專利名稱：：檢測(cè)羥基自由基的納米銀分光光度法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及羥基自由基的檢測(cè)方法，具體是用納米銀作為羥基自由基的捕獲劑，以分光光度計(jì)測(cè)定被測(cè)體系的吸光度的方法——納米銀分光光度法。
背景技術(shù)：
：羥基自由基(OH)是目前己知化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種活性氧分子，可以發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，奪取氫原子和羥基化等反應(yīng)，使糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類發(fā)生氧化。由于，OH的氧化能力強(qiáng)、壽命短、對(duì)機(jī)體危害大，它與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬有關(guān)；此外，羥自由基清除率是反映藥物抗氧作用的重要指標(biāo)，因此，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域，已對(duì)自由基開展了大量的研究。此外，在已知的氧化劑中，OH的氧化能力僅次于F2，是一種非選擇性的氧化劑，能很容易的氧化各種有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，氧化效率高，反應(yīng)速度快。因而在大氣化學(xué)、天然水體化學(xué)和廢水深度氧化等的研究中，涉及許多自由基參與的化學(xué)反應(yīng)，自由基與污染物的轉(zhuǎn)化和清除密切相關(guān)。但是，由于自由基非常活潑，濃度低、存在的壽命短，因此建立一種靈敏快速測(cè)定，OH的方法尤為重要。。目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定羥基自由基的方法主要有電子自旋共振法(ESR)，高效液相色譜法(HPLC)，化學(xué)發(fā)光法(CL)，光度法，電化學(xué)法、熒光法等。其中，ESR法可直接用于檢測(cè)和研究具有未成對(duì)電子的自由基與過渡金屬離子及其化合物，但由于此方法是利用自旋捕捉劑與短壽命自由基結(jié)合生成相對(duì)穩(wěn)定的自由基，即自旋加合物，然后進(jìn)行ESR測(cè)定。由于自旋加合物的壽命仍然很短，只有幾分鐘或幾十分鐘，因此，必須捕捉自由基后立即進(jìn)行EPR測(cè)定，故對(duì)樣品的制備及檢測(cè)有很大的限制。HPLC法也是一種常用的間接檢測(cè)*OH的方法，該方法是必須先選擇合適的化合物捕獲體系中的自由基，使之生成具有一定穩(wěn)定性，且能被液相色譜檢測(cè)的產(chǎn)物，然后用HPLC液相色譜測(cè)定，其中，二甲基亞砜(DMSO)捕集自由基測(cè)定法所用的DMSO有毒性，能迅速透過皮膚進(jìn)入體內(nèi)；而水楊酸捕集自由基HPLC測(cè)定法是用電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定OH與水楊酸的生成物2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯甲酸，其檢測(cè)限分別為10和5fmol。HPLC法選擇性較好，能同時(shí)檢測(cè)幾種自由基，但所用儀器價(jià)格昂貴，不易普及推廣。徐向榮等用酵母作發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定了Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的*0H，用于模擬染料廢水處理中'0H的測(cè)定，重現(xiàn)性好，但所用試劑不易獲得，且方法精密度較差。電化學(xué)分析法即利用脫氧核糖與Fenton體系產(chǎn)生-OH作用，在酸性條件下經(jīng)過講解生成丙二醛、丙二醛在于甲醛、氨反應(yīng)生成電活性產(chǎn)物3，5—二乙酰一1，4一二氫吡啶，通過電化學(xué)分析法間接定量羥基自由基的產(chǎn)生量，但此法反應(yīng)步驟較多且所用醛類試劑危害人體健康。熒光法是利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH能將Ce"氧化成Ce4+，測(cè)定Ce"的熒光強(qiáng)度變化即可間接測(cè)定羥自由基的產(chǎn)生量，該方法重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便快速。此外，還有激光誘導(dǎo)熒光法、化學(xué)離子化質(zhì)譜法、化學(xué)擴(kuò)大法也可用來(lái)測(cè)定羥基自由基，但不易普及推廣或儀器價(jià)格昂貴等。已有的分光光度法如徐向榮等在《化學(xué)發(fā)光法測(cè)定Fenton反應(yīng)中的羥基自由基及其應(yīng)用》(環(huán)境科學(xué)，1998年19巻第2期)用DMSO捕集Fenton反應(yīng)體系中的'OH，產(chǎn)生的甲基亞磺酸與堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽反應(yīng)，生成的重氮化合物經(jīng)甲苯:正丁醇(3:1)混合物萃取后，用分光光度法在420nm處進(jìn)行比色測(cè)定，這種方法用來(lái)研究羥基自由基的產(chǎn)生與清除準(zhǔn)確可靠，有較好的重現(xiàn)性。賈之慎等用水楊酸捕集Fenton反應(yīng)體系中的OH，生成的2,3-二羥基苯甲酸用乙醚萃取，用鎢酸鈉和亞硝酸鈉顯色，然后用分光光度計(jì)測(cè)定其510nm處的吸光度，結(jié)果顯示吸光度隨水楊酸濃度、F^+濃度及H202的濃度增加而上升，認(rèn)為這體現(xiàn)了，OH生成的變化規(guī)律，這種方法是一般實(shí)驗(yàn)室可采用的簡(jiǎn)便實(shí)用的方法。此外還有細(xì)胞色素C光度法，金鳴等在《鄰二氮菲一F^+氧化法檢測(cè)H202/Fe"產(chǎn)生的羥自由基》(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996年第23巻第6期)中的鄰二氮菲一F^+—H202體系分光光度法，分光光度法測(cè)定OH不需要昂貴的儀器，簡(jiǎn)便、快速，易推廣普及，但測(cè)定過程中的干擾因素較多，準(zhǔn)確性、靈敏度和選擇性有待提高。
發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明的目的是提供一種新的納米銀為捕獲劑的檢測(cè)羥基自由基的納米銀分光光度法。這種方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)費(fèi)用低，且所用試劑安全無(wú)毒。本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基自由基的檢測(cè)(1)取定量的納米銀，與已知濃度的含有或可產(chǎn)生羥基自由基的被測(cè)物混勻，用水定容后形成被測(cè)體系；(2)將被測(cè)體系轉(zhuǎn)移至比色皿，使用分光光度計(jì)于460nm處測(cè)定其吸光度A',(3)取納米銀作空白對(duì)照，測(cè)定吸光度A。；(4)求得AA二A。-A;(5)依照不同濃度的被測(cè)體系中羥基自由基的濃度C與AA值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(6)按上述(1)(4)的方法，測(cè)得某未知濃度被測(cè)體系的AA，依據(jù)(5)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知濃度被測(cè)體系中羥基自由基的濃度。為了與目前的分光光度計(jì)的檢測(cè)范圍和靈敏度相適應(yīng)，確保和提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，本發(fā)明將被測(cè)體系中納米銀的濃度規(guī)定為0.0040.04mmol/L。本發(fā)明在被測(cè)體系形成后需在5min后將被測(cè)體系移入比色皿測(cè)定吸光度，這樣能提高測(cè)定方法的穩(wěn)定性，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。納米銀是一種新型功能材料，存在表面等離子共振吸收，共振散射效應(yīng)，已用于共振散射光譜分析，并獲得了較好的效果。其在殺菌消毒等方面的應(yīng)用也取得了很大的成功。納米銀制備簡(jiǎn)單，可利用微波高壓快速制得納米銀微粒，然后采用高速離心法純化。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基可以氧化納米銀微粒而使其成為銀離子，導(dǎo)致體系的吸光度降低，據(jù)此建立了測(cè)定羥基自由基的納米銀分光光度法——以納米銀為羥基自由基捕獲劑，采用分光光度計(jì)測(cè)定體系的吸光度。Ag+*OH—Ag++OH—銀雖然是重金屬，但本發(fā)明的方法中，用量極少，且本發(fā)明只使用納米銀這一種試劑，因此，不會(huì)增加檢測(cè)費(fèi)用。銀性質(zhì)穩(wěn)定，不容易與其它一般物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以能避免檢測(cè)過程中各種干擾，表現(xiàn)出高度選擇性，減少檢測(cè)誤差，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定和檢測(cè)結(jié)果的可靠，而且銀安全無(wú)毒，也不對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)羥基自由基對(duì)納米銀的氧化反應(yīng)靈敏，不可逆、速度快，從而使得檢測(cè)過程快速，所得結(jié)果穩(wěn)定，方法的重現(xiàn)性好、靈敏度高，檢出限可達(dá)0.25nmol/L(H202)，超出現(xiàn)有的分光光度法。納米銀分光光度法與一般的分光光度法一樣，所用的分光光度計(jì)是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)儀器，品種型號(hào)很多，價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)單，被普遍使用，一般實(shí)驗(yàn)人員在一般的實(shí)驗(yàn)室中即可完成對(duì)羥基自由基的檢測(cè)。本發(fā)明將被測(cè)體系中納米銀的濃度規(guī)定為0.0040.04mmol/L，使得吸光度的數(shù)值及其變化均能被目前的分光光度計(jì)可靠地檢測(cè)出來(lái)，從而確保和提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性?？紤]到氧化反應(yīng)的時(shí)間因素，本發(fā)明規(guī)定需在被測(cè)體系形成后5min之后再進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)留出氧化反應(yīng)過程所需要的時(shí)間，等待體系反應(yīng)停止，狀態(tài)穩(wěn)定，這樣的檢測(cè)結(jié)果才是可靠的、準(zhǔn)確的。根據(jù)本發(fā)明的試驗(yàn)，液相納米銀僅在460nm處產(chǎn)生一個(gè)表面等離子體共振吸收峰，所以本發(fā)明的檢測(cè)羥基自由基的納米銀分光光度法選取460nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，這樣就保證了檢測(cè)結(jié)果的最大程度的可靠?？傊?，本發(fā)明的檢測(cè)羥基自由基的納米銀分光光度法，不使用昂貴的儀器設(shè)備，不需要種類繁多的試劑，也不需要嚴(yán)格的檢測(cè)條件和環(huán)境，由一般的實(shí)驗(yàn)員在很普通的實(shí)驗(yàn)室中即可快速簡(jiǎn)單地完成檢測(cè)，而且數(shù)據(jù)穩(wěn)定，結(jié)果可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性好，非常適宜于測(cè)定羥基自由基，可應(yīng)用于抗氧化研究中檢測(cè)離體實(shí)驗(yàn)體系中的羥基自由基的氧化、清除效應(yīng)，特別是對(duì)于篩選抗氧化劑具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的方法也可用于快速簡(jiǎn)單靈敏地檢測(cè)臭氧濃度和其它自由基。圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2是納米銀的吸收光譜圖。其中曲線1:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg;曲線2:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg—1.25umol/LH202;曲線3:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg—2.5timol/LH2O2;曲線4:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg—5.0ymol/LH202。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施方式描述了在酸性條件下，F(xiàn),催化H202產(chǎn)生羥基自由基，羥基自由基具有較強(qiáng)的氧化性，可將銀納米微粒氧化為銀離子，吸光度降低，據(jù)此建立的測(cè)定羥基自由基的方法。主要反應(yīng)式如下，F(xiàn)e2++H202~~Fe3++OH-+OH(1)Fe3++H202Fe2++H02'+1^(2)(Ag)n+-OH~~Ag++OKT(3)羥基自由基的測(cè)定方法的描述如下在5mL的具塞刻度試管中，依次加入pH3.06.0HAc-NaAc緩沖溶液0.1~1.0mL和0.2~1.0mL的濃度為2.0mmol/L的FeS04溶液以及一定量的&02溶液(取標(biāo)定過的儲(chǔ)備液稀釋)，然后再加入0.1-1.0mL濃度為0.20mmol/L的納米銀微粒，用水稀釋到刻度，混勻，5~10min后將溶液轉(zhuǎn)移到比色皿，測(cè)定其460nm波長(zhǎng)處的A，不加^02溶液做空白，測(cè)定其吸光度A()，求得AA-A()-A，以AA與形成被測(cè)體系時(shí)加入的過氧化氫量所成的濃度C作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。由反應(yīng)原理可知，羥基自由基的濃度與過氧化氫濃度成正比，為研究方便，這里用過氧化氫濃度代替羥基自由基的濃度。當(dāng)然這里過氧化氫的用量應(yīng)能全部反應(yīng)完全，全部轉(zhuǎn)化成羥基自由基，且羥基自由基又全部用來(lái)氧化銀納米微粒。實(shí)施例配制11202溶液取30。/。H2O2l.0ml，加水稀釋成250ml，混勻；取此溶液用高錳酸鉀溶液標(biāo)定其濃度為0.0395mol/L;臨用前取適量，用水稀釋成54.0pnol/L的H202溶液。在5mL的具塞刻度試管中，依次加入0.10mLpH4.0HAc-NaAc緩沖溶液和0.30mL的濃度為2.0mmol/L的FeS04溶液以及46.3|jL、92.5pL、185(iL、37(VL、555pL、740(iL上述已配制好的濃度為54.0^mol/L的Hz02溶液，然后再加入0.40mL濃度為0.20mmol/L的納米銀微粒，用水稀釋到刻度，混勻，5min后將溶液轉(zhuǎn)移到比色皿,置于UV1900PC型分光光度計(jì)(上海亞研電子公司)測(cè)定其460nm波長(zhǎng)處的A，不加&02溶液做空白，測(cè)定其吸光度J。，求得A」=為"。有關(guān)數(shù)據(jù)見表一。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表一得出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。圖1表明隨吸光度的變化值隨著過氧化氫濃度C的增大呈線性關(guān)系，線性范圍為0.508.0pmol/L，回歸方程為AJ柳nf0.0424C+0.002，相關(guān)系數(shù)為0.9997，檢出限為0.25umol/L。取上述配制好的H202溶液55(V1，按上述的方法測(cè)出A、A。、AA，重復(fù)三次，結(jié)果如表二。表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>依據(jù)圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知被測(cè)體系中原有的11202溶液為5.925|imol/L，產(chǎn)生的羥基自由基的濃度平均值亦為5.925pmol/L，檢測(cè)結(jié)果的RSD=1.0%。權(quán)利要求1.檢測(cè)羥基自由基的納米銀分光光度法，含有下述步驟(1)取定量的納米銀，與已知濃度的含有或可產(chǎn)生羥基自由基的被測(cè)物混勻，用水定容后形成被測(cè)體系；(2)將被測(cè)體系轉(zhuǎn)移至比色皿，使用分光光度計(jì)于460nm處測(cè)定其吸光度A；(3)取納米銀作空白對(duì)照，測(cè)定吸光度A0；(4)求得ΔA＝A0-A；(5)依照不同濃度的被測(cè)體系中羥基自由基的濃度C與ΔA值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(6)按上述(1)～(4)的方法，測(cè)得某未知濃度被測(cè)體系的ΔA，依據(jù)(5)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知濃度被測(cè)體系中羥基自由基的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于被測(cè)體系中納米銀的濃度為。.004~0.04咖ol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于被測(cè)體系形成后，需在5min后移入比色皿測(cè)定吸光度。全文摘要本發(fā)明的納米銀分光光度法是用納米銀作為羥基自由基的捕獲劑，以分光光度計(jì)測(cè)定被測(cè)體系的吸光度的方法。通過以下步驟檢測(cè)羥基自由基(1)取定量的納米銀，與已知濃度的含有或可產(chǎn)生羥基自由基的被測(cè)物混勻，用水定容后形成被測(cè)體系；(2)將被測(cè)體系轉(zhuǎn)移至比色皿，使用分光光度計(jì)于460nm處測(cè)定其吸光度A；(3)取納米銀作空白對(duì)照，測(cè)定吸光度A₀；(4)求得ΔA＝A₀-A；(5)依照不同濃度的被測(cè)體系中羥基自由基的濃度C與ΔA值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(6)按上述(1)～(4)的方法，測(cè)得某未知濃度被測(cè)體系的ΔA，依據(jù)(5)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知濃度被測(cè)體系中羥基自由基的濃度。這種方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)費(fèi)用低，且所用試劑安全無(wú)毒。文檔編號(hào)G01N21/17GK101158638SQ20071005056公開日2008年4月9日申請(qǐng)日期2007年11月15日優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日發(fā)明者劉慶業(yè),梁愛惠,王素梅,蔣治良申請(qǐng)人:廣西師范大學(xué)