)為0.5-1.0m；在注射泵推動(dòng)下使原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道行酰化反應(yīng)，控制?；磻?yīng)溫度為40-55℃，?；磻?yīng)時(shí)間為20-35min，在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)后處理得到蔗糖-6-月桂酸酯。本發(fā)明具有反應(yīng)時(shí)間短、高選擇性及高產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12M1/00GK103184256SQ20111045737
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者杜理華, 羅錫平, 顧生妹, 張航誠(chéng), 胡玉婷 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)