專利名稱：家蠶性染色體連鎖基因PdpⅠ及其隱性致死突變基因和它們在家蠶性比控制中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一個來自家蠶性染色體、具有隱性致死特征的/V/7 I基因缺失突變及其在家蠶雜交后代群體性比控制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
家蠶屬于雌異型昆蟲，雌蠶性染色體為zw，雄蠶為ττ’如果在其ζ染色體上有一個隱性致死突變基因，則在雌性個體中，隱性致死突變基因發(fā)揮作用，使雌性個體死亡；而在雄性個體中，由于有兩個Z染色體，如果僅有一個Z染色體上帶有隱性致死突變，另一個Z染色體上是正?；颍瑒t這樣的雄性個體仍然存活。就一個蠶品種而言，雄蠶繭的繭層率和鮮繭出絲率要比雌蠶繭高，且雄蠶食桑量少，葉絲轉(zhuǎn)化率高；此外，雄蠶體質(zhì)強健，更容易飼養(yǎng)，而且雄蠶絲纖度細、凈度好，適于剿制高品位生絲。為此，世界各國科學家對專養(yǎng)雄蠶技術(shù)進行了一系列的探索。1975年俄羅斯科學家V. A. Strunnikov等運用輻射誘變等技術(shù)手段，將家蠶10號常染色體上的顯性卵色基因易位到W染色體上，將原來10號染色體上的等位基因突變?yōu)閣2，培育出限性卵色品系，雌卵為黑色，雄卵為黃色。再對該品系進行輻射誘變，用Z染色體上的as油蠶性狀標記做篩選，將Z染色體上的一個帶有顯性性狀的片段易位到W染色體上。然后在兩條Z染色體上各誘導一個非等位又緊密連鎖的致死基因Λ (51見-Λ)和厶(.SLBL-I2).致死基因厶可以被易位到W染色體中的正?；蛩采w，而致死基因I2不能被易位到W染色體上片段所覆蓋，育成了家蠶性連鎖平衡致死系。家蠶性連鎖平衡致死系雌性個體的Z染色體上有致死基因Λ ；在其W染色體上有一個來自Z染色體的易位片段、能夠掩蓋Z染色體上致死基因I1的正?；?，其基因型為I11Zn。家蠶性連鎖平衡致死系雄性個體的兩個Z染色體上各含有一個非等位的隱性致死突變基因，一個Z染色體上含有致死基因Λ，另一個ζ染色體上含有致死基因厶，其基因型為η家蠶性連鎖平衡致死系自交，后代有四種基因型=W+77Z77 (雌，黑色，活)，Z77Z7"(雄，黃色，活)，t11!12 (雌，黑色，死)，I11I11 (雄，黃色，死)，雌雄各有一半死亡；當常規(guī)雌蠶與性連鎖平衡致死系的雄蠶雜交，后代雌蠶全部死亡，雄蠶全部存活，從而達到控制性比、專養(yǎng)雄蠶的目標。1996年春，浙江省農(nóng)業(yè)科學院從俄羅斯科學院引進了以家蠶性連鎖平衡致死系S-8、S-14，并開展了利用性連鎖平衡致死技術(shù)實現(xiàn)專養(yǎng)雄蠶的研究。經(jīng)10年攻關(guān)研究，創(chuàng)建了家蠶性連鎖平衡致死系細胞控制基因和導入方法(專利號ZL01132108. 3)、回交改良家蠶性連鎖平衡致死系的方法(專利號ZL01U6809. 3)、一種雜交改良家蠶性連鎖平衡致死系性狀的方法(專利號200810061660. 5)三項國家發(fā)明專利；建立了一個低成本的雄蠶雜交種繁育方法；育成了秋華X平30、華菁X平60等家蠶性連鎖平衡致死實用蠶品種，雄蠶率達99. 8%，繭層率和出絲率比常規(guī)品種提高23%，綜合經(jīng)濟效益提高20%左右
發(fā)明內(nèi)容
為了解決家蠶后代性比控制的技術(shù)問題。本發(fā)明的第一個目的是提供家蠶性染色體連鎖基因/V/7 I及一種基因編碼的蛋白質(zhì)；本發(fā)明的第二個目的是提供上述的家蠶性染色體連鎖基因突變的一條家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因SLBL-I1及其編碼的蛋白質(zhì)；本發(fā)明的第三個目的是提供上述的基因用于選育雄蠶；本發(fā)明的第四個目的是提供一種分子標記法進行致死基因51見-Λ向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法；本發(fā)明的第五個目的是提供用于鑒定致死基因51見-Λ的方法及其特異性引物。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
家蠶性染色體連鎖基因/ I，該基因具有kq ID NO. USeq ID NO. 3、Seq ID NO. 5、Seq ID NO. 7、Seq ID NO. 9 和 kq ID NO. 11 所示的 mRNA 序列。Pdp I基因具有10個外顯子，三個不同的啟動子，可編碼6種不同的mRNA，序列如 kq ID NO. USeq ID NO. 3、Seq ID NO. 5、Seq ID NO. 7、Seq ID NO. 9 和 kq ID NO. 11所示，翻譯 6 種蛋白質(zhì)，序列如 kq ID NO. 2,Seq ID NO. 4,Seq ID NO. 6,Seq ID NO. 8,SeqID NO. 10和^^ ID NO. 12所示。/ I基因?qū)儆阡\指類調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在家蠶胚胎的肌肉、表皮、中腸及脂肪組織中都有表達，參與生物節(jié)律調(diào)控，調(diào)控細胞內(nèi)核酸復(fù)制、細胞有絲分裂及胚胎及幼蟲的生長發(fā)育。該基因的缺失可造成胚胎發(fā)育的停止。致死時期在轉(zhuǎn)青期，死亡蠶卵外表呈青灰色，蟻蠶不能孵化。經(jīng)RNA干擾研究發(fā)現(xiàn)，注射/V/7 I基因dsRNA的家蠶在胚胎后期出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，致死時期在轉(zhuǎn)青期(25°C條件下催青第9天左右)，蟻蠶不能孵化。為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因，該基因具有kq ID NO. U Seq ID NO. 3, Seq IDNO. 5、Seq ID NO. 7、Seq ID NO. 9和kq ID NO. 11所示的mRNA序列經(jīng)過突變獲得的基因序列。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供一種家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因5Ζ/ Ζ-Λ，該基因具有^^ ID Ν0. 13所示的DNA序列。上述的致死基因51見所在的Z染色體缺失了包括Pdp I基因在內(nèi)的0. 184Mb的Z染色體片段。融合了一個約4. 3Mb的10號染色體片段。是一個Z-10融合染色體，Pdp I基因的缺失可引起家蠶胚胎致死突變，致死時期在轉(zhuǎn)青期，其表型與/ I基因的RNA干擾結(jié)果一致。為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
上述的基因/V/7 I突變基因、致死基因用于選育雄蠶。本發(fā)明提供的家蠶基因能夠引起雌蠶在胚胎期致死，而雄蠶可以存活，具有控制家蠶雜交后代性比的特性。為了實現(xiàn)上述的第四個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
分子標記法進行所述的致死基因51見-Λ向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法，該方法包括以下的步驟
1)選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與常規(guī)品系的雌蠶雜交，F(xiàn)l代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型全部存活，基因型為TL11或TL12,雄蠶飼養(yǎng)至蛾期，與常規(guī)品系的雌蠶進行單蛾雜交，雄蛾與卵圈一一對應(yīng)，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性引物進行PCR檢測，選擇含有所述致死基因SLBL-I1的雄蛾的后代F2代，基因型為TL11,繼續(xù)飼養(yǎng)，不含基因的卵圈棄去；2)將F2代蠶飼養(yǎng)至蛾期，選擇雄蛾與常規(guī)品系的雌蠶進行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，進行PCR檢測，選擇含有所述致死基因SLBL-I1的雄蛾的后代F3代，基因型為ZZ"，繼續(xù)飼養(yǎng)；如此反復(fù)多代雜交，就可將基因?qū)氤Ｒ?guī)品系中。本發(fā)明采用分子標記輔助育種，便于將SLBL-I1基因轉(zhuǎn)育到常規(guī)家蠶品種中，加速育種進程。作為最優(yōu)選，上述的特異性的PCR引物如下正向引物5' -GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3'，反向引物5 ‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3 ‘；基因型為ZZ 11含有所述致死基因SLBL-I1的雄蛾能夠擴增出2，940 bp片段。為了實現(xiàn)上述的第五個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
用于鑒定致死基因51見-Λ的方法，該方法采用特異性的PCR引物，正向引物5' -GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3'，反向引物5 ‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3 ‘，進行 PCR檢測，能夠擴增出2，940 bp片段的為權(quán)利要求3所述的致死基因SLBL-I10用于鑒定致死基因51見-Λ的特異性引物，該特異性的PCR引物由正向引物5 ‘ -GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3 '，反向引物5 ‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3 '組成。該特異性引物還可以用于進行致死基因51見-Λ向常規(guī)品系的轉(zhuǎn)育及性比控制品種的分子鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因I1 (.SLBL-I1)所在的Z染色體是一個Z-IO融合染色體，具有胚胎期隱性致死特性，致死的原因是由于缺失了/V/7 I基因。利用公布的特異性引物可對該染色體進行分子鑒定；利用其隱性致死突變可對雜交后代的性比進行控制；利用分子標記輔助將該染色體向常規(guī)品系進行轉(zhuǎn)育，加快育種進程，培育全雄品系并進行推廣應(yīng)用。


圖1為家蠶/V/7 I基因的基因結(jié)構(gòu)圖。圖2為/V/7 I基因的干擾后家蠶胚胎發(fā)育圖，家蠶在胚胎后期出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，致死時期在轉(zhuǎn)青期，25°C條件下催青第9天左右，蟻蠶不能孵化。圖3為含有致死基因的家蠶胚胎發(fā)育圖，可引起家蠶胚胎致死突變現(xiàn)象，致死時期在轉(zhuǎn)青期，其表型與/V/7 I基因的RNA干擾結(jié)果一致。圖4為致死基因SLBL-I1染色體結(jié)構(gòu)模式圖。圖5為家蠶性連鎖平衡致死系與常規(guī)品系雜交育種圖。
具體實施例方式下面就本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。需要指出的是，以下實施例僅用于說明本發(fā)明，一下實施例中如無特殊說明均按常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、家蠶/ I (Par domain protein I)基因的克隆
1. 1用Trizol試劑(購自hvitrogen公司)提取家蠶P50等常規(guī)品系的總RNA，以O(shè)lig-d(T) 18為引物，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以所合成的cDNA為模板，以正向引物(Pdp 1 F 5' -GTGGACCTAGATGAGTTCCTGTC-3 ‘)和反向引物(Pdpl R: 5' -CGTTCCTCTAAATTTGTCCAGG-3')進行 PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物連接到 pMD-18 載體(大連Takara公司)中，得到重組質(zhì)粒pMD- Pdp I，經(jīng)序列測定，獲得的PCR擴增產(chǎn)物產(chǎn)物為 750 bp。1.2用獲得的750 bp的序列檢索家蠶EST數(shù)據(jù)庫，對檢索到的EST序列進行拼接分析，并檢索家蠶基因組DNA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)家蠶/V/7 I基因有三個不同的啟動子，有10個外顯子，基因結(jié)構(gòu)如圖1所示，可轉(zhuǎn)錄合成6中不同的mRNA，序列如kq ID NO. 1、Seq IDNO. 3、Seq ID NO. 5、Seq ID NO. 7、Seq ID NO. 9 和 kq ID NO. 11 所示，翻譯 6 種蛋白質(zhì)，序列如 kq ID NO. 2、Seq ID NO. 4、Seq ID NO. 6、Seq ID NO. 8、Seq ID NO. 10 和 kq IDNO. 12所示。Pdp I屬于鋅指類調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在家蠶胚胎的肌肉、表皮、中腸及脂肪組織中都有表達，參與生物節(jié)律調(diào)控基因，調(diào)控細胞內(nèi)核酸復(fù)制，細胞有絲分裂及胚胎及幼蟲的生長發(fā)育。1.3 重組質(zhì)粒 pMD- Pdpl 為模板，用 T7+Pdp I F(5'-TAATACGACTCACTATAGGGGTGGACCTAGATGAGTTCCTGTC -3')、T7+Pdp I R(5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGTTCCTCTAAATTTGTCCAGG -3')引物進行PCR，獲得的PCR產(chǎn)物用HKcribeTM RNAi轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自BioLabs公司)轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。1. 4選取家蠶PND品系的雌蛾產(chǎn)卵后2小時左右的新鮮蠶卵，按照每粒蠶卵注射5 nl濃度為2 yg/μ 的dsRNA，注射后的蠶卵放在25°C條件下催青，第10天后，在顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育。1. 5顯微觀察發(fā)現(xiàn)，注射了/V/7 I基因的dsRNA的胚胎大多在轉(zhuǎn)青期致死，死亡蠶卵外表呈青灰色，部分蟻蠶雖能咬破卵殼，但不能爬出，輕與SLBL-I1胚胎的表型一致(如圖2)。實施例2、家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因I1所在的Z染色體特異性序列克隆2. 1提取家蠶性連鎖平衡致死系黃色雄性死亡胚胎(基因型為I11I11)的基因組DNA，用
特異性引物(F 5‘ -GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3‘，R 5‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3‘)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆、序列測定，具有％(1 ID N0. 13所示的特異序列。2. 2將kq ID NO. 13所示的序列與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中的DNA序列比對，并與前面的RNA序列比對，發(fā)現(xiàn)1-567的序列來自Z染色體，5794490來自于10號染色體，之間GAAACATGTAT為拼接序列，其染色體結(jié)構(gòu)模式如圖4所示。2. 3對家蠶性連鎖平衡致死系黃色雄性死亡胚胎(基因型為廣廣)基因組DNA的檢測發(fā)現(xiàn)，致死基因I1 (SLBL-I1)所在的Z染色體末端有大約0. 184Mb(chrl :22203367-22395194)的片段缺失，其中含有13個預(yù)測功能基因，通過對這些基因的表達分析，發(fā)現(xiàn)僅有/ I (Par domain protein I)在胚胎期表達，且家蠶性連鎖平衡致死系黃色雄性死亡胚胎(基因型為廣廣)的表型與/V/7 I基因的RNA干擾結(jié)果一致(如圖3)，說明SLBL-I1的隱性致死特性是由于/ ^基因缺失造成的。實施例3、分子標記輔助進行基因向常規(guī)品系的轉(zhuǎn)育
選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與常規(guī)品系的雌蠶雜交，F(xiàn)l代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型(ZZ"或ZZ")全部存活，雄蠶飼養(yǎng)至蛾期，與常規(guī)品系的雌蠶進行單蛾雜交，雄蛾與卵圈一一對應(yīng)，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性引物(F:5' -GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3'，R 5 ‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3 ‘，)進行 PCR 檢測，選擇能夠擴增出2，940 bp片段的雄蛾的后代(F2代，基因型為ZZ")繼續(xù)飼養(yǎng)。不含5ΜΖ-Λ基因的卵圈棄去，減少養(yǎng)蠶工作量。CN 102559691 A說明書5/5 頁 將F2代蠶飼養(yǎng)至蛾期，選擇雄蛾與常規(guī)品系的雌蠶進行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，進行PCR檢測，選擇能夠擴增出2，940 bp片段的雄蛾的后代(F3代，基因型為ZZ")繼續(xù)飼養(yǎng)。如此反復(fù)多代雜交，就可將基因?qū)氤Ｒ?guī)品系中(如圖5)。
權(quán)利要求
1.家蠶性染色體連鎖基因/ I，其特征在于該基因具有kq ID NO. USeq ID NO. 3、Seq ID NO. 5、Seq ID NO. 7、Seq ID NO. 9 和 kq ID NO. 11 所示的 mRNA 序列。
2.權(quán)利要求1所述的mRNA序列編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有kqID NO. 2、Seq ID NO. 4,Seq ID NO. 6,Seq ID NO. 8,Seq ID NO. 10 和 kq ID NO. 12 所示的氨基酸序列。
3.家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因，其特征在于該基因具有^^ID NO. U Seq IDNO. 3、Seq ID NO. 5、Seq ID NO. 7、Seq ID NO. 9 和 kq ID NO. 11 所示的 mRNA 序列經(jīng)過突變獲得的基因序列。
4.家蠶性連鎖平衡致死系的致死基因51見-Λ，其特征在于該基因具有^^ID NO. 13所示的DNA序列。
5.權(quán)利要求3或4所述的基因用于選育雄蠶。
6.分子標記法進行權(quán)利要求4所述的致死基因向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)選擇家蠶性連鎖平衡致死系的雄蠶與常規(guī)品系的雌蠶雜交，F(xiàn)l代雌蠶全部死亡，雄蠶有兩種基因型全部存活，基因型為ZZ"或ΖΖ"，雄蠶飼養(yǎng)至蛾期，與常規(guī)品系的雌蠶進行單蛾雜交，雄蛾與卵圈一一對應(yīng)，交配后的雄蛾提取基因組DNA，用特異性引物進行PCR檢測，選擇含有所述致死基因SLBL-I1的雄蛾的后代F2代，基因型為TL11,繼續(xù)飼養(yǎng)，不含基因的卵圈棄去；2)將F2代蠶飼養(yǎng)至蛾期，選擇雄蛾與常規(guī)品系的雌蠶進行單蛾雜交，交配后的雄蛾提取基因組DNA，進行PCR檢測，選擇含有所述致死基因SLBL-I1的雄蛾的后代F3代，基因型為ΖΖ"，繼續(xù)飼養(yǎng)；如此反復(fù)多代雜交，就可將基因?qū)氤Ｒ?guī)品系中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子標記法進行致死基因向常規(guī)品系轉(zhuǎn)育的方法，其特征在于其特征在于步驟1)和步驟2)中特異性的PCR引物如下正向引物5' -GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3'，反向引物5 ‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3 ‘；基因型為ZZ 11含有所述致死基因SLBL-I1的雄蛾能夠擴增出2，940 bp片段。
8.用于鑒定權(quán)利要求4所述的致死基因的方法，其特征在于該方法采用特異性的PCR引物，正向引物5'-GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3'，反向引物5‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3‘，進行PCR檢測，能夠擴增出2，940 bp片段的為權(quán)利要求4所述的致死基因SLBL-I10
9.用于鑒定權(quán)利要求4所述的致死基因的特異性的PCR引物，其特征在于該特異性的PCR引物由正向引物5' -GTGTAGGATCACCGAGCAGTCAC-3'，反向引物5 ‘ -GAGTGACCGACAGGAACGACCTG-3 ‘組成。
10.權(quán)利要求9所述的特異性引物用于進行權(quán)利要求4所述的致死基因向常規(guī)品系的轉(zhuǎn)育及性比控制品種的分子鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一個來自家蠶性染色體、具有隱性致死特征的PdpⅠ基因缺失突變及其在家蠶雜交后代群體性比控制中的應(yīng)用。具有隱性致死特性的家蠶性(Z)染色體連鎖基因PdpⅠ，該突變來自于家蠶性連鎖平衡致死系(sex-linkedbalancedlethal(SLBL))的致死基因l1(SLBL-l1)，該Z染色體末端缺失了包括PdpⅠ(PardomainproteinI)基因在內(nèi)的0.184Mb的片段，并和一個約4.3Mb的10號染色體片段融合組成一個融合染色體。由于Pdp1基因的缺失，具有隱性致死的特性，造成家蠶胚胎發(fā)育停止，利用該變異的致死特性可對家蠶雜交后代的性比進行控制，同時利用其特異性的序列，在家蠶育種過程中，輔助進行家蠶性連鎖平衡致死系的轉(zhuǎn)育，專養(yǎng)雄蠶，提高絲質(zhì)品質(zhì)。
文檔編號A01K67/04GK102559691SQ20111045712
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者何麗華, 劉巖, 孟智啟, 柳新菊, 牛寶龍, 祝新榮, 翁宏飆, 譚安江, 黃勇平 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院