專利名稱：一種羥基酪醇的提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高含量羥基酪醇的制備方法。
背景技術(shù)：
橄欖(olive)在植物學(xué)上屬木樨科(Oleaceae)，其最著名的要數(shù)油橄欖(Olea europaea L.)，后者又稱洋橄欖。油橄欖原產(chǎn)小亞細(xì)亞，主要分布于地中海沿岸地區(qū)，以西 班牙、意大利、葡萄牙以及阿爾巴尼亞為集中產(chǎn)地，現(xiàn)在世界各國都引種栽培，我國也不例 夕卜，20世紀(jì)70 80年代甘肅省率先引進(jìn)國外的油橄欖品種，栽培成功，目前已初具規(guī)模。橄欖葉中已知的主要功效成分有三類簡單酚類化合物(如羥基酪醇、酪醇)；裂 環(huán)烯醚萜(如橄欖苦苷、女貞苷的配基以及它們相應(yīng)的脫酰二醛衍生物)；木酚素類。此三 類化合物都是很好的抗氧化劑。其中，橄欖苦苷在臨床上作為藥品，能抑制病毒、細(xì)菌、微生 物及其引起的毒素，對低密度脂蛋白(LDL)具有抗氧化作用，改善高血壓、高血脂等心血管 疾病，提高T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、吞噬細(xì)胞的再生能力，加強(qiáng)細(xì)胞對病毒和感染的免疫能力。 而作為橄欖苦苷苷元的羥基酪醇，不僅同樣對于低密度脂蛋白(LDL)具有有效的抗氧化保 護(hù)作用和抑制血小板凝集，而且近年來的醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)羥基酪醇對亞硝酸鹽決定的DNA堿 基修飾和酪氨酸消化反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，并能在人類細(xì)胞系統(tǒng)中接觸自由基氧類引起的 細(xì)胞毒性(Visioli, F Free Radical-scavenging property of Olive Oil polyphenol. Biochemical and Biophysical Research communications 247 (1) 1998 :60)。此夕卜輕基酪 醇還具有很強(qiáng)的消炎作用、擴(kuò)張血管和抗菌作用，能夠防止動脈粥樣硬化，能降低某些癌癥 (如乳腺、前列腺、子宮內(nèi)膜，消化道)的發(fā)病率。由于羥基酪醇具有更強(qiáng)的抗氧化活性和降 低癌癥發(fā)病率的作用，因此，作為苷元的羥基酪醇相對其配糖體橄欖苦苷具有更為巨大的 醫(yī)療作用前景。就資源而言，僅我國每年因采收和修剪而廢棄的橄欖葉的總量以萬噸計(jì)，而以西 班牙、意大利、葡萄牙以及阿爾巴尼亞為傳統(tǒng)集中產(chǎn)地的地中海沿岸地區(qū)，其橄欖葉資源可 謂取之不盡，用之不竭。目前國內(nèi)對于橄欖苦苷和羥基酪醇的提取和利用缺乏行之有效的 方法，資源利用率十分低下，造成了極大的浪費(fèi)。國外有專利報道橄欖葉提取物的制備方法，美國專利(US98101563)用80%甲醇 溶劑提取橄欖葉片、真空濃縮、粗提物噴霧干燥，制備橄欖葉片提取物，其中橄欖苦苷含量 約為40%，該方法制備的提取物橄欖苦苷含量低，殘留溶劑有毒性，而且并沒有涉及羥基酪 醇的制備方法。國內(nèi)有報道采用橄欖葉片制備橄欖葉提取物的制備方法，顏宜謙利用橄欖葉制備 橄欖多酚，申報了專利(CN1333203A)，其提取工藝是水提醇沉、乙酸乙酯萃取法制備80% 橄欖多酚提取物，但沒有明確其單體成分。劉岱琳的專利(CN101298411B)，公開了一種從橄 欖提取液中提取羥基酪醇的方法，該方法采取苯乙烯類樹脂柱層析、乙酸乙酯萃取和分子 蒸餾技術(shù)可將橄欖葉中的羥基酪醇提純至70 %，但對其原料中的橄欖苦苷沒有得到利用， 造成了資源的利用不完全。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中不足，提供一種高含量羥基酪醇的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種羥基酪醇的提純方法，包括如下步驟(1)按質(zhì)量比為1 10 40的比例，將橄欖苦苷粗品在攪拌下用去離子水溶解；(2)過中等極性的吸附型大孔樹脂層析柱、活性炭層析柱和中性氧化鋁層析柱至 少一種，用2 5倍于保留體積的去離子水沖洗，隨后用2 5倍于保留體積的體積分?jǐn)?shù)為 30% 70%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇水溶液的洗脫液；(3)真空濃縮所述乙醇水溶液的洗脫液至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；(4)用兩種方法之一種進(jìn)行第一種方法在所述的精制的橄欖苦苷水溶液中，加入無機(jī)酸使溶液的pH = 1 3，在65 90°C，反應(yīng)2 12小時；加入氫氧化鈉飽和水溶液使pH = 7，得到含有羥基酪醇 的水溶液；第二種方法在所述的精制的橄欖苦苷水溶液中，加入糖苷酶，糖苷酶的添加量 為所述橄欖苦苷水溶液質(zhì)量的0. 4% 3. 5%，在37 55°C，反應(yīng)1 8小時，糖苷酶滅活 處理，得到含有羥基酪醇的水溶液；(5)將所述含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度2 10度，以等量乙酸乙酯萃 取2 5次，酯層合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀即為純度> 80%的羥基酪醇。所述大孔型樹脂優(yōu)選AB-8型、DlOl型、D71型、HPD-100型或X_5型樹脂。所述步驟(2)去離子水的體積優(yōu)選為3 4倍于保留體積。所述步驟(2)乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為35% 60%，乙醇水溶液的體積為 3 4倍于保留體積。所述無機(jī)酸為鹽酸、磷酸或冰乙酸。所述步驟(5)所述糖度為3 5度，所述乙酸乙酯的萃取次數(shù)為3 4次。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明的方法，充分利用了橄欖葉資源中橄欖苦苷和羥基酪醇兩大有效成分單 向轉(zhuǎn)化的化學(xué)特性，轉(zhuǎn)化率可接近100%，改變了目前羥基酪醇提純過程中對橄欖苦苷成分 的盲目分離的現(xiàn)狀，而是使其轉(zhuǎn)化成為更具經(jīng)濟(jì)價值的羥基酪醇，提高了經(jīng)濟(jì)效益，同時， 大大降低了制備高含量羥基酪醇的難度。2、本發(fā)明采用柱層析技術(shù)精制橄欖苦苷粗品，使得橄欖苦苷的含量可以至少提高 到60%以上，減少了后續(xù)工藝中乙酸乙酯萃取所需乙酸乙酯的用量和催化反應(yīng)催化劑的用 量，在節(jié)約成本的同時降低了對環(huán)境的污染程度。3、依照本發(fā)明制備的羥基酪醇含量最高可達(dá)90%。4、本發(fā)明首次建立了可以同時分析樣品中橄欖苦苷和羥基酪醇含量的HPLC方 法，可以準(zhǔn)確直觀的監(jiān)控橄欖苦苷和羥基酪醇兩種成分的含量和轉(zhuǎn)化程度。


圖1為橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。圖2為橄欖苦苷40%的HPLC圖譜。
圖3為羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。圖4為橄欖苦苷酶解后得到的含有羥基酪醇的溶液的HPLC圖譜。圖5為精制得到80%羥基酪醇的HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用的原料橄欖苦苷粗品可以是同時含有橄欖苦苷和羥基酪醇兩種成分 的橄欖葉水提濃縮液或粉末，也可以是只含有橄欖苦苷一種成分的橄欖葉水提濃縮液或粉末。橄欖苦苷粗品粉末橄欖苦苷含量不低于10%，羥基酪醇含量不作要求，由橄欖 葉直接以純水熱回流提取、濃縮，噴霧干燥而得。橄欖苦苷水提濃縮液要求液體中橄欖苦苷含量不低于1%，羥基酪醇含量不作 要求，由橄欖葉直接以純水熱回流提取，濃縮而得。本公司研究時采用的是“陜西康盛生物技術(shù)有限公司”生產(chǎn)的橄欖苦苷提取物，但 本發(fā)明不限定使用該產(chǎn)品，與該企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品相似的其它來源的橄欖苦苷粗品粉末或橄 欖苦苷水提濃縮液都可以做為本發(fā)明的原料。各實(shí)施例用HPLC方法同時分析樣品中橄欖苦苷和羥基酪醇的含量，步驟為采用 高效液相色譜法，色譜條件為采用十八烷基化學(xué)鍵和固定相為填充劑，即ODS C18柱，規(guī)格 為250mmX4. 6mm ；紫外檢測波長為280nm，溫度為30°C，流動相為乙腈和0. 2%磷酸水溶液 按體積比為1 1 4的混合液，流速為lml/min。實(shí)施例11)將橄欖苦苷含量為10%的粗品粉末加入30質(zhì)量倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過AB-8型大孔樹脂柱，用3倍于保留體積的去離子水沖洗， 隨后用3倍于保留體積的體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇水溶液的洗脫液；3)將收集的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入鹽酸使溶液的pH= 2，75°C下攪拌7小時，反映 終止時加入適量氫氧化鈉飽和溶液中和至使PH = 7，得到含有羥基酪醇的水溶液；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為81. 36%。實(shí)施例21)將橄欖苦苷含量為1%，羥基酪醇含量為0. 4%的橄欖葉提取濃縮液加入10質(zhì) 量倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過串聯(lián)DlOl型大孔樹脂柱和中性氧化鋁柱，用3倍于保留體 積的去離子水沖洗，隨后用3. 5倍于保留體積的35%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫 液；3)將收集的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入溶液質(zhì)量1. 5%的糖苷酶，45°C下攪拌4小時， 反應(yīng)終止時升溫至75°C保溫30分鐘滅活；得到含有羥基酪醇的水溶液；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度7度，以等量乙酸乙酯萃取4次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為81. 5%。
實(shí)施例31)將橄欖苦苷含量為25%的粗品粉末加入20質(zhì)量倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過中性氧化鋁層析柱，用3倍保留體積的去離子水沖洗，隨 后用4倍于保留體積的50%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫液；3)將收集的含乙醇的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入鹽酸使溶液的pH= 1，75°C下攪拌7小時，反應(yīng) 終止時加入適量氫氧化鈉飽和溶液中和至中性；得到含有羥基酪醇的水溶液；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度10度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯 層合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為83. 4%。實(shí)施例41)將橄欖苦苷含量為0. 2%，羥基酪醇含量為1. 0%的橄欖葉提取濃縮液加入10 質(zhì)量倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過HPD-100型大孔樹脂柱，用2倍保留體積的去離子水沖洗， 隨后用2倍于保留體積的35%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫液；3)將收集的含乙醇的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入冰乙酸使溶液的pH= 3，90°C下攪拌2小時，反 應(yīng)終止時加入適量氫氧化鈉飽和溶液中和至中性；得到含有羥基酪醇的水溶液；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取2次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為80. 6%。實(shí)施例51)將橄欖苦苷含量為40%的粗品粉末加入20質(zhì)量倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過AB-8型大孔樹脂柱，用5倍保留體積的去離子水沖洗，隨 后用5倍于保留體積的60%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫液；3)將收集的含乙醇的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入磷酸，65°C下攪拌12小時，反應(yīng)終止時加入適 量氫氧化鈉飽和溶液中和至中性；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度3度，以等量乙酸乙酯萃取5次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為86. 45%。實(shí)施例61)將橄欖苦苷含量為40%的粗品粉末加入40質(zhì)量倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過AB-8型大孔樹脂柱，用3倍保留體積的去離子水沖洗，隨 后用3倍于保留體積的70%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫液；3)將收集的含乙醇的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入溶液質(zhì)量2%的糖苷酶，50°C下攪拌6小時，反 應(yīng)終止時升溫至75°C保溫30分鐘滅活；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度3度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為86. 55%。實(shí)施例71)將橄欖苦苷含量為40%的粗品粉末加入40質(zhì)量倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?br> 2)將橄欖苦苷水溶液過D71型大孔樹脂柱，用4倍保留體積的去離子水沖洗，隨后 用4倍于保留體積的30%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫液；3)將收集的含乙醇的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入溶液質(zhì)量0.4%的糖苷酶，55°C下攪拌8小時， 反應(yīng)終止時升溫至75°C保溫30分鐘滅活；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為80. 3%。實(shí)施例81)將橄欖苦苷含量為40%的粗品粉末加入40倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過X-5型大孔樹脂柱，用5倍保留體積的去離子水沖洗，隨后 用5倍于保留體積的55%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫液；3)將收集的含乙醇的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入溶液質(zhì)量3. 5%的糖苷酶，45°C下攪拌1小時， 反應(yīng)終止時升溫至75°C保溫30分鐘滅活；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為81. 23%。實(shí)施例91)將橄欖苦苷含量為40%的粗品粉末加入40倍去離子水?dāng)嚢枞芙猓?)將橄欖苦苷水溶液過活性炭層析柱，用2倍保留體積的去離子水沖洗，隨后用2 倍于保留體積的55%乙醇水溶液洗脫，收集含乙醇的洗脫液；3)將收集的含乙醇的洗脫液真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；4)在精制橄欖苦苷水溶液中，加入溶液質(zhì)量2%的糖苷酶，37°C下攪拌6小時，反 應(yīng)終止時升溫至75°C保溫30分鐘滅活；5)將含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯層 合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀物，其羥基酪醇含量為83. 2%。
權(quán)利要求
1.一種羥基酪醇的提純方法，其特征是包括如下步驟(1)按質(zhì)量比為1 10 40的比例，將橄欖苦苷粗品在攪拌下用去離子水溶解；(2)過中等極性的吸附型大孔樹脂層析柱、活性炭層析柱和中性氧化鋁層析柱至少 一種，用2 5倍于保留體積的去離子水沖洗，隨后用2 5倍于保留體積的體積分?jǐn)?shù)為 30% 70%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇水溶液的洗脫液；(3)真空濃縮所述乙醇水溶液的洗脫液至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；(4)用兩種方法之一種進(jìn)行第一種方法在所述的精制的橄欖苦苷水溶液中，加入無機(jī)酸使溶液的pH = 1 3，在 40 90°C，反應(yīng)2 12小時；加入氫氧化鈉飽和水溶液使pH = 7，得到含有羥基酪醇的水 溶液；第二種方法在所述的精制的橄欖苦苷水溶液中，加入糖苷酶，糖苷酶的添加量為所述 橄欖苦苷水溶液質(zhì)量的0. 4% 3. 5%，在37 55°C，反應(yīng)1 8小時，糖苷酶滅活處理，得 到含有羥基酪醇的水溶液；(5)將所述含有羥基酪醇的水溶液真空濃縮至糖度2 10度，以等量乙酸乙酯萃取 2 5次，酯層合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀即為純度> 80%的羥基酪醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基酪醇的提純方法，其特征是所述大孔型樹脂為AB-8 型、DlOl型、D71型、HPD-100型或X-5型樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基酪醇的提純方法，其特征是所述步驟( 去離子水 的體積為3 4倍于保留體積。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基酪醇的提純方法，其特征是所述步驟O)乙醇水溶 液的體積分?jǐn)?shù)為35% 60%，乙醇水溶液的體積為3 4倍于保留體積。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基酪醇的提純方法，其特征是所述無機(jī)酸為鹽酸、磷 酸或冰乙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基酪醇的提純方法，其特征是所述步驟( 所述糖度 為3 5度，所述乙酸乙酯的萃取次數(shù)為3 4次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羥基酪醇的提純方法，步驟為將橄欖苦苷粗品在攪拌下用去離子水溶解；過吸附型大孔樹脂層析柱，用去離子水沖洗，用乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；真空濃縮至無醇，得到精制的橄欖苦苷水溶液；加入無機(jī)酸反應(yīng)；加入氫氧化鈉使pH＝7，得到含有羥基酪醇的水溶液；真空濃縮，以等量乙酸乙酯萃取，酯層合并濃縮除去乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀即為純度≥80％的羥基酪醇。本發(fā)明的方法，充分利用了橄欖葉資源中橄欖苦苷和羥基酪醇單向轉(zhuǎn)化的特性，轉(zhuǎn)化率高，改變了目前羥基酪醇提純過程中對橄欖苦苷成分的盲目分離的現(xiàn)狀，而是使其轉(zhuǎn)化成為更具經(jīng)濟(jì)價值的羥基酪醇，提高了經(jīng)濟(jì)效益，同時，大大降低了制備高含量羥基酪醇的難度。
文檔編號C07C39/11GK102093170SQ20101057377
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者孫華庚, 於洪建 申請人:天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司