一種堿性脂肪固定化堿性脂肪酶的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定化堿性脂肪酶的制作方法。
【背景技術】
[0002]脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶，可催化油脂的選擇性水解及其它酯類的轉(zhuǎn)酯、氨解反應等，是一種高效的生物催化劑，廣泛應用于生物能源、食品、制革、洗滌、醫(yī)藥和有機合成等諸多工業(yè)領域。在眾多脂肪酶中南極假絲酵母固定化脂肪酶B (以下簡稱固定化脂肪酶)的用途最為廣泛，它對非水溶性和水溶性物質(zhì)都有很強的催化活性。
[0003]全球范圍內(nèi)，脂肪酶生產(chǎn)和銷售呈每年擴張的趨勢。脂肪酶的主要供應商丹麥諾維信的產(chǎn)能已經(jīng)達到滿產(chǎn)，而在丹麥，該產(chǎn)品的產(chǎn)能擴大受到成本的限制。國內(nèi)的脂肪酶生產(chǎn)商缺乏提升產(chǎn)品品質(zhì)的能力，一直處于低價格低質(zhì)量的競爭狀態(tài)，且沒有產(chǎn)業(yè)化的固定化脂肪酶。
[0004]國際上適于生物柴油的脂肪酶產(chǎn)品主要有丹麥諾維信公司以及日本天野公司，其中諾維信公司生產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)品在整個酶法有機合成、藥物合成以及生物柴油制備領域占壟斷地位。據(jù)估計中國脂肪酶市場容量約為50億元人民幣，鑒于中國生物柴油、造紙、皮革、食品、飼料、醫(yī)藥制造行業(yè)的高速發(fā)展，脂肪酶的應用會越來越廣泛，市場需求越來越大，預計在未來幾年脂肪酶每年將以10%-15%的速度增長。
[0005]中國專利201310116628.3公開了一種制備固定化脂肪酶的方法。該方法，利用耦合固定化技術即吸附、交聯(lián)及包埋三種結(jié)合的方法對脂肪酶進行固定化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是提供了一種新的固定化堿性脂肪酶的制作方法。
[0007]本發(fā)明的技術方案是:
一種固定化堿性脂肪酶的制作方法，依次包括以下步驟:
1)將固含量為420g/L的堿性脂肪酶發(fā)酵液3.St冷卻至10°C，離心分離2h得到菌渣和液酶；
2)將液酶升溫至30°C，加入磷酸鹽至磷酸鹽濃度為lmol/L，然后投入200kg載體，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至6.0，攪拌24h，靜置20h，離心分離得到固化酶和上清液；
3)向載體4倍體積的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至7~8，攪拌1.5h，用空壓在罐內(nèi)壓干甘氨酸，收集在罐內(nèi)的固化酶；
4)將步驟3)得到的固化酶用2倍體積的lmol/L磷酸鹽溶液攪拌洗滌并壓干，重復5次，再用2倍體積的lmol/L磷酸鹽溶液浸泡固化酶，攪拌30min，離心分離得到固化酶；
5)將步驟4)得到的固化酶投入到I倍體積的95%的乙醇中，攪拌處理lOmin，然后離心分離得到堿性脂肪酶；
6)將步驟5)得到的堿性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的環(huán)境下烘干1h得到固定化堿性脂肪酶成品。
[0008]進一步，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。
[0009]本發(fā)明在脂肪酶提取過程中不使用大量有機溶劑和其他有害原料，提高了固化酶活力，提高產(chǎn)品的使用批次達200或以上。
【具體實施方式】
[0010]下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。
[0011]實施例1
一種固定化堿性脂肪酶的制作方法，依次包括以下步驟:
1)將固含量為420g/L的堿性脂肪酶發(fā)酵液3.St冷卻至10°C，離心分離2h得到菌渣和液酶；
2)將液酶升溫至30°C，加入磷酸二氫鉀至磷酸二氫鉀濃度為lmol/L，然后投入200kg載體，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至6.0，攪拌24h，靜置20h，離心分離得到固化酶和上清液；
3)向載體4倍體積的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至7~8，攪拌1.5h，用空壓在罐內(nèi)壓干甘氨酸，收集在罐內(nèi)的固化酶；
4)將步驟3)得到的固化酶用2倍體積的lmol/L磷酸二氫鉀溶液攪拌洗滌并壓干，重復5次，再用2倍體積的lmol/L磷酸二氫鉀溶液浸泡固化酶，攪拌30min，離心分離得到固化酶；
5)將步驟4)得到的固化酶投入到I倍體積的95%的乙醇中，攪拌處理lOmin，然后離心分離得到堿性脂肪酶；
6)將步驟5)得到的堿性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的環(huán)境下烘干1h得到固定化堿性脂肪酶成品。
[0012]經(jīng)檢驗得到的固定化堿性脂肪酶活力為12100U/g。
[0013]實施例2
一種固定化堿性脂肪酶的制作方法，依次包括以下步驟:
1)將固含量為420g/L的堿性脂肪酶發(fā)酵液3.St冷卻至10°C，離心分離2h得到菌渣和液酶；
2)將液酶升溫至30°C，加入磷酸氫二鉀至磷酸氫二鉀濃度為lmol/L，然后投入200kg載體，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至6.0，攪拌24h，靜置20h，離心分離得到固化酶和上清液；
3)向載體4倍體積的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至7~8，攪拌1.5h，用空壓在罐內(nèi)壓干甘氨酸，收集在罐內(nèi)的固化酶；
4)將步驟3)得到的固化酶用2倍體積的lmol/L磷酸氫二鉀溶液攪拌洗滌并壓干，重復5次，再用2倍體積的lmol/L磷酸氫二鉀溶液浸泡固化酶，攪拌30min，離心分離得到固化酶；
5)將步驟4)得到的固化酶投入到I倍體積的95%的乙醇中，攪拌處理lOmin，然后離心分離得到堿性脂肪酶；
6)將步驟5)得到的堿性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的環(huán)境下烘干1h得到固定化堿性脂肪酶成品。
[0014]經(jīng)檢驗得到的固定化堿性脂肪酶活力為12300U/g。
[0015]凡在不脫離本發(fā)明核心的情況下做出的簡單的變形或修改均落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種固定化堿性脂肪酶的制作方法，其特征在于:依次包括以下步驟: 1)將固含量為420g/L的堿性脂肪酶發(fā)酵液3.St冷卻至10°C，離心分離2h得到菌渣和液酶； 2)將液酶升溫至30°C，加入磷酸鹽至磷酸鹽濃度為lmol/L，然后投入200kg載體，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至6.0，攪拌24h，靜置20h，離心分離得到固化酶和上清液； 3)向載體4倍體積的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH至7~8，攪拌1.5h，用空壓在罐內(nèi)壓干甘氨酸，收集在罐內(nèi)的固化酶； 4)將步驟3)得到的固化酶用2倍體積的lmol/L磷酸鹽溶液攪拌洗滌并壓干，重復5次，再用2倍體積的lmol/L磷酸鹽溶液浸泡固化酶，攪拌30min，離心分離得到固化酶； 5)將步驟4)得到的固化酶投入到I倍體積的95%的乙醇中，攪拌處理lOmin，然后離心分離得到堿性脂肪酶； 6)將步驟5)得到的堿性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的環(huán)境下烘干1h得到固定化堿性脂肪酶成品。
2.根據(jù)權利要求1所述的所述的固定化堿性脂肪酶的制作方法，其特征在于:磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化堿性脂肪酶的制作方法，1）提取液酶；2）固化；3）甘氨酸處理；4）將步驟3）得到的固化酶用2倍體積的1mol/L磷酸鹽溶液攪拌洗滌并壓干，重復5次，再用2倍體積的1mol/L磷酸鹽溶液浸泡固化酶，攪拌30min，離心分離得到固化酶；5）將步驟4）得到的固化酶投入到1倍體積的95%的乙醇中，攪拌處理10min，然后離心分離得到堿性脂肪酶；6）將步驟5）得到的堿性脂肪酶固化酶在40℃、真空度-0.09MPa的環(huán)境下烘干10h得到固定化堿性脂肪酶成品。本發(fā)明在脂肪酶提取過程中不使用大量有機溶劑和其他有害原料，提高了固化酶活，提高產(chǎn)品的使用批次達200或以上。
【IPC分類】C12N11-00
【公開號】CN104762287
【申請?zhí)枴緾N201510199817
【發(fā)明人】林楠棋, 詹艷艷, 張書汁, 張欣
【申請人】焦作健康元生物制品有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月25日