專利名稱:一種來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3<sup>+</sup>CD56<sup>+</sup>細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)和免疫療法,尤其涉及一種高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+CD56+細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù):
⑶3+CD56+細(xì)胞是一種在體外利用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞。由人血液中的單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得。由于該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá)⑶3+ (⑶3+為T細(xì)胞表面特異性蛋白,僅存在于T細(xì)胞表面)和⑶56+ (⑶56+為NK細(xì)胞表面特異性蛋白)兩種膜蛋白分子,故又被稱為NK細(xì)胞(natural killer cell,自然殺傷細(xì)胞)樣T淋巴細(xì)胞(N KT細(xì)胞),兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC(major histocompatibility complex主要組織相容性復(fù)合體)限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。相對于LAK細(xì)胞(lymphokine activated killer cells,淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)以及CTL細(xì)胞(cytotoxic T-1ymphocyte cells,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞),其表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷能力與更廣的殺瘤譜。⑶3+CD56+細(xì)胞在正常人外周血中含量極低,僅1% — 5%。因此,在體外培養(yǎng)中,提高其絕對數(shù)量對提高臨床治療效果至關(guān)重要。目前的經(jīng)典制備方法為:采集人體外周血,分離得到單個(gè)核細(xì)胞,將單個(gè)核細(xì)胞置于培養(yǎng)液中,加入多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)其分化(如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN- Y等)培養(yǎng)至第21天,收獲得到⑶3+⑶56+細(xì)胞。但這種方法獲得的CD3+CD56+細(xì)胞的培養(yǎng)周期過長且細(xì)胞毒活性不夠理想。以下是現(xiàn)有技術(shù)的一種方案:1、采集自體外周血,存放于密閉容器中,以枸櫞酸鈉抗凝。2、將采集的血液經(jīng)離心分離,得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。3、調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度I X 106/mL,并加入細(xì)胞因子IFN- Y至其終濃度為1000U/mL,于37 0C,5%C02培養(yǎng)箱中孵育24h。4、24h后加入IL-2、抗CD3單克隆抗體及IL-1,至IL-2終濃度為300 500U/mL,抗⑶3單克隆抗體終濃度為50ng/mL及IL-1終濃度為100U/mL。之后每隔3天半量換液,全量補(bǔ)充IL-2。5、第21天收獲細(xì)胞。此方案的缺點(diǎn)是:1、現(xiàn)有技術(shù)采用病人自體外周血,受病人個(gè)體差異的影響較大,不利于產(chǎn)業(yè)化制備,給臨床推廣帶來了難度。2、外周血屬于發(fā)育成熟的機(jī)體組織,細(xì)胞增殖潛力較小,受病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)高,且年齡越大細(xì)胞活性越低。3、枸櫞酸鈉抗凝劑本身對細(xì)胞有一定的毒性,并且其用量較大,堿性強(qiáng),對血液成分的影響較大。
4、現(xiàn)有技術(shù)所制備的免疫細(xì)胞,其對腫瘤細(xì)胞的殺傷性還有待提高。有鑒于此,如何設(shè)計(jì)一種⑶3+⑶56+細(xì)胞的制備方法,以解決現(xiàn)有技術(shù)制備周期較長及細(xì)胞的增值潛力較小的現(xiàn)象,是業(yè)內(nèi)人士亟需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中,血液成分的穩(wěn)定性不佳、采集過程缺乏安全性,并且細(xì)胞的制備周期較長,增殖潛力較小等缺陷,本發(fā)明提供了一種來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+⑶56+細(xì)胞的制備方法。根據(jù)本發(fā)明,提供了一種來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+⑶56+細(xì)胞的制備方法,其中,從圍產(chǎn)期胎盤血中分離單個(gè)核細(xì)胞以誘導(dǎo)分化形成CD3+CD56+細(xì)胞。優(yōu)選地,包括以下步驟:a.采集所述圍產(chǎn)期胎盤血于密閉容器內(nèi);b.從所述圍產(chǎn)期胎盤血中分離單個(gè)核細(xì)胞;以及c.誘導(dǎo)分化所述單個(gè)核細(xì)胞。優(yōu)選地,所述步驟a中,所述圍產(chǎn)期胎盤血以含肝素鈉抗凝劑抗凝。優(yōu)選地,用含肝素鈉抗凝劑的采血袋進(jìn)行采血,搖勻后,將所述采血袋和生物冰袋一起放入保溫箱, 保持溫度為4 25°C,溫差不超過±5°C,在6小時(shí)內(nèi)運(yùn)送所述采血袋至實(shí)驗(yàn)室,且運(yùn)輸途中避免血液經(jīng)X線照射并遠(yuǎn)離輻射源。優(yōu)選地,所述步驟b包括:bl.向第一離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液,將所述圍產(chǎn)期胎盤血以等體積D-Hank’s液稀釋混勻,并將稀釋后的所述圍產(chǎn)期胎盤血緩慢疊加于所述淋巴細(xì)胞分離液之上,保持液層分界清晰;稀釋后的所述圍產(chǎn)期胎盤血體積與所述淋巴細(xì)胞分離液體積比為2:1 ;b2.將所述第一離心管進(jìn)行離心,其中,以800 1200g的離心力在10 25°C下離心25 30min ;b3.吸取所述第一離心管內(nèi)的上層血漿,密封并冷藏,冷藏溫度為-20°C,吸取所述第一離心管內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞層液體,移入第二離心管內(nèi);b4.向所述第二離心管內(nèi)加入D-Hank’s液以稀釋所述單個(gè)核細(xì)胞層液體,所述D-Hank’s液與所述單個(gè)核細(xì)胞層液體的體積比為5:1,離心洗滌所述第二離心管,去除上清;以及b5.用含體積濃度為10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液重懸所述單個(gè)核細(xì)胞,調(diào)節(jié)所述單個(gè)核細(xì)胞密度為I 3X 106/mL。優(yōu)選地,所述步驟b4中,以300 500g的離心力在4°C下離心5 lOmin。 優(yōu)選地,所述步驟c包括:Cl.將所述步驟b5中的所述含單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶,加入IFN- y至所述IFN-Y終濃度為500 1600U/mL,將所述培養(yǎng)瓶置于37°C,CO2的體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育24h ;c2.繼續(xù)向所述培養(yǎng)瓶內(nèi)加入IL-2、抗⑶3單克隆抗體、SCF及IL-1至所述IL_2終濃度為500 1000U/mL,所述抗⑶3單克隆抗體終濃度為50 100ng/mL,所述SCF終濃度為40 80ng/mL及所述IL-1終濃度為100 300U/mL,然后每隔1 3天半量換液,全量補(bǔ)充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF,保證細(xì)胞密度處于1 3X 106/mL ;以及c3.至第14 17天收獲經(jīng)分化的所述單個(gè)核細(xì)胞,離心并用所述培養(yǎng)液重懸,檢測所述單個(gè)核細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞含量。優(yōu)選地,所述步驟Cl中,所述IFN- Y的終濃度為1000U/mL。優(yōu)選地,所述步驟c2中,所述IL-2的終濃度為750U/mL。優(yōu)選地,所述步驟c2中,所述抗⑶3單克隆抗體的濃度為75ng/mL,所述SCF的濃度為55ng/mL,所述IL-1的濃度為150U/mL。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:1、重新選擇抗凝劑,設(shè)計(jì)新型采血裝置,保證血液成分的穩(wěn)定性以及采集過程的方便安全。2、采集圍產(chǎn)期胎盤血以從中分離單個(gè)核細(xì)胞,其增殖潛力比外周血單個(gè)核細(xì)胞更高,受病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)更低。3、重新調(diào)整細(xì)胞因子的使用,進(jìn)一步提高細(xì)胞增殖數(shù)量。4、縮短了制備周期,便于產(chǎn)業(yè)化實(shí)施。
為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案,下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹,顯而易見地,下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例,對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講,在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下,還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1示出了依據(jù)本發(fā)明的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+⑶56+細(xì)胞的制備方法中,離心第一離心管后的液體分層狀態(tài)示意圖。圖2A 2F示出了在100倍顯微鏡下觀察到的依據(jù)本發(fā)明收獲的單個(gè)核細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間下的細(xì)胞狀態(tài)。圖3A 3F示出了不同時(shí)期細(xì)胞群體中⑶3+CD56+細(xì)胞含量流式檢測圖。圖4A與4B示出了 1號圍產(chǎn)期胎盤血通過本發(fā)明最終達(dá)到的細(xì)胞群體中⑶3+⑶56+細(xì)胞含量流式檢測圖譜。圖5A與5B示出了 2號圍產(chǎn)期胎盤血通過本發(fā)明最終達(dá)到的細(xì)胞群體中⑶3+⑶56+細(xì)胞含量流式檢測圖譜。圖6A與6B示出了 3號圍產(chǎn)期胎盤血通過本發(fā)明最終達(dá)到的細(xì)胞群體中⑶3+⑶56+細(xì)胞含量流式檢測圖譜。圖7A與7B示出了 4號圍產(chǎn)期胎盤血通過本發(fā)明最終達(dá)到的細(xì)胞群體中⑶3+⑶56+細(xì)胞含量流式檢測圖譜。圖8A與8B示出了 5號圍產(chǎn)期胎盤血通過本發(fā)明最終達(dá)到的細(xì)胞群體中⑶3+⑶56+細(xì)胞含量流式檢測圖譜。圖9A 9F示出了對K562細(xì)胞殺傷性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖10示出了本方案與對照方案獲取的效應(yīng)細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷效果對照圖。圖1lA 1lC示出了對Hela細(xì)胞殺傷性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖12示出了本方案與對照方案獲取的效應(yīng)細(xì)胞對Hela細(xì)胞的殺傷效果對照圖。圖13A 13C示出了對A549細(xì)胞殺傷性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖14示出了本方案與對照方案獲取的效應(yīng)細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷效果對照圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖,對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。 本發(fā)明的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+CD56+細(xì)胞的制備方法包括以下步驟:a.采集圍產(chǎn)期胎盤血于密閉容器內(nèi)。首先,在新生兒娩出后10秒鐘內(nèi),在距新生兒臍部5 8cm處用兩把止血鉗夾住,在兩鉗間結(jié)扎兩處,從中間剪斷該新生兒的臍帶,抱走新生兒正常處理。從遠(yuǎn)離臍帶一端的臍靜脈充盈處用紗布仔細(xì)擦拭、消毒,將該圍產(chǎn)期胎盤血采集于密閉容器內(nèi),并用含肝素鈉抗凝劑進(jìn)行抗凝。例如,可以用特制的含肝素鈉抗凝劑的采血袋進(jìn)行采血。具體操作是將采血袋針頭刺入消毒部位的臍靜脈,通過臍靜脈抽取胎盤血。采集結(jié)束封閉采血袋管。將采集的血液迅速與袋內(nèi)抗凝劑搖勻,避免發(fā)生凝血。將采血袋和生物冰袋一起放入特制的保溫箱,保持溫度為4 25°C,其中,溫差不超過±5°C,并且在6小時(shí)內(nèi)要將采血袋運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,且運(yùn)輸途中應(yīng)該避免血液經(jīng)X線照射并遠(yuǎn)離輻射源。b.從圍產(chǎn)期胎盤血中分離單個(gè)核細(xì)胞。接著,取第一離心管,向其中加入淋巴細(xì)胞分離液,然后用D-Hank’s液稀釋圍產(chǎn)期胎盤血,D-Hank’s液與圍產(chǎn)期胎盤血的體積相等,并且使得D-Hank’s液與圍產(chǎn)期胎盤血混合均勻,將稀釋后的圍產(chǎn)期胎盤血緩慢疊加于第一離心管內(nèi)的淋巴細(xì)胞分離液之上,保持液層分界清晰,稀釋后的圍產(chǎn)期胎盤血體積與淋巴細(xì)胞分離液體積之比為2:1。將第一離心管內(nèi)的混合液進(jìn)行離心,其中,以800 1200g的離心力在10 25°C下離心25 30min,例如離心力可以為900g,溫度可以為20V,離心時(shí)間可以為25min。圖1示出了依據(jù)本發(fā)明的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法中,離心第一離心管后的液體分層狀態(tài)示意圖。參照圖1,第一離心管10內(nèi)的混合液經(jīng)過離心后分層,其中,上層液體101為血漿層,底層液體102為紅細(xì)胞、粒細(xì)胞層,而中間上層液體103為單個(gè)核細(xì)胞層,中間下層液體104為淋巴細(xì)胞分離液層,吸取血漿層液體并將其密封冷藏,冷藏溫度為_20°C,吸取單個(gè)核細(xì)胞層液體,移入第二離心管內(nèi)。向第二離心管內(nèi)加入D-Hank’s液以稀釋第二離心管內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞層液體,其中,D-Hank’s液與單個(gè)核細(xì)胞層液體的體積比為5:1,以300 500g的離心力,在4°C下離心第二離心管內(nèi)的D-Hank’s液與單個(gè)核細(xì)胞層液體混合液5 lOmin,例如,離心力可以為400g,溫度可以為4°C,離心時(shí)間可以為8min,并對其進(jìn)行洗滌,然后去除上清,并再重復(fù)離心洗滌I次。接下來,用體積濃度為10%的胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液重懸單個(gè)核細(xì)胞,并調(diào)節(jié)單個(gè)核細(xì)胞的密度為I 3X 106/mL。c.誘導(dǎo)分化單個(gè)核細(xì)胞。將上述含單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶,加入IFN- y至其終濃度為500 1600U/mL,培養(yǎng)瓶可以為T75培養(yǎng)瓶,然后將培養(yǎng)瓶置于37°C,CO2的體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育24h后,繼續(xù)向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入IL-2、抗CD3單克隆抗體、SCF及IL-1至IL-2終濃度為500 1000U/mL,抗⑶3單克隆抗體終濃度為50 100ng/mL,SCF終濃度為40 80ng/mL及IL-1終濃度為100 300U/mL,具體地,至IFN- y的終濃度為1000U/mL,IL-2的終濃度為750U/mL,抗CD3單克隆抗體的濃度為75ng/mL,SCF的濃度為60ng/mL,IL-1的濃度為200U/mL。然后每隔I 3天半量換液,全量補(bǔ)充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF,保證細(xì)胞密度處于I 3X 106/mL。等到第14 17天收獲經(jīng)分化的單個(gè)核細(xì)胞,離心并用培養(yǎng)液重懸,檢測單個(gè)核細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞含量。實(shí)施例1首先,新生兒娩出后10秒鐘的時(shí)間內(nèi),在距新生兒臍部6cm處用兩把止血鉗夾住,在兩鉗間結(jié)扎兩處,從中間剪斷該新生兒的臍帶,抱走新生兒正常處理。從遠(yuǎn)離臍帶一端的臍靜脈充盈處用紗布仔細(xì)擦拭,以進(jìn)行消毒。消毒后用特制的含肝素鈉抗凝劑的采血袋來采集圍產(chǎn)期胎盤血。具體操作是將針頭刺入經(jīng)過消毒部位的臍靜脈,通過臍靜脈抽取圍產(chǎn)期胎盤血。采集結(jié)束后封閉采血袋管,并將采集的血液迅速與袋內(nèi)抗凝劑搖勻,避免發(fā)生凝血。接著將采血袋和生物冰袋一起放入特制的保溫箱,保溫箱中保持溫度為14°C,并且在6小時(shí)內(nèi)將采血袋運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,且運(yùn)輸途中避免血液照射到X線并遠(yuǎn)離輻射源,以保證圍產(chǎn)期胎盤血的質(zhì)量。接著,取第一離心管,向其中加入淋巴細(xì)胞分離液,用D-Hank’ s液與圍產(chǎn)期胎盤血混合均勻以對圍產(chǎn)期胎盤血進(jìn)行稀釋,D-Hank’s液與圍產(chǎn)期胎盤血的體積相等,將稀釋后的圍產(chǎn)期胎盤血緩慢疊加于第一離心管內(nèi)的淋巴細(xì)胞分離液之上,保持液層分界清晰。稀釋后的圍產(chǎn)期胎盤血體積與淋巴細(xì)胞分離液體積之比為2:1。將第一離心管內(nèi)的混合液進(jìn)行離心,離心力為900g,溫度為20°C,離心時(shí)間為25min。參照圖1,第一離心管10內(nèi)的混合液經(jīng)過離心后分層,其中,上層液體101為血漿層,底層液體102為紅細(xì)胞、粒細(xì)胞層,而中間上層液體103為單個(gè)核細(xì)胞層,中間下層液體104為淋巴細(xì)胞分離液層,吸取血漿層液體并將其密封冷藏,冷藏溫度為-20°C,吸取單個(gè)核細(xì)胞層液體,移入第二離心管內(nèi)。向第二離心管內(nèi)加入D-Hank’s液以稀釋第二離`心管內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞層液體,其中,D-Hank’s液與單個(gè)核細(xì)胞層液體的體積比為5:1,以400g的離心力,在4°C下離心第二離心管內(nèi)的D-Hank’s液與單個(gè)核細(xì)胞層液體混合液5min,并對其進(jìn)行洗滌,而且可以重復(fù)離心洗滌一次,然后去除上清。接下來,用含10%的體積濃度的胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液重懸單個(gè)核細(xì)胞,并調(diào)節(jié)單個(gè)核細(xì)胞的密度為2X 106/mL。最后,將上述含單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)液移入T75培養(yǎng)瓶,加入IFN- Y至其終濃度為1000U/mL,置于37°C,CO2的體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育24h后,繼續(xù)向T75培養(yǎng)瓶內(nèi)加入IL-2、抗⑶3單克隆抗體、SCF及IL-1至IL-2終濃度為1000U/mL,抗⑶3單克隆抗體終濃度為50ng/mL,SCF終濃度為40ng/mL及IL-1終濃度為100U/mL,然后每隔2天半量換液,全量補(bǔ)充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF,保證細(xì)胞密度處于2X106/mL。等到第14 17天收獲經(jīng)分化的單個(gè)核細(xì)胞,離心并用培養(yǎng)液重懸,檢測單個(gè)核細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞含量。檢測上述收獲的單個(gè)核細(xì)胞中的⑶3+CD56+細(xì)胞含量。圖2A 2F示出了在100倍顯微鏡下觀察到的依據(jù)本發(fā)明收獲的單個(gè)核細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間下的細(xì)胞狀態(tài),其中,圖2A為剛接種的單個(gè)核細(xì)胞,圖2B為第4天的單個(gè)核細(xì)胞,圖2C為第7天的單個(gè)核細(xì)胞,圖2D為第10天的單個(gè)核細(xì)胞,圖2E為第13天的單個(gè)核細(xì)胞,圖2F為第14天的單個(gè)核細(xì)胞。由圖2A 2F可見,隨著時(shí)間的延長,細(xì)胞形態(tài)逐步發(fā)生改變,從圓形拉長變成蝌蚪狀,最后變成不規(guī)則形狀。從開始增殖至第14天,統(tǒng)計(jì)每次換液前后細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算得出總增殖倍數(shù)平均可達(dá)100倍以上。圖3A 3F示出了不同時(shí)期細(xì)胞群體中CD3+CD56+細(xì)胞含量流式檢測圖,其中,圖3A與圖3B為未分化的單個(gè)核細(xì)胞中,且圖3B為圖3A中圈出區(qū)域的流式檢測圖;圖3C與圖3D為第7天的單個(gè)核細(xì)胞,且圖3D為圖3C中圈出區(qū)域的流式檢測圖;圖3£與圖3F為第13天的單個(gè)核細(xì)胞,且圖3F為圖3E中圈出區(qū)域的流式檢測圖。由圖3A 3F可見,象限UR中即CD3+CD56+細(xì)胞,其比例隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長不斷升高。具體數(shù)據(jù)見表I。表I不同培養(yǎng)時(shí)期流式檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+⑶56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,從圍產(chǎn)期胎盤血中分離單個(gè)核細(xì)胞以誘導(dǎo)分化形成CD3+CD56+細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,包括以下步驟: a.采集所述圍產(chǎn)期胎盤血于密閉容器內(nèi); b.從所述圍產(chǎn)期胎盤血中分離單個(gè)核細(xì)胞;以及 c.誘導(dǎo)分化所述單個(gè)核細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,所述步驟a中,所述圍產(chǎn)期胎盤血以含肝素鈉抗凝劑抗凝。
4.如權(quán)利要求3所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,用含肝素鈉抗凝劑的采血袋進(jìn)行采血,搖勻后,將所述采血袋和生物冰袋一起放入保溫箱,保持溫度為4 25°C,溫差不超過±5°C,在6小時(shí)內(nèi)運(yùn)送所述采血袋至實(shí)驗(yàn)室,且運(yùn)輸途中避免血液經(jīng)X線照射并遠(yuǎn)離輻射源。
5.如權(quán)利要求1所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,所述步驟b包括: bl.向第一離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液,將所述圍產(chǎn)期胎盤血以等體積D-Hank’ s液稀釋混勻,并將稀釋后的所述圍產(chǎn)期胎盤血緩慢疊加于所述淋巴細(xì)胞分離液之上,保持液層分界清晰;稀釋后的所 述圍產(chǎn)期胎盤血體積與所述淋巴細(xì)胞分離液體積比為2:1 ; b2.將所述第一離心管進(jìn)行離心,其中,以800 1200g的離心力在10 25°C下離心25 30min ; b3.吸取所述第一離心管內(nèi)的上層血漿,密封并冷藏,冷藏溫度為-20°C,吸取所述第一離心管內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞層液體,移入第二離心管內(nèi); b4.向所述第二離心管內(nèi)加入D-Hank’s液以稀釋所述單個(gè)核細(xì)胞層液體,所述D-Hank’s液與所述單個(gè)核細(xì)胞層液體的體積比為5:1,離心洗滌所述第二離心管,去除上清;以及 b5.用含體積濃度為10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液重懸所述單個(gè)核細(xì)胞,調(diào)節(jié)所述單個(gè)核細(xì)胞密度為I 3X 106/mL。
6.如權(quán)利要求5所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,所述步驟b4中,以300 500g的離心力在4°C下離心5 lOmin。
7.如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+⑶56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,所述步驟c包括: Cl.將所述步驟b5中的所述含單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶,加入IFN-Y至所述IFN- y終濃度為500 1600U/mL,將所述培養(yǎng)瓶置于37°C,CO2的體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育24h ; c2.繼續(xù)向所述培養(yǎng)瓶內(nèi)加入IL -2、抗⑶3單克隆抗體、SCF及IL-1至所述IL-2終濃度為500 1000U/mL,所述抗⑶3單克隆抗體終濃度為50 100ng/mL,所述SCF終濃度為40 80ng/mL及所述IL-1終濃度為100 300U/mL,然后每隔I 3天半量換液,全量補(bǔ)充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF,保證細(xì)胞密度處于I 3 X 106/mL ;以及 c3.至第14 17天收獲經(jīng)分化的所述單個(gè)核細(xì)胞,離心并用所述培養(yǎng)液重懸,檢測所述單個(gè)核細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞含量。
8.如權(quán)利要求7所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,所述步驟Cl中,所述IFN-Y的終濃度為1000U/mL。
9.如權(quán)利要求7所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,所述步驟c2中,所述IL-2的終濃度為750U/mL。
10.如權(quán)利要求7所述的來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的⑶3+⑶56+細(xì)胞的制備方法,其特征在于,所述步驟c2中,所述抗CD3單克隆抗體的濃度為75ng/mL,所述SCF的濃度為55ng/mL,所述IL-1的濃度為150U/mL。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種來源于圍產(chǎn)期胎盤血高殺傷K562細(xì)胞的CD3+CD56+細(xì)胞的制備方法,從圍產(chǎn)期胎盤血中分離單個(gè)核細(xì)胞以誘導(dǎo)分化形成CD3+CD56+細(xì)胞。采用本發(fā)明可以縮短細(xì)胞的制備周期,同時(shí)提高細(xì)胞的增殖能力。
文檔編號C12N5/0783GK103173409SQ201310014428
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者劉樂鋒, 王溢文, 魏昌盛, 林強(qiáng), 劉洋 申請人:江蘇和澤生物科技有限公司