專利名稱：融合蛋白及其在制備人白血病抑制因子中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其在制備人白血病抑制因子中的應用。
背景技術：
一、人白血病抑制因子的應用價值白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)最早由小鼠KrebI I腹水瘤細胞的條件培養(yǎng)液中分離獲得，對小鼠髓細胞樣白血病(myeloid leukemia)Ml細胞系表現(xiàn)出抑制增殖和促進分化的生物學活性(Hilton DJ,Nicola NA Metcalf D. Purification of a murine leukemia inhibitory factor from Krebs ascites cells. Anal Biochem,1988, 173(2) p :359-67.),并因此得名。隨后，眾多的研究結果紛紛表明LIF不僅能夠抑制小鼠白血病，更是一種具有廣泛生物學功能的細胞因子(Kurzrock R，Estrov Z，Wetzler M，et al. LIF :not just a leukemia inhibitoryfactor. Endocr Rev，1991，12(3)，p :208-17.)， 會邑夠在造血(Verfaillie C McGlaveP. Leukemia inhibitory factor/human interleukin for DA cells :a growth factorthat stimulates the in vitro development of multipotential human hematopoieticprogenitors. Blood,1991，77 (2)，ρ :263-70.)、生殖(Smith SK，Charnock-JonesDS Sharkey AM. The role of leukemia inhibitory factor and interleukin_6in humanreproduction. Hum Reprod，1998，13Suppl 3，ρ :237-43 ； discussion 244-6. ；Shellard J，Perreau J Brulet P.Role of leukemia inhibitory factor duringmammal ian development. Eur Cytokine Netw，1996，7(4)，ρ :699-712.)、成骨(Cornish J,Callon KiKing A,et al. The effect of leukemia inhibitory factoron bone in vivo. Endocrinology, 1993，132 (3)，ρ :1359-66.)、免疫(PattersonBK，Behbahani H，Kabat WJ, et al. Leukemia inhibitory factor inhibits HIV-Ireplication and is upregulated in placentae from nontransmitting women. J Clinlnvest，2001， 107(3)，ρ :287-94. ；Linker RA, Kruse N，Israel S，et al. Leukemiainhibitory factor deficiency modulates the immune response and limitsautoimmune demyelination a new role for neurotrophic cytokines inneuroinflammation. J Immunol,2008, 180(4), ρ :2204-13.)、神經(jīng)發(fā)育(TurnIeyAM Bartlett PF. Cytokines that signal through the leukemia inhibitory factorreceptor-beta complex in the nervous system. J Neurochem，2000，74 (3)，ρ :889-99.)以及脂肪代謝(Moran CS，Campbell JH Campbell GR. Human leukemiainhibitory factor upregulat es LDLreceptors onliver cells and decreases serumcho1esterο1 in the cholesterol-fed rabbit. Arterioscler Thromb VascBiol, 1997,17(7), ρ :1267-73.)等過程中參與正常的生理功能以及某些疾病病理進程的調節(jié)。1987年，Gearing等人從T淋巴細胞的cDNA文庫中克隆獲得了小鼠的 LIF 基因，并實現(xiàn)了體外重組表達(Gearing DP，Gough NM, King JA，et al. Molecular cloning andexpression of cDNA encoding a murine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF) .EMBO J，1987，6 (13)，ρ :3995-4002.)。目前，小鼠的 LIF 蛋白(Murine1 eukemiainhibitory factor, mLIF)已經(jīng)被普遍用于小鼠胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ES)的體外培養(yǎng)。迄今，國內外研究者已經(jīng)在人、大鼠、豬和羊等組織或細胞中證實了不同種屬來源的LIF基因的存在和LIF蛋白的表達，其中，人源LIF (Human leukemiainhibitory factor,huLIF)最為受到關注。近年來，隨著研究的不斷深入，huLIF 正逐漸呈現(xiàn)出良好的臨床應用前景。在疾病的治療方面，huLIF能夠控制神經(jīng)元的分化和表型的選擇，誘導交感神經(jīng)元分泌神經(jīng)肽，加強感覺神經(jīng)元的存活以及延長人多能神經(jīng)干細胞在體外增殖時間，其在臨床治療神經(jīng)損傷，恢復神經(jīng)功能等方面具有良好的應用前景(Ng YP, He W Ip NY. Leukemia inhibitory factor receptor signalingnegatively modulates nerve growth factor-induced neurite outgrowth in PC12cells and sympathetic neurons.J Biol Chem，2003，278(40)，ρ :38731-9. ；DowsingBJ, Romeo R Morrison WA.Expression of leukemia inhibitory factor in human nervefollowing injury. J Neurotrauma，2001，18(11)，ρ :1279-87. ；CaffertyWB, Gardiner NJ, Gavazzi I，et al. Leukemia inhibitory factor determines thegrowth status of injured adult sensory neurons. J Neurosci，2001，21 (18)，ρ :7161-70. ；Bauer S Patterson PH. Leukemia inhibitory factor promotes neural stemcell self-renewal in the adult brain. J Neurosci，2006，26 (46)，ρ :12089-99.)。同時，由于在胚胎著床、生長、發(fā)育和分化等方面具有重要的作用，重組huLIF正越來越多的被嘗試用于解決多種女性生殖問題(Aghajanova L. Update on the role of leukemia inhibitory factor in assisted reproduct ion.Curr Opin Obstet Gynecol，2010，22(3)，ρ :213-9. ；Paiva P，Menkhorst Ε, Salamonsen L, et al. Leukemiainhibitory factor and ihterleukin-11 :critical regulators in the establishmentof pregnancy. Cytokine Growth Factor Rev，2009， 20(4)，ρ :319-28. ；AghajanovaL. Leukemia inhibitory factor and human embryo implantation. Ann N Y Acad Sci，2004，1034，p :176-83.；郭曉霞.白血病抑制因子(LIF) 在生殖醫(yī)學中的研究進展.中國優(yōu)生與遺傳雜志，1999，7 (6). ；Lass A，Weiser W，Munafo A，et al. Leukemiainhibitory factor in human reproduct ion. Fert il Steril,2001, 76(6)，ρ :1091-6.),包括治療不孕癥、習慣性自發(fā)流產(chǎn)，以及提高輔助生育過程中體外受精和胚胎移植成功率，提供節(jié)育新思路等等。近年來，huLIF還被廣泛認為與機體的免疫功能的調節(jié)具有密切的關系，Patterson等人發(fā)現(xiàn)在胎盤內分泌的huLIF是一種內源性的 I型人免疫獲得性缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)的抑制因子，能夠抑制病毒的復制和垂直轉播，顯示出通過免疫途徑治療HIV感染的潛在價值；近來，huLIF還被證明與懷孕、異體移植耐受和腫瘤逃逸等免疫調控過程密切相關(Nasef A， Mazurier C，Bouchet S,et al. Leukemia inhibitory factor :Rolein human mesenchymal stem cells mediated immunosuppression. Cell Immunol，2008，253 (1-2)，ρ :16-22.； Duluc D，Delneste Y，Tan F，et al. Tumor-associated leukemiainhibitory factor and IL-6skew monocyte differentiation into tumor-associatedmacrophage-like cells. Blood, 2007，110 (13)，ρ :4319-30.)，將在免疫相關疾病的治療中扮演重要角色。
依上述可見，由于具有良好的診斷和治療價值，隨著研究和開發(fā)的不斷進展， huLIF的需求量將會大幅提高。研究制備出大量純度高、活性好的huLIF是加快huLIF的研究及其應用的基礎。然而，目前我國應用的人白血病抑制因子主要依賴于國外進口，價格昂貴，供應不足，無法滿足將來潛在的大規(guī)模臨床應用。因此，建立一種能夠高效、簡便并且廉價的生產(chǎn)純度高、活性好的huLIF的技術方法非常必需，具有重要的實用價值和經(jīng)濟效益。二、人白血病抑制因子的分子結構及生物學功能編碼huLIF的基因位于人第22號染色體上，由三個外顯子和兩個內含子組成 (Sutherland GR, Baker Ε, Hyland VJ, et al. The gene for human leukemiainhibitory factor (LIF)maps to 22ql2. Leukemia, 1989，3 (1)，ρ :9-13.)，經(jīng)轉錄、剪切、翻譯和修飾的過程，分泌表達約為38-67kDa大小的糖蛋白。其中，huLIF所包括的核心蛋白為去除了 N-端信號肽的由180個氨基酸殘基組成的成熟多肽鏈(GenBank :AAA51699. 1)，分子量約為20kDa。huLIF的核心蛋白與mLIF(GenBank :AAA37211. 1)在氨基酸組成有近80% 的同源性，其生物學活性具有種屬向下兼容的特征。與同屬于白介素-6(InterleUkin-6， IL-6)家族的其他細胞因子(包括IL-6、IL-11、OSM、CNTF和CT-I等)相同，huLIF的多種生物學功能是通過與細胞表面特異的受體相結合而實現(xiàn)的(Ni shimoto N, Ogata A， Shima Y,et al. Oncostatin M,leukemia inhibitory factor, and interleukin 6induce the proliferation of humanplasmacytoma cells via the common signal transducer, gpl30. J Exp Med, 1994,179(4), ρ :1343-7. ；Zhang XG, Gu JJ, Lu ZY, et al. Ci 1 iary neurotropic factor, interleukin 11， leukemia inhibitory factor, and oncostat in M are growth factorsfor human myeloma cell lines using the interleukin 6signal transducer gpl30. J Exp Med, 1994,179(4),ρ :1337-42. )。LIF 受體(LIF recptor, LIFR) 復合物廣泛分布在胚胎干細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、肝細胞、成骨細胞和神經(jīng)細胞等效應細胞的細胞膜上，是由LIFR(也被成為LIFR-α或gpl90)和gpl30構成的異源二聚體復合物。當huLIF與細胞膜表面的跨膜LIFR-α識別并發(fā)生低親和力結合之后，LIFR-α與細胞內的“轉換器”分子gpl30相互作用，而形成LIF親和力結合的LIF-LIFR-gpl30復合物，進而激活包JAK/STAT、MAPK、Pi;3K/AKt或SHP-2/Ras/ERK的多條細胞信號通路，并最終表現(xiàn)出 ^^IfW^IJ'^iSft (Kondera-Anasz Ζ, Sikora JMielczarek-Palacz A. Leukemia inhibi tory factor :an important regulator ofendometrial function. Am J Reprod Immunol, 2004,52(2)，ρ :97-105.)。對LIF的分子構效關系進行的相關性研究進一步揭示出雖然在LIF核心蛋白多肽鏈中存在多個糖基化位點并且細胞產(chǎn)生的天然LIF確實為糖蛋白，但是脫去糖基的LIF蛋白在體內外仍然表現(xiàn)出相同的生物學活性(Aikawa J，Sato E，Kyuwa S, et al.Asparagine—1inked glycosylation of the rat leukemia inhibitory factorexpressed by simian C0S7cells.Biosci Biotechnol Biochem,1998,62 (7), ρ :1318-25. ；Sasai K, Aikawa J, Saburi S, et al. Functions of the N-glycans of ratleukemia inhibitory factor expressed in Chinese hamster ovary cells.J Biochem, 1998，124(5)，ρ :999-1003.)，LIF蛋白糖基化與否并非其行使生物學功能的必要條件。與之相反，LIF核心蛋白多肽鏈是否能夠有效的折疊形成由4個長鏈α-螺旋束構成的高級結構則是決定是否能夠與LIFR識別、結合并表現(xiàn)出多樣生物學活性的關鍵因素。 因此，不具備糖基化修飾作用的原核表達系統(tǒng)非常適用于huLIF的高效重組生產(chǎn)，但如何保證和提高重組蛋白的可溶性表達則是此類制備技術的瓶頸。三、人白血病抑制因子的制備技術概況
雖然機體內的多種細胞(包括神經(jīng)元細胞、巨核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、肝細胞、成骨細胞、成肌細胞、腎細胞和胸腺上皮細胞等)均能表達huLIF，但是其生理性表達量很低，通過體外細胞培養(yǎng)直接分離純化huLIF的生產(chǎn)能力遠遠無法滿足日趨增大的研究和臨床需求。因此，國內外均致力于采用基因工程策略重組表達huLIF。至今，huLIF已經(jīng)在細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等多種表達體系中成功表達，但表達量仍不樂觀。1995 年，Samal 等人(Samal BB, Arakawa T, Boone TC, et al. High level expression of human leukemia inhibitory factor (LIF) from asynthetic gene in Escherichia coliand the physical and biologicalcharacterization of the protein. Biochim Biophys Acta, 1995,1260(1), ρ :27-34.)通過改造huLIF編碼基因有效地提高了重組大腸桿菌對該細胞因子的表達能力。然而，令人失望的是，在缺乏有效的折疊輔助機制的原核系統(tǒng)中，過度表達的huLIF形成了無生物學活性的包涵體蛋白，最終導致生產(chǎn)步驟復雜(需要蛋白質復性操作)，生產(chǎn)效率下降。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種融合蛋白及其在制備人白血病抑制因子中的應用。本發(fā)明提供一種融合蛋白，自氮(N)末端至碳(C)末端依次包括Trx蛋白(TRX蛋白)、腸激酶特異識別位點和huLIF成熟核心蛋白；所述腸激酶特異識別位點的碳末端與所述huLIF成熟核心蛋白的氮末端連接；所述Trx蛋白如序列表的序列1自氮末端第1至110 位氨基酸殘基所示；所述腸激酶特異識別位點如序列表的序列1自氮末端第152至156位氨基酸殘基所示；所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸殘基所示。所述融合蛋白還可包括組氨酸標簽；所述組氨酸標簽位于所述Trx蛋白和所述腸激酶特異識別位點之間；所述組氨酸標簽如序列表的序列1自N末端第117至122位氨基酸殘基所示。所述融合蛋白具體可為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且含有所述huLIF成熟核心蛋白的由序列1衍生的蛋白質。所述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述huLIF成熟核心蛋白的編碼基因可如序列表的序列2自5’末端第469至1011 位核苷酸所示(Samal等人進行改造的優(yōu)化基因)。所述腸激酶特異識別位點的編碼基因可如序列表的序列2自5’末端第妨4至468 位核苷酸所示。所述融合蛋白的編碼基因具體可為如下⑴或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且可以表達所述huLIF成熟核心蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且可以表達所述huLIF成熟核心蛋白的DNA分子。
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含有所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體可為在pET_32a(+)的BglII和McI酶切位點之間插入序列表的序列3所示的DNA得到的重組質粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*。所述重組菌具體可為將所述重組質粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*導入大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)得到的重組菌。所述融合蛋白，所述編碼基因，所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌中的任意一種均可用于制備所述huLIF成熟核心蛋白。本發(fā)明還保護一種制備huLIF成熟核心蛋白的方法，包括如下步驟(1)將所述重組菌進行誘導表達和純化；(2)用腸激酶處理步驟(1)得到的溶液，(3)將步驟(2)得到的溶液進行純化，得到huLIF成熟核心蛋白。步驟(1)中，所述誘導表達優(yōu)選為用L-D-乳糖(誘導劑)誘導表達10h。步驟(1)中，所述純化優(yōu)選為進行所述誘導表達后，裂解菌體，取裂解上清依次進行親和層析和陰離子交換層析。所述親和層析包括如下步驟①使用鎳親和純化結合緩沖液(pH8. 5，由水和溶質組成；溶質及其濃度如下20mmol/L咪唑、500mmol/LNaCl、20mmol/L Tri s-Cl,)充分平衡5ml的Hi sTrap FF crude預裝層析柱(GEhealthcare，產(chǎn)品目錄號為17-5286-0 ；②將50mL裂解上清上樣，上樣流速為0. 5ml/min ；③用鎳親和純化結合緩沖液充分洗滌，洗滌流速為lml/min ；④用20mL洗脫液甲(pH8. 5，由水和溶質組成；溶質及其濃度如下60mmol/L咪唑、500mmol/LNaCl、20mmol/L Tris-Cl)充分洗脫非特異性結合的雜質蛋白，洗脫流速為lml/min ；⑤用20mL洗脫液乙(pH8. 5，由水和溶質組成；溶質及其濃度如下300mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl)洗脫目的融合蛋白，洗脫流速為lml/min，收集自洗脫開始第l_6mL的洗脫液。所述陰離子交換層析包括如下步驟 ①用起始緩沖液OOmmol/L Tris-Cl，pH8. 5)充分平衡Iml的HiTrap Q HP預裝層析柱(購自GE Healthcare，產(chǎn)品目錄號為17-1153-01，柱長為2. 5cm,內徑為0. 75cm，凝膠介質為 Q-sehparose high performance)；②將2mL親和層析收集的所述洗脫液脫鹽處理后上樣， 上樣流速為0. 5ml/mi η ；③用3mL所述起始緩沖液洗滌；④采用NaCl濃度范圍為Ommol/ L至500mmol/L的洗脫液進行線性梯度洗脫，起始洗脫液為所述起始緩沖液，終止洗脫液為含500mmol/L NaCl的緩沖液(pH8. 5，由水和溶質組成；溶質及其濃度如下500mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-Cl)，洗脫總體積為10mL，洗脫流速為0. 5mL/min，收集自洗脫開始第 6-9mL的洗脫液。步驟(3)中，所述純化優(yōu)選包括如下步驟將步驟(2)得到的溶液透析置換為起始緩沖液(PH7. 5，由水和溶質組成；溶質及其濃度為20mmol/L NaCl,20mmol/LTris-Cl)， 然后進行陽離子交換層析；所述陽離子交換層析包括如下步驟①用所述起始緩沖液充分平衡5ml的HiTrap SP HP預裝層析柱(GE healthcare，產(chǎn)品目錄號為17-1151-01，柱長為 2. 5cm,內徑為0. 75cm，凝膠介質為SP-sehparosehigh performance)；②將2mL透析置換后的溶液上樣，流速為0. 5ml/min ；③用5mL所述起始緩沖液洗滌，洗滌流速為lml/mi η ；④用 3mL含500mmol/L NaCl的緩沖液(pH8. 5，由水和溶質組成；溶質及其濃度如下500mmol/L NaCl,20mmol/LTris-Cl)進行洗脫，洗脫流速為lml/min，收集自洗脫開始第2_3mL的洗脫液，得到所述huLIF成熟核心蛋白。本發(fā)明提供的含有重組質粒pET-I^rx-Hi^-Erk-huLIF*的工程菌，可以實現(xiàn)huLIF 的可溶性高效表達，經(jīng)過提取與分離純化獲得了高純度的融合蛋白Trx-HiS6-Erk-MiLIF。 將融合蛋白Trx-Hise-Erk-huLIF進行重組腸激酶室溫消化和陽離子交換層析后，可以得到與天然huLIF相同免疫學和生物學性質的重組huLIF。每IL的工程菌培養(yǎng)體系可獲得5mg 重組huLIF。硫氧還蛋白CThioredoxin，Trx)能夠幫助重組huLIF蛋白二硫鍵折疊，并提高表達效率。LIF屬于IL-6細胞因子家族，與同家族的其他細胞因子具有相對保守的空間折疊模式，在二硫鍵的幫助下，共同呈現(xiàn)出由4個長鏈α-螺旋束構成的高度同源的高級結構。 可以預見，能夠創(chuàng)造利于LIF 二硫鍵形成的氧化-還原環(huán)境的Trx蛋白同樣有望輔助其他高級結構同源的IL-6家族細胞因子的這確折疊，因此，本發(fā)明建立的huLIF高效可溶性表達策略將很有可能成為一種該族細胞因子的通用技術。要制備重組huLIF蛋白(rhuLIF蛋白)，需要將其從融合蛋白Trx-Hi %-Erk-huLIF中有效地釋放并分離出來。本發(fā)明中將腸激酶特異識別位點(D-D-D-D-K)與 huLIF成熟核心蛋白N-端第一位氨基酸殘基(kr，S)緊接，該設計對于后續(xù)rhuLIF蛋白的釋放及天然氨基酸序列的保留意義重大。腸激酶特異性識別的氨基酸殘基序列與huLIF 成熟核心蛋白N-端的直接連接并不影響腸激酶的切割效率，在室溫下孵育20h以上就能夠成功的將重組huLIF蛋白從融合蛋白中完全釋放出來。通過蛋白酶的特異性加工最終可以釋放氨基酸組成與天然huLIF完全相同的具有生物學活性的可溶性rhuLIF。此外，由于huLIF(pI = 9. 28)具有比融合標簽Trx-His6-Erk (pi = 5. 63)高得多的等電點。因此，能夠簡單快速的將釋放的huLIF進行分離和回收。聯(lián)想到IL-6家族的 IL-IKpI > 11), OSM (p I > 9)和CT-I (pi > 9)等幾個細胞因子不僅具有與huLIF同源的高級折疊形式而且具有相似的更等電點特征，這些細胞因子將很有望利用本研究建立的 huLIF高效可溶性表達方案和分離純化工藝獲得高效率的制備。本研究利用Trx作為融合伙伴，在兼顧高效表達的同時，成功地解決了原核表達 huLIF時易形成無活性包涵體的瓶頸問題，并通過巧妙引入的重組腸激酶識別位點，實現(xiàn)了 N-端無多余氨基酸殘基重組huLIF的生產(chǎn)。本發(fā)明為將來huLIF的工業(yè)生產(chǎn)、臨床應用研究及以huLIF為靶標的新型疾病檢測與診斷技術的開發(fā)奠定了基礎。本發(fā)明有助于滿足人白血病抑制因子(huLIF)日趨增大的臨床應用需求，解決當前生產(chǎn)過程中存在的關鍵技術問題。


圖1為重組質粒pET-Trx-His6-Erk_huLIF*的構建策略示意圖。圖2為瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物及菌落PCR驗證；M :250bp DNA Ladder Marker (250, 500, 750,1000,1500, 2250, 3000,4500) ；1 :PCR 產(chǎn)物；2 菌落 PCR 產(chǎn)物。圖 3 為重組質粒 PET-iTrx-Hi %-Erk-huLIF* 的酶切鑒定；M :250bp DNA LadderMarker ；1 重組質粒 pET-Trx-Hiii6-Erk-huLIF* ；2 :pET-Trx-His6-Erk-huLIF* 經(jīng) XbaI 和 SacI 雙酶切產(chǎn)物；3 :pET-Trx-His6-Erk-huLIF* 經(jīng) BglII 和 SacI 雙酶切產(chǎn)物。圖4為Trx-HiS6-Erk-MiLIF融合蛋白的同源性分析和結構模式示意圖。
圖5為采用不同誘導時間工程菌中融合蛋白的表達量；M 蛋白質分子量標準；1 未誘導；2-8分別為誘導2、4、6、8、10、12和14h。圖6為融合蛋白的可溶性表達；Μ:蛋白質分子量標準；1 :BL21(DE3)誘導后菌體總蛋白；2 工程菌誘導后菌體總蛋白；3 工程菌誘導后菌體裂解沉淀；4 工程菌誘導后菌體裂解上清。圖7為12% SDS-PAGE檢測目的融合蛋白的純化情況蛋白質分子量標準，1為 BL2KDE3)誘導后菌體總蛋白，2為工程菌誘導后菌體總蛋白，3為工程菌誘導后菌體裂解沉淀，4為工程菌誘導后菌體裂解上清，5為鎳親和柱層析的洗脫峰，6為陰離子交換柱層析的洗脫峰。圖8為融合蛋白的限制性腸激酶切割及huLIF的釋放；M 蛋白質分子量標準；1 融合蛋白溶液；2-9依次為加入重組腸激酶后進行酶反應0、3、6、9、12、16、20和24h的酶切體系溶液。圖9為目的蛋白huLIF的分離純化；M 蛋白質分子量標準；1 融合蛋白液；2 經(jīng)過重組腸激酶加工的huLIF融合蛋白；3 :huLIF蛋白液。圖10為融合蛋白與huLIF重組蛋白的flfestern-blot檢測；M 預染蛋白質分子量標準；1 :huLIF融合蛋白；2 :huLIF重組蛋白。圖11為huLIF重組蛋白的生物學活性鑒定；實線代表吸光值，虛線代表抑制率。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。親和柱層析和離子交換柱層析都是在AKTAexplore 100蛋白純化工作站(GE healthcare)上完成。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。原核表達載體pET-32a(+)購自Novagen，產(chǎn)品目錄號為69015-3。大腸桿菌E. coli BL21(DE3)購自Novagen，產(chǎn)品目錄號為69386。Ml細胞購自ATCC，產(chǎn)品目錄號為 TIB-192(ATCC 編號)。實施例1、重組質粒和工程菌的制備重組質粒的構建過程見圖1。一、Erk-huLIF片段的編碼DNA的制備1、合成序列表的序列3自5，末端第16至558位核苷酸所示的DNA(huLIF片段的編碼DNA，將huLIF成熟核心蛋白的編碼基因優(yōu)化后的DNA)。2、以步驟1合成的DNA為模板，用引物1和引物2組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。引物 I(F) :5，-AAAGGATCCGGACGACGACGACAAGAGCCCGCTTCCAATTACTCC-3，；引物 2 (R) 5，-AAAGAGCTCCTATTAGAAGGCCTGAGCGAGAAC-3，。弓丨物1中引入BamHI酶切位點和緊鄰huLIF成熟多肽N-末端首位氨基酸殘基的腸激酶特異識別位點(Erk)的編碼DNA ；引物2引入McI酶切位點。PCR 反應條件94°C變性 4min ；94°C變性 45sec，58°C退火 45sec, 72°C延伸 45sec， 共擴增30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
3、將PCR擴增產(chǎn)物進行1. 7%瓊脂糖電泳。電泳圖見圖2的泳道1。從電泳圖可見，PCR擴增產(chǎn)物大于500bp，與預期大小相符(預期為580bp左右，包括的huLIF片段的編碼DNA、15bp的腸激酶識別位點的編碼DNA和限制性內切酶的編碼序列及保護堿基)。4、回收純化PCR擴增產(chǎn)物。5、將回收純化的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結果表明PCR擴增產(chǎn)物的5’末端為末端保護堿基和BamHI酶切識別序列，3’末端為末端保護堿基和McI酶切識別序列，上述兩個酶切識別序列之間為序列表的序列3所示的Erk-huLIF片段的編碼DNA(序列3自5’ 末端第1至15位核苷酸為Erk的編碼DNA，第16至558位核苷酸為huLIF片段的編碼DNA， 其中第556至558位核苷酸為片段原有的終止密碼子，第559至561位核苷酸為通過引物增加的終止密碼子)。二、重組質粒pET-Trx-His6-Erk_huLIF*和工程菌的制備1、用限制性內切酶BamHI和^icI雙酶切步驟一回收純化的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切片段。2、用限制性內切酶BglII和McI雙酶切原核表達載體pET_32a(+)，回收載體骨
^K O3、將步驟1回收的酶切片段和步驟2回收的載體骨架連接后轉化大腸桿菌 E. coliBL21(DE3)，篩選具有氨芐青霉素抗性的重組菌，進行菌落PCR(由上述引物1和引物 2組成的引物對)，并提取質粒進行雙酶切鑒定和測序鑒定。菌落PCR的結果見圖2的泳道2。質粒的雙酶切鑒定結果見圖3。質粒經(jīng))(ba I和Me I雙酶切后可見大小約為 IlOObp和5300bp的兩個片段，經(jīng)BglII和&ic I雙酶切后則現(xiàn)約480bp和5900bp的兩個片段。將質粒進行測序。結果表明，得到了重組質粒pET-I^rx-Hi %-Erk-huLIF*。用GeneRurmer和ClustalW軟件分析測序結果顯示在N-端第一個氨基酸殘基上游具有腸激酶特異性識別序列的huLIF片段的編碼序列已成功克隆入表達載體的適當位置，未出現(xiàn)基因突變和移碼。重組質粒pETIrx-Hi%-Erk-huLIF* 中，在骨架載體ρΕΤ_3^ι (+)的 BglII 和 &icl 酶切位點之間插入了序列表的序列3所示的DNA(Erk-huLIF片段的編碼DNA)，骨架載體上的TRX蛋白(Thioredoxin，硫氧還蛋白)的編碼序列、His標簽的編碼序列和Erk_huLIF片段的編碼DNA形成Trx-Hi s6-Erk-huLIF融合蛋白的編碼序列。Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白如序列表的序列1所示，自N末端第1至110位氨基酸殘基為TRX蛋白，第117至122位氨基酸殘基為組氨酸標簽(HHHHHH)，第152至156 位氨基酸殘基為腸激酶特異識別位點(DDDDK)，第157至336位氨基酸殘基為huLIF蛋白。 iTrx-His6-Erk-huLIF融合蛋白與天然huLIF蛋白(GenBank :AAA51699. 1)的同源性比對見圖如。Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的結構模式示意圖見圖4b。Trx-His6-Erk_huLIF融合蛋白利于人白血病抑制因子(huLIF)的可溶性表達、分離純化及后續(xù)加工精制。Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的編碼序列如序列表的序列2所示，自5’末端第1 至330位核苷酸為TRX蛋白的編碼DNA，第349至366位核苷酸為組氨酸標簽(HHHHHH)的編碼DNA，第妨4至468位核苷酸為腸激酶特異識別位點(DDDDK)，第469至1011位核苷酸為huLIF蛋白編碼DNA，第1012至1014為氨基酸為增加的終止密碼子。將含有重組質粒PET-iTrx-Hi%-Erk-huLIF* 的大腸桿菌 E. coli BL21(DE3)命名為工程菌 BI^l/pET-I^x-Hii^-Erk-huLIF*。工程菌 BI^l/pET-I^x-Hii^-Erk-huLIF* 在IPTG或乳糖的誘導下，重組質粒pET-TrX-His6-Erk-huLIF*的T7啟動子能夠指導 Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的高效表達。實施例2、Trx-Hi %-Erk-huLIF融合蛋白的表達一、誘導時間的優(yōu)化1、將實施例1制備的工程菌BL21/pET-Trx-His6-Erk-huLIF*接種于8ml LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。2、次日，將8ml菌液全部轉接至400ml LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中，37°C 200r/min 振搖至 OD600nm 值達到 0. 6-0. 8。3、加入L-D-乳糖(誘導劑)，使其終濃度為ang/L，25°C 180r/min誘導表達。加誘導劑前取樣菌體，分別于加入誘導劑后2h、4h、6h、》i、10h、ia^n 14h取樣菌體，進行12% SDS-PAGE，分析不同誘導時間下目的融合蛋白的表達情況。電泳圖見圖5。結果顯示加入L-D-乳糖濁后，Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白開始表達，并且在IOh后表達量達到峰值，該時間為高效生產(chǎn)的最佳收菌時間。二、Trx-Hi s6-Erk-huLIF融合蛋白的表達形式1、將實施例 1 制備的工程菌 BL21/pET-I^rx-His6-Erk-huLIF*(BL21 (DE3)作為工程菌的對照)接種于8ml LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。2、次日，將8ml菌液全部轉接至400ml LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中，37°C 200r/min 振搖至 OD600nm 值達到 0. 6-0. 8。3、加入L-D-乳糖(誘導劑)，使其終濃度為ang/L，25°C 180r/min誘導表達IOh。4、4°C、5，OOOXg離心15min收集菌體，洗滌后每克濕菌重懸于IOml裂解緩沖液中，冰浴消化和超聲破碎后，4°C、12，000r/min離心30min，分別收集上清(裂解上清)和沉淀(裂解沉淀)。5、將經(jīng)誘導表達的BL21細菌的菌體，工程菌的菌體，裂解上清和裂解沉淀分別進行12% SDS-PAGE檢測，分析目的融合蛋白的可溶性表達情況。電泳圖見圖6。結果顯示目的融合蛋白確實與預期相符，主要以可溶性形式表達，通過凝膠分析軟件分析，表達的融合蛋白占可溶性總蛋白的22 %。三、Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的表達和純化1、將實施例 1 制備的工程菌 BI^l/pET-I^rx-Hise-Erk-huLIFMBI^l (DE3)作為工程菌的對照)接種于48ml LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。2、次日，將48ml菌液全部轉接至2. 4L LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中，37°C 200r/min 振搖至 OD600nm 值達到 0. 6-0. 8。3、加入L-D-乳糖(誘導劑)，使其終濃度為ang/L，25°C 180r/min誘導表達IOh。4、收集菌體，洗滌后重新充分懸浮于IOOml裂解緩沖液QOmmol/L咪唑、500mmol/LNaCl、10mg/ml溶菌酶、20mmol/L Tri s_Cl，ρΗ8· 5)中，經(jīng)冰浴消化(冰浴40分鐘)和超聲破碎(輸出功率150W，溫度0 10°C，處理時間lOmin，每破碎15s，間歇30s)后，4°C、 12，OOOr/min離心30min，分別收集上清(裂解上清)和沉淀(裂解沉淀)。上清即為粗蛋白液(獲得IOOmL,蛋白質濃度為5. 4mg/mL)。5、將粗蛋白液進行親和純化(基于融合蛋白中部的組氨酸標簽)每次純化50mL粗蛋白液，每次的純化方法均如下(1)使用鎳親和純化結合緩沖液(20mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/ LTris-Cl，pH8. 5)充分平衡 5ml 的 HisTrap FF crude 預裝層析柱(GE healthcare，產(chǎn)品目錄號為 17-5286-02)。(2)將粗蛋白液上樣，上樣流速為0. 5ml/min。(3)用鎳親和純化結合緩沖液充分洗滌，洗滌流速為lml/min。(4)用 20mL 洗脫液甲(60mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl, pH8. 5)充分洗脫非特異性結合的雜質蛋白，洗脫流速為lml/min。(5)用 20mL 洗脫液乙(300mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl, pH8. 5)洗脫目的融合蛋白，洗脫流速為lml/min，收集自洗脫開始第l_6mL的洗脫液。將各次收集的洗脫液混合，透析除鹽(透析液為20mmol/L Tris-Cl, pH8. 5)。6、將脫鹽處理后的溶液進行陰離子交換層析HiTrap Q HP預裝層析柱購自GE Healthcare，產(chǎn)品目錄號為17-1153-01。柱長為 2. 5cm,內@為 0. 75cm。
疑月交介質為 Q-sehparose high performance。每次純化2mL，每次的純化方法均如下(1)用起始緩沖液 O0mmol/L Tris-Cl, pH8. 5)充分平衡 Iml 的 HiTrap Q HP 預裝層析柱。(2)將步驟5脫鹽處理后的洗脫液上樣，上樣流速為0. 5ml/min。(3)用3mL起始緩沖液充分洗滌。(4)用不含NaCl的緩沖液QOmmol/L Tri s_Cl，ρΗ8· 5)為起始洗脫液，用含 500mmol/L NaCl 的緩沖液(500mmol/L NaCl、20mmol/L Tri s_Cl，pH8. 5)為終止洗脫液， 進行鹽濃度線性梯度洗脫，洗脫的鹽濃度梯度范圍為Ommol/L至500mmol/L，洗脫總體積為 10mL，洗脫流速為0. 5mL/min并收集自洗脫開始第6_9mL的洗脫液。收集并合并目的洗脫液，混合即為融合蛋白液，-20°C保存、備用。IOOmL裂解上清液可制備出67. 8mg融合蛋白，回收率達57%。7、將BL21(DE3)的菌體，誘導表達后工程菌的菌體、裂解上清、裂解沉淀、鎳親和柱層析的洗脫峰，陰離子交換柱層析的洗脫峰分別進行12% SDS-PAGE檢測，結果見圖7。凝膠分析表明，純化蛋白的純度高于95 %。實施例3、用Trx-Hi s6-Erk-huLIF融合蛋白制備人白血病抑制因子(huLIF)一、酶切時間的優(yōu)化向2毫升實施例2制備的融合蛋白液中加入10微升重組腸激酶(購自Novagen， 產(chǎn)品目錄號為69066-3)(約含10單位腸激酶)，室溫孵育。加入重組腸激酶前取樣，分別于加入重組腸激酶0、3、6、9、12、16、20和24h小時后取樣，進行12% SDS-PAGE檢測，分析融合蛋白的水解及rhuLIF的釋放情況，確定酶切反應
12的最佳時間。電泳檢測結果見圖8。在室溫孵育20小時后，融合蛋白能被重組腸激酶完全切割， 且釋放出約20kDa和17kDa的兩個蛋白質片段，與huLIF和融合標簽(Trx-His6-Erk)的理論分子量相符。結果表明，融合蛋白經(jīng)過重組腸激酶的加工，可成功釋放出游離的目的蛋白。二、huLIF 的制備1、酶切向2毫升實施例2制備的融合蛋白液中加入10微升重組腸激酶(購自Novagen， 產(chǎn)品目錄號為69066-3)(約含10單位腸激酶)，室溫孵育20小時。2、通過透析將步驟1的酶切體系置換為起始緩沖液OOmmol/L NaCl,20mmol/LTri s-Cl，ρΗ7· 5)。3、陽離子交換柱層析HiTrap SP HP預裝層析柱購自GE heal thcare，產(chǎn)品目錄號為17-1151-01。柱長為 2. 5cm,內徑為 0. 75cm。凝膠介質為 SP-sehparose high performance。根據(jù)huLIF的等電點( 9. 28)遠大于融合伙伴(Trx-His6-Erk, 5. 36)的性質， 利用陽離子交換柱層析精制huLIF。每次純化2mL，具體步驟如下(1)用起始緩沖液(20mmol/L Tri s_Cl，pH8. 5)充分平衡 5ml 的 HiTrap SP HP 預裝層析柱。(2)將步驟2的溶液上樣，流速為0. 5ml/min。(3)用起始緩沖液充分洗滌5mL，洗滌流速為lml/min。(4)用 3mL 含 500mmol/L NaCl 的緩沖液(500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl, pH8. 5)進行洗脫，洗脫流速為lml/min，收集自洗脫開始第2_3mL的洗脫液。(5)收集并合并目的洗脫液，采用透析法將huLIF蛋白置換于滅菌的PBS緩沖液 (ρΗ7· 4)中，即為huLIF蛋白液，-20°C保存、備用。將實施例2制備的融合蛋白液、重組腸激酶加工的融合蛋白液(步驟1的溶液) 和huLIF蛋白液分別進行15% SDS-PAGE。電泳結果見圖9。結果顯示，經(jīng)過Hi1Trap SPHP 預裝柱的分離，獲得的純度高于95%的huLIF。利用BCA測定huLIF蛋白液的蛋白濃度，結果表明從每升誘導表達體系收集的工程菌菌體中，通過上述工藝可獲得5mg的huLIF。三、Western-blot 鑒定將實施例2制備的融合蛋白液和實施例3的步驟二制備的huLIF蛋白液分別進行 12% SDS-PAGE，將電泳凝膠采用半干轉印法轉移至PVDF膜，以小鼠抗huLIF的單克隆抗體為一抗(1 5，000稀釋；購自R&D公司，產(chǎn)品目錄號為MAB2501)，以辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG抗體為二抗(1 10，000稀釋；購自Pierce公司，產(chǎn)品目錄號為32430)， 使用ECL顯色試劑盒鑒定融合蛋白及huLIF蛋白的免疫學性質。檢測結果見圖10。結果表明融合蛋白及huLIF蛋白均能與市售的抗huLIF單克隆抗體發(fā)生特異性的免疫反應，經(jīng)過ECL顯色，在相應位置呈現(xiàn)雜交色帶。四、生物學活性(抑制小鼠髓樣白血病Ml細胞增殖)鑒定mLIF在體外能夠有效的抑制小鼠髓細胞樣白血病(myeloid leukemia)Ml細胞的增殖，由于huLIF具有生物學活性向下兼容的特性，具有mLIF相同的生物學活性，因此抑制 Ml細胞的增殖也被廣泛的用于鑒定rhLIF的生物學活性。1、首先使用含有5% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)Ml細胞，并將生長狀態(tài)良好的Ml細胞以每孔1 X IO4個細胞鋪布于96孔細胞培養(yǎng)板中(背景孔用等體積含有5% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基代替Ml細胞液，設置3個復孔)。2、以線性濃度梯度加入0. lpg/ml lOng/ml的步驟三制備的huLIF蛋白液，每個濃度做5個平行復孔，于37°C，5 % CO2的條件孵育7 (對照孔用等體積pH7. 4PBS緩沖液代替huLIF蛋白液，設置3個復孔)。3、利用改良MTT檢測法測定Ml細胞的增殖情況，主要步驟為向每個細胞培養(yǎng)孔中加入20 μ 1的5mg/ml的MTT溶液，37°C 5% CO2孵育4h ；向每孔中加入150 μ 1的“三聯(lián)液”(10% SDS、5%異丙醇和12mol/ml HCl)孵育16h ；利用酶標儀測定OD57tlnm，并根據(jù)以下計算公式計算huLIF對Ml細胞增殖的抑制率抑制率=(0D57(lnm#s平均值-OD 570nm 背景
值)/(0D57Qnm對照平均值-OD57tlnm背景平均值)X 100% ；各個濃度的吸光值與抑制率結果見圖11?？梢奾uLIF確實能夠有效的抑制Ml細胞的增殖。4、根據(jù)抑制率計算ED50 (細胞因子的半數(shù)有效量)ED50(細胞因子的半數(shù)有效量)是指抑制Ml細胞增殖的抑制率達到50%時，加入 huLIF的終濃度。huLIF 蛋白液的 ED50 值達到 5ng/mL。5、細胞因子比活性細胞因子比活力(U/mg)= ED50(ng/mL)/lXl(T6。huLIF蛋白液的細胞因子比活性約為0. 5X107U/mgo
權利要求
1.一種融合蛋白，自氮末端至碳末端依次包括Trx蛋白、腸激酶特異識別位點和huLIF 成熟核心蛋白；所述腸激酶特異識別位點的碳末端與所述huLIF成熟核心蛋白的氮末端連接；所述Trx蛋白如序列表的序列1自氮末端第1至110位氨基酸殘基所示；所述腸激酶特異識別位點如序列表的序列1自氮末端第152至156位氨基酸殘基所示；所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸殘基所示。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白還包括組氨酸標簽；所述組氨酸標簽位于所述Trx蛋白和所述腸激酶特異識別位點之間；所述組氨酸標簽如序列表的序列1自氮末端第117至122位氨基酸殘基所示。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且含有所述huLIF成熟核心蛋白的由序列1衍生的蛋白質。
4.權利要求1至3中任一所述融合蛋白的編碼基因。
5.如權利要求4所述的編碼基因，其特征在于所述huLIF成熟核心蛋白的編碼基因如序列表的序列2自5’末端第469至1011位核苷酸所示；所述腸激酶特異識別位點的編碼基因如序列表的序列2自5’末端第妨4至468位核苷酸所示。
6.如權利要求5所述的編碼基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因是如下(1) 或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且可以表達所述huLIF成熟核心蛋白的 DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且可以表達所述huLIF成熟核心蛋白的DNA分子。
7.含有權利要求4至6中任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
8.如權利要求7所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pET-32a(+) 的BglII和McI酶切位點之間插入序列表的序列3所示的DNA得到的重組質粒 pET-Trx-His6-Erk-huLIF* ；所述重組菌為將所述重組質粒 pET-Trx-His6-Erk_huLIF* 導入大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)得到的重組菌。
9.權利要求1至3中任一所述融合蛋白、權利要求4至6中任一所述編碼基因，權利要求7或8所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌中的任意一種在制備huLIF成熟核心蛋白中的應用；所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸殘基所示。
10.一種制備huLIF成熟核心蛋白的方法，包括如下步驟(1)將權利要求8所述重組菌進行誘導表達和純化；(2)用腸激酶處理步驟(1)得到的溶液，(3)將步驟( 得到的溶液進行純化，得到huLIF成熟核心蛋白；所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸殘基所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合蛋白及其在制備人白血病抑制因子中的應用。所述融合蛋白自氮端至碳端依次包括序列1自N端第1至110位氨基酸殘基所示Trx蛋白、序列1自氮端第152至156位氨基酸殘基所示腸激酶特異識別位點和序列1自氮端第157至336位氨基酸殘基所示huLIF成熟核心蛋白；腸激酶特異識別位點的碳端與huLIF成熟核心蛋白的氮端連接。本發(fā)明利用Trx作為融合伙伴，在兼顧高效表達同時，成功解決了原核表達huLIF時易形成無活性包涵體的瓶頸問題，通過巧妙引入重組腸激酶識別位點，實現(xiàn)了氮端無多余氨基酸殘基重組huLIF的生產(chǎn)。本發(fā)明有助于滿足人白血病抑制因子日趨增大的臨床應用需求，解決當前生產(chǎn)過程中存在的關鍵技術問題。
文檔編號C07K19/00GK102477098SQ201010572488
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權日2010年11月29日
發(fā)明者林潔, 馬嵐 申請人:清華大學深圳研究生院