本申請(qǐng)要求2014年8月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/037,071和2014年11月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/082,468的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)各自以引用的方式整體并入本文中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中的目標(biāo)分析物的系統(tǒng)和方法。具體地，本發(fā)明提供基于局部等離子體共振的分析物檢測(cè)系統(tǒng)，其能夠檢測(cè)樣品中的極少量目標(biāo)分析物。

發(fā)明背景

當(dāng)前免疫測(cè)定和生物分子結(jié)合測(cè)定通常需要多個(gè)步驟和復(fù)雜設(shè)備來執(zhí)行測(cè)定。在執(zhí)行此類非均相測(cè)定中所涉及的靈敏度的缺乏和復(fù)雜性由將標(biāo)記的特異性結(jié)合配偶體與未標(biāo)記的特異性結(jié)合配偶體分離的特定需要所引起。

已經(jīng)嘗試開發(fā)基于貴金屬納米顆粒的局部表面等離子體共振(LSPR)性質(zhì)的測(cè)定(Tokel等，Chem Rev.，第114卷：5728–5752，2014)。LSPR為通過入射光誘導(dǎo)的納米大小結(jié)構(gòu)中的電子的集體振蕩。金屬納米顆粒對(duì)于其最近處的折射系數(shù)變化具有強(qiáng)電磁反應(yīng)，因此納米顆粒的共振頻率的偏移可作為結(jié)合至納米顆粒表面的分子的指示來測(cè)量。雖然金屬納米顆粒，尤其是金納米顆粒，在診斷測(cè)定中用于檢測(cè)結(jié)合事件，此類測(cè)定總體上受到低靈敏度的影響并且不能用于定量地監(jiān)測(cè)連續(xù)結(jié)合事件的動(dòng)力學(xué)。

因此，需要在提供增加的靈敏度的同時(shí)使用均相格式的改進(jìn)測(cè)定方法。利用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)諸如光譜學(xué)的測(cè)定將亦為合乎需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)通過分子結(jié)合至金屬納米層表面所誘導(dǎo)的光學(xué)信號(hào)。所觀察到的放大極大地增加了檢測(cè)特異性生物分子結(jié)合事件的靈敏度，以使得可檢測(cè)亞皮克數(shù)量的生物分子。因此，本發(fā)明提供分析物檢測(cè)裝置和使用此類裝置來檢測(cè)樣品中的極少量目標(biāo)分析物的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，分析物檢測(cè)裝置包括多個(gè)檢測(cè)綴合物、含有金屬納米層的表面和多個(gè)捕獲分子，其中所述捕獲分子固定于所述金屬納米層上并且能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物。在分析物檢測(cè)裝置以?shī)A心測(cè)定格式來配置的實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物包含偶合至能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物的結(jié)合配偶體的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)。在分析物檢測(cè)裝置以直接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定格式來配置的實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物包含偶合至目標(biāo)分析物的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)。

檢測(cè)綴合物中的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)總體上包含至少兩種貴金屬、過渡金屬、堿金屬、鑭系元素或其組合。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含至少兩種選自金、銀、銅、鉑、鈀、鎘、鐵、鎳以及鋅的金屬。在某些實(shí)施方案中，每種復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包括第一金屬的核心和第二金屬的涂層。在一些實(shí)施方案中，核心可為鍍金的銀或銅。在其他實(shí)施方案中，第一金屬的核心可在涂布之后溶解以使得產(chǎn)生由第二涂層金屬組成的空心結(jié)構(gòu)。

沉積于表面上的金屬納米層可為金屬薄膜或由固定于表面上的多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu)組成。金屬納米層也可由貴金屬或過渡金屬組成。在一些實(shí)施方案中，金屬納米層包含金、銀、銅、鉑、鈀、鎘、鋅或其復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米層包含金。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米層包含銀。仍在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米層包含用金納米層覆蓋的銀納米層。

本發(fā)明還提供使用本文所述的分析物檢測(cè)裝置來檢測(cè)樣品中的目標(biāo)分析物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將樣品與多種檢測(cè)綴合物混合、將混合物與含有其上固定有多個(gè)捕獲分子的金屬納米層的表面接觸、將表面暴露于紫外光-可見光-紅外光光譜內(nèi)的波長(zhǎng)范圍下的光源；以及測(cè)量來自表面的光學(xué)信號(hào)，其中所述光學(xué)信號(hào)的變化指示樣品中的目標(biāo)分析物的存在。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)樣品中的毫微微克至納克數(shù)量的目標(biāo)分析物。

本發(fā)明包括測(cè)定復(fù)合物，其包含：含有偶合至結(jié)合配偶體的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)的檢測(cè)綴合物；目標(biāo)分析物；以及其上固定有捕獲分子的金屬納米層涂布珠粒，其中檢測(cè)綴合物中的結(jié)合配偶體結(jié)合至目標(biāo)分析物上的第一表位并且捕獲分子結(jié)合至目標(biāo)分析物上的第二表位，從而形成包含檢測(cè)綴合物、目標(biāo)分析物和捕獲分子的復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)為鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)或鍍金的銅納米結(jié)構(gòu)并且涂布在珠粒上的金屬納米層包含金。

在另一方面，本發(fā)明提供一種用于制備用于本文描述的檢測(cè)裝置和方法的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括制備包含聚合物與氯金酸的混合物的第一溶液、制備包含銀或銅納米結(jié)構(gòu)的第二溶液以及將第一溶液與第二溶液孵育一段時(shí)間，其中所得混合物包含鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)或鍍金的銅納米結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，將還原劑諸如抗壞血酸添加至反應(yīng)混合物以增加所產(chǎn)生的納米結(jié)構(gòu)的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一溶液中的聚合物為聚乙烯吡咯烷酮。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一溶液中的聚合物為聚乙烯醇。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.牛血清白蛋白(BSA)偶合金納米層傳感器(通道1)和人IgG偶合金納米層傳感器(通道2-4)的峰波長(zhǎng)的移位相對(duì)于采集時(shí)間的圖。箭頭指示未標(biāo)記蛋白質(zhì)A、1mM HCl或用膠體金(CGC)標(biāo)記的蛋白質(zhì)A的注射順序和濃度。

圖2.抗-CRP C7抗體偶合金納米層傳感器的峰波長(zhǎng)的移位相對(duì)于采集時(shí)間的圖。箭頭指示0至100ng/ml濃度的不同通道中的CRP(CRP負(fù)荷)、1μg/ml未標(biāo)記抗-CRP C6抗體或3μg/ml用膠體金標(biāo)記的抗-CRP C6抗體(C6-CGC)的注射順序。當(dāng)傳感器表面以未標(biāo)記抗-CRP C6抗體占據(jù)時(shí)，未觀察到進(jìn)一步C6-CGC結(jié)合。

圖3.抗-CRP C7抗體偶合金納米層傳感器的峰波長(zhǎng)的移位相對(duì)于采集時(shí)間的圖。箭頭指示0至100ng/ml濃度的不同通道中的CRP(CRP負(fù)荷)、1μg/ml用膠體金標(biāo)記的抗-CRP C6抗體(C6-CGC)、3μg/ml C6-CGC、或1mM HCl(酸)的注射順序。

圖4A.以圖3中的不同C6-CGC濃度的10ng/ml CRP負(fù)載的抗-CRP C7抗體偶合金納米層傳感器的反射光譜。

圖4B.在引入用膠體金標(biāo)記的3μg/ml抗-CRP C6抗體(C6-CGC)之后，使用三個(gè)濃度之一的CRP孵育的抗-CRP C7抗體偶合金納米層傳感器的峰波長(zhǎng)的移位相對(duì)于采集時(shí)間的圖。右側(cè)的表描繪在引入C6-CGC之后700秒的峰分析。

圖5.抗-CRP C7抗體偶合金納米層傳感器的峰波長(zhǎng)的移位相對(duì)于采集時(shí)間的圖。箭頭指示0至100ng/ml濃度的不同通道中的CRP(CRP負(fù)荷，其具有最小化的孵育時(shí)間)、3μg/ml用膠體金標(biāo)記的抗-CRP C6抗體(C6-CGC)或1mM HCl(酸)的注射順序。

圖6.在即時(shí)引入3μg/ml用膠體金標(biāo)記的抗-CRP C6抗體(C6-CGC)之后，圖5中的痕量的峰波長(zhǎng)的移位相對(duì)于采集時(shí)間的圖。右側(cè)的表描繪與通過CRP孵育獲得的峰移位(值展示于圖4B中)相比，在引入C6-CGC之后700秒的峰分析。

圖7.使用三個(gè)濃度之一的CRP和綴合至鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)的C6抗-CRP抗體孵育的抗-CRP C7抗體偶合金納米層傳感器的峰波長(zhǎng)的移位相對(duì)于采集時(shí)間的圖。對(duì)照為具有固定的牛血清白蛋白(BSA)代替C7抗體的金納米層傳感器。

發(fā)明詳述

本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：基于LSPR的測(cè)定中的顯著放大可通過以復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記的結(jié)合配偶體來達(dá)成。因此，本發(fā)明提供包括以下的分析物檢測(cè)裝置：LSPR表面(例如含有金屬納米層的表面)、固定至金屬納米層的多個(gè)捕獲分子以及包含偶合至生物分子的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)的多個(gè)檢測(cè)綴合物。

分析物檢測(cè)裝置可以?shī)A心測(cè)定格式或直接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定格式來配置。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，夾心測(cè)定格式的分析物檢測(cè)裝置包括(i)多個(gè)檢測(cè)綴合物，其中綴合物包含偶合至能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物的結(jié)合配偶體的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)，(ii)含有金屬納米層的表面，以及(iii)多個(gè)捕獲分子，其中捕獲分子固定于金屬納米層上并且能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，直接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定格式的分析物檢測(cè)裝置包括(i)多個(gè)檢測(cè)綴合物，其中綴合物包含偶合至目標(biāo)分析物的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)，(ii)含有金屬納米層的表面，以及(iii)多個(gè)捕獲分子，其中捕獲分子固定于金屬納米層上并且能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物。

本發(fā)明的分析物檢測(cè)裝置包括含有金屬納米層的表面。表面可為任何合適的尺寸和形狀，諸如芯片、孔、試管或珠粒。在一些實(shí)施方案中，表面為長(zhǎng)方形芯片。在其他實(shí)施方案中，表面為圓盤。在某些實(shí)施方案中，表面為試管(例如，圓柱形或長(zhǎng)方形試管)的底部、蓋子和/或內(nèi)壁。在其他實(shí)施方案中，表面為非金屬顆粒的陣列。表面可由各種材料制造，所述材料包括但不限于玻璃、石英、硅、二氧化硅、聚苯乙烯、石墨、織物(例如聚乙烯織物)、絲網(wǎng)或膜(例如膠乳、聚乙烯、尼龍或聚酯膜)。

金屬納米層優(yōu)選沉積于表面上。在一些實(shí)施方案中，金屬納米層可覆蓋具體表面的整個(gè)表面區(qū)域。在其他實(shí)施方案中，金屬納米層可僅沉積于表面的一部分上。舉例而言，表面可含有多個(gè)凹陷或孔并且金屬納米層沉積于凹陷或孔內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，金屬納米層可以穿過表面的多個(gè)間隔沉積物形式施加至表面。金屬納米層的光學(xué)性質(zhì)可通過改變納米層的厚度和/或納米結(jié)構(gòu)的性質(zhì)來調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，納米層由金屬納米島組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，納米層由納米棒組成。用于本發(fā)明裝置和方法中的金屬納米層的合適厚度包括約0.5nm至約100nm、約5nm至約30nm或約3nm至約10nm。具有可用于本發(fā)明裝置和方法中的金屬納米層涂層的示例性表面包括在美國(guó)專利公布號(hào)2006/0240573中所描述的表面，所述專利公布以引用的方式整體并入本文。

在某些實(shí)施方案中，金屬納米層為金屬薄膜。將金屬薄膜沉積于基板表面上的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且包括但不限于，原子層沉積、脈沖激光沉積、落模鑄造、氣相沉積以及吸附。參見，例如，Atanasov等，Journal of Physics：Conference Series 514(2014)；Walters和Parkin，Journal of Materials Chemistry，19：574-590，2009；以及Gupta等，J.Appl.Phys.92，5264-5271，2002，所述文獻(xiàn)各自以引用的方式整體并入本文。金屬薄膜可包含其他組分，例如金屬薄膜可為聚合物薄膜、Langmuir-Blodgett薄膜或氧化物薄膜。在一些實(shí)施方案中，金屬薄膜包含兩個(gè)層，其中每個(gè)層包含不同金屬。舉例而言，金屬薄膜可包括用金層覆蓋的銀層。

在其他實(shí)施方案中，金屬納米層包含固定至表面的多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu)。金屬納米結(jié)構(gòu)可固定至表面，所述固定為通過用試劑處理表面材料以添加化學(xué)化學(xué)官能團(tuán)，諸如氰化物、胺、硫醇、羧基、醛或馬來酰亞胺，并且使金屬納米結(jié)構(gòu)與所處理表面反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。已知金屬納米結(jié)構(gòu)以較高親和力結(jié)合至此類化學(xué)官能團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，包括金屬納米層的金屬納米結(jié)構(gòu)為球狀納米顆粒。此類納米顆粒具有小于約300nm、小于約200nm或小于約150nm的直徑。在一些實(shí)施方案中，球狀納米顆粒具有約5nm至約200nm、約10nm至約100nm或約20nm至約60nm的直徑。在某些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生金屬納米層的金屬納米結(jié)構(gòu)的尺寸類似于用于檢測(cè)綴合物中的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)的尺寸。在此類實(shí)施方案中，將兩組納米結(jié)構(gòu)的尺寸匹配可提供反射光譜、發(fā)射光譜或散射光譜中的最佳波長(zhǎng)移位。

金屬納米層(金屬薄膜或多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu))可主要由貴金屬或其復(fù)合物組成。在其他實(shí)施方案中，金屬納米層(金屬薄膜或多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu))可主要由過渡金屬或其復(fù)合物組成。在某些實(shí)施方案中，金屬納米層包含選自金、銀、銅、鉑、鈀、釕、銠、鋨、銥、鈦、鉻、鎘、鋅、鐵、鈷、鎳及其復(fù)合物的金屬。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，金屬納米層(例如金屬薄膜或多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu))包含金。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，金屬納米層(例如金屬薄膜或多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu))包含銀。在某些實(shí)施方案中，金屬納米層(例如金屬薄膜或多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu))包含金與銀或金與銅的復(fù)合物。使用堿金屬(例如鋰、鈉、鉀、銣、銫以及鈁)或鑭系元素(例如鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿以及镥)可提高LSPR峰的強(qiáng)度。因此，在一些實(shí)施方案中，金屬納米層(金屬薄膜或多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu))可主要由一或多種堿金屬或鑭系元素組成。在其他實(shí)施方案中，金屬納米層(金屬薄膜或多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu))可主要由貴金屬和堿金屬或鑭系元素的組合組成。

本發(fā)明的分析物檢測(cè)裝置還包括固定至沉積于表面上的金屬納米層的多個(gè)捕獲分子。捕獲分子能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物。如本文使用的，“特異性結(jié)合”是指以高親和力結(jié)合至目標(biāo)分子，例如，至少10^-6M的親和力。在一些實(shí)施方案中，捕獲分子為半抗原和其他小分子、藥物、激素、生物大分子，包括但不限于抗體或其片段(例如，F(xiàn)v、Fab、(Fab)₂、單鏈、CDR等)、抗原、受體、配體、多核苷酸、適體、多肽、多糖、脂多糖、糖肽、脂蛋白或核蛋白。在某些實(shí)施方案中，多個(gè)捕獲分子為抗體。在其他實(shí)施方案中，多個(gè)捕獲分子為抗原。

將分子固定至金屬納米層或納米結(jié)構(gòu)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此類方法包括共軛化學(xué)，諸如涉及1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、磺基-NHS偶合、疏水性結(jié)合或硫醚化學(xué)的那些方法。在一些實(shí)施方案中，分子可經(jīng)由較大載體分子或蛋白質(zhì)來間接地偶合至金屬納米層或納米結(jié)構(gòu)。當(dāng)分子較小，諸如為激素、藥物和小于10kD的其他小分子時(shí)，此間接偶合尤其適用。優(yōu)選地，載體蛋白質(zhì)不能夠與目標(biāo)分析物特異性相互作用。

本發(fā)明的分析物檢測(cè)裝置還可包括多個(gè)檢測(cè)綴合物。根據(jù)測(cè)定配置，檢測(cè)綴合物包含偶合至能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物或捕獲分子的結(jié)合配偶體的金屬納米結(jié)構(gòu)。舉例而言，在裝置以?shī)A心測(cè)定格式配置的實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物包含偶合至或綴合至能夠特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的結(jié)合配偶體的金屬納米結(jié)構(gòu)。在裝置以直接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定格式配置的其他實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物包含偶合至或綴合至目標(biāo)分析物的金屬納米結(jié)構(gòu)。

結(jié)合配偶體可為與捕獲分子相同類型的分子，包括但不限于半抗原和其他小分子、藥物、激素、生物大分子，諸如抗體或其片段(例如，F(xiàn)v、Fab、(Fab)₂、單鏈、CDR等)、抗原、受體、配體、多核苷酸、適體、多肽、多糖、脂多糖、糖肽、脂蛋白或核蛋白。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體為與捕獲分子相同類型的分子，但是優(yōu)選在不同于捕獲分子的結(jié)合部位的位置處結(jié)合至目標(biāo)分析物。舉例而言，結(jié)合配偶體和捕獲分子可均為識(shí)別目標(biāo)分析物的抗體，但是結(jié)合配偶體結(jié)合目標(biāo)分析物的表位與捕獲分子結(jié)合目標(biāo)分析物的表位分開并且理想地不重疊。因此，在某些實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體為識(shí)別目標(biāo)分析物的第一表位的抗體并且捕獲分子為識(shí)別目標(biāo)分析物的第二表位的不同抗體。

檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)可主要由貴金屬或其復(fù)合物組成。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)可主要由過渡金屬或其復(fù)合物組成。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)可包含堿金屬或鑭系元素以及貴金屬或過渡金屬。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)包含選自金、銀、銅、鉑、鈀、釕、銠、鋨、銥、鈦、鉻、鎘、鋅、鐵、鈷、鎳及其復(fù)合物的金屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米結(jié)構(gòu)為金納米結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米結(jié)構(gòu)為銀納米結(jié)構(gòu)。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)為復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)?！皬?fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)”是指包含至少兩種貴金屬、過渡金屬、堿金屬或鑭系元素的納米結(jié)構(gòu)。兩種或更多種金屬可混合在一起，如在合金中，或兩種或更多種金屬可存在于納米結(jié)構(gòu)的單獨(dú)部分中。舉例而言，一種金屬可形成納米結(jié)構(gòu)的核心，而第二金屬形成納米結(jié)構(gòu)的外殼層或涂層。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含至少兩種選自金、銀、銅、鉑、鈀、釕、銠、鋨、銥、鈦、鉻、鎘、鋅、鐵、鈷及鎳的金屬。在其他實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含至少兩種選自金、銀、銅、鉑、鈀、鎘、鐵、鎳及鋅的金屬。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含金和銀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含金和銅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含銀和銅。

在一些實(shí)施方案中，每種復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)為第一金屬與第二金屬的合金。在某些實(shí)施方案中，每種復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含第一金屬的核心和第二金屬的涂層。在一個(gè)實(shí)施方案中，核心為銀并且涂層為金。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心為銅并且涂層為金。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心為銀并且涂層為銅。在一些實(shí)施方案中，每種復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含電介質(zhì)核心(例如二氧化硅、硫化金、二氧化鈦、二氧化硅及聚苯乙烯)，第一金屬的第一涂層和第二金屬的第二涂層。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，核心為二氧化硅，第一涂層(即內(nèi)涂層)為鍍銀層，并且第二涂層為鍍金層(即外涂層)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心為二氧化硅，第一涂層(即內(nèi)涂層)為鍍銅層，并且第二涂層為鍍金層(即外涂層)。

在一些實(shí)施方案中，在使用第二金屬的涂布過程之后，將包含第一金屬的核心溶解以形成由第二金屬組成的空心結(jié)構(gòu)。例如，銀核心用金納米顆粒涂布產(chǎn)生銀核心周圍的金外殼并且銀核心隨后溶解或降解，導(dǎo)致形成中空納米金殼層結(jié)構(gòu)。

金屬納米結(jié)構(gòu)包括球狀納米顆粒以及納米片和納米殼。納米片具有大于其厚度的橫向尺寸(例如邊緣長(zhǎng)度)。納米片包括納米盤、納米多邊形、納米六邊形、納米立方體、納米環(huán)、納米星形以及納米棱柱體。在一些實(shí)施方案中，金屬納米結(jié)構(gòu)，包括復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，具有選自以下的幾何結(jié)構(gòu)；球狀納米顆粒、錐體納米顆粒、六邊形納米顆粒、納米管、納米殼、納米棒、納米點(diǎn)、納米島、納米線、納米盤、納米立方體或其組合。其他形狀也為可能的，包括不規(guī)則形狀。在某些實(shí)施方案中，金屬納米結(jié)構(gòu)的尺寸和形狀為不均勻的–即金屬納米結(jié)構(gòu)為不同形狀和尺寸的納米結(jié)構(gòu)的非均勻混合物。

對(duì)于球狀納米顆粒，合適直徑范圍包括約5nm至約200nm、約10nm至約100nm和約20nm至約60nm。對(duì)于納米片，邊緣長(zhǎng)度可為約10nm至約800nm、約20nm至約500nm、約50nm至約200nm、約30nm至約100nm或約10nm至約300nm。納米片的厚度范圍可為約1至約100nm、約5nm至約80nm、約10nm至約50nm或約5nm至約20nm。

在一些實(shí)施方案中，納米片具有大于2的縱橫比?？v橫比為邊緣長(zhǎng)度與厚度的比率。優(yōu)選地，納米片具有約2至約25、約3至約20、約5至約10、約2至約15或約10至約30的縱橫比。

結(jié)合配偶體或目標(biāo)分析物可使用與以上對(duì)于將捕獲分子固定至金屬納米層所述類似的方法來偶合至或綴合至金屬納米結(jié)構(gòu)(例如復(fù)合納米結(jié)構(gòu))。此類方法包括但不限于，EDC共軛化學(xué)、磺基-NHS偶合、疏水性結(jié)合或硫醚化學(xué)。結(jié)合配偶體或目標(biāo)分析物可經(jīng)由各種化學(xué)官能團(tuán)來偶合至金屬納米結(jié)構(gòu)，所述化學(xué)官能團(tuán)包括硫醇、胺、二硫醇、丙烯酸亞磷酰胺、迭氮化物或炔。

在一些實(shí)施方案中，用于沉積于表面上的金屬納米層中的一種或多種金屬可與制造檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)的一種或多種金屬相同。舉例而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，沉積于表面上的金屬納米層包括金薄膜或多個(gè)金納米結(jié)構(gòu)并且檢測(cè)綴合物包含金納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，用于沉積于表面上的金屬納米層的金屬不同于用于產(chǎn)生檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)的一種或多種金屬。例如，在一些實(shí)施方案中，沉積于表面上的金屬納米層包括銀薄膜或多個(gè)銀納米結(jié)構(gòu)并且檢測(cè)綴合物包含金納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，沉積于表面上的金屬納米層包括金薄膜或多個(gè)金納米結(jié)構(gòu)并且檢測(cè)綴合物包含銀納米結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，沉積于表面上的金屬納米層包括金薄膜或多個(gè)金納米結(jié)構(gòu)并且檢測(cè)綴合物包含復(fù)合納米結(jié)構(gòu)。在相關(guān)實(shí)施方案中，復(fù)合納米結(jié)構(gòu)包含鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)。在其他具體實(shí)施方案中，沉積于表面上的金屬納米層包括金薄膜或多個(gè)金納米結(jié)構(gòu)并且檢測(cè)綴合物包含復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，包括鍍金的銅納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，沉積于表面上的金屬納米層包括金薄膜或多個(gè)金納米結(jié)構(gòu)并且檢測(cè)綴合物包含復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，包括鍍金的磁石納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，沉積于表面上的金屬納米層包括金薄膜或多個(gè)金納米結(jié)構(gòu)并且檢測(cè)綴合物包含復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，包括金和堿金屬或鑭系元素。

本發(fā)明還包括包含如本文所公開的本發(fā)明的分析物檢測(cè)裝置的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含(i)含有其上固定有多個(gè)捕獲分子的金屬納米層的表面和(ii)包含如本文描述的多個(gè)檢測(cè)綴合物的組合物。在某些實(shí)施方案中，組合物與表面分開地封裝以使得它可隨后在執(zhí)行檢測(cè)方法期間與表面接觸。在一些實(shí)施方案中，將包含多個(gè)檢測(cè)綴合物的組合物凍干，例如，呈球團(tuán)或珠粒形式。在相關(guān)實(shí)施方案中，含有金屬納米層的表面可為芯片、圓盤或試管。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，含有金屬納米層的表面為適合與離心轉(zhuǎn)子一起使用的試管。在此類實(shí)施方案中，金屬納米層可沉積于試管的蓋子、底部和/或壁上。

在某些實(shí)施方案中，本文所述分析物檢測(cè)系統(tǒng)的所有組分包含于離心轉(zhuǎn)子或圓盤內(nèi)。例如，轉(zhuǎn)子或圓盤可含有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)腔室，其中定位含有固定捕獲分子和多個(gè)檢測(cè)綴合物的金屬納米層表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米層表面為定位于反應(yīng)腔室的底部的芯片。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米層直接沉積于反應(yīng)腔室的底板上。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬納米層表面為以金屬納米層涂布的珠粒(例如塑料珠粒)。在所有此類實(shí)施方案中，捕獲分子固定至金屬納米層表面。在相關(guān)實(shí)施方案中，多個(gè)檢測(cè)綴合物以凍干組合物，諸如凍干珠粒或球團(tuán)形式存在。

在替代性實(shí)施方案中，捕獲分子綴合至金屬納米結(jié)構(gòu)，所述金屬納米結(jié)構(gòu)呈膠體懸浮體形式。將多個(gè)檢測(cè)綴合物添加至在測(cè)試樣品存在下的懸浮液。如果目標(biāo)分析物存在于樣品中，在檢測(cè)綴合物與含有捕獲分子的懸浮納米結(jié)構(gòu)之間發(fā)生復(fù)合物形成，從而引起光學(xué)信號(hào)變化(例如，懸浮納米結(jié)構(gòu)的峰吸光率波長(zhǎng)的移位)。

因此，在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)腔室的轉(zhuǎn)子或圓盤，其中每個(gè)反應(yīng)腔室包含(i)含有如本文描述的多個(gè)檢測(cè)綴合物的凍干組合物和(ii)以金屬納米層涂布的顆粒，其中多個(gè)捕獲分子固定至金屬納米層。此類試劑盒提供一步式分析物檢測(cè)方法，由此測(cè)試樣品與轉(zhuǎn)子或圓盤接觸，并且將離心力施加至轉(zhuǎn)子或圓盤將測(cè)試樣品遞送至反應(yīng)腔室，其中樣品與多個(gè)檢測(cè)綴合物和含有固定捕獲分子的金屬納米層涂布珠?；旌?。在轉(zhuǎn)子或圓盤含有超過一個(gè)反應(yīng)腔室的實(shí)施方案中，可選擇檢測(cè)綴合物和捕獲分子以使得可在每個(gè)反應(yīng)腔室中檢測(cè)不同分析物。如果轉(zhuǎn)子包含多個(gè)反應(yīng)腔室，這些轉(zhuǎn)子格式檢測(cè)裝置可以?shī)A心測(cè)定格式、直接競(jìng)爭(zhēng)格式或兩者來配置。

本文論述的任何類型金屬納米層或金屬納米結(jié)構(gòu)可與這些轉(zhuǎn)子格式檢測(cè)裝置一起使用。在一些實(shí)施方案中，涂布在珠粒上的金屬納米層為金納米層并且檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)為金納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，涂布在珠粒上的金屬納米層為銀納米層并且檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)為金納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，涂布在顆粒上的金屬納米層為金納米層并且檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)為銀納米結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，涂布在顆粒上的金屬納米層為用金納米層覆蓋的銀納米層并且檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)為金納米結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，涂布在珠粒上的金屬納米層為金納米層并且檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)為復(fù)合納米結(jié)構(gòu)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合納米結(jié)構(gòu)為鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合納米結(jié)構(gòu)為鍍金的銅納米結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的試劑盒還可包括用于使用裝置檢測(cè)測(cè)試樣品中的分析物的說明書、用于收集生物樣品的裝置或工具和/或用于從固體材料諸如土壤、食物和生物組織中獲得樣品的提取緩沖液。

本發(fā)明還提供檢測(cè)在樣品中的目標(biāo)分析物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括：(i)將測(cè)試樣品與如本文描述的多個(gè)檢測(cè)綴合物混合；(ii)使所述混合物與含有金屬納米層的表面接觸，其中如本文描述的多個(gè)捕獲分子固定至金屬納米層；(iii)將表面暴露于紫外光-可見光-紅外光光譜內(nèi)的波長(zhǎng)范圍下的光源；以及(iv)測(cè)量來自表面的光學(xué)信號(hào)，其中光學(xué)信號(hào)的變化指示樣品中的目標(biāo)分析物的存在。

在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)方法為夾心測(cè)定。在此類實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物包含偶合至結(jié)合配偶體的金屬納米結(jié)構(gòu)，所述結(jié)合配偶體能夠特異性結(jié)合至存在于樣品中的目標(biāo)分析物以形成分析物-檢測(cè)綴合物復(fù)合物。固定至金屬納米層表面的多個(gè)捕獲分子還能夠特異性結(jié)合至存在于樣品中的目標(biāo)分析物。將金屬納米層暴露于光源并且測(cè)量光學(xué)信號(hào)，其中光學(xué)信號(hào)的變化指示樣品中的分析物的存在。經(jīng)由說明，當(dāng)含有目標(biāo)分析物的樣品與多個(gè)檢測(cè)綴合物混合時(shí)，目標(biāo)分析物結(jié)合至檢測(cè)綴合物中的結(jié)合配偶體以形成分析物-檢測(cè)綴合物復(fù)合物。這些復(fù)合物進(jìn)而結(jié)合至經(jīng)由分析物固定至金屬納米層表面的多個(gè)捕獲分子，從而使檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)緊鄰金屬納米層表面。通過金屬納米層表面吸收或散射的光的量受到復(fù)合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)的接近性影響，因而產(chǎn)生峰吸收波長(zhǎng)的增強(qiáng)移位，從而指示樣品中的目標(biāo)分析物的存在。

在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)方法為競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。在此類實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物包含偶合至所關(guān)注目標(biāo)分析物的金屬納米結(jié)構(gòu)。如在夾心測(cè)定方法中，固定至金屬納米層表面的多個(gè)捕獲分子能夠特異性結(jié)合至目標(biāo)分析物。在此類型的測(cè)定中，檢測(cè)綴合物最初將結(jié)合至捕獲分子。如果含有目標(biāo)分析物的樣品與此類初始復(fù)合物混合，則樣品中的未標(biāo)記或游離目標(biāo)分析物將與檢測(cè)綴合物競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合至捕獲分子。此類型的測(cè)定中的光學(xué)信號(hào)的變化將由于檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)自金屬納米層表面的位移產(chǎn)生，從而成比例地減少峰吸收波長(zhǎng)的波長(zhǎng)移位。

測(cè)試樣品可為任何類型液體樣品，包括生物樣品或由環(huán)境或食物樣品制備的提取物。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，測(cè)試樣品為生物樣品。生物樣品包括但不限于，全血、血漿、血清、唾液、尿液、胸膜腔積液、汗液、膽液、腦脊液、糞便、陰道流體、精子、眼晶狀體液、黏液、滑液、腹膜液、羊水、活檢組織、唾液以及細(xì)胞裂解物。生物樣品可從懷疑患有疾病病狀，諸如癌癥、傳染病(例如，病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌感染)、心血管疾病、代謝疾病、自身免疫疾病等的人受試者或動(dòng)物受試者獲得。生物樣品也可從經(jīng)歷常規(guī)醫(yī)學(xué)檢查的健康受試者(例如人類或動(dòng)物)獲得。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，將測(cè)試樣品與多個(gè)檢測(cè)綴合物混合并且隨后使得混合物與含有固定捕獲分子的金屬納米層表面接觸。在其他實(shí)施方案中，使測(cè)試樣品與含有固定捕獲分子的金屬納米層表面接觸并且隨后添加多個(gè)檢測(cè)綴合物。在某些實(shí)施方案中，使得樣品、多個(gè)檢測(cè)綴合物與含有固定捕獲分子的金屬納米層表面同時(shí)接觸。例如，使樣品與兩種試劑同時(shí)接觸可在如上所述的轉(zhuǎn)子格式檢測(cè)裝置中發(fā)生。

如上所述的任何分析物檢測(cè)裝置可用于本發(fā)明的檢測(cè)方法中。因此，本文所述的各種金屬納米層表面、捕獲分子和檢測(cè)綴合物適用于檢測(cè)方法中。例如，在所述方法的一些實(shí)施方案中，含有金屬納米層的表面為芯片、孔、試管或珠粒。在所述方法的某些實(shí)施方案中，含有金屬納米層的表面為并入或適合與離心轉(zhuǎn)子一起使用的試管的壁和底部。在這些和其他實(shí)施方案中，表面上的金屬納米層為金屬薄膜，如金薄膜。在所述方法的其他實(shí)施方案中，表面上的金屬納米層包含固定于表面上的多個(gè)金屬納米結(jié)構(gòu)，如金納米結(jié)構(gòu)。

在檢測(cè)方法的某些實(shí)施方案中，檢測(cè)綴合物包含偶合至結(jié)合配偶體或目標(biāo)分析物的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)。如本文描述，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含至少兩種貴金屬或過渡金屬。在所述方法的一些實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含至少兩種選自金、銀、銅、鉑、鈀、釕、銠、鋨、銥、鈦、鉻、鎘、鋅、鐵、鈷及鎳的金屬。在所述方法的其他實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含至少兩種選自金、銀、銅、鉑、鈀、鎘、鐵、鎳及鋅的金屬。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含金和銀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含金和銅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含銀和銅。用于本發(fā)明方法中的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)可包括許多不同的幾何形狀，諸如球狀納米顆粒、錐體納米顆粒、六邊形納米顆粒、納米管、納米殼、納米棒、納米點(diǎn)、納米島、納米線、納米盤、納米立方體或其組合。

在某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法中的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)為第一金屬與第二金屬的合金。在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法中的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含第一金屬的核心和第二金屬的涂層。在具體實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含銀核心和鍍金層。在其他實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含銅核心和鍍金層。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心為銀并且涂層為銅。在一些實(shí)施方案中，每種復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)包含電介質(zhì)核心(例如二氧化硅、硫化金、二氧化鈦、二氧化硅和聚苯乙烯)、第一金屬的第一涂層和第二金屬的第二涂層。在檢測(cè)方法的一個(gè)特定實(shí)施方案中，核心為二氧化硅，第一涂層(即內(nèi)涂層)為鍍銀層，并且第二涂層為鍍金層(即外涂層)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心為二氧化硅，第一涂層(即內(nèi)涂層)為鍍銅層，并且第二涂層為鍍金層(即外涂層)。

本發(fā)明檢測(cè)方法可用于測(cè)定目標(biāo)分析物的定性或定量的量。此類方法尤其適用于測(cè)定樣品中的目標(biāo)分析物的近似量，其尤其可用于診斷某些醫(yī)學(xué)病狀或評(píng)估藥物療法的功效。在一個(gè)實(shí)施方案中，可測(cè)定目標(biāo)分析物的數(shù)量，方法是通過如本文對(duì)于具有已知量目標(biāo)分析物的樣品所描述地測(cè)量來自金屬納米層表面的光學(xué)信號(hào)的變化來建立具體分析物的校準(zhǔn)曲線；測(cè)定測(cè)試樣品的光學(xué)信號(hào)變化；并且將測(cè)試樣品的光學(xué)信號(hào)變化與對(duì)于校準(zhǔn)曲線獲得的值比較。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定第一試劑與第二試劑之間的復(fù)合物的數(shù)量包括將來自測(cè)試樣品的吸光率和/或反應(yīng)速率與來自具有已知量復(fù)合物的一個(gè)樣品的吸光率和/或反應(yīng)速率比較，從而測(cè)定測(cè)試樣品中的復(fù)合物的數(shù)量。自測(cè)試樣品獲得的定量值可與預(yù)先確定的臨界值比較，其中所述預(yù)先確定的臨界值指示目標(biāo)分析物的異?；蛘Ｋ疁?zhǔn)。

本發(fā)明的檢測(cè)方法提供一種用于檢測(cè)樣品中的極少量目標(biāo)分析物的高度靈敏技術(shù)。如通過工作實(shí)例展示，來自金納米層表面的基于等離子體共振的信號(hào)的放大可使用金納米結(jié)構(gòu)綴合物達(dá)成，以使得可檢測(cè)樣品中的納克數(shù)量的目標(biāo)分析物。因此，在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)到納克數(shù)量的目標(biāo)分析物的存在。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)來自金納米層表面的基于等離子體共振的信號(hào)的顯著更大放大可使用復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)綴合物來達(dá)成。使用綴合至分析物特異性抗體的鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)使得能夠檢測(cè)皮克數(shù)量的目標(biāo)分析物，與使用金納米結(jié)構(gòu)綴合物獲得的數(shù)量相比，靈敏度增加1000倍。參見實(shí)施例3。因此，在所述方法的一些實(shí)施方案中，檢測(cè)皮克數(shù)量的目標(biāo)分析物的存在。在所述方法的其他實(shí)施方案中，檢測(cè)毫微微克數(shù)量的目標(biāo)分析物的存在。更大靈敏度可通過改變復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)和/或金屬納米層表面的組成和/或形狀來獲得。

當(dāng)入射光施加于金屬納米結(jié)構(gòu)，金屬中的導(dǎo)帶電子在入射電磁波的相同頻率下共同地振蕩。由于此類共振振蕩，納米結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈吸收并散射特定波長(zhǎng)范圍的光。對(duì)于包含貴金屬或過渡金屬的金屬納米結(jié)構(gòu)，此波長(zhǎng)范圍為在紫外光-可見光-紅外光光譜中，這取決于納米結(jié)構(gòu)的具體組成。因此，施加適用于本發(fā)明方法的電磁能的光源可包括可施加紫外光-可見光光譜或紫外光-可見光-紅外光光譜內(nèi)的波長(zhǎng)范圍的任何來源，包括弧光燈和激光。在一些實(shí)施方案中，光源可裝備單色器以使得特定波長(zhǎng)的光可施加于金屬納米層表面。

金屬納米層和納米結(jié)構(gòu)的光學(xué)性質(zhì)取決于其尺寸、形狀和組成。例如，固體金納米顆粒具有約515nm至約560nm的吸收峰波長(zhǎng)(λ_最大)，這取決于粒徑。具有30nm直徑的金球狀納米顆粒在約520nm下最大吸收，并且隨著粒徑增加，λ_最大移位至更長(zhǎng)波長(zhǎng)。銀和銅顆粒在紫外光/藍(lán)光或紅光區(qū)域(例如，約350nm至約500nm)中具有λ_最大，并且增加的粒徑導(dǎo)致λ_最大移位至更長(zhǎng)波長(zhǎng)。金屬納米棒具有橫向λ_最大1和縱向λ_最大2。不同金屬的合金通常展現(xiàn)出構(gòu)成金屬的吸收峰之間的中間范圍內(nèi)的吸收峰。舉例而言，包含金與銀的50/50合金的納米結(jié)構(gòu)展現(xiàn)約470nm的λ_最大，并且金的量逐漸增加導(dǎo)致吸收峰移位至更長(zhǎng)波長(zhǎng)。LSPR信號(hào)對(duì)于局部媒介折射系數(shù)的變化的靈敏度可通過改變納米結(jié)構(gòu)的形狀或幾何結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)。例如，與球相比，非球形顆粒(例如納米棱柱體、納米棒、納米殼等)具有增加的LSPR靈敏度。在一些實(shí)施方案中，光學(xué)性質(zhì)(例如在具體波長(zhǎng)下的吸收/散射)通過改變沉積于表面上的金屬納米層或用于檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)的尺寸、形狀或組成來針對(duì)具體應(yīng)用加以定制。

入射光與金屬納米層表面之間的相互作用可作為反射光或透射光來監(jiān)測(cè)。吸收或散射的入射光的量可作為反射模式中的吸收光譜或透射模式中的吸收光譜來測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，由金屬納米層測(cè)量的光學(xué)信號(hào)可為光學(xué)反射、吸收光譜、散射光譜和/或發(fā)射光譜。

由結(jié)合配偶體、目標(biāo)分析物與捕獲分子之間的復(fù)合物形成所導(dǎo)致的金屬納米層與檢測(cè)綴合物中的金屬納米結(jié)構(gòu)之間的等離子體偶合產(chǎn)生了金屬納米層的局部表面等離子體共振光譜的變化。例如，此類變化可包括增加的光學(xué)消光、增加的光學(xué)反射和/或增加的散射和/或發(fā)射信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，指示樣品中的目標(biāo)分析物的存在的光學(xué)信號(hào)的變化包括光學(xué)散射的移位、增加或減少或這些特征的組合。在某些實(shí)施方案中，指示樣品中的目標(biāo)分析物的存在的光學(xué)信號(hào)的變化為光譜峰波長(zhǎng)移位。在一個(gè)實(shí)施方案中，光學(xué)光譜峰的波長(zhǎng)移位可為200nm至1200nm光譜窗內(nèi)的紅移(例如，移位至更長(zhǎng)波長(zhǎng))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，光學(xué)光譜峰的波長(zhǎng)移位可為200nm至1200nm光譜窗內(nèi)的藍(lán)移(例如，移位至更短波長(zhǎng))。光學(xué)信號(hào)的變化可在設(shè)定反應(yīng)期之后的具體時(shí)間點(diǎn)測(cè)量。另外或可選地，可測(cè)量在反應(yīng)期內(nèi)的光學(xué)信號(hào)的變化(例如速率測(cè)定)。兩種類型測(cè)量可用于目標(biāo)分析物的定性或定量分析。

用于測(cè)量不同波長(zhǎng)的光學(xué)信號(hào)并獲得消光、散射或發(fā)射光譜的各種方法在本領(lǐng)域中為已知的。任何分光光度儀器或光度儀器適用于所公開的方法。一些非限制性實(shí)例包括板讀出器、Cobas Fara分析器以及Piccolo和Vetscan分析器(Abaxis，Inc.，Union City，CA)、光纖讀出器(例如，LightPath^TM S4(LamdaGen，Menlo Park，CA))、SPR儀器(例如，可自GE Healthcare獲得的Biacore儀器)、來自O(shè)lympus，Hitachi的離心分析器等。

本發(fā)明還包括一種測(cè)定復(fù)合物，其包含(i)含有偶合至結(jié)合配偶體的復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)的檢測(cè)綴合物、(ii)目標(biāo)分析物和(iii)其上固定有捕獲分子的金屬納米層涂布珠粒，其中檢測(cè)綴合物中的結(jié)合配偶體結(jié)合至目標(biāo)分析物上的第一表位并且捕獲分子結(jié)合至目標(biāo)分析物上的第二表位，從而形成包含檢測(cè)綴合物、目標(biāo)分析物和捕獲分子的復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定復(fù)合物包含在適合與離心轉(zhuǎn)子一起使用的試管中。在其他實(shí)施方案中，測(cè)定復(fù)合物包含在離心轉(zhuǎn)子或圓盤中的反應(yīng)腔室內(nèi)。

測(cè)定復(fù)合物中的結(jié)合配偶體和捕獲分子可為如上所述的任何類型的分子，包括半抗原和其他小分子、藥物、激素、生物大分子，諸如抗體或其片段(例如，F(xiàn)v、Fab、(Fab)₂、單鏈、CDR等)、抗原、受體、配體、多核苷酸、適體、多肽、多糖、脂多糖、糖肽、脂蛋白、或核蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體為抗體并且捕獲分子為不同抗體。

以上詳細(xì)描述了金屬納米層和復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，涂布珠粒(例如塑料或玻璃珠粒)的金屬納米層為金納米層。在另一個(gè)實(shí)施方案中，涂布珠粒的金屬納米層為銀納米層。所述珠粒優(yōu)選小于0.5cm，但是大于0.1mm。在某些實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)為鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)為鍍金的銅納米結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，金屬納米結(jié)構(gòu)包含用銀離子、銅離子或這兩種離子摻雜的金。

任何類型的目標(biāo)分析物可使用本發(fā)明的方法、裝置和測(cè)定復(fù)合物來檢測(cè)，尤其為有效診斷疾病的那些方法、裝置和測(cè)定復(fù)合物。目標(biāo)分析物可包括但是不限于蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、肽、核酸(RNA、DNA、mRNA、miRNA)、激素、糖蛋白、多糖、毒素、病毒、病毒粒子、藥物分子、半抗原或化學(xué)品。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)分析物為與人和/或動(dòng)物的傳染病相關(guān)的標(biāo)記或抗原。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)分析物為與具體生理狀態(tài)或病理病狀相關(guān)的標(biāo)記或抗原。

在某些實(shí)施方案中，目標(biāo)分析物為致病抗原或致病抗原的抗體。例如，致病抗原可為病毒抗原(例如，貓白血病病毒、犬細(xì)小病毒、口蹄疫病毒、流感病毒、a型、b型、c型肝炎病毒、HIV病毒、人乳頭瘤病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、狂犬病病毒等)、細(xì)菌抗原(例如，埃立克體屬、疏螺旋體屬、無形體屬、炭疽、沙門氏菌、桿菌等)、真菌抗原、或寄生蟲抗原(例如，犬心絲蟲、梨形鞭毛蟲、惡性瘧原蟲、非洲錐蟲、布氏錐蟲等)。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)分析物為疾病相關(guān)抗原或疾病相關(guān)抗原的抗體。疾病相關(guān)抗原包括但不限于癌癥相關(guān)抗原或標(biāo)記(例如，PSA、AFP、CA125、CA15-3、CA19-9、CEA、NY-ESO-1、MUC1、GM3、GD2、ERBB2等)、心血管疾病相關(guān)抗原或標(biāo)記(例如，肌鈣蛋白、C-反應(yīng)蛋白、腦鈉肽、CKMB、脂肪酸結(jié)合蛋白等)、代謝相關(guān)抗原或標(biāo)記(例如，促甲狀腺激素、甲狀腺素、瘦蛋白、胰島素)或自身免疫疾病相關(guān)抗原或標(biāo)記(例如，自身抗體)。在某些實(shí)施方案中，目標(biāo)分析物為炎癥抗原或標(biāo)記(例如，C-反應(yīng)蛋白、MRP14、MRP8、25F9等)。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)分析物為妊娠相關(guān)抗原或標(biāo)記(例如，胎兒抗原、人絨毛膜促性腺素)。

本發(fā)明還提供一種用于制備復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包含制備包含聚合物與氯金酸的混合物的第一溶液、制備包含銀或銅納米結(jié)構(gòu)的第二溶液以及將第一溶液與第二溶液一起孵育一段時(shí)間，其中所得混合物包含鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)或鍍金的銅納米結(jié)構(gòu)。所得混合物優(yōu)選具有約515nm至約670nm或約520nm至約560nm的峰吸光率。在一個(gè)實(shí)施方案中，所得混合物具有約530nm的峰吸光率。

用于制備第一溶液的聚合物可為以下中的任一種：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚乙烯亞胺、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、各種樹膠、明膠或包含任何前述物質(zhì)的混合聚合物。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，聚合物為聚乙烯吡咯烷酮。不同類型的涂布納米結(jié)構(gòu)可通過改變聚合物的分子量來獲得。聚合物的合適分子量范圍包括約5,000道爾頓至約150,000道爾頓、約10,000道爾頓至約100,000道爾頓、約20,000道爾頓至約80,000道爾頓。在一些實(shí)施方案中，聚合物具有小于50,000道爾頓的分子量。在其他實(shí)施方案中，聚合物具有小于20,000道爾頓的分子量。在某些實(shí)施方案中，聚合物具有約10,000道爾頓的分子量。

鍍金層的特征可通過調(diào)整聚合物與氯金酸的濃度比來控制。例如，聚合物與氯金酸的濃度比為約100:1至約1:100、約2:1至約5:1或約1.5:1至約8:1。在一些實(shí)施方案中，聚合物與氯金酸的濃度比為1:1。聚合物的合適濃度包括但不限于水或乙醇中的約0.1％至約20％濕重。氯金酸的合適濃度包括但不限于約0.001M至約1.0M、約0.010M至約0.500M和約0.050M至約0.100M。

涂層效率和厚度也可受到涂布溶液(即第一溶液)的pH和鹵化物含量影響。在某些實(shí)施方案中，溶液的pH保持在約3至約14的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，溶液的鹵化物含量小于150mM。在其他實(shí)施方案中，溶液的鹵化物含量在約0至約50mM范圍內(nèi)。

制備銀和銅納米結(jié)構(gòu)的溶液的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，包含銀或銅納米結(jié)構(gòu)的第二溶液可通過美國(guó)專利公布號(hào)2012/0101007、美國(guó)專利公布號(hào)2014/0105982或美國(guó)專利公布號(hào)2013/0230717描述的任何方法來制備，所述專利各自以引用的方式整體并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含銀或銅納米結(jié)構(gòu)的第二溶液通過將銀源或銅源與還原劑混合來制備。合適銀源包括銀鹽，諸如硝酸銀。合適銅源包括硫酸銅(II)、氯化銅(II)、氫氧化銅(II)和硝酸銅(II)、乙酸銅(II)和三氟乙酸銅(II)?？膳c銀源或銅源反應(yīng)以形成納米結(jié)構(gòu)的還原劑可包括葡萄糖、抗壞血酸、硼氫化鈉以及聚合物諸如PVP的堿性溶液(例如pH大于7.5)。在某些實(shí)施方案中，還原劑為抗壞血酸。銀納米結(jié)構(gòu)或銅納米結(jié)構(gòu)的所需形狀和光學(xué)光譜峰可通過調(diào)整反應(yīng)物的比率或濃度來實(shí)現(xiàn)，如普通本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。僅舉例而言，高濃度的還原劑可產(chǎn)生五角形和雙錐形納米結(jié)構(gòu)，而低濃度的還原劑可產(chǎn)生細(xì)長(zhǎng)納米線或管。根據(jù)納米結(jié)構(gòu)的具體形狀，包含銀或銅納米結(jié)構(gòu)的第二溶液可具有約550nm至約1000nm、約600nm至約700nm、約630nm至約680nm、約750nm至約850nm、約900nm至約940nm、約580nm至約620nm或約550nm至約750nm的峰吸光率。在某些實(shí)施方案中，包含銀納米結(jié)構(gòu)的第二溶液具有約600nm(即595nm至605nm，包括端點(diǎn))的峰吸光率。在一些實(shí)施方案中，包含銅納米結(jié)構(gòu)的第二溶液具有約585nm(即580nm至590nm，包括端點(diǎn))的峰吸光率。在一些實(shí)施方案中，與包含類似尺寸和形狀的銀納米結(jié)構(gòu)的溶液的峰吸光率相比，包含銅納米結(jié)構(gòu)的溶液的峰吸光率更大(即紅移)。

在一些實(shí)施方案中，第一溶液與第二溶液的孵育期為至少12小時(shí)。在其他實(shí)施方案中，第一溶液與第二溶液的孵育期大于24小時(shí)，優(yōu)選大于48小時(shí)，更優(yōu)選至少72小時(shí)。反應(yīng)混合物的峰吸光率的變化可在孵育期期間監(jiān)測(cè)以相應(yīng)地調(diào)整孵育時(shí)間。舉例而言，峰吸光率移位至較短波長(zhǎng)，例如在520nm至550nm區(qū)域內(nèi)，可指示鍍金的納米結(jié)構(gòu)已經(jīng)穩(wěn)定。在某些實(shí)施方案中，所得納米結(jié)構(gòu)對(duì)于氯化鈉(例如，0.25-1M)的穩(wěn)定性用于指示納米結(jié)構(gòu)的適當(dāng)涂層。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供合成具有大于約50/mL的光學(xué)密度的納米結(jié)構(gòu)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將如本文描述的聚合物與氯金酸混合、將混合物在設(shè)定溫度下攪拌第一時(shí)段、將抗壞血酸添加至混合物以及將混合物孵育第二時(shí)段。納米結(jié)構(gòu)的尺寸和形狀通過聚合物與氯金酸的濃度比以及孵育溫度和時(shí)間來決定。聚合物和氯金酸的濃度可在如上所述范圍內(nèi)。溫度可基于所需納米結(jié)構(gòu)的尺寸和形狀來調(diào)節(jié)，但是可在約4℃至約100℃范圍內(nèi)。類似地，孵育期(即第一時(shí)段)可基于納米結(jié)構(gòu)的所需性質(zhì)來調(diào)節(jié)，但是可在約15分鐘至一天范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，在第一孵育期之后，將約0.1至1份的抗壞血酸(例如約1至5M)添加至混合物。添加抗壞血酸之后的第二孵育期可為約1至約24小時(shí)。不受理論約束，添加抗壞血酸使得所產(chǎn)生納米結(jié)構(gòu)的數(shù)量大幅度增加。

在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括將混合物添加或摻雜約1至約100份的氯化金(例如約0.001M至1M)或硝酸銀(例如約0.001M至1M)或其他金屬(例如貴金屬、過渡金屬、堿金屬或鑭系元素)。此摻雜步驟可進(jìn)一步增加所得納米結(jié)構(gòu)的共振強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，在將抗壞血酸添加至反應(yīng)之前，將氯化金、硝酸銀或其他金屬添加至混合物。在其他實(shí)施方案中，在添加抗壞血酸之后，將氯化金、硝酸銀或其他金屬添加至混合物。金屬和抗壞血酸的添加順序可調(diào)節(jié)以將所得納米結(jié)構(gòu)定制為所需形狀和尺寸。

本發(fā)明通過不應(yīng)視為限制的以下額外實(shí)施例來進(jìn)一步說明。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對(duì)所公開的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變并且仍獲得相似或類似的結(jié)果。

在整個(gè)本公開中提及的所有專利和非專利文件出于所有目的以引用的方式整體并入。

實(shí)施例

實(shí)施例1.金納米顆粒綴合分析物的LSPR信號(hào)的放大

通過提供其上沉積有金納米層薄膜的塑料芯片來制備分析物檢測(cè)系統(tǒng)。將人IgG蛋白質(zhì)(100μg/ml)固定至金納米層薄膜以產(chǎn)生傳感器表面。通過將牛血清白蛋白固定至金納米層薄膜來構(gòu)建控制傳感器。將兩種類型的傳感器表面定位于裝備有發(fā)光和集光纖維的儀器內(nèi)，所述纖維將光照在金納米層表面上并且收集自表面反射回來的光。

使含有游離蛋白質(zhì)A(10μg/ml)的樣品與兩種類型傳感器表面接觸并且測(cè)量反射光譜的變化。如圖1所示出，將游離蛋白質(zhì)A引入到含有固定人IgG的傳感器并不產(chǎn)生金納米層薄膜的反射光譜的顯著可見變化，如通過峰波長(zhǎng)的移位所測(cè)量的。

通過用1mM鹽酸處理來再生傳感器表面并且將含有兩種不同濃度(3.5μg/ml和0.175μg/ml)的綴合至膠體金納米顆粒(CGC)的蛋白質(zhì)A的樣品與傳感器表面接觸。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A(即目標(biāo)分析物)綴合至膠體金納米顆粒時(shí)，金納米層表面的反射光譜的變化加劇。確切地說，與10μg/ml未標(biāo)記蛋白質(zhì)A相比，3.5μg/ml蛋白質(zhì)A-CGC產(chǎn)生更大的峰波長(zhǎng)移位。參見圖1，傳感器2。等離子體共振信號(hào)的放大足夠大到使得能夠檢測(cè)納克濃度的蛋白質(zhì)A-CGC。參見圖1，傳感器3。BSA傳感器的反射光譜的變化代表蛋白質(zhì)A分子非特異性結(jié)合至傳感器表面并且與蛋白質(zhì)A分子特異性結(jié)合至固定IgG分子所誘導(dǎo)的變化相比，顯著更小。

此初始實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明由金屬納米層表面處的結(jié)合事件所誘導(dǎo)的局部化表面等離子體共振信號(hào)的變化的顯著放大可通過將目標(biāo)分析物偶合至膠體金納米顆粒來達(dá)成。對(duì)于所檢測(cè)的納克數(shù)量的分析物，觀察到靈敏度提高將近60倍。

實(shí)施例2.夾心測(cè)定中的LSPR信號(hào)的放大

此實(shí)施例描述一系列實(shí)驗(yàn)，其被設(shè)計(jì)來評(píng)估使用金納米顆粒綴合物的局部化表面等離子體共振信號(hào)的放大是否也可在目標(biāo)分析物不直接綴合至金納米顆粒的夾心測(cè)定格式中達(dá)成。金納米層芯片表面如實(shí)施例1描述來制備。將針對(duì)C-反應(yīng)蛋白(CRP)(100μg/ml)的C7抗體固定至沉積于芯片表面上的金納米層薄膜以產(chǎn)生抗-CRP傳感器。將識(shí)別與C7抗體相比有所不同的非重疊CRP表位的C6抗體綴合至膠體金納米顆粒(C6-CGC)，以用于一些實(shí)驗(yàn)或以未標(biāo)記形式用于其他實(shí)驗(yàn)。

在第一系列實(shí)驗(yàn)中，將含有三種不同濃度的CRP(1ng/ml、10ng/ml或100ng/ml)的樣品與抗-CRP傳感器一起孵育15至20分鐘并且監(jiān)測(cè)金納米層的反射光譜的變化。如圖2所示，在CRP結(jié)合至傳感器表面上的固定C7抗-CRP抗體后，觀察到極小峰移位。隨后傳感器表面暴露至未標(biāo)記C6抗-CRP抗體(1μg/ml)并未導(dǎo)致顯著進(jìn)一步峰移位。參見圖2。類似地，隨后傳感器表面暴露至3μg/ml的C6-CGC并不產(chǎn)生反射光譜的任何進(jìn)一步變化，指示結(jié)合CRP分子可能以未標(biāo)記C6抗體飽和。參見圖2。

在第二系列實(shí)驗(yàn)中，將含有三種不同濃度的CRP(1ng/ml、10ng/ml或100ng/ml)的樣品與抗-CRP傳感器一起孵育15至20分鐘。隨后引入兩種不同濃度的C6-CGC(1μg/ml和3μg/ml)并且測(cè)量反射光譜的變化(圖3和圖4A)。結(jié)果表明與未標(biāo)記C6抗體相比，使C6抗-CRP抗體綴合至金納米顆粒會(huì)放大峰波長(zhǎng)移位。增加C6-CGC的濃度產(chǎn)生峰波長(zhǎng)的劑量依賴性移位。然而，1ng/ml與10ng/ml之間的信號(hào)差異較小(圖4B)。

在第三系列實(shí)驗(yàn)中，評(píng)估分析物孵育時(shí)間對(duì)于信號(hào)顯現(xiàn)的效應(yīng)。將抗-CRP傳感器與含有0ng/ml、10ng/ml或100ng/ml CRP的樣品接觸并且立即引入3μg/ml C6-CGC而無任何分析物孵育時(shí)間或洗滌。如圖5和圖6所示，較短分析物孵育時(shí)間產(chǎn)生較小峰波長(zhǎng)移位。

此三組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明LSPR信號(hào)的放大可使用金納米顆粒綴合物以?shī)A心測(cè)定格式來達(dá)成。與未標(biāo)記抗體相比，當(dāng)檢測(cè)器抗體用膠體金顆粒標(biāo)記時(shí)，觀察到增強(qiáng)的信號(hào)移位，從而允許檢測(cè)納克濃度的分析物。

實(shí)施例3.使用鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)信號(hào)放大

為了檢查改變用于標(biāo)記結(jié)合配偶體的金屬的類型是否影響LSPR信號(hào)的放大，制備復(fù)合金屬納米結(jié)構(gòu)。具體地，鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)制備如下。通過添加50.0mL去離子H₂O、500.0μL檸檬酸三鈉(75mM)、200μL AgNO₃(200mM)和500.0μL H₂O₂(27％)同時(shí)在室溫下強(qiáng)力地?cái)嚢鑱碇苽溷y納米結(jié)構(gòu)。然后，將500μL等分試樣的NaBH₄(200mM)快速注射到水溶液，引起顏色變?yōu)榈S色。在幾分鐘時(shí)間內(nèi)，顏色繼續(xù)自暗黃色變化至紅色至紫色并且最后穩(wěn)定于藍(lán)色。UV/Vis光譜測(cè)定的溶液的峰吸光率為604.5nm。

通過將5.0mL藍(lán)色溶液添加至50μL聚乙烯吡咯烷酮(PVP MW≈10,000乙醇中的20％)與50μL的HAuCl₄(20mM)的混合物來將鍍金層添加至銀納米結(jié)構(gòu)。在72小時(shí)孵育時(shí)間之后，樣品變?yōu)榘导t色并且具有534.5nm的峰吸光率。通過在20,000rpm下離心20分鐘來將納米顆粒洗滌兩次并且重新懸浮于2.0mL去離子H₂O中。溶液具有深紅色、530.3nm的吸收峰和15.0OD單位的總吸光率。

鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)(Au@AgNPs)綴合至C6抗-CRP抗體通過添加600.0μL Au@AgNPs和20.0μL C6抗-CRP抗體(8.0mg/mL)至880.0μL去離子H₂O來執(zhí)行，使最終抗體濃度達(dá)到17.8μg/mL/OD。在4℃下2小時(shí)孵育期之后，將樣品在30,000g下離心20分鐘并且重新懸浮于含有PBS中的BSA(10mg/mL)的1.5mL封閉溶液中。將綴合至抗-CRP C6抗體的Au@AgNP儲(chǔ)存于4℃下直到進(jìn)一步使用為止。

如實(shí)施例2描述地來制備抗-CRP金納米層傳感器并且其具有530nm下的峰吸收。還制備含有金納米層而沒有任何固定抗體的控制傳感器。將傳感器用100μL PBS平衡。

將在PBS中稀釋至1.5OD的綴合至Au@AgNP的100μL C6抗-CRP抗體與1、10或500pg/mL CRP抗原一起預(yù)混合1分鐘。然后使混合物與抗-CRP或?qū)φ諅鞲衅鞅砻娼佑|并且測(cè)量金納米層表面的反射光譜的變化。結(jié)果表明鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了由CRP-抗體復(fù)合物結(jié)合至傳感器表面所誘導(dǎo)的峰波長(zhǎng)移位(圖7)。使用鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)來檢測(cè)1pg/mL的CRP抗原是可能的，與使用金納米顆粒獲得的靈敏度相比，靈敏度提高1000倍。在較高濃度的抗原下，結(jié)合位點(diǎn)飽和并且沒有發(fā)生進(jìn)一步移位。

此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明在復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，諸如鍍金的銀納米結(jié)構(gòu)，用于標(biāo)記分析物結(jié)合配偶體時(shí)，實(shí)現(xiàn)來自金屬納米層表面的LSPR信號(hào)的顯著增強(qiáng)的放大。

實(shí)施例4.合成較高光密度納米結(jié)構(gòu)

通過將1ml最終體積的以下試劑以所指示順序混合來制備金納米顆粒：0.1ml的1％PVP-10(1％wt/wt)、0.2ml的0.1M氯化金、0.1ml的5N NaOH、0.4ml的水和0.2ml的1M抗壞血酸。在每次添加之后，將反應(yīng)混合物混合。光譜測(cè)量指示在室溫下24小時(shí)之后，反應(yīng)大部分完成。此方案產(chǎn)生球狀金納米顆粒，其展現(xiàn)約535nm的LSPR峰和每ml約80的對(duì)應(yīng)光密度。通過將硝酸銀或氯化金添加至預(yù)成型金納米顆粒來進(jìn)行使用額外金或銀的成層。通過在30,000g下離心1-2小時(shí)來移除過量試劑。

在單獨(dú)反應(yīng)中，將0.05ml的20％PVP(wt/wt)與0.25ml水、0.1ml的5N NaOH、0.1ml的1M檸檬酸鈉、0.5ml的0.1M氯化金和1ml的1M抗壞血酸混合。此方案導(dǎo)致立即形成約90/ml的OD和～525nm的LSPR峰的膠體金顆粒。在最終OD與最終反應(yīng)混合物中的2.5mM金與25mM金之間的金濃度之間觀察到線性對(duì)應(yīng)。

應(yīng)了解所公開的發(fā)明不限于所描述具體方法、協(xié)定和材料，因?yàn)檫@些可變化。還應(yīng)了解本文所用的術(shù)語(yǔ)為僅出于描述特定實(shí)施方案的目的，且不欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求書所限定。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即會(huì)認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文所述的發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多等效物。此類等效物意欲由以下權(quán)利要求書涵蓋。