專利名稱：一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結的細胞株及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株及其制備方法。
背景技術：
腫瘤是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項研究報告表明，全球癌癥狀況將日益嚴重，因此，深入研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移的分子機制，尋找更為有效的腫瘤治療方案，成為當今醫(yī)學研究的前沿課題。隨著腫瘤生物學研究的不斷深入，腫瘤的早期診斷及預防水平有了較大的提高，但是腫瘤治療后的高轉移及高復發(fā)仍是腫瘤臨床治療中一個亟待解決的難題。近年來，“腫瘤干細胞”學說的提出及其研究進展，從一個全新的角度去認識腫瘤。該學說認為，腫瘤中存在一部分獨特的具有自我更新和分化功能的干細胞樣亞群并將之稱為腫瘤干細胞，這一亞群細胞正是腫瘤的起源細胞并維持腫瘤的生長。因此，腫瘤細胞株是研究細胞癌變機理、腫瘤轉移、腫瘤放療和化療敏感性分子基礎等生物醫(yī)學問題的重要材料，建立和鑒定不同的腫瘤細胞株是一項很有意義的工作。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，所述細胞株具有典型的腫瘤細胞生物學特性；同時，還提供一種所述細胞株的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，命名為人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株 0225-12ScacLym，保藏號為 CCTCC NO :C201033。
所述細胞株在倒置顯微鏡下觀察顯示，細胞體積小，核大，胞漿少，細胞與平皿之間貼附生長，貼附不緊密，細胞可成團半懸浮生長。
所述細胞株的體外倍增時間為31. 22證。
所述細胞株的蛋白表達特征為NSE陽性表達。
本發(fā)明所述人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12SCaCLym，是一株來源于中國南方人肺小細胞癌淋巴結轉移灶的細胞株，原始肺癌組織來源于一位M歲男性肺癌病人的左肺門腫瘤病灶，病人在手術前一年接收了放療和化療，藥物療程和射線劑量如下VP12+DDP 2療程，放療56gyU8天)，紫杉醇+DDP 3療程，肺門和縱隔淋巴結變小。 手術前3個月又出現(xiàn)肺門腫物增大，痰中找到腫瘤細胞，即行拓撲替康+DDP 3療程，肺門腫物見縮小后即實行手術。淋巴結轉移癌組織經(jīng)NOD-SCID鼠體內(nèi)生長形成移植瘤后再體外培養(yǎng)成功細胞株。
一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株的制備方法，包括以下步驟(1)組織塊機械解離將切除的人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織解離， 清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織清洗，然后加入膠原酶，孵育，過濾，然后收集腫瘤細胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細胞；(3)對步驟(2)得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個月，即得細胞株。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，所述制備方法包括以下步驟(1)組織塊機械解離將切除的人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織解離，清洗去除粘液和紅細胞等雜質(zhì)，分離肺癌實質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織， 得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，把剩余組織再細切，清洗組織碎片，然后向組織片加入膠原酶，在 37°C下孵育4-18小時；過濾，然后收集腫瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細胞；(3)對步驟(2)得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個月，即得細胞株。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(1)為將切除的人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織解離成0. 5cm3，用100%的青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS緩沖液反復清洗組織去除粘液和紅細胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個10號注射器針頭分離肺癌實質(zhì)組織，并去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織后，得到剩余的組織。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，步驟(2)為使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，用PBS緩沖液清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩余組織再細切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小時，通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液，然后收集腫瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細胞。更優(yōu)選地，步驟(2)中，加入膠原酶的同時還加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高膠原酶對組織的解離效率。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，步驟(3)中純化后的肺癌細胞的培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5%C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每3_5 天傳代一次。
采用本發(fā)明所述制備方法得到人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株 0225-12ScacLym，是從病理類型為小細胞肺癌的肺癌病人經(jīng)歷過VP-16、卡鉬和紫杉醇化療和肺局部放療后的縱隔淋巴結轉移灶切除物中培養(yǎng)成功，經(jīng)病理鑒定為小細胞肺癌淋巴結轉移。所得細胞株為上皮樣細胞，具有典型的腫瘤細胞生物學特性，它能在體外連續(xù)長期傳代，在體外培養(yǎng)一年，傳100多代，細胞仍然生長增殖活躍，而且經(jīng)檢測，其一般生物學特性表明所述細胞株細胞小，胞漿較少，可成團懸浮生長，也可貼壁生長，貼壁松散，接觸性生長抑制消失。


圖1為本發(fā)明所述細胞株在400x倒置顯微鏡下的形態(tài)圖。
圖2為本發(fā)明所述細胞株種植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤組織的形態(tài)圖。
具體實施方式
為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1本發(fā)明一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，按照以下制備方法所得(1)組織塊機械解離將手術切除的人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織以消毒小剪刀迅速解離到0. 5cm3大小，用100%青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，消毒PBS緩沖液反復清洗組織去除粘液和紅細胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個10號注射器針頭細心分離肺癌實質(zhì)組織，盡量去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化在解剖顯微鏡下去除肺癌標本中的間質(zhì)組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)所得的剩余的組織切成Imm3組織片，用PBS緩沖液清洗組織片。讓組織片沉淀，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩余組織再細切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C孵育4_18小時后。在膠乳膠原酶的同時可加入3mM CaCl2,以提高膠原酶對組織的解離效率。通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片；對較大的組織碎片可以加入新鮮的膠原酶進行進一步的解離。消化完全后，收集腫瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中懸浮細胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細胞；(3)對步驟(2)所得存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質(zhì)細胞，純化后的肺癌細胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5% C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每3-5天傳代一次，連續(xù)培養(yǎng)并傳代超過12 個月，得細胞株。
所述步驟(1)中的人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織，來源于一位M 歲男性肺癌病人的左肺門腫瘤病灶。病人在手術前一年接受了放療和化療，藥物療程和射線劑量如下VP16+DDP 2療程，放療56gy ( 天)，紫杉醇+DDP 3療程，肺門和縱隔淋巴結變小，手術前3個月又出現(xiàn)肺門腫物增大，痰中找到腫瘤細胞，即行拓撲替康+DDP 3療程， 肺門腫物見縮小后即實行手術。
所述步驟(3)得到的細胞株，于2010年4月1日送達中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :C201033，命名為人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株 0225-12ScacLymo
實施例2本發(fā)明所述人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12ScacLym的檢測鑒定 1、G6PD同工酶檢測物種來源(由中國典型培養(yǎng)物保藏中心檢測)。
本發(fā)明所述小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12SCaCLym，是一株中國南方人肺小細胞癌淋巴結轉移灶來源細胞株，原始肺癌組織來源于病人縱隔淋巴結腫瘤轉移病灶，具體來源于一位M歲男性肺癌病人的左肺門腫瘤病灶。病人在手術前一年接受了放療和化療，藥物療程和射線劑量如下VP16+DDP 2療程，放療56gyU8天)，紫杉醇+DDP 3療程，肺門和縱隔淋巴結變小，手術前3個月又出現(xiàn)肺門腫物增大，痰中找到腫瘤細胞，即行拓撲替康+DDP 3療程，肺門腫物見縮小后即實行手術。淋巴結轉移癌組織經(jīng)NOD-SCID 鼠體內(nèi)生長形成移植瘤后再體外培養(yǎng)成功細胞株。
2、形態(tài)觀察主要觀察細胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等，以及細胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。
2. 1倒置光學顯微鏡主要在正常生長狀態(tài)下觀察細胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、粘附特性等。
在放大倍數(shù)為400x的倒置光學相差顯微鏡下觀察本發(fā)明所述小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12ScacLym，如附圖1所示，可見細胞體積小，核大，胞漿少，細胞與平皿之間貼附生長，貼附不緊密，細胞可成團半懸浮生長。
2. 2免疫組化檢測細胞標記蛋白采用S-P法進行免疫組化染色，免疫組化染色S-P試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。所用的抗體為CK7、TTF-I、vimentin、EGFR、VEGF 和 NSE。
具體步驟為(1)待檢測細胞株提前M小時爬片于消毒載玻片上，M小時后，用PBS緩沖液沖洗2 次，冷丙酮固定15分鐘，浸泡于PBS中備用；(2)取所需玻片加1滴或50μ 1過氧化物酶阻斷溶液(試劑Α)室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(3)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育 10分鐘；(4)除去血清，每張切片加1滴或50μ 1的第一抗體，室溫下孵育60分鐘；(5)PBS沖洗三次，每次3-5分鐘；除去PBS液，每張切片加一滴或50μ 1生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(6)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1鏈霉菌抗生物素過氧化酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(7)除去PBS液，每張切片加2滴或100μ 1新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察 3-10分鐘；(8)自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗返藍；(9)DAB顯色，切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。
免疫組化檢測結果判斷方法按細胞著色評分棕褐色3分；棕黃色2分；淡黃色 1分；無著色0分。同樣物鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù)，按陽性細胞的數(shù)量評分一個視野內(nèi)著色細胞>70%為4分；51%-75%為3分；11%_50%為2分；1%_10%為1分；陰性為0分。兩項得分相乘，滿3分為“ + ” ；4分為“++” ；5分以上為“+++”?！? +++”為陽性表達。
本發(fā)明所述小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12SCaCLym的免疫組織化學染色顯示，其與來源的轉移灶腫瘤組織有著相似的蛋白表達，其突出的表達特征為 NES陽性表達。
3、細胞生長增殖檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數(shù)、倍增時間、細胞周期時間。
3.1 MTT法測定細胞生長增殖和對藥物的敏感性(1)取96孔細胞制備板，每孔中加0.Iml含2X IO4 IOXlO4靶細胞的制備液(含10% 小牛血清的DMEM制備液)，在37°C 5% C02的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備2_3小時，讓細胞貼壁；(2)用DMEM制備液0.1 100倍遞次配置藥物，每孔加0. Iml稀釋的藥物和待檢細胞， 每個稀釋度3個重復孔。對照孔9個3個陽性對照孔，每孔加0. Iml含1000倍藥物的DMEM 制備液和細胞，3個陰性對照孔，每孔加不含藥物的0. Iml DMEM制備液和細胞，3個空白對照孔，每孔加0.1ml DMEM制備液，不加細胞。在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備M 48小時或預定的時間；(3)吸去制備液，用PBS洗滌一次(如為懸浮細胞，應在吸去上清液前離心制備板)；(4)每孔加0.Iml PBS和10 μ 1 MTT染液，在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備4 6小時；(5)每孔加0.Iml酸化異丙醇，也可用含10% SDS的lOmmol/L HCl代替酸化異丙醇， 在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值，檢測波長570nm，參考波長630nm。以OD值對樣品稀釋度作圖，比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。
3. 2細胞流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡流式細胞儀是美國BECKMAN-COULTER(貝克曼-庫爾特)公司生產(chǎn)。機器型號ELITE， 激光波長488nm，功率15麗。取IO6已固定的細胞，用PBS洗兩遍，去上清后加入300 μ 1 DNA染液(內(nèi)含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20單位/ml)，室溫30min。上機激光管預熱30min后用熒光微球(美國BECKMAN-COULTER公司)調(diào)整儀器，使各放大器接收的信號的 HCV值<2%，收集12000個細胞，DNA周期分析用美國ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE軟件，最后計算出細胞各期的百分數(shù)。另外，細胞凋亡是用儀器自帶軟件處理，直接得出細胞的凋亡率。
本發(fā)明所述小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12SCaCLym的體外倍增時間為31. 225h0
4、異體動物接種向異體動物體內(nèi)接種細胞懸液，觀察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射時用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下進行注射。
IO6個所述小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12SCaCLym細胞種植在 5只4周齡的NOD-SCID鼠肩胛部皮下，第2周種植部位均出現(xiàn)直徑為2mm的移植瘤，2個月后瘤體增大到1. 2cm,麻醉后處死動物，移植瘤組織經(jīng)包埋切片HE染色，形態(tài)如附圖2所示， 放大倍數(shù)為200x的形態(tài)圖，細胞體積小，核大，核仁明顯，與來源的病人組織相似。
最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。
權利要求
1.一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，其特征在于，命名為人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12ScacLym，保藏號為CCTCC NO C201033。
2.如權利要求1所述的來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，其特征在于，所述細胞株在倒置顯微鏡下觀察顯示，細胞體積小，核大，胞漿少，細胞與平皿之間貼附生長，貼附不緊密，細胞可成團半懸浮生長。
3.如權利要求1所述的來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，其特征在于，所述細胞株的體外倍增時間為31. 22 ！。
4.如權利要求1所述的來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，其特征在于，所述細胞株的蛋白表達特征為NSE陽性表達。
5.一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)組織塊機械解離將切除的人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織解離， 清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織清洗，然后加入膠原酶，孵育，過濾，然后收集腫瘤細胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細胞；(3)對步驟(2)得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個月，即得細胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開一種來源于人放化療后復發(fā)小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，所述細胞株命名為人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12ScacLym，保藏號為CCTCCNOC201033。所述細胞株是從病理類型為小細胞肺癌的肺癌病人經(jīng)歷過VP-16、卡鉑和紫杉醇化療和肺局部放療后的縱隔淋巴結轉移灶切除物中培養(yǎng)制備所得，具有典型的腫瘤細胞生物學特性，能在體外連續(xù)長期傳代。同時，本發(fā)明還公開了所述細胞株的制備方法。
文檔編號C12N5/09GK102517254SQ20111045730
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月31日
發(fā)明者何建行, 李慧靈 申請人:何建行, 廣州呼吸疾病研究所, 李慧靈