專利名稱：家蠶性染色體連鎖基因slc35b1及其隱性致死突變基因和它們?cè)诩倚Q性比控制中的應(yīng)用的制作方法
家蠶性染色體連鎖基因SLC35B1及其隱性致死突變基因和它們?cè)诩倚Q性比控制中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一個(gè)來(lái)自家蠶性染色體，具有隱性致死突變特征的5Z0557 (solute carrier family 35member Bi)基因及其在家蠶雜交后代性比控制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
就一個(gè)蠶品種而言，雄蠶繭的繭層率和鮮繭出絲率要比雌蠶繭高，且雄蠶食桑量少，葉絲轉(zhuǎn)化率高；此外，雄蠶體質(zhì)強(qiáng)健，更容易飼養(yǎng)，而且雄蠶絲纖度細(xì)、凈度好，適于剿制高品位生絲。為此，世界各國(guó)科學(xué)家對(duì)專養(yǎng)雄蠶技術(shù)進(jìn)行了一系列的探索。1975年俄羅斯科學(xué)家V. A. ^rurmikov等運(yùn)用輻射誘變等技術(shù)手段，育成了家蠶性連鎖平衡致死系。在性連鎖平衡致死系內(nèi)自交，其后代雌雄性個(gè)體各有一半存活，使品系得以保持。當(dāng)平衡致死系的雄蟲與常規(guī)品系的雌蟲交配的后代只有雄蟲能夠存活，雌蟲全部致死，達(dá)到專養(yǎng)雄蠶的目的。
1996年春，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從俄羅斯科學(xué)院引進(jìn)了以家蠶性連鎖平衡致死系 S-8、S-14，并開(kāi)展了利用性連鎖平衡致死技術(shù)實(shí)現(xiàn)專養(yǎng)雄蠶的研究。經(jīng)10年攻關(guān)研究，創(chuàng)建了家蠶性連鎖平衡致死系細(xì)胞控制基因和導(dǎo)入方法(專利號(hào)ZL01132108. 3)、回交改良家蠶性連鎖平衡致死系的方法(專利號(hào)ZL01U6809. 3)、一種雜交改良家蠶性連鎖平衡致死系性狀的方法(專利號(hào)200810061660. 5)三項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專利；建立了一個(gè)低成本的雄蠶雜交種繁育方法；育成了秋華X平30、華菁X平60等家蠶性連鎖平衡致死實(shí)用蠶品種， 雄蠶率達(dá)99. 8%，繭層率和出絲率比常規(guī)品種提高23%，綜合經(jīng)濟(jì)效益提高20%左右。
家蠶屬于雌異型昆蟲，雌蠶性染色體為ZW，雄蠶為TL·，如果在其Z染色體上有一個(gè)隱性致死突變基因，則在雌性個(gè)體中，隱性致死突變基因發(fā)揮作用，使雌性個(gè)體死亡；而在雄性個(gè)體中，由于有兩個(gè)Z染色體，如果僅有一個(gè)Z染色體上帶有隱性致死突變，另一個(gè)Z 染色體上是正?；?，則這樣的雄性個(gè)體仍然存活。
家蠶性連鎖平衡致死系性比控制的關(guān)鍵在于隱性致死突變基因，家蠶性連鎖平衡致死系雌性個(gè)體的Z染色體上有一個(gè)隱性致死突變基因I1 (SLBL-I1)；在其W染色體上有一個(gè)來(lái)自Z染色體的易位片段，能夠掩蓋Z染色體上隱性致死突變基因的致死作用，其基因組為fi11。家蠶性連鎖平衡致死系雄性個(gè)體的兩個(gè)Z染色體上各含有一個(gè)非等位的隱性致死突變基因，一個(gè)Z染色體上含有一個(gè)隱性致死突變基因I1 (SLBL-I1),另一個(gè)Z染色體上含有一個(gè)隱性致死突變基因厶(51見(jiàn)-4)，其基因型為Z"Z"。家蠶性連鎖平衡致死系自交，后代有四種基因型(雌，活)，z"浐(雄，活)，w"浐(雌，死)，z"z"(雄，死)，雌雄各有一半死亡；當(dāng)常規(guī)雌蠶與性連鎖平衡致死系的雄蠶雜交，后代雌蠶全部死亡，雄蠶全部存活，從而達(dá)到控制性比、專養(yǎng)雄蠶的目標(biāo)。發(fā)明內(nèi)容
為了解決家蠶后代性比控制的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供家蠶性染色體連鎖基因5Z0557及一種基因編碼的蛋白質(zhì)；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述的家蠶性染色體連鎖基因突變的一個(gè)家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因51見(jiàn)及其編碼的蛋白質(zhì)；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述的基因用于選育雄蠶；本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種分子標(biāo)記法進(jìn)行致死基因51見(jiàn)向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法；本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供用于鑒定致死基因SLBL-I2的方法及其特異性引物。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案家蠶性染色體連鎖基因5Z0557，該基因具有kq ID NO. 1所示的mRNA序列。
上述的kq ID NO. 1所示的mRNA序列包含7個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)屬于糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，參與保持細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的動(dòng)態(tài)平衡及胚胎的發(fā)育。上述的mRNA序列編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有^^ ID NO. 2所示的氨基酸序列共319個(gè)氨基酸。經(jīng)RNA干擾研究發(fā)現(xiàn)，注射基因dsRNA的家蠶在胚胎期出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，致死時(shí)期在反轉(zhuǎn)期終了期 (25°C條件下催青第6天左右)。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因，該基因由kq ID NO. 1所示的mRNA序列經(jīng)過(guò)突變得到。
作為優(yōu)選，本發(fā)明提供了家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因51見(jiàn)-4，該基因具有 Seq ID NO. 3所示的mRNA序列。上述的mRNA序列編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有kq ID NO. 4 所示的氨基酸序列。51見(jiàn)基因是由于缺失了包含第四個(gè)外顯子在內(nèi)1，019 bp的片段， 該基因在表達(dá)時(shí)第五外顯子隨內(nèi)含子一起被切除，產(chǎn)生的mRNA只有5個(gè)外顯子，只有1，617 bp，編碼249個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域不完整，喪失正常生理功能，引起胚胎發(fā)育停止(25°C條件下催青第6天左右)，其表型與SLC35B1基因的RNA干擾結(jié)果一致。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案上述的基因5Z0557突變基因以及基因51見(jiàn)用于選育雄蠶。本發(fā)明提供的家蠶基因SLC35B1經(jīng)過(guò)突變或缺失得到的基因，能夠引起雌蠶在胚胎期致死，而雄蠶可以存活，具有控制家蠶雜交后代性比的特性。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第四個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案分子標(biāo)記法進(jìn)行所述的致死基因SLBL-I2向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法，該方法包括以下的步驟1)選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與正常品系的雌蠶雜交，F(xiàn)l代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型TL11或TL12全部存活，雄蠶飼養(yǎng)至蛾期，與正常品系的雌蠶進(jìn)行單蛾雜交， 雄蛾與卵圈一一對(duì)應(yīng)，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇基因型為TL12的雄蛾的后代F2繼續(xù)飼養(yǎng)，不含基因的卵圈棄去；2)將F2代蠶飼養(yǎng)至蛾期，選擇雄蛾與正常品系的雌蠶進(jìn)行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇基因型為U12的雄蛾的后代F3繼續(xù)飼養(yǎng)；如此反復(fù)多代雜交，即將基因SLBL-I2導(dǎo)入正常品系中。
本發(fā)明采用分子標(biāo)記輔助育種，便于將SLBL-I2基因轉(zhuǎn)育到常規(guī)家蠶品種中，加速育種進(jìn)程。作為最優(yōu)選，上述的特異性的PCR引物如下正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC ；基因型為 TZ12 的雄蛾含有基因SLBL-I2,能夠擴(kuò)增出750 bp片段。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第五個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案用于鑒定致死基因51見(jiàn)的方法，該方法采用特異性的PCR引物，正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC,反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC，進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，能夠擴(kuò)增出750bp片段為致死基因SLBL-I20
用于鑒定致死基因SLBL-I2的特異性引物，該特異性引物由正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC,反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC 組成。該特異性弓丨物還可以用于進(jìn)行致死基因SLBL-I2向常規(guī)品系的轉(zhuǎn)育及性比控制品種的分子鑒定。
本發(fā)明提供了一個(gè)家蠶性染色體連鎖基因及其隱性致死突變基因 SLBL-I2的序列及PCR鑒定的特異性引物；利用標(biāo)記輔助育種技術(shù)可加速51見(jiàn)向常規(guī)品系的轉(zhuǎn)育，在家蠶后代性比控制、專養(yǎng)雄蠶、提高絲質(zhì)品質(zhì)等生產(chǎn)中有重大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為家蠶性染色體連鎖基因SLC35B1及其隱性致死突變基因SLBL-I2的結(jié)構(gòu)模式圖。
圖2為攜帶基因蠶胚胎發(fā)育圖，胚胎在反轉(zhuǎn)期停止發(fā)育(25°C條件下催青第6天左右)。
圖3 敏SLC35B1基因dsRNA的家蠶胚胎發(fā)育圖，家蠶在胚胎期出現(xiàn)死亡現(xiàn)象， 致死時(shí)期在反轉(zhuǎn)期終了期(25°C條件下催青第6天左右)，死亡胚胎尚未著色。
圖4為家蠶性連鎖平衡致死系與常規(guī)品系雜交育種圖。
具體實(shí)施方式
下面就本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要指出的是，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，一下實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明均按常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、家蠶SLC35B1基因的克隆1.1用Trizol試劑(購(gòu)自hvitrogen公司)提取家蠶P50等常規(guī)品系的總RNA，以 Olig-d(T) 18為引物，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以所合成的 cDNA 為模板，以正向引物(SLC35B1 F 5‘ -ATTGACGTACGACATTCGTACTTTCG-3‘)和反向引物(SLC35B1 R: 5' -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3')進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物連接到 pMD-18載體(大連Takara公司)中，得到重組質(zhì)粒pMD_SLC35Bl，經(jīng)序列測(cè)定，獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物為1，733 bp，序列如kq. NOl所示，其編碼區(qū)為219-1，175，所編碼的蛋白質(zhì)含有319個(gè)氨基酸，序列如kq. N02所示。
1. 2提取家蠶P50等常規(guī)品系的基因組DNA，以正向引物(SLC;35B1 F 5'-ATTGACG TACGACATTCGTACTTTCG-3‘)和反向引物(SLC35B1 R: 5‘ -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3‘) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR經(jīng)克隆、序列測(cè)定，并與前面的RNA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)家蠶5Z0557基因的 mRNA包含7個(gè)外顯子(如圖1)。
1.3 用特異性的 PCR 引物(正向引物5 ‘ -GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC-3 ‘，反向引物5'-GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC-3')對(duì)家蠶P50等常規(guī)品系的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物為1，769 bp。
實(shí)施例2、家蠶性連鎖平衡致死系致死基因I2 (SLBL-I2)基因的克隆2. 1提取家蠶性連鎖平衡致死系的總RNA，以O(shè)lig-(KT)w為引物，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以所合成的cDNA為模板，以正向弓丨物(SLC35B1 F :5'-ATTGACGTACGACATTCGTACTTTCG-3')和反向引物(SLC35B1 R: 5' -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3')進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物連接到 pMD-18 載體(大連 Takara公司)中，經(jīng)序列測(cè)定，獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1，523 bp，序列如kq. N03所示，其編碼區(qū)為219-965，所編碼的蛋白質(zhì)含有249個(gè)氨基酸，序列如kq. N04所示。
2. 2提取家蠶性連鎖平衡致死系的基因組DNA，以正向引物 (SLC35B1 F :5'-ATTGACGTACGACATTCGTACTTTCG-3')和反向引物(SLC35B1 R: 5 ‘ -GATCTAAACAGATATGGTATATCCG-3 ‘)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR經(jīng)克隆、序列測(cè)定，并與正常 SLC35B1基因的RNA序列比對(duì)，HSLBL-I2基因缺失了包含第四個(gè)外顯子在內(nèi)1，019 bp 的片段，造成基因在表達(dá)時(shí)第五外顯子隨內(nèi)含子一起被切除，產(chǎn)生的mRNA只有5個(gè)外顯子 (如圖1)。
2.3 用特異性的 PCR 引物(正向引物5‘ -GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC-3‘，反向引物5' -GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC-3')對(duì)家蠶性連鎖平衡致死系的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物為750 bp.利用該特異性的PCR 引物可對(duì)家蠶5Z0557正常基因及其隱性致死突變基因進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例3、家蠶SLC35B1基因的RNA干擾3.1 重組質(zhì)粒 pMD-SLC;35Bl 為模板，用 T7+SLC35B1 F (5‘ -TAATACGACTCACTATAGGGATT GACGTACGACATTCGTACTTTCG-3‘)、T7+SLC35B1 R(5‘-TAATACGACTCACTATAGGGGATCTAAACAGAT ATGGTATATCCG-3')引物進(jìn)行PCR，獲得的PCR產(chǎn)物用HKcribeTM RNAi轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自 BioLabs公司)轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。
3. 2選取家蠶PND品系的雌蛾產(chǎn)卵后2小時(shí)左右的新鮮蠶卵，按照每粒蠶卵注射 5 nl濃度為2 yg/μ 的dsRNA，注射后的蠶卵放在25°C條件下催青，第6、第7、第8天后分別取部分解剖蠶卵，在顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育。
3. 3顯微觀察發(fā)現(xiàn)，注射了 SLC35B1基因的dsRNA的蠶卵胚胎在催青第6后停止了發(fā)育，胚胎不能轉(zhuǎn)色，表型與胚胎的表型一致(如圖2、圖3所示)。
實(shí)施例4、分子標(biāo)記輔助進(jìn)行基因向常規(guī)品系的轉(zhuǎn)育選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與常規(guī)品系的雌蠶雜交，F(xiàn)l代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型(ZZ"或ZZ")全部存活，雄蠶飼養(yǎng)至蛾期，與常規(guī)品系的雌蠶進(jìn)行單蛾雜交，雄蛾與卵圈一一對(duì)應(yīng)，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物(正向引物 5'-GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC-3'，反向引物5'-GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC-3')進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，選擇能夠擴(kuò)增出750 bp (表示含有基因)片段的雄蛾的后代(F2代，基因型為U12、繼續(xù)飼養(yǎng)。不含基因的卵圈棄去，減少養(yǎng)蠶工作量。
將F2代蠶飼養(yǎng)至蛾期，選擇雄蛾與常規(guī)品系的雌蠶進(jìn)行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇能夠擴(kuò)增出750 bp片段的雄蛾的后代(F3代，基因型為ZZ")繼續(xù)飼養(yǎng)。如此反復(fù)多代雜交，就可將基因?qū)氤Ｒ?guī)品系中(如圖4)。
權(quán)利要求
1.家蠶性染色體連鎖基因51^557，其特征在于該基因具有^^ID NO. 1所示的mRNA 序列。
2.權(quán)利要求1所述的mRNA序列編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有kqID NO. 2 所示的氨基酸序列。
3.家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因，其特征在于該基因fikqID NO. 1所示的 mRNA序列經(jīng)過(guò)突變得到。
4.家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因51見(jiàn)-4，其特征在于該基因具有^^ID NO. 3 所示的mRNA序列。
5.權(quán)利要求3或4所述的基因用于選育雄蠶。
6.分子標(biāo)記法進(jìn)行權(quán)利要求4所述的致死基因SLBL-I2向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與正常品系的雌蠶雜交，F(xiàn)l代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型TL11或TL12全部存活，雄蠶飼養(yǎng)至蛾期，與正常品系的雌蠶進(jìn)行單蛾雜交， 雄蛾與卵圈一一對(duì)應(yīng)，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇基因型為TL12的雄蛾的后代F2繼續(xù)飼養(yǎng)，不含基因的卵圈棄去；2)將F2代蠶飼養(yǎng)至蛾期，選擇雄蛾與正常品系的雌蠶進(jìn)行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性的PCR引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇基因型為U12的雄蛾的后代F3繼續(xù)飼養(yǎng)；如此反復(fù)多代雜交，即將基因SLBL-I2導(dǎo)入正常品系中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子標(biāo)記法進(jìn)行權(quán)利要求4所述的致死基因SLBL-I2向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法，其特征在于步驟1)和步驟2)中特異性的PCR引物如下正向引物 GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC ；基因型為 TL12 的雄蛾含有基因SLBL-I2,能夠擴(kuò)增出750 bp片段。
8.用于鑒定權(quán)利要求4所述的致死基因SLBL-I2的方法，其特征在于該方法采用特異性的PCR引物，正向引物GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物 GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC，進(jìn)行PCR檢測(cè)，能夠擴(kuò)增出750bp片段為權(quán)利要求3所述的致死基因SLBL-I20
9.用于鑒定權(quán)利要求4所述的致死基因的特異性引物，其特征在于該特異性引物由正向引物GAGCTGAAGACTGGGCCGTCGTC，反向引物GGATCGCAATTTCTCGTCGGCTC 組成。
10.權(quán)利要求9所述的特異性引物用于進(jìn)行權(quán)利要求3所述的致死基因SLBL-I2向常規(guī)品系的轉(zhuǎn)育及性比控制品種的分子鑒定。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一個(gè)來(lái)自家蠶性(Z)染色體，具有隱性致死突變特征的SLC35B1(solutecarrierfamily35memberB1)基因及其在家蠶雜交后代性比控制中的應(yīng)用。本發(fā)明所公開(kāi)的家蠶SLC35B1基因來(lái)自于家蠶性(Z)染色體，其隱性致死突變是來(lái)自于家蠶性連鎖平衡致死系(sex-linkedbalancedlethal(SLBL))的致死基因l2(SLBL-l2)，能夠引起雌蠶在胚胎期致死，而雄蠶可以存活，具有控制雜交后代性比的特性，利用其序列特性，在家蠶育種過(guò)程中，輔助進(jìn)行家蠶性連鎖平衡致死系的轉(zhuǎn)育，專養(yǎng)雄蠶，提高絲質(zhì)品質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102533773SQ201110457128
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者何麗華, 劉巖, 孟智啟, 柳新菊, 牛寶龍, 祝新榮, 翁宏飆, 譚安江, 黃勇平 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院