專利名稱：：羥基酪醇作為抗衰老劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及羥基酪醇和包含羥基酪醇的組合物作為抗衰老劑的用途。本發(fā)明還涉及抗衰老方法。"抗衰老"在本發(fā)明的上下文中表示延遲動(dòng)物中衰老的過(guò)程，改善動(dòng)物中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或促進(jìn)動(dòng)物中健康的衰老。
背景技術(shù)：
：線粒體是細(xì)胞中負(fù)責(zé)能量產(chǎn)生的細(xì)胞器。線粒體內(nèi)膜中埋有包含復(fù)合體I、II、III、IV和V的呼吸鏈，所述呼吸鏈通過(guò)一系列氧化還原反應(yīng)傳遞電子并產(chǎn)生ATP，這是被稱作氧化磷酸化的過(guò)程。除了對(duì)細(xì)胞提供能量的公知功能以外，線粒體及其組件參與大量其他細(xì)胞活動(dòng)。例如，線粒體還控制產(chǎn)熱和凋亡過(guò)程，并因此涉及衰老過(guò)程。線粒體含有高水平的氧化劑，因?yàn)楹粑溡越档偷男使ぷ鲿r(shí)或者在能量解偶聯(lián)期間產(chǎn)生活性物質(zhì)，例如超氧陰離子。超氧陰離子作為電子傳遞鏈若干步驟中的副產(chǎn)物產(chǎn)生，所述步驟例如復(fù)合體III中輔酶Q的還原，其中形成作為中間體的高度活性的自由基(Q—)。該不穩(wěn)定的屮間體會(huì)導(dǎo)致電子"泄漏"，其中電子直接跳躍至氧并形成超氧陰離子，而不是沿著正常的電子傳遞鏈的一系列受到良好控制的反應(yīng)移動(dòng)?？寡趸瘎┦悄軌驕p緩或阻止其他分子氧化的分子?？寡趸瘎┩ㄟ^(guò)去除自由基中間體來(lái)終止氧化鏈反應(yīng)，并且通過(guò)氧化其自身抑制其他氧化反應(yīng)。還原劑例如硫醇或多酚通常具有抗氧化特性。公知的抗氧化劑例如維生素A、C和E清除自由基并保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)免受損傷?？寡趸瘎┻€保護(hù)線粒體遠(yuǎn)離ATP生產(chǎn)期間產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)和自由基。盡管過(guò)去普遍接受施用抗氧化劑對(duì)于促進(jìn)線粒體生物發(fā)生(biogenesis)是有益的，但是情況顯示并非如此。Gomez-Carberaetal.2008j附./C//".87(1):142-149在雙盲的隨機(jī)化臨床研究中證明，每天口服施用1g維生素C降低骨骼肌中線粒體的生物發(fā)生。過(guò)去羥基酪醇被描述為具有積極的心血管作用(見(jiàn)例如Gonzalez-Santiagoetal2006JAerosc/emws188:35-42;或Mitroetal2003WAfCD.iVw^/rio""/Afetofto/&/n""ofCa/Y//ovascK/afZ)&eosas13(5):306)，f旦是這些涉及羥基酪醇的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用和/或其作為抗氧化劑的狀態(tài)。本發(fā)明涉及羥基酪醇的抗衰老特性，這與其作為抗氧化劑起作用的能力不同。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含羥基酪醇的組合物作為抗衰老劑的用途，其中所述組合物基本不含白藜蘆醇且其中所述組合物被經(jīng)口施用給動(dòng)物。衰老的特征是生理功能的逐漸損失，這可能是由多種細(xì)胞組件中積累的損傷引起的。線粒體是通過(guò)轉(zhuǎn)化三磷酸腺苷(ATP)分子中的營(yíng)養(yǎng)物而在細(xì)胞中產(chǎn)生能量的普遍存在的細(xì)胞器，所述能量被用于正常的細(xì)胞功能和維持。線粒體還涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。最近有人提出，線粒體功能的損失不僅促成疾病，而且在衰老過(guò)程中起重要作用。某些器官中線粒體數(shù)量的降低和線粒體呼吸鏈的損傷常常伴隨著衰老過(guò)程，并且被認(rèn)為是衰老的一個(gè)主要原因。年齡在65-75歲的健康受試者顯示改變的線粒體特性的征兆，其特征是氧化酶活性和組織線粒體含量的損失。另外，得自衰老動(dòng)物的組織顯示線粒體結(jié)構(gòu)的改變，伴隨著降低的能量產(chǎn)生。衰老的人和動(dòng)物器官在組織中具有提高的線粒體DNA(mtDNA)突變水平，并且mtDNA損傷與最大生命期成反比。無(wú)營(yíng)養(yǎng)不良的熱量限制(這是提高生命期的公認(rèn)的最好方法)還增加編碼下述蛋白質(zhì)的基因并減少指示細(xì)胞衰老的DNA損傷，所述蛋白質(zhì)涉及人骨骼肌中的線粒體功能。因此，衰老伴隨著降低的線粒體生物發(fā)生和線粒體損傷的累積。"線粒體生物發(fā)生"是指線粒體生長(zhǎng)、擴(kuò)增和健康維持的過(guò)程。線粒體生物發(fā)生是涉及核參與者和線粒體參與者二者的復(fù)雜過(guò)程。線粒體DNA編碼小量蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在線粒體核糖體上被翻譯。這些蛋白質(zhì)中的大部分是位于線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈的高度疏水的亞基。核編碼的蛋白質(zhì)在胞質(zhì)核糖體上被翻譯，并被輸入線粒體中。這些蛋白質(zhì)包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，酶或酶亞基，輸入機(jī)制、復(fù)制機(jī)制、轉(zhuǎn)錄機(jī)制和翻譯機(jī)制的組件，和陪伴分子。過(guò)氧化物酶體增殖子活化的受體-7共同活化子-l(PGC-l)是細(xì)胞能量代謝的共同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其涉及線粒體功能的控制并誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生。衰老組織中PGC-1的減少是線粒體功能障礙的一個(gè)關(guān)鍵因素，所述線粒體功能障礙可以通過(guò)PGC1的增加來(lái)預(yù)防，所述PGC1的增加導(dǎo)致提高的線粒體生物發(fā)生。羥基酪醇通過(guò)線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活化和線粒體生物發(fā)生的提高改進(jìn)線粒體功能。由此，線粒體功能的改進(jìn)能夠預(yù)防細(xì)胞衰老，并因此預(yù)防身體的衰老。因此，羥基酪醇可以被認(rèn)為是預(yù)防衰老和年齡相關(guān)疾病的一種有用的藥劑。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示PGC-la的表達(dá)。A)PGC-la脂肪細(xì)胞中的Western印跡分析。B)用光密度法針對(duì)尸GC-7wc^微管蛋白比例計(jì)算的定量值。數(shù)值為五個(gè)試驗(yàn)的均值士SE。豐與對(duì)照相比p〈0.05;"與對(duì)照相比P〈0.01。圖2顯示線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)。用羥基酪醇將3T3-L1脂肪細(xì)胞處理48小時(shí)。隨后將細(xì)胞溶于SDS樣品緩沖液中，并通過(guò)Western印跡用針對(duì)*微管蛋白、線粒體電子傳遞復(fù)合物I、復(fù)合物II、復(fù)合物III和復(fù)合物V的抗體進(jìn)行分析。穩(wěn)態(tài)水平蛋白質(zhì)的代表性免疫印跡在頂部(A)顯示。通過(guò)光密度法對(duì)條帶的定量分析在B、C、D和E中分別針對(duì)線粒體復(fù)合物I、復(fù)合物II、復(fù)合物III和復(fù)合物V顯示。所示結(jié)果是來(lái)自4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的對(duì)照與對(duì)照細(xì)胞相比的提高倍數(shù)。*與對(duì)照相比p<0.05。**與對(duì)照相比p<0.01。圖3顯示線粒體DNA的表達(dá)。用羥基酪醇將3T3-L1脂肪細(xì)胞處理48小時(shí)。使用SYBR綠，用熒光對(duì)PCR產(chǎn)物定量。針對(duì)D-環(huán)18sRNA比例計(jì)算定量值。結(jié)果被表述為對(duì)照的提高倍數(shù)。數(shù)據(jù)是均值士SE(n=5)。*與對(duì)照相比PO.05;"與對(duì)照相比p0.01。圖4顯示3T3-L1脂肪細(xì)胞中的氧消耗。將等體積的細(xì)胞在96-LBDOxygenBiosensor平板的孔中分成等分試樣。覆蓋平板，用熒光微板分光光度計(jì)隨時(shí)間記錄每孔中的熒光。A)代表性氧消耗曲線。B)通過(guò)測(cè)定動(dòng)力學(xué)測(cè)量結(jié)果計(jì)算每種條件下脂肪細(xì)胞呼吸速率的定量改變。數(shù)值為均值±SE;顯示的結(jié)果是來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的對(duì)照與對(duì)照細(xì)胞相比。*與對(duì)照相比p〈0.05。圖5顯示用羥基酪醇處理對(duì)脂肪細(xì)胞中復(fù)合物活性的影響。(A)復(fù)合物I，(B)復(fù)合物II，和(C)復(fù)合物III。用不同濃度的羥基酪醇將脂肪細(xì)胞處理48小時(shí)。數(shù)值對(duì)于復(fù)合物I而言是來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的均值土SE，對(duì)復(fù)合物n和m而言是來(lái)自六個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的均值土SE，并且每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行。*與對(duì)照相比？<0.05，^與對(duì)照相比p0.01。PGCla，過(guò)氧化物酶體活化子受體(PPAR)，共同活化子la，是一種轉(zhuǎn)錄共同活化子，其作為大范圍代謝和生理學(xué)過(guò)程的主要調(diào)節(jié)子發(fā)揮作用，并且是線粒體生物發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵因素。PGC-la過(guò)表達(dá)刺激3T3細(xì)胞中線粒體的生物發(fā)生，如提高的線粒體量和活性所示。優(yōu)選地，羥基酪醇是組合物中唯一的活性抗衰老成分。由此，根據(jù)本發(fā)明的組合物和羥基酪醇自身使人年輕和/或健康，帶來(lái)了抗衰老的解決方案，并且預(yù)防衰老過(guò)程和/或使人在衰老時(shí)快樂(lè)或更滿足。本發(fā)明的另一方面是包含羥基酪醇的組合物用于制造下述組合物的用途，所述組合物用于降低動(dòng)物中給定年齡處年齡相關(guān)疾病的發(fā)病率，進(jìn)而提高生存更久的可能性；用于推遲動(dòng)物中衰老過(guò)程的視覺(jué)征兆，例如但不限于頭發(fā)泛灰、皺紋、聽(tīng)覺(jué)功能損失、肌肉量損失、骨密度損失和固有心臟功能的損失；和/或用于降低動(dòng)物中加速衰老過(guò)程的生活方式疾病的風(fēng)險(xiǎn)；其中所述組合物基本不含白藜蘆醇。本發(fā)明的一個(gè)目的是包含羥基酪醇的組合物作為抗衰老劑的用途，其中所述組合物基本不含白藜蘆醇且其中所述組合物經(jīng)口施用給動(dòng)物。羥基酪醇(3,4-二羥基苯乙醇)可以是合成來(lái)源或其可以從橄欖葉、橄欖果實(shí)的提取物和橄欖油生產(chǎn)的植被水(vegetationwater)中被分離。因此，術(shù)語(yǔ)"羥基酪醇"還包括含有羥基酪醇的植物的任何材料或提取物或植物部分的任何材料或提取物或植物(例如橄欖)果實(shí)的任何提取物/濃縮物/果汁，特別是以植物材料或提取物的總重為基礎(chǔ)，以至少30重量％的量，優(yōu)選地以至少40重量％的量，更優(yōu)選地以至少50、55、60、65、70、75、80、85、卯重量％的量，最優(yōu)選地以至少50重量％的量含有羥基酪醇。本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語(yǔ)"植物材料"表示植物的任何部分，還表示果實(shí)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，除了羥基酪醇外還可以使用羥基酪醇衍生物例如酯和生理學(xué)/藥學(xué)可接受的鹽，或者使用它們代替羥基酪醇。合適的衍生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選的羥基酪醇酯為例如乙酸酯或葡糖苷酸綴合物；最優(yōu)選的是橄欖苦苷。"基本不含白藜戸醇"是指組合物中白藜蘆醇的量以組合物的總重為基礎(chǔ)《1重量％，優(yōu)選地<0.5重量％，更優(yōu)選地<0.1重量％。其還表示不有意地向組合物中添加白藜蘆醇。白藜蘆醇僅可作為從植物或植物果實(shí)(例如橄欖)中獲得的羥基酪醇提取物/濃縮物的副產(chǎn)物存在于組合物中。如果存在，則其處于生物活性不顯著的濃度下。"組合物被經(jīng)口施用給動(dòng)物"，這表示組合物是可以被動(dòng)物食用或飲用或通過(guò)口/頜(jaw)放入動(dòng)物胃中的任何形式。因此，組合物優(yōu)選地選自飲食補(bǔ)劑、食物添加劑、功能性食物、詞料添加劑、功能性飼料、食物預(yù)混物、飼料預(yù)混物和飲料。飲食補(bǔ)劑形式的例子是片劑、丸劑、顆粒劑、錠劑、膠囊、即食飲品和泡騰配制物。.食物/飼料添加劑的例子是為用于消耗在食物/飼料的制造期間或其制備期間添加進(jìn)食物/飼料中的任何組合物/配制物。功能性食物的例子是乳制品(酸乳)、谷物棒和烘焙物品例如蛋糕、曲奇和面包。也包括臨床營(yíng)養(yǎng)品。功能性飼料(包括寵物食品組合物)的例子包括旨在提供必需飲食需求的飼料，以及所有的零食(例如狗餅干)或其他飼料補(bǔ)劑。包含根據(jù)本發(fā)明的組合物的動(dòng)物飼料可以是干燥組合物(例如粗粉(kibble))、半濕潤(rùn)組合物、濕潤(rùn)組合物或其任何組合的形式。替代地或額外地，動(dòng)物飼料是補(bǔ)劑例如肉汁(gravy)、飲用水、酸乳、粉末、懸浮液、咀嚼物、調(diào)劑物(例如餅干)或任何其他遞送形式。食物預(yù)混物的例子是用于制造乳制品、谷物棒和烘焙物(例如蛋糕和曲奇)和湯的預(yù)混物。本發(fā)明的另一方面涉及飼料添加劑或添加劑組合物，例如要被添加進(jìn)一種或多種可食用飼料物質(zhì)或成分中，例如用于制備飼料組合物或用于補(bǔ)充現(xiàn)存的飼料以形成飼料組合物。所謂的預(yù)混物是本發(fā)明的動(dòng)物詞料添加劑的例子。預(yù)混物表示一種或多種微量成分(micro-ingredient)與稀釋劑和/或載體的優(yōu)選地均一的混合物。預(yù)混物被用于促進(jìn)微量成分在更大混合物中的均一分散。預(yù)混物可以是顆?；驁F(tuán)粒的形式。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，羥基酪醇在被添加進(jìn)詞料中的形式下或被包含在飼料添加劑屮時(shí)，是充分確定的。術(shù)語(yǔ)"充分確定的"表示羥基酪醇制劑至少為40%純凈。在另一具體的實(shí)施方案中，充分確定的羥基酪醇制劑為至少60%、65%、70%、75%、80°/。、85%、88%、90%、92%、94%或至少95%純凈。通常，脂溶性和水溶性維生素，以及痕量礦物質(zhì)形成用于添加進(jìn)飼料中的所謂預(yù)混物的部分，而主要礦物質(zhì)則通常被獨(dú)立地添加進(jìn)詞料中。另外，任選的飼料添加劑成分是著色劑，例如類胡蘿卜素如^-胡蘿卜素、蝦青素和葉黃素；芳香化合物；穩(wěn)定劑；抗微生物肽；產(chǎn)活性氧的物類；和/或至少一種選自以下的酶植酸酶(EC3丄3.8或3丄3.26);木聚糖酶(EC3.2丄8);半乳聚糖酶(EC3.2丄89);仏半乳糖苷酶(EC3.2丄22);蛋白酶(EC3.4.)、磷脂酶Al(EC3丄L32);磷脂酶A2(EC3丄1.4);溶血磷脂酶(EC3丄1.5);磷脂酶C(EC3丄4.3);磷脂酶D(EC3丄4.4);淀粉酶，例如c^淀粉酶(EC3.2丄1);和/或^-葡聚糖酶(EC3.2丄4或EC3.2.1.6)。飲料包括無(wú)醇飲品和含酒精的飲品，以及要添加進(jìn)飲用水和液體食品中的液體制劑。無(wú)醇飲品為例如方便飲品、軟飲、運(yùn)動(dòng)飲品或一般性運(yùn)動(dòng)飲料、果汁(如例如橙汁、蘋果汁和葡萄汁)；蔬菜汁(如番茄汁)；思慕雪、檸檬水、功能性水、接近水的飲品(即具有低卡路里含量的基于水的飲品)、茶和基于乳的飲品。含酒精的飲品特別是啤酒。液體食品為例如湯和乳制品(例如麥芯飲品)。根據(jù)本發(fā)明的飲食組合物可還含有保護(hù)性水膠體、粘合劑、成膜劑、包封劑/材料、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑(油、脂肪、蠟、卵磷脂等等)、吸附劑、載體、填充劑、輔助化合物、分散劑、濕潤(rùn)劑、加工助劑(溶劑)、流動(dòng)劑、遮味劑、增重劑、啫喱化劑(jellyfyingagents)、凝膠形成劑、抗氧化劑和抗微生物劑。也可以替代飲食補(bǔ)劑使用并被本發(fā)明涵蓋的是藥物組合物。除了可藥用的載體和具有上文給出的優(yōu)選的純度(和其他優(yōu)選級(jí))的羥基酪醇(衍生物)以外，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可還含有常規(guī)的藥物添加劑和佐劑、賦形劑或稀釋劑，包括但不限于水、任何來(lái)源的明膠、植物膠、硫酸木質(zhì)素、滑石、糖、淀粉、阿拉伯膠、植物油、聚亞烷基二醇、調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、濕潤(rùn)劑、填充劑等等。載體材料可以是適用于口施用的有機(jī)或無(wú)機(jī)惰性載體。根據(jù)本發(fā)明的飲食補(bǔ)劑和藥物組合物可以是適用于對(duì)動(dòng)物體(優(yōu)選地對(duì)人體)口施用的任何蓋侖形式(galenicform)，例如固體形式如片劑、丸劑、顆粒劑、錠劑、膠囊和泡騰配制物如粉末和片劑，或液體形式如溶液、乳液或懸浮液，如例如飲料、糊劑和油懸浮液。糊劑可以被填充進(jìn)硬殼或軟殼膠囊中。飲食和藥物組合物可以是受控(延遲)釋放配制物的形式。根據(jù)本發(fā)明，這類組合物被用于延遲動(dòng)物(優(yōu)選人)中的衰老過(guò)程，用于改善動(dòng)物(優(yōu)選人)中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或用于促進(jìn)動(dòng)物(優(yōu)選人)中的健康衰老。因此，本發(fā)明還涉及(具有上文給出的形式和優(yōu)選級(jí)的)被經(jīng)口施用給動(dòng)物(優(yōu)選人)的包含羥基酪醇組合物，所述組合物用于延遲動(dòng)物(優(yōu)選人)中的衰老過(guò)程，用于改善動(dòng)物(優(yōu)選人)中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或用于促進(jìn)動(dòng)物(優(yōu)選人)中的健康衰老，其中所述組合物基本不包含白藜蘆醇。。另外，本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)動(dòng)物施用有效量羥基酪醇或有效量包含羥基酪醇的組合物而延遲動(dòng)物中的衰老過(guò)程，改善動(dòng)物中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或促進(jìn)動(dòng)物中健康衰老的方法，其中所述組合物基本不含白藜蘆醇。動(dòng)物在本發(fā)明的上下文中包括人并包括哺乳動(dòng)物、魚(yú)和鳥(niǎo)。優(yōu)選的"動(dòng)物"是人、寵物動(dòng)物和農(nóng)業(yè)動(dòng)物。特別優(yōu)選的動(dòng)物是人。寵物動(dòng)物的例子是狗、貓、鳥(niǎo)、觀賞魚(yú)(aquariumfish)、荷蘭豬、G'ack)兔子、野兔和雪貂。農(nóng)業(yè)動(dòng)物的例子是觀賞魚(yú)、豬、馬、反芻動(dòng)物(牛、綿羊和山羊)和家禽。"延遲動(dòng)物中的衰老過(guò)程"在本發(fā)明的上下文中表示以下任何一種降低動(dòng)物中給定年齡處年齡相關(guān)疾病的發(fā)病率，進(jìn)而提高生存更久的可能性；推遲動(dòng)物中衰老過(guò)程的視覺(jué)征兆，例如但不限于頭發(fā)泛灰、皺紋、聽(tīng)覺(jué)功能損失、肌肉量損失、骨密度損失和固有心臟功能的損失；和/或降低動(dòng)物中加速衰老過(guò)程的生活方式疾病的風(fēng)險(xiǎn)。"改善動(dòng)物中年齡相關(guān)的生理缺陷"在本發(fā)明的上下文中表示降低(在給定年齡下)發(fā)生年齡相關(guān)疾病的(平均)風(fēng)險(xiǎn)。"促進(jìn)動(dòng)物中健康的衰老"在本發(fā)明的上下文中表示提高健康的生命預(yù)期，即提高保持健康更久的概率。這類效果最好在介入試驗(yàn)中研究，將經(jīng)處理的個(gè)體與未經(jīng)處理的對(duì)照組中平均衰老狀態(tài)/疾病發(fā)病率進(jìn)行比較。用于人(70kg人)的羥基酪醇每日劑量可以為至少0.1mg。其可從5到500mg變化，優(yōu)選地從10到100mg變化。對(duì)哺乳動(dòng)物而言，羥基酪醇的優(yōu)選的劑量從0.28到1.9mg/kg代謝體重變化，其中對(duì)哺乳動(dòng)物而言"代謝體重"[以kg計(jì)]-(體重[以kg計(jì)])a75這表示例如對(duì)70kg的人而言，優(yōu)選的每日劑量應(yīng)在6.77和45.98mg之間變化，對(duì)20kg的狗而言，優(yōu)選的每日劑量應(yīng)在2.23和15.1mg之間變化。本發(fā)明接著通過(guò)以下的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡述。實(shí)施例實(shí)施例1軟明膠膠囊通過(guò)常規(guī)工序來(lái)制備提供下述劑量的軟明膠膠囊，所述劑量為每粒膠囊50mg羥基酪醇。合適的每日劑量為l到5粒膠囊。其它成分甘油。水、明膠、植物油實(shí)施例2通過(guò)常規(guī)工序來(lái)制備提供下述劑量的硬明膠膠囊，所述劑量為每粒膠囊75mg羥基酪醇。合適的每日劑量為1到5粒膠囊。其它成分填料適量的乳糖或纖維素或纖維素衍生物潤(rùn)滑劑如果需耍的話，硬脂酸鎂(0.5%)實(shí)施例3片劑通過(guò)常規(guī)工序來(lái)制備片劑，每片提供100mg羥基酪醇作為活性成分，和微晶纖維素、二氧化硅(Si02)、硬脂酸鎂、交羧甲基纖維素鈉總計(jì)500mg作為賦形劑。實(shí)施例4軟飲可如下制備含有羥基酪醇的軟飲<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>混合果汁濃縮物和水溶性香料而不摻入空氣。將色素溶于去離子水中。將抗壞血酸和檸檬酸溶于水中。將苯甲酸鈉溶于水中。果膠在攪拌下被添加并在煮沸時(shí)溶解。冷卻溶液。預(yù)混合橙油和油溶性香料。將"F"下提到的活性成分?jǐn)嚢柽M(jìn)A的果汁濃縮物混合物中。為了制備軟飲，將所有的組分A-F混合在一起后使用Turrax和隨后使用高壓勻化器(p,=200bar,p2=50bar)勻化。雄伊J5線粒體生物發(fā)生抗兔PGC-la和抗兔PPAR々購(gòu)自SantaCraz(California,美國(guó))；抗畫&微管蛋白來(lái)自Sigma(St.Louis,MO，美國(guó))；Mito畫TrackerGreenFM、抗氧化的復(fù)合體I、II、III和V來(lái)自Invitrogen(Carlsbad,美國(guó))；SYBRGREENPCRMasterMix來(lái)自ABI(Warrington,英國(guó))；BDOxygenBiosensorSystem平板來(lái)自BDBiosciences(California,美國(guó))；羥基酪醇(DSMNutritionalProducts);線粒體D-環(huán)和18SRNA引物由BioasiaBiotech(上海，中國(guó))合成，用于細(xì)胞培養(yǎng)的其他試劑來(lái)自Invitrogen(Carlsbad,美國(guó))。細(xì)胞培養(yǎng)和脂肪細(xì)胞分化在補(bǔ)充有10%胎牛血清的Dulbecco's改良的Eagle's培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞(AmericanTypeCultureCollection),并允許其達(dá)到匯合。用補(bǔ)充有10。/。胎牛血清的DMEM中1piM胰島素、0.25/xM地塞米松和0.5mM3-異丁基-l-甲基黃嘌呤起始前脂肪細(xì)胞的分化。48小時(shí)后，用補(bǔ)充有10%胎牛血清和1^M胰島素的DMEM替換培養(yǎng)基。每隔一天用含10%胎牛血清的DMEM替換培養(yǎng)基。分化誘導(dǎo)后9-10天，當(dāng)顯示卯％脂肪細(xì)胞表型時(shí)使用細(xì)胞。線粒體量的測(cè)定用胰蛋白酶消化脂肪細(xì)胞并于4'C下在1000rpm離心5分鐘，重懸于用HEPES和O.l%BSA緩沖的Kreb'sRinger溶液中，然后在DMEM中于37'C下用0.1pMMitoTrackerGreenFM孵育30分鐘。將細(xì)胞在4'C下以1000ipm離心5分鐘，并重懸于用HEPES緩沖的400[U新鮮的Kreb'sRinger溶液中。為了檢査級(jí)分中的相對(duì)線粒體染色，將來(lái)自每種級(jí)分的200[ilPBS中20x103個(gè)Mitotracker-標(biāo)記的細(xì)胞上樣在96-孔板中，并使用熒光微量培養(yǎng)板分光光度計(jì)(Molecularprobe)對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行讀數(shù)(激發(fā)485±25nm;發(fā)射538±25nm)。結(jié)果被表述為熒光強(qiáng)度超過(guò)未處理的對(duì)照細(xì)胞的提高倍數(shù)。數(shù)值是來(lái)自四個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果的均值士SE。Western印跡分析處理后，用冰冷的PBS將細(xì)胞洗滌兩次，于室溫下在樣品緩沖液(62.5mMTris-ClpH6.8，2°/。SDS，5mMDTT)中裂解，并振蕩。然后將細(xì)胞裂解物煮沸5分鐘并通過(guò)離心(13000ipm，4'C下10分鐘)澄清。使用Bio-RadDC蛋白質(zhì)試驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。對(duì)可溶的裂解產(chǎn)物進(jìn)行10%SDS-PAGE(每條泳道10pg)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并用5Q/o脫脂乳/TBST在室溫下封閉1小時(shí)。在5X奶/TBST中于4'C下將膜與針對(duì)以下的初級(jí)抗體孵育過(guò)夜PPAR々(1:1000)、PGC-la(1:1000)、《■微管蛋白(1:10000)、復(fù)合體I(1:2000)、復(fù)合體II(1:2000)、復(fù)合體III(l:2000)和復(fù)合體V(1:2000)。用TBST將膜洗滌三次后，在室溫下將膜與結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶的二級(jí)抗體孵育1小時(shí)。使用ECL(RocheManheim，德國(guó))使Western印跡顯影，并通過(guò)掃描密度測(cè)定法定量。測(cè)量脂肪細(xì)胞中的呼吸測(cè)量完整細(xì)胞的氧消耗，作為線粒體呼吸活性的指標(biāo)。BDtmOxygenBiosensorSystem(BDBiosciences,FranklinLakes,NJ，美國(guó))是包埋在可透氣且疏水基質(zhì)中的對(duì)氧敏感的熒光化合物(三1,7-聯(lián)苯-1，10二氮雜菲釕(II)氯化物)，所述基質(zhì)永久性附著于多孔板的底部。染料附近的氧濃度與液體培養(yǎng)基中的氧濃度處于平衡中。氧以可預(yù)測(cè)的濃度依賴性方式淬滅染料。熒光的量與孔屮氧消耗的速率相關(guān)，這進(jìn)而可以涉及能夠與氧消耗相關(guān)聯(lián)的任何種類的反應(yīng)。這一特有的技術(shù)允許氧水平的同質(zhì)同時(shí)檢測(cè)。處理后，在添加了1%BSA的KRH緩沖液中洗滌脂肪細(xì)胞。在BDOxygenBiosensorSystem平板(BDBiosciences)中一式三份將來(lái)自每一條件下的細(xì)胞分為等分試樣。將平板密封，在Fluorescence分光光度計(jì)(Molecularprobes)上485nm的激發(fā)波長(zhǎng)和630nm的發(fā)射波長(zhǎng)下，以1分鐘的間隔讀數(shù)60分鐘。多個(gè)條件之間等體積中含有的細(xì)胞數(shù)不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(Wilson-Fritchetal.,2004JClinInvest114:1281-1289)。線粒體DNA的測(cè)量在Mx3000PReal-TimePCR體系(Stratagene)中進(jìn)行定量PCR。用12.5jwlSYBR-GreenMasterMix(ABI)、0.5pi每種引物(IO/xM)、lOOng模板(DNA)或無(wú)模板(NTC)進(jìn)行反應(yīng)，并添加無(wú)RNase的水達(dá)到25pi的終體積。循環(huán)條件如下50。C2分鐘，在95。C下初始變性10分鐘，然后在95'C下30秒、55'C下1分鐘、72'C下30秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)定量PCR一式三份進(jìn)行。使用以下的引物線粒體D-環(huán)正向，5'-AATCTACCATCCTCCGTG-3，(SEQ.ID.NO:1)反向5'-GACTAATGATTCTTCACCGT(SEQ.ID.NO:2)18SRNA正向5'-CATTCGAACGTCTGCCCTATC-3'(SEQ.ID.NO:3)和反向5'國(guó)CCTGCTGCCTTCCTTGGA-3'(SEQ.ID.NO:4)小鼠18SrRNA基因發(fā)揮內(nèi)源參照基因的作用。制作解鏈曲線以確保特異性擴(kuò)增。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用于相對(duì)定量。然后計(jì)算線粒體D-環(huán)與1.8SrRNA的比例。最后的結(jié)果表示為對(duì)照的百分比。線粒體復(fù)合物I、II和III的活性測(cè)定在100mm平板中培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，在PBS中洗滌，重懸于適當(dāng)?shù)牡葷B緩沖液(0.25M蔗糖、5mMTris-HCl，pH7.5和0.1mM苯甲磺酰氟化物)中，并且勻化。通過(guò)細(xì)胞勻化物的差速離心分離線粒體。使用略微修改的常規(guī)實(shí)驗(yàn)(PickloandMontine，2001BiochimBiophysActa1535:145-152;Humphries,K.M.，andSzweda，L.I.1998Biochemistry37:15835-15841)，通過(guò)光譜測(cè)定法測(cè)定NADH-CoQ氧化還原酶(復(fù)合物I)、琥珀酸鹽-CoQ氧化還原酶(復(fù)合物II)、CoQ-細(xì)胞色素c還原酶(復(fù)合物m)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有定性數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)被表示為均值士SE。通過(guò)使用兩組之間的單通道ANOVABonferroni's事后檢驗(yàn)，測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。顯著性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為p0.05。繼羥某酪醇對(duì)脂肪細(xì)胞中PGC-la蛋白質(zhì)水平的影響如圖1中所示，羥基酪醇對(duì)從0.1到10.0/M遞增的PGC-la顯示鐘形影響，在1.0下具有最大蛋白質(zhì)表達(dá)(205±52%，與對(duì)照相比p，0.05)。輕某酪醇對(duì)脂肪細(xì)胞中復(fù)合物I、II、III和V蛋白質(zhì)表達(dá)的影響通過(guò)Western印跡測(cè)定線粒體復(fù)合物(圖2)。在0.1/iM(131±16%，與對(duì)照相比p〈0.05)、l.O岸(163±31%，與對(duì)照相比pO.Ol)和IO.O岸(138±21%,與對(duì)照相比p<0.05)的羥基酪醇處理下觀察到線粒體電子傳遞復(fù)合物I蛋白質(zhì)的增加。羥基酪醇對(duì)線粒體DNA的影響因?yàn)橐阎狣-環(huán)是mtDNA重鏈和輕鏈二者上主要的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，所以我們體外檢查了羥基酪醇是否能夠提高mtDNA表達(dá)。如圖3中所示，在用l.OpM羥基酪醇處理的脂肪細(xì)胞中，mtD-環(huán)/18SRNA的比例顯著提高。羥基酪醇對(duì)脂肪細(xì)胞中氧消耗的影響為了確定提高的線粒體生物發(fā)生是否伴隨著氧消耗的改變，用0.1-IO岸的羥基酪醇處理細(xì)胞。如圖4屮所示，在用1.0-5.0^M羥基酪醇處理的脂肪細(xì)胞中氧消耗的基底速率顯著提高。線粒體復(fù)合物I、II和III活性的測(cè)定相對(duì)于對(duì)照，分別在0.1pM和1.0岸下的羥基酪醇顯示脂肪細(xì)胞中線粒體復(fù)合物I和II活性的顯著提高(圖5A和5B)。在0.1mM-10pM下，羥基酪醇還顯示脂肪細(xì)胞中線粒體復(fù)合物III活性的顯著提高。數(shù)據(jù)顯示羥基酪醇提高mtDNA-編碼的多肽和線粒體電子傳遞復(fù)合物I的表達(dá)。另外，復(fù)合物II和V的活性和氧消耗被提高，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體呼吸活性的提高。最后，羥基酪醇提高過(guò)氧化物酶體增殖子活化的受體-7共同活化子1(pgc-1)的表達(dá)，所述pgc-1涉及線粒體活性和線粒體生物發(fā)生的控制。pgc-1的該增加導(dǎo)致提高的線粒體生物發(fā)生。總之，羥基酪醇促進(jìn)線粒體活性，并可用于預(yù)防或治療衰老過(guò)程。權(quán)利要求1.包含羥基酪醇的組合物作為抗衰老劑的用途，其中所述組合物基本不含白藜蘆醇，并且其中所述組合物經(jīng)口施用給動(dòng)物。2.包含羥基酪醇的組合物的下述用途用于延遲動(dòng)物中的衰老過(guò)程，用于改善動(dòng)物中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或用于促進(jìn)動(dòng)物中健康衰老的用途(或用于制造用于所述用途的組合物)，其中所述組合物基本不含白藜盧醇。3.包含羥基酪醇的組合物的下述用途用于降低動(dòng)物中給定年齡處年齡相關(guān)疾病的發(fā)病率，進(jìn)而提高生存更久的可能性；用于推遲動(dòng)物中衰老過(guò)程的視覺(jué)征兆，例如但不限于頭發(fā)泛灰、皺紋、聽(tīng)覺(jué)功能損失、肌肉量損失、骨密度損失和固有心臟功能的損失；和/或用于降低動(dòng)物中加速衰老過(guò)程的生活方式疾病的風(fēng)險(xiǎn)(或用于制造用于所述用途的組合物)；其中所述組合物基本不含fl藜蘆醇。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)或多項(xiàng)的用途，其中羥基酪醇是所述組合物中唯一的活性抗衰老成分。5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)或多項(xiàng)的用途，其中所述組合物選自膳食補(bǔ)劑、食物添加劑、功能性食物、食物預(yù)混物、飼料添加劑、功能性飼料、飼料預(yù)混物和飲料。6.經(jīng)口施用給動(dòng)物的包含輕基酪醇的組合物，所述組合物用于延遲所述動(dòng)物中的衰老過(guò)程，用于改善所述動(dòng)物中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或用于促進(jìn)所述動(dòng)物中的健康衰老，其中所述組合物基本不含白藜蘆醇。7.經(jīng)口施用給動(dòng)物的包含羥基酪醇的組合物，所述組合物用于降低動(dòng)物中給定年齡處年齡相關(guān)疾病的發(fā)病率，進(jìn)而提高生存更久的可能性；用于推遲動(dòng)物中衰老過(guò)程的視覺(jué)征兆，例如但不限于頭發(fā)泛灰、皺紋、聽(tīng)覺(jué)功能損失、肌肉量損失、骨密度損失和固有心臟功能的損失；和/或用于降低動(dòng)物中加速衰老過(guò)程的生活方式疾病的風(fēng)險(xiǎn)；其中所述組合物基本不含白藜戸醇。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的組合物，其中所述組合物是膳食補(bǔ)劑、食物添加劑、功能性食物、飼料添加劑、功能性詞料或飲料的形式。9.根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的組合物，其中所述動(dòng)物是人。10.通過(guò)對(duì)動(dòng)物施用有效量的羥基酪醇或有效量的包含羥基酪醇的組合物來(lái)延遲所述動(dòng)物中的衰老過(guò)程、改善所述動(dòng)物中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或促進(jìn)所述動(dòng)物中健康衰老的方法，其中所述組合物基本不含白藜蘆醇。11.通過(guò)對(duì)動(dòng)物施用有效量的羥基酪醇或有效量的包含羥基酪醇的組合物，降低所述動(dòng)物中給定年齡處年齡相關(guān)疾病的發(fā)病率，進(jìn)而提高生存更久的可能性；推遲所述動(dòng)物中衰老過(guò)程的視覺(jué)征兆，例如但不限于頭發(fā)泛灰、皺紋、聽(tīng)覺(jué)功能損失、肌肉量損失、骨密度損失和固有心臟功能的損失；和/或降低所述動(dòng)物中加速衰老過(guò)程的生活方式疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法；其中所述組合物基本不含白藜蘆醇。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其中所述動(dòng)物是人。全文摘要本發(fā)明涉及羥基酪醇(或包含羥基酪醇的組合物)作為抗衰老劑的用途。本發(fā)明還另外涉及的組合物基本上不包含白藜蘆醇，并且經(jīng)口施用給動(dòng)物。本發(fā)明還涉及抗衰老方法?！翱顾ダ稀痹诒景l(fā)明的上下文中表示延遲所述動(dòng)物中衰老的過(guò)程，改善所述動(dòng)物中年齡相關(guān)的生理缺陷，和/或促進(jìn)所述動(dòng)物中健康的衰老。文檔編號(hào)A61K31/05GK101663029SQ200880012559公開(kāi)日2010年3月3日申請(qǐng)日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日發(fā)明者丹尼爾·雷德?tīng)査苟喾?卡林·威茲,迎·王-史密特申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司