固定化脂酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及固定化脂酶及其制備方法，特別涉及固定化脂肪酶的制備方法。本發(fā) 明還涉及制備的固定化脂肪酶在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶是一類特殊的?；饷福軌蛟谟?水界面上催化酯水解、酯合成、酯交 換、及立體異構(gòu)體拆分等化學(xué)反應(yīng)，常被應(yīng)用于食品、日化、生物能源等領(lǐng)域。然而，它的廣 泛應(yīng)用仍然被穩(wěn)定性差、易失活、不能重復(fù)使用，并且反應(yīng)后混入產(chǎn)品，給分離純化帶來(lái)困 難等缺陷所限制。為了改善脂肪酶的這些特性，開發(fā)了許多利用載體固定化脂肪酶的技術(shù)， 主要包括物理吸附，共價(jià)交聯(lián)和有機(jī)/無(wú)機(jī)材料包裹三種方式。
[0003] 物理吸附方法的代表是目前諾維信公司（Novozymes)商品化的固定化脂肪酶 (Novozym 435)，是用大孔樹脂吸附的脂肪酶。此外還有用活性炭、硅膠等材料進(jìn)行吸附的 方法。其次，共價(jià)交聯(lián)法多采用高碘酸鈉、戊二醛等化學(xué)試劑將酶與載體進(jìn)行交聯(lián)。包裹方 式的脂肪酶固定化方法主要采用聚丙烯酸酯、聚氨酯、有機(jī)硅等作為粘合劑與粗酶粉或酶 溶液混合成漿狀涂布于載體上。然而，吸附法存在溫度穩(wěn)定性較差、反應(yīng)擴(kuò)散阻力較大、吸 附不牢固等問(wèn)題。共價(jià)法和包埋法，需要借助多種化學(xué)試劑，共價(jià)法甚至涉及多步化學(xué)反 應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致脂肪酶部分位點(diǎn)的失活，造成脂肪酶活力的下降。而且，上述傳統(tǒng)方法得到的固 定化酶是脂肪酶粗酶制劑，含有多種雜蛋白，不具有專一性；此外酶與產(chǎn)物分離仍然需要高 速離心的方式，費(fèi)時(shí)耗力，不具有便捷性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N固定化脂酶，其包括脂酶和作為固定載體的磁性顆 粒。
[0005] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述脂酶攜帶分子標(biāo)簽，所述磁性顆粒的表面包含 能夠與所述分子標(biāo)簽結(jié)合的物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂酶所攜帶的分子標(biāo)簽為組 氨酸標(biāo)簽（His-tag)。
[0006] 在一些實(shí)施方案中，與上述分子標(biāo)簽結(jié)合的物質(zhì)為金屬離子，在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述金屬離子為鈷、鎳、銅、鋅、鐵等。更優(yōu)選地，所述金屬離子為Co 2+。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的磁性顆粒的直徑為0. 1-10 μ m，優(yōu)選為約 1-5 μ m。在一實(shí)施方案中，所述磁性顆粒的磁核選自鐵氧體、金屬、金屬合金、鐵氧化物、二 氧化鉻等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述磁核為鐵氧化物，更優(yōu)選為YFe304。
[0008] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，固定化脂酶的固定作用力是基于磁珠表面的金屬離子（例 如Co2+)與脂酶上分子標(biāo)簽（例如His-tag)之間的螯合親和作用。這種固定方式能方便快 捷地利用磁分離回收酶（便捷性），且結(jié)合力（親和作用）比普通物理吸附法更為牢固（高 穩(wěn)定性）。
[0009] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂酶為脂肪酶或磷脂酶，更優(yōu)選為微生物脂肪酶。在 一些實(shí)施方案中，上述微生物脂肪酶為來(lái)自以下微生物的脂肪酶：米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)、疏棉狀嗜熱絲抱菌（Thermomyces lanuginosus)、南極假絲酵母（Candida antarctic)、黑曲霉菌（Aspergillus niger)、裙皺假絲酵母（Candida rugosa)、假單胞菌 屬（Pseudononas sp.)等。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的脂肪酶為米黑根毛霉脂 肪酉每（Rhizomucor miehei lipase, RML)〇
[0010] 本發(fā)明的固定化脂酶具有下述至少一種特性：更好的熱穩(wěn)定性、更高的有機(jī)溶劑 耐受性，更優(yōu)異的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性，有利于酶法生物加工在工業(yè)化中的應(yīng)用，例 如大量制備生物柴油。
[0011] 第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝斯潭ɑ傅闹苽浞椒?，其包括將攜帶分子標(biāo)簽的脂酶 與磁性顆粒接觸，從而得到固定于所述磁性顆粒上的脂酶，其中所述磁性顆粒的表面包含 能夠與所述分子標(biāo)簽結(jié)合的物質(zhì)。
[0012] 本發(fā)明通過(guò)金屬離子（如Co2+)修飾的磁性顆粒借助His-tag和Co 2+之間的螯合 作用，一步法特異純化并固定化脂酶。這種方式既實(shí)現(xiàn)了固定化酶的高純度（專一性），又 能方便快捷地利用磁分離回收酶（便捷性），且結(jié)合力（親和作用）比普通物理吸附法更為 牢固（高穩(wěn)定性）。
[0013] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將脂酶與磁性顆粒接觸10-30分鐘，優(yōu)選為約20分 鐘。在一些實(shí)施方案中，上述脂酶與磁性顆粒的比例為l-5mg脂酶/mg磁性顆粒。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，所述脂酶與磁性顆粒在pH為7-10、更優(yōu)選為約8的條件下進(jìn)行接觸。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所用的脂酶溶液為細(xì)胞裂解得到的粗酶溶液。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，上述脂酶為脂肪酶或磷脂酶，更優(yōu)選為微生物脂肪酶。在一些實(shí)施方案 中，上述微生物脂肪酶為來(lái)自以下微生物的脂肪酶：米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)、疏 棉狀嗜熱絲抱菌（Thermomyces lanuginosus)、南極假絲酵母（Candida antarctic)、黑曲 霉菌（Aspergillus niger)、裙皺假絲酵母（Candida rugosa)、假單胞菌屬（Pseudononas sp.)等。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase, RML)〇
[0015] 本發(fā)明人將分子標(biāo)簽引入脂酶，利用磁性顆粒一步法完成了脂酶的純化和固定 化。此外，固定化后的酶還具有下述至少一種特性：更好的熱穩(wěn)定性、更高的有機(jī)溶劑耐受 性，更優(yōu)異的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性，有利于酶法生物加工在工業(yè)化中的應(yīng)用，例如大 量制備生物柴油。
[0016] 第三方面，本申請(qǐng)還提供了由上述方法制備的固定化脂酶，其中所述脂酶攜帶分 子標(biāo)簽，所述磁性顆粒的表面包含能夠與所述分子標(biāo)簽結(jié)合的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述固定化脂 酶為固定于磁性顆粒的脂肪酶。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不僅本申請(qǐng)的固定化酶能重復(fù)利用，連所用的基材（磁性 顆粒）本身都能重復(fù)利用。
[0018] 第四方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝吮景l(fā)明的固定化脂酶在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。
[0019] 本申請(qǐng)的固定化酶具有更優(yōu)異的有機(jī)溶劑（甲醇）耐受性，利于脂肪酶在生物柴 油（高級(jí)脂肪酸與甲醇酯化后的產(chǎn)物）制備中的應(yīng)用。
[0020] 第五方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝舜判灶w粒的用途。
[0021] 具體地，提供了磁性顆粒在制備固定化脂酶中的用途，所述磁性顆粒用于純化和 固定化脂肪酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂酶攜帶分子標(biāo)簽，所述磁性顆粒的表面包含能 夠與所述分子標(biāo)簽結(jié)合的物質(zhì)。
[0022] 另外，本申請(qǐng)還提供了磁性顆粒在回收固定化脂酶中的用途，其中所述磁性顆粒 作為固定化脂酶的載體，提供磁響應(yīng)性，便于固定化脂酶的回收和重新利用。
[0023] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0024] 圖1顯示了固定化脂肪酶RML經(jīng)洗滌和洗脫后的樣品的凝膠電泳圖，其中從左到 右，各泳道加載的樣品分別為泳道1 :菌體破碎離心后的上清液（即粗酶液）；泳道2 :粗酶 液與磁珠孵育后的上清液；泳道3-5 :洗滌孵育后的磁珠得到的上清液，泳道3-5分別對(duì)應(yīng) 第1、2、3次洗滌得到的上清液；泳道6 :第一次洗脫得到的洗脫液樣品，泳道7為：第二次洗 脫得到的洗脫液樣品。
[0025] 圖2顯示了固定化RML在不同溫度下的相對(duì)酶活力，以檢測(cè)其與游離RML相比的 最適溫度（圖2A)和熱穩(wěn)定性（圖2B)。
[0026] 圖3顯示了固定化RML和游離RML在不同濃度甲醇存在下的剩余酶活力，其中橫 坐標(biāo)為甲醇濃度，縱坐標(biāo)為剩余酶活力。
[0027] 圖4顯示了固定化RML和游離RML在儲(chǔ)存不同時(shí)間后剩余的酶活力。
[0028] 圖5顯不了固定化RML的磁響應(yīng)性。A圖顯不未置于磁場(chǎng)的固定化RML懸浮液的 分布狀態(tài)，B圖是固定化RML懸浮液置于磁場(chǎng)后的分布狀態(tài)。
[0029] 圖6顯示了（ Λ )回收的固定化RML的酶活力，以及（□)由重生磁珠重新吸附 RML后得到的固定化RML的酶活力，其中縱坐標(biāo)為相對(duì)剩余酶活力，橫坐標(biāo)為重復(fù)利用次 數(shù)。
[0030] 圖7顯示不同尺寸的磁性顆粒的磁響應(yīng)性，左側(cè)樣品的磁性顆粒直徑為1 μ m，右 側(cè)樣品的磁性顆粒直徑為l〇nm。
[0031] 圖8A顯示了固定化磷脂酶PLC(CL0PLC8(GenBank:D49969. 1)經(jīng)洗滌和洗脫后的 樣品的凝膠電泳圖，其中從左到右，各泳道加載的樣品分別為泳道1 :菌體破碎離心后的上 清液（即粗酶液）；泳道2 :粗酶液與磁珠孵育后的上清液；泳道3-6 :洗滌孵育后的磁珠得 到的上清液，泳道3-6分別對(duì)應(yīng)第1、2、3、4次洗滌得到的上清液；泳道7 :洗