本申請(qǐng)要求2014年05月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/993,581；2014年06月18日提交的62/013,823；2014年09月10日提交的62/048,489；2014年09月12日提交的62/049,520；和2014年09月25日提交的62/055,093的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。還對(duì)USSN14/206,284(公開(kāi)號(hào)US-2014/0272939)；USSN14/208,040(公開(kāi)號(hào)US-2014/0274775)；和USSN14/203,638(公開(kāi)號(hào)US-2014/0256588)進(jìn)行了引用，其公開(kāi)也通過(guò)引用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于進(jìn)行免疫測(cè)定的改進(jìn)的方法。所述方法經(jīng)設(shè)計(jì)以在免疫測(cè)定中放大信號(hào)并錨定其中采用的免疫測(cè)定復(fù)合物。發(fā)明背景已經(jīng)開(kāi)發(fā)了大量關(guān)于采用結(jié)合反應(yīng)(例如抗原抗體反應(yīng)，核酸雜交和受體配體反應(yīng))的技術(shù)的文獻(xiàn)，用于對(duì)樣品中感興趣的分析物的靈敏測(cè)量。許多生物化學(xué)結(jié)合系統(tǒng)的高度特異性導(dǎo)致了在各種市場(chǎng)中許多有價(jià)值的分析方法和系統(tǒng)，包括基礎(chǔ)研究，人用和獸用診斷，環(huán)境監(jiān)控以及工業(yè)測(cè)試。可以通過(guò)在結(jié)合反應(yīng)中直接測(cè)量分析物的參與來(lái)測(cè)量感興趣的分析物的存在。在一些方法中，可以通過(guò)測(cè)量附接到一種或多種結(jié)合材料的可觀察標(biāo)記物來(lái)指示該參與。雖然夾心法免疫測(cè)定形式在許多應(yīng)用中提供了極好的靈敏度和特異性，一些分析物以過(guò)低的濃度存在而無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)的免疫測(cè)定技術(shù)檢測(cè)。夾心法免疫分析的性能也可能因?yàn)闄z測(cè)抗體的非特異性結(jié)合以及包含高解離率抗體的夾心法混合物的不穩(wěn)定性而被限制。然而，修改傳統(tǒng)方法來(lái)改進(jìn)靈敏度和特異性的努力通常導(dǎo)致更加復(fù)雜，勞動(dòng)密集的方案，其可能由每一步的低效率而被阻礙，可能極大的影響分析的靈敏度和特異性。例如，在要求多個(gè)結(jié)合事件和/或反應(yīng)的復(fù)雜分析中，如果任意一個(gè)事件或反應(yīng)不太理想，整體分析的靈敏度和特異性可能受到影響。對(duì)于通過(guò)改進(jìn)靈敏度，減少非特異性結(jié)合和改進(jìn)夾心法復(fù)合物的穩(wěn)定性改進(jìn)夾心法免疫分析表現(xiàn)的新技術(shù)有需要。發(fā)明概述本發(fā)明考慮以下的具體實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本文所述的實(shí)施方案進(jìn)行多種修改，增加和改變而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這些修改，增加和改變意在落入權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實(shí)施方案(1)：檢測(cè)樣品中感興趣分析物的方法，包含：使分析物結(jié)合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于所述分析物的捕獲試劑，和錨定試劑；和(ii)與核酸探針連接的用于所述分析物的檢測(cè)試劑；從而在所述表面上形成包含所述捕獲試劑、分析物和檢測(cè)試劑的復(fù)合物；延伸所述探針以形成包含結(jié)合到錨定試劑的錨定區(qū)的延伸序列；使所述延伸序列結(jié)合到錨定試劑上；以及測(cè)量結(jié)合到所述表面上的延伸序列的量。在實(shí)施方案(1)中，所述捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體(aptamer)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，捕獲試劑是抗體。檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述檢測(cè)試劑是抗體。在實(shí)施方案(1)的一個(gè)具體的實(shí)例中，捕獲和檢測(cè)試劑是針對(duì)分析物的抗體。錨定試劑可以包括寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位；以及任選地，所述錨定區(qū)可以包括適體，且所述錨定試劑可包括適體配體。所述錨定區(qū)可包含核酸序列，且錨定試劑可包括DNA-結(jié)合蛋白。所述錨定試劑可以包含寡核苷酸序列，且錨定序列可以包括互補(bǔ)寡核苷酸序列。所述錨定區(qū)可以包括單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。實(shí)施方案(1)的結(jié)合步驟可進(jìn)一步包括在錨定區(qū)和錨定試劑間形成三螺旋。所述方法可進(jìn)一步包含在結(jié)合步驟之前變性錨定區(qū)以暴露單鏈序列；在結(jié)合步驟前將錨定區(qū)暴露于解旋酶活性；和/或在結(jié)合步驟之前將所述錨定區(qū)暴露于核酸酶處理。在這一實(shí)施方案中，所述錨定區(qū)可包含一個(gè)或多個(gè)半抗原修飾的堿基，且錨定試劑可包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)所述半抗原特異的抗體；和/或錨定區(qū)可以包括一個(gè)或多個(gè)配體修飾的堿基，且錨定試劑可以包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)所述配體特異的受體。所述延伸序列可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)檢序列，且測(cè)量步驟還包括將所述延伸序列與互補(bǔ)于所述一種或多種檢測(cè)序列的多種標(biāo)記的探針接觸；延伸序列可包括一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基，且測(cè)量步驟可包括將延伸序列于多個(gè)能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的檢測(cè)部分(moieties)接觸；和/或所述延伸序列可包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基，且所述測(cè)量步驟可進(jìn)一步包括檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基的存在。在該實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的結(jié)合伴侶和可檢測(cè)標(biāo)記。所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；和/或所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親和素和可檢測(cè)標(biāo)記；和/或一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含親和素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；和/或所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親和素和可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)施方案(1)的第一步可以包含使分析物以以下順序結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于所述分析物的檢測(cè)試劑；或?qū)嵤┓桨?1)的第一步可以包含使分析物以以下順序結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于所述分析物的檢測(cè)試劑；和(ii)在所述表面上的捕獲試劑；和/或第一個(gè)步驟可以包含使分析物同時(shí)或基本同時(shí)結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于所述分析物的檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(1)的延伸步驟可包含將探針結(jié)合到模板核酸序列并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸所述探針；和/或?qū)⑺鎏结樈Y(jié)合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸所述環(huán)形模板。在這一實(shí)施方案中，延伸的探針可以在探針延伸之后仍位于表面上。因此，復(fù)合物可以在延伸步驟之后仍結(jié)合到表面上，例如，延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的10-100μm以內(nèi)的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的小于100μm、小于50μm，或更特別地小于10μm的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。實(shí)施方案(1)的延伸步驟可以包含PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、SDA(鏈置換擴(kuò)增)、3SR(自動(dòng)維持合成反應(yīng))，或等溫?cái)U(kuò)增方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，延伸步驟可包括等溫?cái)U(kuò)增方法，例如解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。在實(shí)施方案(1)中所指的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑定位在表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果所述表面是板的孔，則所述孔可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上；和/或所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結(jié)合域上。在一個(gè)實(shí)施方案中，孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在表面上的10-100nm內(nèi)。所述表面可以包括電極而測(cè)量步驟可以進(jìn)一步包括向所述電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，以及任選地，所述方法包括收集電極上的顆粒并向所述電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。實(shí)施方案(1)的測(cè)量步驟可以進(jìn)一步包含使延伸的序列結(jié)合到具有可檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)探針，測(cè)量所述可檢測(cè)標(biāo)記物，并將所述測(cè)量與樣品中分析物的量關(guān)聯(lián)，其中所述檢測(cè)探針包含與延伸序列的區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量光散射，光吸收，熒光，化學(xué)發(fā)光，電化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光，磷光，放射性，磁場(chǎng)，或其組合測(cè)量所述可檢測(cè)標(biāo)記物。在實(shí)施方案(1)的具體實(shí)施例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記物是ECL標(biāo)記物而測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(2)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)錨定試劑；和(b)用于分析物的與核酸探針連接的檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(2)的錨定試劑可以包含寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且捕獲試劑可包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述捕獲試劑可包括抗體，和/或所述檢測(cè)試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體。在試劑盒的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述檢測(cè)試劑是抗體。實(shí)施方案(2)的試劑盒的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果試劑盒表面是板的孔，則表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上；和/或所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結(jié)合域上。在試劑盒的具體的實(shí)施例中，所述表面是孔，并且所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在所述表面上的10-100nm內(nèi)。此外，所述試劑盒的表面可以包含電極。實(shí)施方案(3)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)使分析物結(jié)合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，以及包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(ii)與核酸探針連接的用于分析物的檢測(cè)試劑；從而在所述表面上形成包含所述捕獲試劑、分析物和檢測(cè)試劑的復(fù)合物；(b)延伸探針以形成包含與錨定序列互補(bǔ)的錨定序列互補(bǔ)體(complement)的延伸序列；(c)將錨定序列與錨定序列互補(bǔ)體雜交；和(d)測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。在實(shí)施方案(3)中，所述捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在具體實(shí)施例中，所述捕獲試劑是抗體。同樣，所述檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在實(shí)施方案(3)的具體實(shí)施例中，所述檢測(cè)試劑是抗體。在實(shí)施方案(3)的一個(gè)實(shí)例中，所述捕獲試劑和檢測(cè)試劑是針對(duì)分析物的抗體。所述錨定寡核苷酸序列可以包含單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。所述延伸序列可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列，且所述測(cè)量步驟還包括將所述延伸序列與互補(bǔ)于所述一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列的多種經(jīng)標(biāo)記探針接觸；或者或另外，所述延伸序列還可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基，并且所述測(cè)量步驟還可以包括使延伸序列與能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的多個(gè)可檢測(cè)部分接觸。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，延伸序列還可以包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基，并且測(cè)量步驟還可以包括檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基的存在。所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包括適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的結(jié)合伴侶和可檢測(cè)標(biāo)記。所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；所述一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的堿基包含生物素，且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親和素和可檢測(cè)標(biāo)記；所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含親和素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；和/或所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含生物素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親和素和可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)施方案(3)的步驟(a)可以包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測(cè)試劑?；蛘?，步驟(a)可包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于分析物的檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，步驟(a)可以包含同時(shí)或基本上同時(shí)將分析物結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(3)的延伸步驟可以包括將探針結(jié)合到模板核酸序列并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸探針?；蛘撸由觳襟E可以包括將探針結(jié)合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸環(huán)形模板。延伸的探針可以在探針延伸之后仍定位于表面上。例如，在延伸步驟后，復(fù)合物仍結(jié)合到表面上。在一個(gè)實(shí)施例中，延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的10-100um內(nèi)的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。在這一特定實(shí)施方案中，所述延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、SDA(單鏈置換擴(kuò)增)、3SR(自動(dòng)維持合成反應(yīng))，或等溫?cái)U(kuò)增方法。例如，所述延伸步驟可包括等溫?cái)U(kuò)增方法，如解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。實(shí)施方案(3)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果所述表面是板的孔，則其可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結(jié)合域上。如果所述表面是孔，則其可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同的結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在表面上的10-100nm內(nèi)。在具體的實(shí)施例中，表面可以包括電極，并且測(cè)量步驟還可以包括向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。所述方法還可以包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。測(cè)量步驟還可包括將延伸序列結(jié)合到具有可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針，測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記，并將測(cè)量與樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)，其中檢測(cè)探針包含與延伸序列的區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列。在該實(shí)施方案中，通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記。例如，可檢測(cè)標(biāo)記是ECL標(biāo)記，且測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(4)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(b)連接到核酸探針的用于分析物的檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(4)的試劑盒包括包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體的捕獲試劑。在具體的實(shí)施例中，所述捕獲試劑可以包括抗體。同樣，檢測(cè)試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，并且具體地，所述檢測(cè)試劑可以包括抗體。實(shí)施方案(4)的試劑盒包括表面，其可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上，例如，如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。例如，所述捕獲試劑和錨定試劑可以在所述表面上的10-100nm內(nèi)。實(shí)施方案(4)的表面可以包括電極。實(shí)施方案(5)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；和(iii)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成復(fù)合物，所述表面包含結(jié)合試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)使用需要第一和第二近端探針接近的延伸過(guò)程，延伸第二探針以形成包含與錨定序列互補(bǔ)的錨定序列互補(bǔ)體的延伸序列；(c)將錨定序列與錨定序列互補(bǔ)體雜交；和(d)測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。實(shí)施方案(5)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑是抗體。第二檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個(gè)具體實(shí)施例中，第二檢測(cè)試劑是抗體。更具體地，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。在實(shí)施方案(5)中，錨定寡核苷酸序列可以包括單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。在這一實(shí)施方案中，延伸序列進(jìn)一步可以包括一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列，并且測(cè)量步驟還可以包括使延伸序列與多個(gè)與一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列互補(bǔ)的標(biāo)記探針接觸。延伸序列還可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾堿基，且所述測(cè)量步驟還包括將所述延伸序列與多個(gè)能夠與所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基結(jié)合的可檢測(cè)部分。延伸序列可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基，并且測(cè)量步驟還可以包括檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基的存在。一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包括適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位，或模擬表位，并且所述多個(gè)可檢測(cè)的部分每一個(gè)包含所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的結(jié)合伴侶以及可檢測(cè)標(biāo)記物。例如，一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含鏈霉親和素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含生物素，且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親和素和可檢測(cè)標(biāo)記；所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含親和素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；和/或所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含生物素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親和素和可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)施方案(5)的步驟(a)可以包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測(cè)試劑。或者，步驟(a)可包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于分析物的檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或步驟(a)可以包括同時(shí)或基本上同時(shí)將分析物結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(5)的延伸步驟可以包括將探針結(jié)合到模板核酸序列并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸探針。延伸步驟還可以包括將探針結(jié)合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸環(huán)形模板。所述延伸的探針可以在探針延伸之后仍定位于表面上，例如，在延伸步驟后復(fù)合物仍結(jié)合到表面上。所述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的10-100um內(nèi)的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、SDA(單鏈置換擴(kuò)增)、3SR(自動(dòng)維持合成反應(yīng))，或等溫?cái)U(kuò)增方法。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述延伸步驟可包括等溫?cái)U(kuò)增方法，例如為解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。實(shí)施方案(5)的延伸過(guò)程可包括使步驟(a)中形成的復(fù)合物與連接子(connector)序列接觸，所述連接子序列包含(i)與第二探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列和(ii)與第一探針的非重疊區(qū)互補(bǔ)的雙末端序列。所述方法還可以包括連接所述連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列?；蛘?，延伸過(guò)程可包括將實(shí)施方案(5)的步驟(a)中形成的復(fù)合物與第一連接子寡核苷酸序列和第二連接子寡核苷酸序列接觸，所述第一連接寡核苷酸序列包含互補(bǔ)于所述第一探針的第一區(qū)域和所述第二探針上的第一區(qū)域的第一連接探針序列，所述第二連接寡核苷酸包含互補(bǔ)于所述第一探針的第二非重疊性區(qū)域和所述第二探針的第二非重疊性區(qū)域的第二探針序列；并且任選地，連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列。實(shí)施方案(5)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面還可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內(nèi)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述表面可以包括電極，且所述測(cè)量步驟還可包括向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，并且任選地，實(shí)施方式(5)的方法還包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。實(shí)施方案(5)的測(cè)量步驟還可包括將延伸序列與具有可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針結(jié)合，測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記，并將測(cè)量與樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)，其中檢測(cè)探針包含與延伸序列的區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列。可通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記是ECL標(biāo)記，且測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(6)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；和(c)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(6)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在具體的實(shí)施例中，捕獲試劑可以包括抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，在具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑可以包括抗體。類(lèi)似地，第二檢測(cè)試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在具體的實(shí)施例中，第二檢測(cè)試劑可以包括抗體。實(shí)施方案(6)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果所述表面是孔，則該孔可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結(jié)合域上；和/或如果所述表面是孔，則該孔可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同的結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在表面上的10-100nm內(nèi)。在具體的實(shí)施例中，表面可以包括電極。實(shí)施方案(7)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)將在(c)中形成的檢測(cè)復(fù)合物與連接子序列接觸，所述連接子序列包含(i)與第二近端探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補(bǔ)的雙末端序列；(c)將連接子序列與第一和第二近端探針雜交；(d)連接連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過(guò)靶序列的滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)延伸第二近端探針以產(chǎn)生包含結(jié)合錨定試劑的結(jié)合域的擴(kuò)增子；(f)將擴(kuò)增子結(jié)合到錨定試劑；和(g)測(cè)量表面上的擴(kuò)增子的量。實(shí)施方案(8)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)將在(c)中形成的檢測(cè)復(fù)合物與第一連接子寡核苷酸和第二連接子寡核苷酸接觸，其中(i)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)，且(ii)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)；(c)將第一和第二連接子寡核苷酸與第一和第二近端探針雜交；(d)連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二近端探針兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過(guò)靶序列的滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)延伸第二近端探針以產(chǎn)生包含結(jié)合錨定試劑的結(jié)合域的擴(kuò)增子；(f)將擴(kuò)增子結(jié)合到錨定試劑；和(g)測(cè)量表面上的擴(kuò)增子的量。實(shí)施方案(7)和(8)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個(gè)具體實(shí)施例中，捕獲試劑是抗體。相似地，第一檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測(cè)試劑是抗體。另外，第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第二檢測(cè)試劑是抗體。在實(shí)施方案(7)和(8)的一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(7)和(8)的錨定試劑可以包括寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位。在一個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合域可以包括適體，且錨定試劑可以包括適體配體。結(jié)合域可以包括核酸序列，且錨定試劑可以包括DNA結(jié)合蛋白；和/或錨定試劑可以包括寡核苷酸序列，且擴(kuò)增子可以包括互補(bǔ)寡核苷酸序列。實(shí)施方案(7)和(8)的擴(kuò)增子可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列，且所述測(cè)量步驟可以進(jìn)一步包括將所述延伸序列與互補(bǔ)于所述一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列的多種經(jīng)標(biāo)記探針接觸。此外，擴(kuò)增子可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基，并且測(cè)量步驟還可以包括使延伸序列與能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的多個(gè)可檢測(cè)部分接觸。另外，擴(kuò)增子可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基，并且測(cè)量步驟還可以包括檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基的存在。所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的結(jié)合伴侶和可檢測(cè)的標(biāo)記。所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)的標(biāo)記；所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親和素和可檢測(cè)標(biāo)記；所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含親和素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；和/或所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親和素和可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)施方案(7)和(8)的步驟(a)可包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑?；蛘撸襟E(a)可包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。另外，步驟(a)可以包括同時(shí)或基本上同時(shí)將分析物結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(7)和(8)的擴(kuò)增子可以在探針延伸之后仍定位于表面上。復(fù)合物可以在延伸步驟后仍結(jié)合在表面上。例如，所述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的10-100um內(nèi)的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述延伸的探針在距離位于表面上復(fù)合物位置小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結(jié)合至錨定試劑。實(shí)施方案(7)和(8)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內(nèi)。另外，表面可以包括電極，并且測(cè)量步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在這些實(shí)施方案((7)和(8))中，該方法還可以包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。測(cè)量步驟可以包括將擴(kuò)增子結(jié)合到具有可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針，測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記，并將測(cè)量與樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)，其中檢測(cè)探針包含與擴(kuò)增子區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列。通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記。例如，可檢測(cè)標(biāo)記是ECL標(biāo)記，且測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(9)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)錨定試劑；(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；和(d)連接子序列，包含(i)與第二近端探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補(bǔ)的雙末端序列。實(shí)施方案(10)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)錨定試劑；和(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；和(d)(i)第一連接子寡核苷酸和(ii)第二連接子寡核苷酸，其中(x)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)，和(y)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)。實(shí)施方案(9)和(10)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑可以包括抗體。第一檢測(cè)試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑可包括抗體。第二檢測(cè)試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第二檢測(cè)試劑可包括抗體。實(shí)施方案(9)和(10)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，捕獲試劑和錨定試劑可以在所述表面上的10-100nm內(nèi)。實(shí)施方案(9)和(10)的表面可以包括電極。實(shí)施方案(11)：檢測(cè)樣品中感興趣分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)將在(c)中形成的檢測(cè)復(fù)合物與連接子序列相接觸，所述連接子序列包含(i)與第二近端探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列，(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)互補(bǔ)的雙末端序列，和(iii)與錨定序列配對(duì)的序列；(c)將連接子序列與第一和第二近端探針雜交；(d)連接所述連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過(guò)靶序列的滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)延伸第二近端探針以產(chǎn)生包含與錨定序列互補(bǔ)的多個(gè)錨定序列互補(bǔ)體的擴(kuò)增子；(f)將所述錨定序列與所述錨定序列互補(bǔ)體之一雜交；和(g)測(cè)量表面上的擴(kuò)增子的量。實(shí)施方案(12)：檢測(cè)樣品中感興趣分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)將在(a)中形成的檢測(cè)復(fù)合物與第一連接子寡核苷酸和第二連接子寡核苷酸接觸，其中(i)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)，(ii)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)，且(iii)第一和/或第二連接子還包含與錨定序列配對(duì)的序列；(c)將第一和第二連接子寡核苷酸與第一和第二近端探針雜交；(d)連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過(guò)靶序列的滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)延伸第二近端探針以產(chǎn)生包含多個(gè)與錨定序列互補(bǔ)錨定序列互補(bǔ)體的擴(kuò)增子；(f)將錨定序列與錨定序列互補(bǔ)體之一雜交；和(g)測(cè)量表面上的擴(kuò)增子的量。實(shí)施方案(11)和(12)的捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑是抗體。第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，并且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑是抗體。同樣，第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第二檢測(cè)試劑是抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(11)和(12)的擴(kuò)增子可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列，且所述測(cè)量步驟可以進(jìn)一步包括將所述延伸序列與互補(bǔ)于所述一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列的多種經(jīng)標(biāo)記探針接觸。此外，擴(kuò)增子還可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基，并且測(cè)量步驟可以包括將延伸序列與能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的多個(gè)可檢測(cè)部分接觸。擴(kuò)增子另外包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基，并且測(cè)量步驟可以包括檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的堿基的存在。所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的結(jié)合伴侶和可檢測(cè)標(biāo)記。所述一種或多種修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；所述一種或多種修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親和素和可檢測(cè)標(biāo)記；所述一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包含親和素，并且所述多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記；和/或一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基可以包括生物素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親和素和可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)施方案(11)和(12)的步驟(a)可包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑。或者，步驟(a)可包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。另外，步驟(a)可以包括同時(shí)或基本上同時(shí)將分析物結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(11)和(12)的擴(kuò)增子可以在探針延伸之后仍定位于表面上，且任選地，復(fù)合物在延伸步驟后仍結(jié)合在表面上。例如，擴(kuò)增子在所述表面上的復(fù)合物位置的10-100um內(nèi)的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。實(shí)施方案(11)和(12)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。任選地，所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內(nèi)。實(shí)施方案(11)和(12)的表面可以包括電極，并且測(cè)量步驟還可以包括向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，任選地，實(shí)施方案(11)和(12)進(jìn)一步包含收集電極上的顆粒并且向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。測(cè)量步驟還可以包括將擴(kuò)增子與具有可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針結(jié)合，測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記，并將測(cè)量與樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)，其中檢測(cè)探針包含與擴(kuò)增子的區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列?？赏ㄟ^(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記是ECL標(biāo)記，且測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(11)和(12)的樣品可以包含一種或多種分析物分子，并且表面可以包括用于一種或多種分析物分子的多種捕獲試劑，所述捕獲試劑分布在位于表面上的多個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域上，且所述方法可以包括：(x)將所述一種或多種分析物分子結(jié)合到所述表面上的一種或多種捕獲試劑；(y)確定每個(gè)結(jié)合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在；和(z)鑒定含有分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目和/或不含分析物分子的分析物結(jié)合域的數(shù)目。測(cè)量步驟可以包括對(duì)來(lái)自表面的光信號(hào)成像以生成包括多個(gè)像素的圖像，并且每個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域映射(map)到圖像中的一個(gè)或多個(gè)像素上?？煞直娴慕Y(jié)合區(qū)域可以是陣列的元件和/或可分辨的結(jié)合區(qū)域被配置為分離單個(gè)顆粒。每個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域可以是具有體積＜100nL的單個(gè)納米孔，如，其中至少99％的結(jié)合區(qū)域含有零個(gè)或一個(gè)分析物分子，其中至少約95％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子，其中至少約80％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子，和/或其中至少約50％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子。可以至少部分地使用校正曲線、泊松分布分析和/或包含至少一個(gè)或一個(gè)分析物分子的結(jié)合區(qū)域數(shù)目的高斯分布分析來(lái)確定實(shí)施方案(11)和(12)中樣品中分析物分子的濃度。在實(shí)施方案(11)和(12)中，樣品可以包含一種或多種分析物分子，表面可以包括多個(gè)顆粒，每個(gè)顆粒包括用于分析物分子的多種結(jié)合試劑，其中多個(gè)顆粒分布在多個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)中，并且所述方法可以包括：(i)將一種或多種分析物分子結(jié)合到所述表面上的一種或多種結(jié)合試劑，和(ii)將所述多種顆粒分布在可分辨結(jié)合區(qū)域陣列上；和(iii)確定每個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在，以便鑒定含有分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目和/或鑒定不含分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目。實(shí)施方案(13)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；和(d)連接子序列，包含(i)與第二近端探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補(bǔ)的雙末端序列。實(shí)施方案(14)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；和(d)(i)第一連接子寡核苷酸和(ii)第二連接寡核苷酸，其中(x)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)，且(y)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)。實(shí)施方案(13)和(14)的捕獲試劑可以包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑可以包括抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，例如，第一檢測(cè)試劑可以包括抗體。類(lèi)似地，第二檢測(cè)試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，例如，第二檢測(cè)試劑可以包括抗體。實(shí)施方案(13)和(14)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內(nèi)，且任選地，所述表面可以包括電極。實(shí)施方案(15)：檢測(cè)樣品中分析物的方法，其中所述方法可包括：(a)將分析物結(jié)合到第一和第二檢測(cè)試劑以形成檢測(cè)復(fù)合物，每個(gè)檢測(cè)復(fù)合物包含分析物、第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑，其中第一檢測(cè)試劑具有第一可檢測(cè)標(biāo)記，且第二檢測(cè)試劑具有第二可檢測(cè)標(biāo)記，(b)在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔分析物，使得大多數(shù)反應(yīng)容器包含一個(gè)或更少的分析物；和(c)通過(guò)計(jì)數(shù)含有第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的反應(yīng)容器的數(shù)量來(lái)檢測(cè)分析物分子的數(shù)量。在該實(shí)施方案(15)中，所述第一檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測(cè)試劑是抗體。同樣，第二檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或配體，例如第二檢測(cè)試劑是抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(15)的步驟(a)可以進(jìn)一步包含形成包含所述分析物和所述檢測(cè)試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于10分之1。或者，實(shí)施方案(15)的步驟(a)可以進(jìn)一步包括形成包含所述分析物和所述檢測(cè)試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于100分之1。此外，實(shí)施方案(15)的步驟(a)可以進(jìn)一步包括形成包含所述分析物和所述檢測(cè)試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于1000分之1。此外，實(shí)施方案(15)的步驟(a)可以進(jìn)一步包括形成包含所述分析物和所述檢測(cè)試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于10000之1。實(shí)施方案(16)：檢測(cè)樣品中分析物的方法，所述方法包括：(a)將分析物結(jié)合到捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑以形成檢測(cè)復(fù)合物，每個(gè)檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、分析物、第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑，其中(i)第一檢測(cè)試劑具有第一可檢測(cè)標(biāo)記，且第二檢測(cè)試劑具有第二可檢測(cè)標(biāo)記，(ii)捕獲試劑在表面上；(b)在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔分析物，使得多個(gè)反應(yīng)容器包含一個(gè)或更少的分析物；和(c)通過(guò)計(jì)數(shù)含有第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的反應(yīng)容器的數(shù)量來(lái)檢測(cè)分析物分子的數(shù)量。在該實(shí)施方案中，捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測(cè)試劑是抗體。此外，第二檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第二檢測(cè)試劑是抗體。例如，捕獲試劑、第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(16)的步驟(b)可以進(jìn)一步包括在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于10分之1。此外，實(shí)施方案(16)的步驟(b)可以進(jìn)一步包括在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于100之1。實(shí)施方案(16)的步驟(b)可以進(jìn)一步包括在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于1000之1。此外，實(shí)施方案(16)的步驟(b)可以進(jìn)一步包括在多個(gè)反應(yīng)容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性小于10000分之1。實(shí)施方案(16)的檢測(cè)復(fù)合物中的捕獲試劑可以在將捕獲試劑結(jié)合到分析物之前在表面上；或者在將捕獲試劑固定在表面上之前，將檢測(cè)復(fù)合物中的捕獲試劑結(jié)合到分析物。在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)試劑可以包括靶向部分，而且所述表面可以包括靶向部分互補(bǔ)體。靶向部分和靶向劑結(jié)合伴侶選自以下的結(jié)合對(duì)：親和素-生物素、鏈霉親和素-生物素、受體-配體、抗體-抗原、核酸-核酸互補(bǔ)體。實(shí)施方案(16)的表面是顆粒，并且任選地，捕獲試劑被固定在多個(gè)顆粒上，并且通過(guò)將分析物結(jié)合到捕獲試劑并將顆粒分配到多個(gè)反應(yīng)容器中來(lái)實(shí)現(xiàn)分析物的分配。捕獲試劑可以被固定在多個(gè)顆粒上，并且通過(guò)將顆粒分配到多個(gè)反應(yīng)容器中然后將分析物結(jié)合到捕獲試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)分析物的分配。實(shí)施方案(16)可以進(jìn)一步包括將多個(gè)顆粒分隔到多個(gè)反應(yīng)容器中，其中多個(gè)顆粒包含靶向部分，捕獲試劑包括靶向部分互補(bǔ)體，并且通過(guò)使靶向模塊互補(bǔ)體結(jié)合靶向部分實(shí)現(xiàn)分析物的分隔。實(shí)施方案(16)還可以包括在分隔步驟之前和/或分隔步驟之后洗滌顆粒。實(shí)施方案(16)的表面可以是反應(yīng)容器之一內(nèi)的位置。在該實(shí)施方案中，捕獲試劑可以被固定在多個(gè)反應(yīng)容器的表面，并且通過(guò)將分析物結(jié)合到捕獲試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)分析物的分隔。任選地，反應(yīng)容器具有其上固定有靶向部分的表面，捕獲試劑包括靶向部分互補(bǔ)體，并且通過(guò)將靶向部分互補(bǔ)體結(jié)合到靶向部分來(lái)實(shí)現(xiàn)分析物的分配。在該具體的實(shí)施例中，該方法可以進(jìn)一步包括在檢測(cè)步驟之前洗滌反應(yīng)容器。實(shí)施方案(16)的多個(gè)反應(yīng)容器可以包括納米孔陣列。多個(gè)反應(yīng)容器可以包括至少10,000個(gè)反應(yīng)容器。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)容器具有小于100nL的體積。任選地，在檢測(cè)時(shí)小于50％的反應(yīng)容器含有分析物，在檢測(cè)時(shí)小于10％的反應(yīng)容器含有分析物，在檢測(cè)時(shí)小于1％的反應(yīng)容器含有分析物，和/或在檢測(cè)時(shí)小于0.1％的反應(yīng)容器含有分析物。在實(shí)施方案(16)的一個(gè)方面，第一可檢測(cè)標(biāo)記是偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的第一酶，并且第二可檢測(cè)標(biāo)記是偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的第二酶，并且步驟(d)可以包括添加一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)的底物，產(chǎn)生酶反應(yīng)系統(tǒng)的產(chǎn)物并計(jì)數(shù)含有所述產(chǎn)物的反應(yīng)容器。在此實(shí)施方案中，可以僅在第一酶和第二酶極其接近(例如，第一和第二酶在彼此的200nM內(nèi)，或者第一和第二酶在彼此的50nM內(nèi))時(shí)產(chǎn)生產(chǎn)物。例如，第一酶是氧化酶，第二酶是過(guò)氧化酶，并且底物包含氧化酶底物和經(jīng)標(biāo)記的AmplexRed或魯米諾衍生物。在此實(shí)施方案中，氧化酶可以是葡萄糖氧化酶，并且氧化酶底物是葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，由檢測(cè)復(fù)合物中的第一和第二酶催化的反應(yīng)導(dǎo)致經(jīng)標(biāo)記的AmplexRed或魯米諾在表面上的固定化，并且任選地，該方法可以包含測(cè)量表面上的經(jīng)標(biāo)記的AmplexRed或魯米諾。經(jīng)標(biāo)記的AmplexRed或魯米諾是任選地生物素-AmplexRed或魯米諾，并且該方法可以包含添加經(jīng)標(biāo)記的鏈霉親合素并測(cè)量鏈霉親合素上的標(biāo)記。實(shí)施方案(16)的步驟(d)可以包含測(cè)量在第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物與相同分析物分子結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的接近依賴(lài)性信號(hào)(proximitydependentsignal)，并計(jì)算產(chǎn)生接近依賴(lài)性信號(hào)的反應(yīng)容器的數(shù)目，例如，通過(guò)PLA-RCA產(chǎn)生接近依賴(lài)性信號(hào)。例如，第一可檢測(cè)標(biāo)記物可以是FRET供體，并且可檢測(cè)標(biāo)記物是FRET受體，并且通過(guò)激發(fā)FRET供體和測(cè)量從FRET受體的發(fā)射測(cè)量接近依賴(lài)性信號(hào)。在一個(gè)實(shí)例中，可以獨(dú)立測(cè)量第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物。任選地，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物是就光譜特性而言彼此不同的發(fā)光標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)例中，第一可檢測(cè)標(biāo)記物是與第一底物起反應(yīng)以產(chǎn)生第一信號(hào)的第一酶，并且第二可檢測(cè)標(biāo)記物是與第二底物起反應(yīng)以產(chǎn)生第二信號(hào)的第二酶，并且實(shí)施方案(16)的步驟(d)可以包含添加第一酶底物和第二酶底物，并且計(jì)算產(chǎn)生第一和第二信號(hào)的反應(yīng)容器的數(shù)目。第一和第二信號(hào)可以是具有不同光譜特性的光學(xué)吸光度的變化。任選地，第一和第二信號(hào)是具有不同光譜特性的發(fā)光信號(hào)。第一和第二酶可以是水解酶，例如選自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、或其組合，并且第一和第二底物選自磷酸鹽、硫酸鹽、半乳糖苷和葡糖苷酸修飾的穩(wěn)定化二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)、4-甲基傘形基(4-methylumbelliferyl)、熒光素或其組合。在一個(gè)具體的例子中，第一和第二酶選自辣根過(guò)氧化酶、beta-半乳糖苷酶、和堿性磷酸酶。實(shí)施方案(16)的檢測(cè)步驟可以包括經(jīng)由光散射、光吸光度、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、發(fā)光、放射性、磁場(chǎng)或其組合的檢測(cè)。實(shí)施方案(17)：用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，所述試劑盒在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一檢測(cè)試劑；(b)包含第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二檢測(cè)試劑；(c)配置為含有一個(gè)或更少的分析物分子的多個(gè)反應(yīng)容器。實(shí)施方案(18)：用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，所述試劑盒在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一檢測(cè)試劑；(b)包含第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二檢測(cè)試劑；(c)包含捕獲試劑的表面；和(d)配置為含有一個(gè)或更少的分析物分子的多個(gè)反應(yīng)容器。實(shí)施方案(17)和(18)的第一和第二檢測(cè)試劑可以包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位、適體，或其組合。在一個(gè)實(shí)例中，第一和第二檢測(cè)試劑包括抗體。捕獲抗體可以包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位、或適體，例如，捕獲抗體可以包括抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，捕獲試劑可以包括靶向部分且表面可以包括靶向部分互補(bǔ)體，例如靶向部分和靶向劑結(jié)合伴侶選自以下結(jié)合對(duì)：親和素-生物素、鏈霉親和素-生物素、受體-配體、抗體-抗原、核酸-核酸互補(bǔ)體。實(shí)施方案(17)和(18)的表面可以是顆粒，且例如，捕獲試劑固定在多個(gè)顆粒上?；蛘?，該表面是反應(yīng)容器之一內(nèi)的位置，例如，捕獲試劑固定在多個(gè)反應(yīng)容器的表面上?；蛘撸砻媸欠磻?yīng)容器之一內(nèi)的位置，并且例如，捕獲試劑被固定在多個(gè)反應(yīng)容器的表面上。任選地，反應(yīng)容器具有其上固定有靶向部分的表面，并且捕獲試劑包含靶向部分互補(bǔ)體。多個(gè)反應(yīng)容器可以包含納米孔陣列或油包水乳劑中分散的水液滴。多個(gè)反應(yīng)容器可以包含至少10,000個(gè)反應(yīng)容器，并且任選地，所述多個(gè)中的反應(yīng)容器具有小于100nL的體積。實(shí)施方案(17)和(18)的試劑盒中，第一可檢測(cè)標(biāo)記可以是偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的第一酶，且第二可檢測(cè)標(biāo)記是偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的第二酶，并且試劑盒可以在一個(gè)或多個(gè)額外的小瓶，容器或隔室中包括，反應(yīng)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)底物。例如，第一酶是氧化酶，第二酶是過(guò)氧化物酶，底物包括氧化酶底物和標(biāo)記的AmplexRed或魯米諾衍生物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，氧化酶是葡萄糖氧化酶，且氧化酶底物是葡萄糖。第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記可以是接近-依賴(lài)性系統(tǒng)的組分，例如，第一可檢測(cè)標(biāo)記是FRET供體，且可檢測(cè)標(biāo)記是FRET受體?？梢元?dú)立測(cè)量第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記。任選地，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記是就光譜特性而言彼此不同的發(fā)光標(biāo)記。實(shí)施方案(17)和(18)的試劑盒中，第一可檢測(cè)標(biāo)記是與第一底物反應(yīng)產(chǎn)生第一信號(hào)的第一酶，且第二可檢測(cè)標(biāo)記是與第二底物反應(yīng)產(chǎn)生不同的第二信號(hào)的第二酶，并且試劑盒可以在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包括，第一酶底物和第二酶底物。任選地，第一和第二信號(hào)是具有不同光譜特性的光吸收的變化。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二信號(hào)是具有不同光譜特性的發(fā)光信號(hào)。第一和第二酶可以是水解酶。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二酶選自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，或其組合。第一和第二底物可以選自磷酸鹽、硫酸鹽、半乳糖苷和葡糖苷酸修飾的穩(wěn)定的二氧雜環(huán)丁烷、4-甲基傘形酮、熒光素，或其組合。任選地，第一和第二酶選自辣根過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。實(shí)施方案(19)：檢測(cè)樣品中目的分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合至捕獲試劑、具有第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一檢測(cè)試劑和具有第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二檢測(cè)試劑并形成復(fù)合物，其中所述復(fù)合物中的捕獲試劑在表面上固定化；(b)交聯(lián)第一和第二檢測(cè)試劑以形成交聯(lián)產(chǎn)物；(c)將所述交聯(lián)產(chǎn)物從所述表面釋放到洗脫液中；(d)計(jì)算包含第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物兩者的洗脫液中的個(gè)別交聯(lián)產(chǎn)物。在該實(shí)施例(19)中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑是抗體。此外，第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適配體，且具體地，第二檢測(cè)試劑可以是抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑和第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(19)可進(jìn)一步包括加入交聯(lián)劑以交聯(lián)第一和第二檢測(cè)試劑，例如，第一和第二檢測(cè)試劑包含反應(yīng)性部分，且交聯(lián)劑是連接到反應(yīng)性部分的多官能交聯(lián)劑。例如，反應(yīng)性部分包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來(lái)酰亞胺、點(diǎn)擊化學(xué)試劑(clickchemistryreagent)，及其組合。交聯(lián)劑可以包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來(lái)酰亞胺，點(diǎn)擊化學(xué)試劑，及其組合。第一和第二檢測(cè)試劑可以包括結(jié)合部分，并且交聯(lián)劑是結(jié)合部分的多價(jià)結(jié)合伴侶。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二檢測(cè)試劑是動(dòng)物物種的抗體，并且交聯(lián)劑是靶向動(dòng)物物種的抗體的多價(jià)抗物種抗體。第一和第二檢測(cè)試劑可以包括生物素，并且交聯(lián)劑是鏈霉親和素；第一和第二檢測(cè)試劑包括鏈霉親和素，并且交聯(lián)劑是生物素；第一和第二檢測(cè)試劑與鏈霉親和素連接，并且交聯(lián)劑是包含多個(gè)生物素分子的聚合物；和/或第一和第二檢測(cè)試劑分別包含第一和第二核酸探針，并且交聯(lián)劑是寡核苷酸，其可以包含與第一核酸探針互補(bǔ)的序列和與第二核酸探針互補(bǔ)的不同序列。實(shí)施方案(19)的表面可以包括顆粒、反應(yīng)容器，例如管或安瓿瓶，和/或表面可以包括多孔板的孔。實(shí)施方案(19)的方法可以進(jìn)一步包括收集顆粒和洗滌顆粒以除去雜質(zhì)，且任選地，通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記包括ECL標(biāo)記，并且計(jì)數(shù)步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(20)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含固定的捕獲試劑的表面；(b)具有第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一檢測(cè)試劑；(c)具有第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二檢測(cè)試劑；和(d)與第一和第二檢測(cè)試劑反應(yīng)的交聯(lián)劑。實(shí)施方案(20)的第一和第二檢測(cè)試劑可以包含反應(yīng)性部分，并且交聯(lián)劑是連接到反應(yīng)性部分的多官能交聯(lián)劑。反應(yīng)性部分可包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來(lái)酰亞胺、點(diǎn)擊化學(xué)試劑，及其組合；并且交聯(lián)劑可以包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來(lái)酰亞胺、點(diǎn)擊化學(xué)試劑及其組合。實(shí)施方案(20)的第一和第二檢測(cè)試劑可以包含結(jié)合部分，并且交聯(lián)劑是結(jié)合部分的多價(jià)結(jié)合伴侶，例如，第一和第二檢測(cè)試劑是動(dòng)物物種的抗體，并且交聯(lián)試劑是靶向動(dòng)物物種的抗體的多價(jià)抗物種抗體；所述第一和第二檢測(cè)試劑包括生物素，并且交聯(lián)劑是鏈霉親和素；第一和第二檢測(cè)試劑包括鏈霉親和素，并且交聯(lián)劑是生物素；第一和第二檢測(cè)試劑與鏈霉親和素連接，并且交聯(lián)劑是包含多個(gè)生物素分子的聚合物；和/或第一和第二檢測(cè)試劑分別包含第一和第二核酸探針，并且交聯(lián)劑是可以包括與第一核酸探針互補(bǔ)的序列以及與第二核酸探針互補(bǔ)的不同的序列的寡核苷酸。實(shí)施方案(20)的表面可以包括顆粒、多孔板的孔，或反應(yīng)容器，例如管或安瓿瓶。另外，所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于表面上不同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于孔內(nèi)的不同結(jié)合域上。所述表面還可以包括電極。實(shí)施方案(21)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到捕獲試劑、第一和第二檢測(cè)試劑以形成檢測(cè)復(fù)合物，其中第一檢測(cè)試劑可以包括第一可檢測(cè)標(biāo)記和第一核酸探針，第二檢測(cè)試劑可以包括第二可檢測(cè)標(biāo)記和第二核酸探針，并且復(fù)合物中的捕獲試劑被固定在表面上；(b)如下交聯(lián)第一和第二檢測(cè)試劑：(i)將第一探針與第二探針雜交，(ii)將第一和第二探針與具有與第一和第二探針互補(bǔ)的區(qū)域的第三核酸雜交，或(iii)連接所述第一和第二探針；(c)將所述交聯(lián)產(chǎn)物從所述表面釋放到洗脫液中；(d)計(jì)數(shù)包含第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的洗脫液中的個(gè)別交聯(lián)產(chǎn)物。實(shí)施方案(21)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測(cè)試劑是抗體；第二檢測(cè)試劑可以是抗體，抗原，配體，受體，寡核苷酸，半抗原，表位，模板或適體，例如第二檢測(cè)試劑是抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(21)的表面可以包括顆粒、反應(yīng)容器，例如管或安瓿瓶，或多孔板的孔。實(shí)施方式(21)的方法可進(jìn)一步包括收集顆粒并洗滌顆粒以除去雜質(zhì)。可以通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記包括ECL標(biāo)記，并且計(jì)數(shù)步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)實(shí)施方案(22)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含固定化捕獲試劑的表面；(b)具有第一可檢測(cè)標(biāo)記和第一核酸探針的第一檢測(cè)試劑；(c)具有第二可檢測(cè)標(biāo)記和第二核酸探針的第二檢測(cè)試劑；和(d)具有與所述第一和第二核酸探針互補(bǔ)的區(qū)域的第三核酸。實(shí)施方案(22)的表面可以包括顆粒、多孔板的孔或反應(yīng)容器，例如管或安瓿瓶。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于表面上不同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于孔內(nèi)的不同結(jié)合域上。表面任選地可以包括電極。實(shí)施方案(23)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，其包括：(a)將分析物結(jié)合至捕獲試劑、第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑以形成復(fù)合物，其中第一檢測(cè)試劑可包括第一核酸探針，第二檢測(cè)試劑可以包括第二核酸探針，并且復(fù)合物中的捕獲試劑固定在表面上；(b)延伸所述第二核酸探針以形成包含可檢測(cè)標(biāo)記的延伸序列，該延伸依賴(lài)于所述復(fù)合物中第一和第二核酸探針的共定位；(c)將所述延伸序列從所述表面釋放到洗脫液中；和(d)計(jì)數(shù)洗脫液中的個(gè)別延伸序列。在該實(shí)施方案中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個(gè)具體實(shí)例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑是抗體。第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且具體地，第二檢測(cè)試劑是抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(23)的表面可以包括顆粒、反應(yīng)容器，例如管或安瓿瓶；或多孔板的孔。實(shí)施方案(23)的方法可進(jìn)一步包含收集并洗滌顆粒以除去雜質(zhì)。實(shí)施方案(23)的標(biāo)記可以通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述標(biāo)記可以包括ECL標(biāo)記，并且計(jì)數(shù)步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(23)的延伸步驟可以包括將探針與模板核酸序列結(jié)合，并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸探針。延伸步驟還可以包括將第一探針結(jié)合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸環(huán)形模板。延伸步驟可以包括將第一探針結(jié)合到模板核酸序列，將第二探針結(jié)合到模板序列，以及連接第一和第二探針。任選地，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記，并且個(gè)別延伸序列的計(jì)數(shù)可以包括單分子熒光檢測(cè)，例如可以包括熒光關(guān)聯(lián)光譜和/或熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜。單分子熒光檢測(cè)可包括使洗脫液流過(guò)毛細(xì)管，將光源聚焦在毛細(xì)管內(nèi)的體積上以產(chǎn)生探詢區(qū)，并用光檢測(cè)器觀察探詢區(qū)以檢測(cè)經(jīng)過(guò)探詢區(qū)的熒光分子的通過(guò)。單分子熒光檢測(cè)還可包括使洗脫液流過(guò)毛細(xì)管，將光源聚焦在毛細(xì)管內(nèi)的體積上以產(chǎn)生探詢區(qū)，并用光檢測(cè)器觀察探詢區(qū)以檢測(cè)經(jīng)過(guò)探詢區(qū)的熒光分子的通過(guò)。實(shí)施方案(24)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到捕獲試劑、具有第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一檢測(cè)試劑和具有第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二檢測(cè)試劑，并形成復(fù)合物，其中所述復(fù)合物中的捕獲試劑被固定在表面上；(b)通過(guò)將固定化的捕獲試劑從表面解離進(jìn)入洗脫液，從表面釋放形成的復(fù)合物；和(c)計(jì)數(shù)洗脫液中包含第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記兩者的個(gè)別產(chǎn)物。在該實(shí)施方案中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測(cè)試劑是抗體；第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測(cè)試劑是抗體；并且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(24)的表面可以包括顆粒、反應(yīng)容器，例如管或安瓿瓶，和/或多孔板的孔。實(shí)施方式(24)的方法可以包括收集顆粒并洗滌顆粒以除去雜質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記，且在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記包括ECL標(biāo)記，并且計(jì)數(shù)步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)實(shí)施方案(25)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結(jié)合到：(i)包含針對(duì)分析物的捕獲試劑的表面上的捕獲試劑；(ii)與第一核酸探針連接的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；和(iii)與第二核酸探針連接的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成復(fù)合物，所述復(fù)合物包含結(jié)合試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)使用要求第一和第二探針接近的延伸過(guò)程，延伸第二探針以形成延伸序列；和(c)測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。在該實(shí)施方案中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測(cè)試劑是抗體；第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測(cè)試劑是抗體；并且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(25)的延伸序列可以包含一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列，并且測(cè)量步驟可以包含使延伸序列與與一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列互補(bǔ)的多個(gè)標(biāo)記的探針接觸；延伸序列可以包含一種或多種經(jīng)修飾的堿基，并且測(cè)量步驟可以包含使延伸序列與能夠結(jié)合一種或多種經(jīng)修飾的堿基的多個(gè)可檢測(cè)部分接觸；和/或延伸序列可以包含一種或多種標(biāo)記的堿基，并且測(cè)量步驟可以包含檢測(cè)一種或多種標(biāo)記的堿基的存在。一種或多種修飾的堿基包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位、或模擬位，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含一種或多種修飾的堿基的結(jié)合伴侶和可檢測(cè)標(biāo)記物。一種或多種修飾的堿基可以包含鏈霉親合素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記物；一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親合素和可檢測(cè)標(biāo)記物；一種或多種修飾的堿基包含親合素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記物；和/或一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親合素和可檢測(cè)標(biāo)記物。實(shí)施方案(25)的步驟(a)可包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測(cè)試劑；以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于分析物的檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或?qū)⒎治鑫锿瑫r(shí)或基本上同時(shí)結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測(cè)試劑。延伸步驟可以包括將探針結(jié)合到模板核酸序列，并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸探針；或?qū)⑻结樈Y(jié)合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸環(huán)形模板。在該實(shí)施方案中，所述延伸的探針在探針延伸后可仍位于表面上，例如，所述復(fù)合物在延伸步驟后仍結(jié)合到表面。延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、SDA(單鏈置換擴(kuò)增)、3SR(自動(dòng)維持合成反應(yīng))，或等溫?cái)U(kuò)增方法。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述延伸步驟可包括等溫?cái)U(kuò)增方法，如解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。實(shí)施方案(25)的延伸過(guò)程可包括將步驟(a)中形成的復(fù)合物與連接子序列接觸，所述連接子序列包含(i)與第二探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列和(ii)與第一探針的非重疊區(qū)互補(bǔ)的雙末端序列。該過(guò)程可以進(jìn)一步包括連接連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二探針雜交的環(huán)形靶序列。實(shí)施方案(25)的延伸過(guò)程還可以包括將在步驟(a)中形成的復(fù)合物與第一連接子寡核苷酸序列和第二連接子寡核苷酸序列接觸，所述第一連接子寡核苷酸序列包含互補(bǔ)于所述第一探針的第一區(qū)域和所述第二探針的第一區(qū)域的第一連接子探針序列，所述第二連接子寡核苷酸包含互補(bǔ)于所述第一探針的第二非重疊性區(qū)域和所述第二探針的第二非重疊性區(qū)域的第二連接子探針序列。該過(guò)程還可以包括連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列。實(shí)施方案(25)的表面可以包括顆?；蚨嗫装宓目?。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于表面上相同的結(jié)合域上，并且如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。所述表面可以包括電極，并且測(cè)量步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。該方法任選地包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。測(cè)量步驟可進(jìn)一步包括將延伸序列結(jié)合到具有可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針，測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記，并將測(cè)量與樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)，其中檢測(cè)探針包含與延伸序列的區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列。可通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記是ECL標(biāo)記，并且測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(26)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包括：(a)包含用于分析物的捕獲試劑的表面；(b)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；和(c)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(26)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如捕獲試劑可以包括抗體；第一檢測(cè)試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測(cè)試劑可包括抗體；第二檢測(cè)試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測(cè)試劑可包括抗體；并且表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上；并且如果表面是孔，則孔可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。任選地，表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于表面上的相同結(jié)合域上，并且如果表面是孔，則孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。所述表面可以包括電極。實(shí)施方案1-26的表面可以包括測(cè)定容器(例如試管、比色皿、流動(dòng)池、FACS細(xì)胞分選儀、筒(cartridge)或多孔板的孔)的內(nèi)表面。所述表面還可以包括載玻片、測(cè)定芯片，或測(cè)定陣列；針、探針、珠，或過(guò)濾介質(zhì)；側(cè)向流介質(zhì)，例如過(guò)濾膜。實(shí)施方案(27)：檢測(cè)包含一種或多種分析物分子的樣品中的感興趣的分析物的方法，所述方法包括：(a)將樣品與包含位于表面上的多個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)域的表面接觸，每個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)域包含用于樣品中一種或多種分析物分子的多種捕獲試劑；(b)將一種或多種分析物分子結(jié)合到(i)表面上的一種或多種捕獲試劑；(ii)包含第一可檢測(cè)標(biāo)記的用于分析物的第一檢測(cè)試劑，和(iii)包含第二可檢測(cè)標(biāo)記的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上的可分辨的結(jié)合域上形成檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包括捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑，其中所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記是不同的標(biāo)記化合物；(c)確定每個(gè)結(jié)合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在；和(d)鑒定含有分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目和/或鑒定不含分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目。鑒定步驟可以包括對(duì)來(lái)自表面的光學(xué)信號(hào)進(jìn)行成像以生成包括多個(gè)像素的圖像，并且每個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域映射到圖像中的一個(gè)或多個(gè)像素?？煞直娴慕Y(jié)合區(qū)域可以是陣列的元件和/或被配置為分離個(gè)別顆粒。每個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域可以是具有體積＜100nL的單個(gè)納米孔和/或至少99％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子；至少約95％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子；其中至少約80％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子；或至少約50％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子?？梢灾辽俨糠值厥褂冒辽僖粋€(gè)或一個(gè)分析物分子的結(jié)合區(qū)域數(shù)目的校正曲線、泊松分布分析和/或高斯分布分析來(lái)確定樣品中分析物分子的濃度。實(shí)施方案(27)的表面可以包括多個(gè)顆粒，每個(gè)顆粒包括用于分析物分子的多種捕獲試劑，其中多個(gè)顆粒分布在多個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)中，并且所述方法可以包括：(i)將一種或多種分析物分子結(jié)合到所述表面上的一種或多種結(jié)合試劑，和用于所述一種或多種分析物分子中的每一種的第一和第二檢測(cè)試劑，其中所述第一和第二檢測(cè)試劑分別包括第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記；(ii)在可糞便結(jié)合區(qū)的陣列間分布多個(gè)顆粒；和(iii)確定每個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在，以便鑒定含有分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目和/或鑒定不含分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目，其中任選地，每個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域可以是具有體積＜100nL的單個(gè)納米孔，和/或至少99％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子；至少約95％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子；其中至少約80％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子；或至少約50％的結(jié)合區(qū)域包含零個(gè)或一個(gè)分析物分子。實(shí)施方案(27)中的捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測(cè)試劑是抗體；第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，例如第二檢測(cè)試劑是抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(27)的步驟(a)可以包括以下列順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑；按以下順序?qū)⒎治鑫锝Y(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或?qū)⒎治鑫锿瑫r(shí)或基本上同時(shí)結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(27)的表面可以包括顆粒或多孔板的孔。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述表面可以包括電極，且所述鑒定步驟可以包括向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。實(shí)施方案(27)的方法可以進(jìn)一步包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量第一可檢測(cè)標(biāo)記；和/或第二可檢測(cè)標(biāo)記通過(guò)光散射、光學(xué)吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量。所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記可以獨(dú)立地測(cè)量，并且在一個(gè)實(shí)例中，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記是相對(duì)于光譜特性彼此不同的發(fā)光標(biāo)記。實(shí)施方案(27)的表面可以包括測(cè)定容器(例如試管、比色皿、流動(dòng)池、FACS細(xì)胞分選儀、筒，或多孔板的孔)的內(nèi)表面。所述表面還可以包括載玻片、測(cè)定芯片，或測(cè)定陣列；針、探針、珠，或過(guò)濾介質(zhì)；側(cè)向流介質(zhì)，例如過(guò)濾膜。實(shí)施方案(28)：用于檢測(cè)包含一種或多種分析物分子的樣品中的感興趣的分析物的試劑盒，所述試劑盒包括：(a)包含位于表面上的多個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)域的表面，每個(gè)可分辨結(jié)合區(qū)域包含用于樣品中一種或多種分析物分子的多種捕獲試劑；(b)包含第一可檢測(cè)標(biāo)記的用于所述分析物的第一檢測(cè)試劑，和(c)包含第二可檢測(cè)標(biāo)記的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；其中所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記是不同的標(biāo)記化合物。實(shí)施方案(28)的可分辨結(jié)合區(qū)域可以是陣列的元件和/或被配置為分離的個(gè)別的顆粒。任選地，每個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域任選地是體積＜100nL的個(gè)別納米孔。所述表面可以包括多個(gè)顆粒，每個(gè)顆粒包括用于分析物分子的多種捕獲試劑，其中所述多個(gè)顆粒分布在多個(gè)可分辨的結(jié)合區(qū)域上，并且所述試劑盒可以包括：用于所述一種或多種分析物分子中的每一種的第一和第二檢測(cè)試劑，其中所述第一和第二檢測(cè)試劑分別包括第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)施方案(28)中的捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測(cè)試劑是抗體；第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測(cè)試劑是抗體。在一個(gè)具體實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)分析物的抗體。實(shí)施方案(28)的表面可以包括顆?；蚨嗫装宓目?。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，表面可以包括電極，并且鑒定步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量第一可檢測(cè)標(biāo)記；和/或通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量第二可檢測(cè)標(biāo)記。第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記可以獨(dú)立地測(cè)量，并且在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記是相對(duì)于光譜特性彼此不同的發(fā)光標(biāo)記。實(shí)施方案(28)的表面可以包括測(cè)定容器(例如試管、比色皿、流動(dòng)池、FACS細(xì)胞分選儀、筒，或多孔板的孔)的內(nèi)表面。所述表面還可以包括載玻片、測(cè)定芯片，或測(cè)定陣列；針、探針、珠，或過(guò)濾介質(zhì)；側(cè)向流介質(zhì)，例如過(guò)濾膜。實(shí)施方案(29)：檢測(cè)樣品中的HIVp24的方法，包括：(a)將HIVp24結(jié)合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于HIVp24的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸的錨定試劑；(ii)連接到第一核酸探針的用于HIVp24的第一檢測(cè)試劑；和(iii)連接到第二核酸探針的用于HIVp24的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成復(fù)合物，所述復(fù)合物包含結(jié)合試劑、HIVp24以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)使用需要第一和第二探針接近的延伸過(guò)程，延伸第二探針以形成包含與錨定序列互補(bǔ)的錨定序列互補(bǔ)體的延伸序列；(c)將錨定序列與錨定序列互補(bǔ)體雜交；和(d)測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。實(shí)施方案(29)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑是抗體。第二檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)例中，第二檢測(cè)試劑是抗體。更具體地，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是HIVp24的抗體。在實(shí)施方案(29)中，錨定寡核苷酸序列可以包括單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。在該實(shí)施方案中，延伸序列可以包括一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列，且測(cè)量步驟可以包括將延伸序列與多個(gè)與一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列互補(bǔ)的標(biāo)記探針接觸。延伸序列還可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基，并且測(cè)量步驟可以包括將延伸序列與能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的多個(gè)可檢測(cè)部分接觸。延伸序列可以進(jìn)一步包含一種或多種經(jīng)標(biāo)記的堿基，并且測(cè)量步驟可以包括檢測(cè)一種或多種標(biāo)記的堿基的存在。一種或多種修飾的堿基可以包括適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位，或模擬表位，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含一種或多種修飾的堿基的結(jié)合伴侶和可檢測(cè)標(biāo)記。例如，一種或多種修飾的堿基包含鏈霉親合素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記物；一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親合素和可檢測(cè)標(biāo)記物；或者一種或多種修飾的堿基包含親合素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記物；和/或一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親合素和可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)施方案(29)的步驟(a)可以包括按以下順序?qū)IVp24結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的檢測(cè)試劑?；蛘?，步驟(a)可包括以下列順序?qū)IVp24結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于HIVp24的檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或步驟(a)可以包括同時(shí)或基本上同時(shí)將HIVp24結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(29)的延伸步驟可以包括將探針結(jié)合到模板核酸序列，并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸探針。延伸步驟可以進(jìn)一步包括將探針結(jié)合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸環(huán)形模板。在探針延伸之后延伸的探針可以仍位于表面上，例如在延伸步驟后復(fù)合物仍結(jié)合到表面上。所述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的10-100um內(nèi)的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、SDA(單鏈置換擴(kuò)增)、3SR(自動(dòng)維持合成反應(yīng))，或等溫?cái)U(kuò)增方法。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述延伸步驟可包括等溫?cái)U(kuò)增方法，例如為解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。實(shí)施方案(29)的延伸過(guò)程可包括將步驟(a)中形成的復(fù)合物與連接序列子接觸，所述連接子序列包含(i)與第二探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列和(ii)與第一探針的非重疊區(qū)互補(bǔ)的雙末端序列。該方法可以進(jìn)一步包括連接寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列?；蛘撸由爝^(guò)程可包括將實(shí)施方案(29)的步驟(a)中形成的復(fù)合物與第一連接子寡核苷酸序列和第二連接子寡核苷酸序列接觸，所述第一連接子寡核苷酸序列包括與第一探針上的第一區(qū)域和第二探針上的第一區(qū)域互補(bǔ)的第一連接子探針序列，所述第二連接子寡核苷酸序列包含與第一探針的第二非重疊區(qū)和第二探針的第二非重疊區(qū)互補(bǔ)的第二探針序列；并且任選地，連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列。實(shí)施方案(29)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面還可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內(nèi)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述表面可以包括電極，且所述測(cè)量步驟還可包括向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，并且任選地，實(shí)施方式(29)的方法進(jìn)一步包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。實(shí)施方案(29)的測(cè)量步驟可以包括將延伸序列與具有可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針結(jié)合，測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記，并將該測(cè)量與樣品中p24的量相關(guān)聯(lián)，其中檢測(cè)探針包含與延伸序列的區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列?？赏ㄟ^(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記是ECL標(biāo)記，且測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(30)：用于檢測(cè)樣品中的HIVp24的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于HIVp24的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)與第一核酸探針連接的用于HIVp24的第一檢測(cè)試劑；和(c)與第二核酸探針連接的用于HIVp24的第二檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(30)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑可以包括抗體。同樣，第一檢測(cè)試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一檢測(cè)試劑可以包括抗體。類(lèi)似地，第二檢測(cè)試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位，模擬表位，或適體，且在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第二檢測(cè)試劑可以包括抗體。實(shí)施方案(30)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面還可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上；和/或如果表面是孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內(nèi)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述表面可以包括電極。實(shí)施方案(31)：檢測(cè)樣品中的HIVp24的方法，包括：(a)將HIVp24結(jié)合到：(i)在表面上的用于HIVp24的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于HIVp24的第一檢測(cè)試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于HIVp24的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、HIVp24以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)將在(c)中形成的檢測(cè)復(fù)合物與連接子序列相接觸，所述連接子序列包含(i)與第二近端探針互補(bǔ)的內(nèi)部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補(bǔ)的雙末端序列；(c)將連接子序列與第一和第二近端探針雜交；(d)連接連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過(guò)靶序列的滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)延伸第二近端探針以產(chǎn)生包含結(jié)合錨定試劑的結(jié)合域的擴(kuò)增子；(f)將擴(kuò)增子結(jié)合到錨定試劑；和(g)測(cè)量表面上的擴(kuò)增子的量。實(shí)施方案(32)：檢測(cè)樣品中的HIVp24的方法，包括：(a)將HIVp24結(jié)合到：(i)在表面上的用于HIVp24的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于HIVp24的第一檢測(cè)試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于HIVp24的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、HIVp24以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)將在(c)中形成的檢測(cè)復(fù)合物與第一連接子寡核苷酸和第二連接子寡核苷酸相接觸，其中(i)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)，且(ii)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個(gè)非重疊區(qū)域互補(bǔ)；(c)將第一和第二連接子寡核苷酸與第一和第二近端探針雜交；(d)連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過(guò)靶序列的滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)延伸第二近端探針以產(chǎn)生包含結(jié)合錨定試劑的結(jié)合域的擴(kuò)增子；(f)將擴(kuò)增子結(jié)合到錨定試劑；和(g)測(cè)量表面上的擴(kuò)增子的量。實(shí)施方案(31)和(32)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個(gè)具體實(shí)施例中，捕獲試劑是抗體。類(lèi)似地，第一檢測(cè)試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測(cè)試劑是抗體。另外，第二檢測(cè)試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測(cè)試劑是抗體。在實(shí)施方案(31)和(32)的一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測(cè)試劑是對(duì)HIVp24的抗體。實(shí)施方案(31)和(32)的錨定試劑可以包括寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位。在一個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合表位可以包括適體，且錨定試劑可以包括適體配體。結(jié)合域可以包括核酸序列，且錨定試劑可以包括DNA結(jié)合蛋白；和/或錨定試劑可以包括寡核苷酸序列，且擴(kuò)增子可以包括互補(bǔ)寡核苷酸序列。實(shí)施方案(31)和(32)的擴(kuò)增子可以包含一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列，并且測(cè)量步驟可以包含使延伸序列接觸與一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列互補(bǔ)的多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的探針。此外，擴(kuò)增子可以進(jìn)一步包含一種或多種經(jīng)修飾的堿基，并且測(cè)量步驟可以包含使延伸序列接觸能夠結(jié)合一種或多種經(jīng)修飾的堿基的多個(gè)可檢測(cè)部分。此外，擴(kuò)增子可以進(jìn)一步包含一種或多種經(jīng)標(biāo)記的堿基，并且測(cè)量步驟可以包含檢測(cè)一種或多種經(jīng)標(biāo)記的堿基的存在。一種或多種經(jīng)修飾的堿基可以包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位、或模擬位，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含一種或多種經(jīng)修飾的堿基的結(jié)合伴侶和可檢測(cè)標(biāo)記物。一種或多種經(jīng)修飾的堿基可以包含鏈霉親合素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記物；一種或多種經(jīng)修飾的堿基可以包含生物素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含鏈霉親合素和可檢測(cè)標(biāo)記物；一種或多種經(jīng)修飾的堿基可以包含親合素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含生物素和可檢測(cè)標(biāo)記物；和/或一種或多種經(jīng)修飾的堿基可以包含生物素，并且多個(gè)可檢測(cè)部分各自包含親合素和可檢測(cè)標(biāo)記物。實(shí)施方案(31)和(32)的步驟(a)可包括以下列順序?qū)IVp24結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的第一和第二檢測(cè)試劑。或者，步驟(a)可包括以下列順序?qū)IVp24結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)用于HIVp24的第一和第二檢測(cè)試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。另外，步驟(a)可以包括同時(shí)或基本上同時(shí)將HIVp24結(jié)合到以下種類(lèi)：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的第一和第二檢測(cè)試劑。實(shí)施方案(31)和(32)的擴(kuò)增子可以在探針延伸之后仍位于表面上。復(fù)合物可以在延伸步驟后仍結(jié)合在表面上。例如，擴(kuò)增子在表面上的復(fù)合物的位置的10-100um內(nèi)的位置處與錨定試劑結(jié)合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復(fù)合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結(jié)合到所述錨定試劑。實(shí)施方案(31)和(32)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的兩個(gè)不同的結(jié)合域上。所述表面可以包含多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結(jié)合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個(gè)不同的結(jié)合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內(nèi)的相同結(jié)合域上。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內(nèi)。另外，表面可以包括電極，并且測(cè)量步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在這些實(shí)施方案((31)和(32))中，該方法還可以包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。測(cè)量步驟可以包括將擴(kuò)增子結(jié)合到具有可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針，測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記，并將測(cè)量與樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)，其中檢測(cè)探針包含與擴(kuò)增子區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列?？蓹z測(cè)標(biāo)記通過(guò)光散射、光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場(chǎng)，或其組合的測(cè)量來(lái)測(cè)量。例如，可檢測(cè)標(biāo)記是ECL標(biāo)記，且測(cè)量步驟可以包括測(cè)量ECL信號(hào)。實(shí)施方案(33)：檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)在足以形成包含結(jié)合至第一檢測(cè)試劑的分析物的分析物復(fù)合物的條件下濃縮樣品，其中所述第一檢測(cè)試劑連接至第一核酸探針；(b)將步驟(a)中形成的分析物復(fù)合物結(jié)合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(ii)與第二核酸探針連接的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑的復(fù)合物；(c)使用需要第一和第二探針接近的延伸過(guò)程，延伸第二探針以形成包含錨定序列互補(bǔ)體的延伸序列，所述互補(bǔ)體與錨定序列互補(bǔ)；(d)將錨定序列與錨定序列互補(bǔ)體雜交；和(e)測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。濃縮步驟(a)可進(jìn)一步包括(i)將包含分析物的樣品與固相接觸，所述固相連接至與第一核酸探針的至少一部分互補(bǔ)的靶向劑，從而形成包含通過(guò)所述第一核酸探針和靶向劑之間的結(jié)合反應(yīng)結(jié)合到固相的分析物的濃縮復(fù)合物；(ii)收集所述濃縮復(fù)合物；(iii)從所述濃縮復(fù)合物中分離樣品的未結(jié)合的組分；和(iv)釋放所述濃縮復(fù)合物以將固相從所述分析物分離，以形成分析物復(fù)合物。實(shí)施方案(34)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測(cè)試劑；(c)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；和(d)固相，其包含與第一核酸探針的至少一部分互補(bǔ)的靶向劑。實(shí)施方案(35)：檢測(cè)樣品中的外來(lái)體(exosome)的方法，包括：(a)將外來(lái)體結(jié)合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于外來(lái)體的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)連接到第一核酸探針的用于外來(lái)體的第一檢測(cè)試劑；和(iii)連接到第二核酸探針的用于外來(lái)體的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成復(fù)合體，所述復(fù)合體包含結(jié)合試劑、外來(lái)體以及第一和第二檢測(cè)試劑；(b)使用需要第一和第二探針接近的延伸過(guò)程，延伸第二探針以形成包含錨定序列互補(bǔ)體的延伸序列，所述互補(bǔ)體與錨定序列互補(bǔ)；(c)將錨定序列與錨定序列互補(bǔ)體雜交；和(d)測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。實(shí)施方案(36)：用于檢測(cè)樣品中感興趣的外來(lái)體的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于外來(lái)體的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)連接到第一核酸探針的用于外來(lái)體的第一檢測(cè)試劑；和(c)連接到第二核酸探針的用于外來(lái)體的第二檢測(cè)試劑。附圖簡(jiǎn)述圖1(a)-(c)例示了免疫測(cè)定中錨定試劑的使用。圖1(a)顯示了使用錨定試劑結(jié)合和穩(wěn)定化檢測(cè)復(fù)合物，所述檢測(cè)復(fù)合物包含捕獲試劑、感興趣的分析物和包含核酸探針的檢測(cè)試劑。延伸核酸探針以結(jié)合錨定試劑。在圖1(b)中，錨定試劑包含以下寡核苷酸序列，其包含與檢測(cè)試劑上形成的延伸序列的一部分互補(bǔ)的區(qū)域。圖1(c)顯示了在具體的實(shí)施方案中，使用兩種檢測(cè)試劑以結(jié)合分析物，每種檢測(cè)試劑包括核酸探針。對(duì)檢測(cè)試劑上的探針進(jìn)行擴(kuò)增過(guò)程，所述過(guò)程使得一種延伸的探針與錨定寡核苷酸序列雜交。圖2(a)顯示一個(gè)具體的實(shí)施方案，其中對(duì)帶有錨定試劑的表面上形成的免疫復(fù)合物進(jìn)行PLA-RCA過(guò)程以在附接于免疫復(fù)合物的延伸序列中摻入多種可檢測(cè)的種類(lèi)。圖2(b)和2(c)是連接寡核苷酸的兩種備選的配置，其可以在本發(fā)明的方法中采用。圖3顯示將寡核苷酸附接于蛋白質(zhì)的方法。圖4(a)例示了本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中在捕獲試劑、分析物和兩種檢測(cè)試劑之間形成表面結(jié)合復(fù)合物，其中所述兩種檢測(cè)試劑各自分別附接第一和第二近端探針，其(ligated)到連接子探針以形成環(huán)形DNA模板，其通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增。圖4(a)還包括擴(kuò)增試劑，其包括與隨著測(cè)定方法進(jìn)展形成的擴(kuò)增子的序列互補(bǔ)的錨定寡核苷酸序列。圖4(b)顯示了第一環(huán)形DNA模板Circ-1、檢測(cè)寡核苷酸序列，擴(kuò)增子的無(wú)活性區(qū)(inertregion)和被設(shè)計(jì)為與第二近端探針雜交的部分PP2的示例性序列。在圖4(c)中描繪了替代實(shí)施方案。圖5和圖6(a)-(b)例示了生成可通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增的擴(kuò)增子的備選方法。圖7例示了一個(gè)備選的實(shí)施方案，其中夾心復(fù)合物中的每個(gè)近端探針的一部分由雜交于各區(qū)段的RNA短鏈暫時(shí)保護(hù)。酶法除去那些鏈以允許近端探針彼此雜交和與要延伸的鏈雜交。圖8顯示了進(jìn)一步的實(shí)施方案，其中近端探針附接于捕獲試劑和檢測(cè)試劑，且每個(gè)近端探針的一部分由與其雜交的RNA短鏈暫時(shí)保護(hù)，如上文關(guān)于圖8描述的。圖9顯示使用實(shí)施例1中描述的方法進(jìn)行的IL-10測(cè)定法的校正曲線。圖10(a)-(b)顯示了使用(a)和不使用(b)錨定試劑的熒光顯微圖像。圖11(a)顯示了包括連接位點(diǎn)1或2的單個(gè)線性連接子寡核苷酸序列的配置，以及在本發(fā)明的測(cè)定中這些連接子的使用。圖11(b)顯示了使用Circ-1和Circ-2的組合相對(duì)于(vs.)包括連接位點(diǎn)1的單個(gè)線性連接寡核苷酸序列或包括連接位點(diǎn)2的單個(gè)線性連接寡核苷酸序列的測(cè)定的比較性能數(shù)據(jù)。圖12顯示使用實(shí)施例1和6中描述的方法進(jìn)行的HIVp24測(cè)定法的校正曲線。圖13顯示使用實(shí)施例1和6中描述的方法對(duì)血清轉(zhuǎn)化組(seroconversionpanel)的分析的結(jié)果。圖14(a)-(c)顯示包括分析物濃縮步驟的用于HIVp24的測(cè)定結(jié)果。圖15顯示包括分析物濃縮步驟的用于HIVp24測(cè)定的校正曲線。圖16是如本文所述的包括分析物濃縮步驟的測(cè)定方法的示意圖。圖17是如本文所述的測(cè)定方法的示意圖，其中在通過(guò)捕獲試劑和/或錨定試劑結(jié)合到表面之前在溶液中形成擴(kuò)增子。圖18是結(jié)合使用多個(gè)U形序列(staplesequences)以附著于擴(kuò)增子，從而在表面上形成更緊湊結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法的示意圖。圖19是結(jié)合3ABPLA-RCA技術(shù)和使用靶向部分及其互補(bǔ)體以將捕獲試劑結(jié)合到表面的橋接免疫測(cè)定形式(bridgingimmunoassayformat)的示意圖。圖20(a)-(b)是用于模板形成的生物合成方法的示意圖。圖21是樣品多重化(multiplexing)的示意圖。圖22是使用本文所述方法檢測(cè)脂蛋白復(fù)合物的示意圖。發(fā)明詳述除非本文中另外定義，關(guān)于本發(fā)明中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有與本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。此外，除非上下文另外要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。冠詞“一個(gè)”和“一種”用于本文指一個(gè)/種或超過(guò)一個(gè)/種(即至少一個(gè)/種)的該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。例如，“一個(gè)/種要素”意指一個(gè)/種要素或超過(guò)一個(gè)/種要素。本發(fā)明包括改進(jìn)的免疫測(cè)定方法，其包括(i)錨定靶分析物和測(cè)定法中使用的一種或多種分析物結(jié)合試劑之間形成的檢測(cè)復(fù)合物；和/或(ii)從經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)復(fù)合物擴(kuò)增信號(hào)。錨定可用于穩(wěn)定化牽涉低結(jié)合親和力相互作用和/或一種或多種高分子量標(biāo)記物或標(biāo)記位點(diǎn)的復(fù)合物。信號(hào)擴(kuò)增可通過(guò)將延伸的探針附接于含有多個(gè)標(biāo)記物或檢測(cè)標(biāo)記位點(diǎn)的結(jié)合復(fù)合物，由此對(duì)于每個(gè)檢測(cè)復(fù)合物擴(kuò)增可檢測(cè)信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括將包含多個(gè)標(biāo)記物或檢測(cè)標(biāo)記位點(diǎn)的延伸探針附接于檢測(cè)復(fù)合物，并將該復(fù)合物錨定至表面以確保復(fù)合物保留在表面上。這種經(jīng)改良的測(cè)定方法可用于檢測(cè)極低數(shù)目的結(jié)合事件，甚至單個(gè)的分析物-結(jié)合試劑復(fù)合物。該基礎(chǔ)辦法不限于免疫測(cè)定且可用于實(shí)施使用其他結(jié)合試劑類(lèi)別的結(jié)合測(cè)定法?？捎糜诟倪M(jìn)結(jié)合測(cè)定法的一種方法是使用表面結(jié)合的錨定試劑以將包含目的分析物的檢測(cè)復(fù)合物粘附至表面并穩(wěn)定化該檢測(cè)復(fù)合物。該辦法可用于克服形成檢測(cè)復(fù)合物的試劑之間的低結(jié)合親和力和/或預(yù)防復(fù)合物在隨后處理之前從表面解離。錨定試劑在結(jié)合測(cè)定法中的使用例示于圖1(a)。表面(101)包含結(jié)合分析物A的捕捉試劑(102)和錨定試劑(103)。在一個(gè)或多個(gè)步驟中，分析物結(jié)合捕捉試劑且檢測(cè)試劑(104)也結(jié)合分析物,，其中所述檢測(cè)試劑連接于核酸探針(105)。分析物可同時(shí)或基本同時(shí)地結(jié)合捕捉和檢測(cè)試劑，或分析物可以序貫結(jié)合捕捉和檢測(cè)試劑的每一種(以任一次序)。因此，在表面上形成復(fù)合物(106)，其包含捕捉試劑、分析物和檢測(cè)試劑。探針延伸以形成延伸序列(107)，其包含結(jié)合錨定試劑的錨定區(qū)域。延伸序列結(jié)合錨定試劑，并測(cè)量結(jié)合于表面的延伸序列的量。結(jié)合測(cè)定領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將容易地理解可用于所述方法的捕捉試劑和陪伴結(jié)合伴侶的范圍。這類(lèi)對(duì)的非限制性例子包括(以任一次序)受體/配體對(duì)、抗體/抗原、天然或合成受體/配體對(duì)、半抗原/抗體對(duì)、抗原/抗體對(duì)、表位/抗體對(duì)、模擬位/抗體對(duì)、適體/靶分子對(duì)、雜交伴侶、和嵌入物/靶分子對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合測(cè)定法采用抗體或其他受體蛋白質(zhì)作為目的分析物的捕捉和/或檢測(cè)試劑。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的抗體分子(包括通過(guò)抗體亞基的體外重聯(lián)合組裝的雜合抗體)、包含抗體的抗原結(jié)合域的抗體片段和重組蛋白質(zhì)構(gòu)建體(如記載于例如Porter,R.R.和Weir,R.C.J.CellPhysiol.,67(Suppl)；51-64(1966)和Hochman,1.Inbar,D.andGivol,D.Biochemistry12:1130(1973))、以及已經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾(例如通過(guò)引入可檢測(cè)的標(biāo)記)的抗體構(gòu)建體。類(lèi)似地，錨定試劑和相應(yīng)的錨定成員或區(qū)域可包含任何適宜的結(jié)合對(duì)，例如受體/配體對(duì)、抗體/抗原、天然或合成受體/配體對(duì)、半抗原/抗體對(duì)、抗原/抗體對(duì)、表位/抗體對(duì)、模擬位/抗體對(duì)、適體/靶分子對(duì)、雜交伴侶、和嵌入物/靶分子對(duì)，和使用通過(guò)靜電電荷結(jié)合的表面和錨定試劑。例如，錨定試劑可以是寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位、或模擬位，且相應(yīng)的錨定區(qū)域分別包含互補(bǔ)的寡核苷酸序列、適體配體、適體、抗原、抗體、受體、配體、或抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，錨定區(qū)域是寡核苷酸序列且錨定試劑包含DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。或者，如果錨定區(qū)域是雙鏈寡核苷酸序列，則錨定試劑可包含嵌入劑。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，錨定區(qū)域可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的寡核苷酸堿基且相應(yīng)的錨定試劑包含結(jié)合錨定區(qū)域上經(jīng)修飾的堿基的一個(gè)或多個(gè)模塊。例如，所述經(jīng)修飾的堿基可包含半抗原或配體，而相應(yīng)的錨定試劑包含分別特異于該半抗原或配體的一種或多種抗體或配體。而且，錨定區(qū)域可包含多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸堿基，其可用于檢測(cè)檢測(cè)復(fù)合物。在圖1(b)中繪出的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，結(jié)合表面的錨定試劑包含用于將檢測(cè)復(fù)合物錨定至表面的寡核苷酸。錨定寡核苷酸序列結(jié)合附接于檢測(cè)復(fù)合物的互補(bǔ)性寡核苷酸序列。在該實(shí)施方案中，表面(108)包含結(jié)合分析物A的捕捉試劑(109)，和包含錨定寡核苷酸序列(111)的錨定試劑(110)。在一個(gè)或多個(gè)步驟中，分析物結(jié)合于捕捉試劑和也結(jié)合分析物的檢測(cè)試劑(112)，其中所述檢測(cè)試劑連接于核酸探針(113)。如上文對(duì)于圖1(a)描述的，分析物可以同時(shí)或基本同時(shí)地結(jié)合捕捉和檢測(cè)試劑，或分析物可以序貫結(jié)合捕捉和檢測(cè)試劑的每一種(以任一次序)。因此，在表面上形成復(fù)合物(114)，其包含結(jié)合試劑、分析物和檢測(cè)試劑。探針延伸以形成延伸序列(115)，其包含互補(bǔ)于錨定序列的錨定序列互補(bǔ)體。錨定序列雜交于錨定序列互補(bǔ)體，并測(cè)量結(jié)合于表面的延伸序列的量。所述檢測(cè)復(fù)合物可包含一種或多種檢測(cè)試劑，例如以增強(qiáng)測(cè)定對(duì)分析物的特異性。使用多種檢測(cè)試劑能增強(qiáng)測(cè)定的特異性，如果例如測(cè)定設(shè)計(jì)為當(dāng)每種檢測(cè)試劑在分析物附近時(shí)發(fā)出可檢測(cè)信號(hào)，或者來(lái)自結(jié)合于分析物的單一檢測(cè)試劑的信號(hào)能與從結(jié)合于分析物的多種檢測(cè)試劑發(fā)出的信號(hào)區(qū)分的話。這類(lèi)測(cè)定的一個(gè)實(shí)施方案顯示于圖1(c)。表面(116)包含結(jié)合分析物A的捕捉試劑(117)和包含錨定寡核苷酸序列(119)的錨定試劑(118)。在一個(gè)或多個(gè)步驟中，分析物結(jié)合于捕捉試劑和結(jié)合分析物的兩種(或更多種)檢測(cè)試劑的每一種(分別為120和121)，其中所述第一和第二檢測(cè)試劑的每一種連接于核酸探針(122和123，分別為第一和第二核酸探針)。分析物可以同時(shí)或基本同時(shí)，或以序貫、逐步的方式結(jié)合捕捉和檢測(cè)試劑。因此，在表面上形成復(fù)合物(124)，其包含捕捉試劑、分析物和一和第二檢測(cè)試劑。使用需要第一和第二探針彼此接近的延伸過(guò)程，第一探針延伸以形成延伸序列(125)，其包含互補(bǔ)于錨定序列的錨定序列互補(bǔ)體。在倒數(shù)第二步中，錨定序列雜交于錨定序列互補(bǔ)體，并測(cè)量結(jié)合于表面的延伸序列的量。圖1(c)中繪出的方法的一個(gè)具體的實(shí)施方案顯示于圖2(a)，其中錨定試劑用于將檢測(cè)復(fù)合物粘附于表面且附接于檢測(cè)復(fù)合物的探針延伸以生成結(jié)合錨定試劑的延伸區(qū)域。在該實(shí)施方案中，使用結(jié)合于近端探針的兩種檢測(cè)試劑檢測(cè)復(fù)合物。該方法還包括將檢測(cè)試劑與連接體序列聯(lián)合，其然后連接以形成環(huán)狀靶序列，并進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以生成結(jié)合錨定試劑的擴(kuò)增子。表面(201)包含捕捉試劑(202)和錨定試劑(203)。在一個(gè)或多個(gè)步驟中，分析物結(jié)合于捕捉試劑，包含第一近端探針(205)的第一檢測(cè)試劑(204)，和包含第二近端探針(207)的第二檢測(cè)試劑(206)，由此在表面上形成檢測(cè)復(fù)合物(208)。使該檢測(cè)復(fù)合物與兩種連接體序列(209a和209b)接觸，其各自包含與所述第一近端探針的非重疊性區(qū)域互補(bǔ)的端序列和與所述第二近端探針的非重疊性區(qū)域互補(bǔ)的端序列。連接體序列與第一和第二近端探針雜交，且連接體寡核苷酸的端序列連接以形成環(huán)狀靶序列(210)，其與第一和第二近端探針兩者雜交。第二近端探針通過(guò)滾環(huán)雜交延伸以生成包含結(jié)合錨定試劑的結(jié)合試劑的擴(kuò)增子，并測(cè)量結(jié)合于表面的擴(kuò)增子的量。第一近端探針可以加帽或有其他修飾以防止第一探針的延伸。(在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，第一近端探針延伸而第二近端探針可以加帽或有其他修飾以防止延伸)。在圖2(a)繪出的實(shí)施方案中，擴(kuò)增子還包含兩個(gè)或更多個(gè)互補(bǔ)于經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)探針的檢測(cè)序列，所述檢測(cè)探針與擴(kuò)增子雜交，用于測(cè)量結(jié)合于表面的擴(kuò)增子的量。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中(未在圖2(a)繪出)，延伸過(guò)程將經(jīng)標(biāo)記的核苷酸堿基摻入擴(kuò)增子，其用于直接檢測(cè)表面上的擴(kuò)增子而不用添加與擴(kuò)增子互補(bǔ)的一種或多種經(jīng)標(biāo)記的探針。圖2(b)是連接體序列組成的示意圖，其顯示第一和第二連接體寡核苷酸(分別為209a和209b)，其中第一連接體的第一端(C1(E1))和第二連接體的第一端(C2(E1))互補(bǔ)于第一近端探針的兩個(gè)非重疊性區(qū)域，且第一連接體的第二端(C1(E2))和第二連接體的第二端(C2(E2))互補(bǔ)于第二近端探針的兩個(gè)非重疊性區(qū)域。所述第一和第二連接體與第一和第二近端探針雜交且第一和第二連接體連接以形成環(huán)狀靶序列，其與第一和第二近端探針兩者雜交。圖2(c)顯示了連接體的一個(gè)備選實(shí)施方案。連接體序列211包含互補(bǔ)于第二近端探針的內(nèi)部序列(CIS)和互補(bǔ)于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的兩個(gè)端序列(分別為CE1和CE2)。在該實(shí)施方案中，僅需要一個(gè)連接事件來(lái)形成環(huán)狀靶序列用于滾環(huán)擴(kuò)增(即與第一近端探針雜交的端CE1和CE2的連接)，然而，由于引發(fā)/延伸來(lái)自第二近端探針，仍需要兩種近端探針接近。優(yōu)選地，第一近端探針加帽或有其他修飾以防止第一探針的延伸。其后，第二近端探針通過(guò)環(huán)狀靶序列的滾環(huán)擴(kuò)增延伸以生成擴(kuò)增子，其包含結(jié)合錨定試劑的結(jié)合區(qū)，并測(cè)量結(jié)合于表面的擴(kuò)增子的量。第一和第二近端探針的序列可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法設(shè)計(jì)。例如，每種探針長(zhǎng)度為約20-50個(gè)堿基，優(yōu)選長(zhǎng)為25-40個(gè)堿基，最優(yōu)選長(zhǎng)為約30-35個(gè)堿基。第一和第二近端探針還包含與如本文中描述的過(guò)程中使用的一種或多種連接體序列或其部分互補(bǔ)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，使檢測(cè)復(fù)合物與兩種連接體序列(209a和209b)接觸，其各自包含互補(bǔ)于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的端序列和互補(bǔ)于第二近端探針的非重疊性區(qū)域的端序列。因此，在該實(shí)施方案中，第一和第二近端探針各自包含互補(bǔ)于連接體的端序列的非重疊性區(qū)域?；蛘?，可使用僅一種連接體且該連接體序列(211)包含互補(bǔ)于第二近端探針的內(nèi)部序列(CIS)和互補(bǔ)于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的兩個(gè)端序列(分別為CE1和CE2)。因此，在該實(shí)施方案中，第一近端探針包含分別互補(bǔ)于連接體的兩個(gè)端序列CE1和CE2的非重疊性區(qū)域，而第二近端探針包含互補(bǔ)于連接體的內(nèi)部序列(CIS)的序列。第一近端探針可以加帽或有其他修飾以防止第一探針的延伸。(在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，第一近端探針延伸而第二近端探針可以加帽或有其他修飾以防止延伸。)因此，示于圖1-2圖1-2中例示的實(shí)施方案顯示可改良結(jié)合測(cè)定法以納入錨定試劑和/或可以擴(kuò)增來(lái)自檢測(cè)復(fù)合物的信號(hào)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在結(jié)合測(cè)定法中采用錨定試劑和信號(hào)擴(kuò)增方法。在包括使用錨定試劑的實(shí)施方式中，存在于表面的錨定試劑的濃度為0.2-200ug/mL，特別是，1.0-50ug/mL，且更特別是3.0-10ug/mL?；蛘撸瑑H一種或另一種方法可以用于實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的結(jié)合測(cè)定。本發(fā)明因此包括具有如圖1-2中描述的信號(hào)擴(kuò)增方法的測(cè)定法，省去了錨定試劑。在其中錨定試劑包含直接或間接結(jié)合于表面(例如經(jīng)由結(jié)合反應(yīng))的錨定序列的那些實(shí)施方案中，可以采用本領(lǐng)域中建立的用于固定化寡核苷酸的方法來(lái)生成錨定試劑，包括共價(jià)和非共價(jià)附接方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述錨定試劑包含連接或以其他方式結(jié)合于錨定序列的蛋白質(zhì)。在該實(shí)施方案中，可以使用能固定化在表面上(共價(jià)或非共價(jià))并通過(guò)錨定寡核苷酸修飾的任意蛋白質(zhì)。非限制性例子包括鏈霉親合素、親合素或牛血清清蛋白(BSA)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，錨定試劑包含BSA。蛋白質(zhì)可由錨定寡核苷酸修飾并使用已知的方法附接于表面，例如如圖3中例示的，使用磺基琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)，一種確立的異雙功能交聯(lián)劑。SMCC的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基團(tuán)與牛血清清蛋白(BSA)的反應(yīng)將BSA標(biāo)記有硫醇反應(yīng)性馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)相應(yīng)地與硫醇修飾的寡核苷酸反應(yīng)以形成BSA-寡核苷酸綴合物，其經(jīng)由穩(wěn)定的硫醚鍵連接。在一個(gè)具體的例子中，通過(guò)將一系列BSA-寡核苷酸綴合物打印到石墨碳表面(優(yōu)選絲網(wǎng)印刷的碳墨電極(screenprintedcarboninkelectrode))上來(lái)形成陣列?；蛘撸绻鞍踪|(zhì)是親合素或鏈霉親合素，則錨定序列可連接于生物素并經(jīng)由生物素-親合素或生物素-鏈霉親合素相互作用聯(lián)合至固定化的親合素或鏈霉親合素。附接于錨定試劑的錨定寡核苷酸可以是將與在延伸過(guò)程期間形成的延伸序列(或擴(kuò)增子)雜交的任意序列。錨定寡核苷酸還可以包含非互補(bǔ)性區(qū)域(例如聚(A)序列)，其用作表面和互補(bǔ)性(雜交)區(qū)域之間的接頭序列以將互補(bǔ)性區(qū)域伸至離開(kāi)表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交序列選擇為與結(jié)合近端或檢測(cè)探針無(wú)關(guān)的擴(kuò)增子區(qū)域(“無(wú)活性”區(qū)域)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，單獨(dú)或與聚(A)臂(例如長(zhǎng)度多達(dá)30個(gè)核苷酸)組合地納入互補(bǔ)于擴(kuò)增子的全長(zhǎng)無(wú)活性區(qū)域的雜交序列(優(yōu)選長(zhǎng)度約25個(gè)核苷酸)。優(yōu)選地，錨定寡核苷酸選自：(i)(擴(kuò)增子無(wú)活性區(qū)域的全長(zhǎng)互補(bǔ)體，長(zhǎng)度25個(gè)核苷酸)-(20個(gè)核苷酸聚(A)臂)；或(ii)(擴(kuò)增子無(wú)活性區(qū)域一部分的互補(bǔ)體，長(zhǎng)度15個(gè)核苷酸)-(30個(gè)核苷酸聚(A)臂)。在一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)施近端連接擴(kuò)增(PLA)來(lái)延伸第二近端探針。如上文對(duì)圖2(a)-(c)描述的，使包含兩種近端探針的復(fù)合物與一種或多種連接體寡核苷酸(209a-209b或211)接觸，且雜交的連接體序列的連接形成環(huán)狀寡核苷酸，其然后用于通過(guò)環(huán)的滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)延伸第二近端探針。適宜的探針設(shè)計(jì)和近端連接擴(kuò)增的擴(kuò)增條件是本領(lǐng)域中確立的。本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)特方面是在連接體之一中納入與錨定試劑中使用的相同序列。由此在第二近端探針的延伸期間，延伸的區(qū)域包含錨定序列的互補(bǔ)體，其與錨定試劑雜交，從而穩(wěn)定化夾心復(fù)合物和防止第二近端探針的解離。延伸的第二近端探針可含有可檢測(cè)的標(biāo)記(例如通過(guò)在RCA延伸反應(yīng)期間納入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸)，可測(cè)量該標(biāo)記來(lái)測(cè)定表面上分析物的量?；蛘?，添加包含可檢測(cè)的標(biāo)記的多種經(jīng)標(biāo)記的探針且與延伸的第二近端探針雜交，并測(cè)量結(jié)合于表面上的分析物的量。可以使用任何適宜的擴(kuò)增技術(shù)來(lái)生成延伸序列(或擴(kuò)增子)，包括但不限于，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，SDA(鏈置換擴(kuò)增)，3SR(自維持合成反應(yīng))，和等溫?cái)U(kuò)增方法，例如螺旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用RCA因?yàn)槠渚挽`敏性、多重性、動(dòng)態(tài)范圍和可擴(kuò)縮性而言具有顯著優(yōu)勢(shì)。RCA的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的(參見(jiàn)例如Baner等,NucleicAcidsResearch,26:50735078,1998；Lizardi等,NatureGenetics19:226,1998；Schweitzer等Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10113119,2000；Faruqi等,BMCGenomics2:4,2000；Nallur等,Nucl.AcidsRes.29:e118,2001；Dean等GenomeRes.11:10951099,2001；Schweitzer等,NatureBiotech.20:359365,2002；U.S.Pat.Nos.6,054,274,6,291,187,6,323,009,6,344,329和6,368,801)。已知RCA的幾種不同的變型，包括線性RCA(LRCA)和指數(shù)性RCA(ERCA)。RCA生成數(shù)以千計(jì)的環(huán)狀模板的拷貝，拷貝的鏈附接于初始靶DNA，從而允許靶物的空間分辨和信號(hào)的快速擴(kuò)增。RCA促進(jìn)(i)單一靶分子的檢測(cè)；(ii)來(lái)自蛋白質(zhì)以及DNA和RNA的信號(hào)的擴(kuò)增；(iii)鑒定已擴(kuò)增的分子在固體表面上的位置；(iv)同時(shí)測(cè)量許多不同的靶物；和(v)分析溶液中或固相中的一種或多種靶物。在基于陣列或顆粒的形式中進(jìn)行多重結(jié)合測(cè)定法時(shí)，RCA產(chǎn)物與檢測(cè)復(fù)合物的空間定位是尤為有利的。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案描述在圖4(a)中，其中使用錨定試劑和信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程兩者。在表面(401)上形成捕獲試劑(402)、分析物(403)和兩種檢測(cè)試劑(304和305)之間的復(fù)合物，每種檢測(cè)試劑分別包括第一和第二近端探針(406和407)。分別添加圖4(a)中第一和第二連接子寡核苷酸Circ-1(408)和Circ-2(409)，當(dāng)兩種近端探針均存在于復(fù)合物中時(shí)，每個(gè)雜交并橋連兩個(gè)近端探針。結(jié)合的連接子探針?lè)謩e在連接位點(diǎn)1和2(410和411)處連接以形成環(huán)形DNA模板(412)。通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增環(huán)形DNA模板以延伸第二近端探針，從而產(chǎn)生包含一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)序列(413)和錨定寡核苷酸序列互補(bǔ)體(414)的擴(kuò)增子(包括部分錨定序列互補(bǔ)體(415))。錨定寡核苷酸序列(416)(附接于捕獲部分(417))和其互補(bǔ)體雜交，多個(gè)檢測(cè)探針與多個(gè)檢測(cè)探針序列雜交，并且測(cè)量結(jié)合到表面的分析物的量(未顯示，但例示于圖1(a))。圖4(b)顯示了第一環(huán)形DNA模板Circ-1(408)(其設(shè)計(jì)為與第一近端探針(PP1)雜交)、檢測(cè)寡核苷酸序列、擴(kuò)增子的無(wú)活性區(qū)域(其可全部或部分使用以結(jié)合錨定寡核苷酸序列)和部分PP2(其設(shè)計(jì)為與第二近端探針雜交)。另外的實(shí)施方案如圖4(c)所示，其中通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增環(huán)形DNA模板以產(chǎn)生包含多個(gè)檢測(cè)序列(分別為418和419)的擴(kuò)增子。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，附接于捕獲部分417的錨定寡核苷酸序列(416)可以作為具有游離3'末端的引物。在該實(shí)施方案中，第二近端探針包括與檢測(cè)序列(413)互補(bǔ)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的測(cè)定形式利用與檢測(cè)序列的5'末端偶聯(lián)的檢測(cè)試劑，其中3'端暴露以促進(jìn)與連接子探針的連接以形成環(huán)形DNA模板，其然后通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增以延伸第二近端探針(PP2)。在該實(shí)施方案中，PP1潛在地獨(dú)立地可用于通過(guò)聚合酶的延伸，但是這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)添加修飾的堿基以防止聚合酶引發(fā)(priming)來(lái)解決?；蛘?，連接模板PP1可以通過(guò)其3'末端直接偶聯(lián)到檢測(cè)試劑，防止該寡核苷酸作為DNA聚合酶的引物參與，即使它被降解。生成通過(guò)RCA或任何適宜的擴(kuò)增方法擴(kuò)增的靶序列的另一種辦法例示于圖5中。在該實(shí)施方案中，每種近端探針能折疊成環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成生成單鏈環(huán)和雙鏈部分，其含有重組信號(hào)。添加重組酶以驅(qū)動(dòng)兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的重組從而形成環(huán)狀DNA模板，其隨后進(jìn)行如上文描述的RCA。標(biāo)記擴(kuò)增子且任選地錨定于錨定試劑，并檢測(cè)分析物。該實(shí)施方案的關(guān)鍵要素是重組酶催化含有序列特異性重組位點(diǎn)的DNA的位點(diǎn)特異性重組的能力。例如，來(lái)自噬菌體P1的Cre重組酶在含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的位點(diǎn)處催化重組，且其他非限制性例子包括但不限于翻轉(zhuǎn)酶(Flippase)(flp，來(lái)自Yeast)，Hin(Salmonella)和Tre，Cre的工程化(進(jìn)化)型式。這種備選的辦法不需要添加另外的組分如寡核苷酸模板、ATP和dNTP。在該實(shí)施方案中，loxP(重組)位點(diǎn)優(yōu)選修飾為非對(duì)稱(chēng)的，從而產(chǎn)生朝向期望的重組產(chǎn)物形成的正常平衡中的遷移。這在圖5中例示，重組位點(diǎn)具有淺/深色陰影。而且，圖6(a)又例示了另一種生成靶序列的方法，其通過(guò)RCA或任何適宜的擴(kuò)增方法擴(kuò)增。附接于檢測(cè)試劑的每種近端探針包含loxP位點(diǎn)，其使得兩個(gè)寡核苷酸之間通過(guò)Cre重組酶能進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，導(dǎo)致新寡核苷酸序列的形成，該新寡核苷酸序列包含側(cè)接loxP位點(diǎn)的一種近端探針的5’部分和另一種近端探針的3’部分。新創(chuàng)建的靶序列隨后可通過(guò)任何適宜的方法擴(kuò)增、標(biāo)記、任選地錨定和如上文描述的檢測(cè)。圖6(a)例示了該實(shí)施方案，使用T7RNA聚合酶啟動(dòng)子作為用于擴(kuò)增的可操作元件。還應(yīng)理解其他RNA聚合酶位點(diǎn)如在近端探針的3或5’部分的任一處連接的T3和SP6也同樣適用于該方法。在該實(shí)施方案中，loxP(重組)位點(diǎn)優(yōu)選修飾為非對(duì)稱(chēng)的，從而產(chǎn)生朝向期望的重組產(chǎn)物形成的正常平衡中的遷移。如圖6(b)中顯示的，該方法還可用于生成可在RCA中使用的環(huán)狀DNA模板。本發(fā)明包括用于檢測(cè)分析物的方法，包括使分析物結(jié)合表面上的捕捉試劑和兩種檢測(cè)試劑以形成檢測(cè)復(fù)合物。該方法包括測(cè)量檢測(cè)復(fù)合物，其中相對(duì)于僅包含兩種檢測(cè)試劑之一的復(fù)合物，測(cè)量方法優(yōu)先測(cè)量包含兩種檢測(cè)試劑的復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括形成復(fù)合物，然后交聯(lián)檢測(cè)試劑并檢測(cè)交聯(lián)的試劑?？梢允褂萌魏芜m宜的交聯(lián)化學(xué)來(lái)連接檢測(cè)復(fù)合物的組分。例如，第一和第二檢測(cè)試劑可以包含反應(yīng)模塊，其通過(guò)添加連接反應(yīng)模塊的多功能交聯(lián)劑反應(yīng)和連接。在該實(shí)施方案中，反應(yīng)模塊和交聯(lián)劑可包含胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺(iodoacetamide)、馬來(lái)酰亞胺、點(diǎn)擊化學(xué)試劑及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二檢測(cè)試劑可以包含結(jié)合模塊且交聯(lián)劑是該結(jié)合模塊的多價(jià)結(jié)合伴侶。該實(shí)施方案的幾個(gè)非限制性例子包括：(a)第一和第二檢測(cè)試劑是動(dòng)物物種的抗體且交聯(lián)劑是靶向該動(dòng)物物種抗體的多價(jià)抗物種抗體；(b)第一和第二檢測(cè)試劑包含生物素且交聯(lián)劑是鏈霉親合素(或反之)；(c)第一和第二檢測(cè)試劑連接于鏈霉親合素且交聯(lián)劑是包含多個(gè)生物素分子的聚合物(或反之)；或(d)第一和第二檢測(cè)試劑分別包含第一和第二核酸探針且交聯(lián)劑是寡核苷酸，其包含互補(bǔ)于第一核酸探針的序列和互補(bǔ)于第二核酸探針的另一個(gè)序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可通過(guò)使分析物結(jié)合固定化的捕捉試劑、第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑以形成復(fù)合物來(lái)檢測(cè)樣品中的目的分析物，其中所述第一檢測(cè)試劑包含第一可檢測(cè)的標(biāo)記和第一核酸探針，和第二檢測(cè)試劑包含第二可檢測(cè)的標(biāo)記和第二核酸探針。在該實(shí)施方案中，第一和第二檢測(cè)試劑通過(guò)以下交聯(lián)：(i)將第一探針雜交于第二探針，(ii)將第一和第二探針雜交于具有互補(bǔ)于第一和第二探針的區(qū)域的第三核酸，或(iii)連接第一和第二探針。一旦交聯(lián)的產(chǎn)物結(jié)合表面就可檢測(cè)該產(chǎn)物，或任選地，交聯(lián)的產(chǎn)物可從表面釋放到洗脫物中并檢測(cè)。在此方面，僅計(jì)算洗脫物中包含第一和第二可檢測(cè)的標(biāo)記兩者的那些各個(gè)交聯(lián)的產(chǎn)物?？梢圆捎萌魏芜m宜的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)洗脫物中標(biāo)記物的存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記物是熒光分子且通過(guò)單分子熒光檢測(cè)，例如熒光相關(guān)光譜和/或熒光交互相關(guān)光譜，來(lái)計(jì)算存在于洗脫物中的經(jīng)標(biāo)記的交聯(lián)產(chǎn)物。在該實(shí)施方案中，單分子熒光檢測(cè)包括使洗脫物流經(jīng)毛細(xì)管，將光源聚焦在毛細(xì)管內(nèi)的某體積上以創(chuàng)建探詢帶(interrogationzone)，并用光檢測(cè)器觀察探詢帶以檢測(cè)熒光分子經(jīng)由探詢帶的通過(guò)。該檢測(cè)方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)與第一標(biāo)記物有關(guān)的第一熒光信號(hào)和與第二標(biāo)記物有關(guān)的第二熒光信號(hào)，并且當(dāng)從探詢帶檢測(cè)出兩種信號(hào)時(shí)對(duì)檢測(cè)事件計(jì)數(shù)?；蛘?，一種標(biāo)記物是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)供體而另一種標(biāo)記物是FRET接受體，且檢測(cè)方法可進(jìn)一步包括激發(fā)探詢帶中的FRET供體并檢測(cè)來(lái)自FRET接受體的熒光信號(hào)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可通過(guò)使分析物結(jié)合固定化的捕捉試劑、第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑以形成復(fù)合物來(lái)檢測(cè)樣品中的分析物，其中所述第一檢測(cè)試劑包含第一核酸探針，第二檢測(cè)試劑包含第二核酸探針；延伸第二核酸探針以形成包含可檢測(cè)的標(biāo)記的延伸序列，所述延伸依賴(lài)于第一和第二核酸探針在復(fù)合物中的共定位；從表面釋放延伸序列至洗脫物中；并計(jì)算洗脫物中的各個(gè)延伸序列。延伸步驟可包括使探針結(jié)合模板核酸序列并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸探針?；蛘撸由觳襟E包括使第一探針結(jié)合模板核酸序列，形成環(huán)狀核酸模板，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸該環(huán)狀模板。延伸步驟還可以包括使第一探針結(jié)合模板核酸序列，使第二探針結(jié)合該模板序列，并連接第一和第二探針。在采用捕捉試劑的本發(fā)明的方法中，捕捉試劑可以直接固定化于固相上或它們可以經(jīng)由次級(jí)結(jié)合試劑如下文描述的靶向性試劑間接固定化。例如，捕捉試劑可以連接于或包含靶向性試劑，其結(jié)合固相上固定化的靶向性試劑互補(bǔ)體。靶向性試劑對(duì)其互補(bǔ)體的結(jié)合可以是直接的(例如，靶向性試劑可為鏈霉親合素而互補(bǔ)體可為生物素)，或者是經(jīng)由橋接試劑為間接的(例如靶向性試劑和互補(bǔ)體可為生物素，而橋接試劑可以是多價(jià)生物素結(jié)合受體如鏈霉親合素)。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向性試劑及其互補(bǔ)體包括第一寡核苷酸和互補(bǔ)性寡核苷酸、受體-配體對(duì)、抗原-抗體對(duì)、半抗原-抗體對(duì)、表位-抗體對(duì)、模擬位-抗體對(duì)、適體-靶分子對(duì)、雜交配偶、或嵌入劑-靶分子對(duì)。測(cè)定中使用的靶向性試劑和互補(bǔ)體選擇為使得與通過(guò)測(cè)定測(cè)量的一種分析物的捕捉或檢測(cè)試劑聯(lián)合的靶向性試劑和互補(bǔ)體與通過(guò)測(cè)定測(cè)量的其他分析物的捕捉或檢測(cè)試劑聯(lián)合的靶向性試劑和互補(bǔ)體基本是非交叉反應(yīng)性的。例如，結(jié)合試劑對(duì)其聯(lián)合的結(jié)合域的結(jié)合(經(jīng)由其聯(lián)合的靶向性試劑和靶向性試劑互補(bǔ)體)應(yīng)實(shí)質(zhì)性大于其對(duì)與其他分析物聯(lián)合的結(jié)合域(且呈現(xiàn)不同的靶向性試劑互補(bǔ)體)的結(jié)合。優(yōu)選地，一種分析物的捕捉或檢測(cè)試劑對(duì)與其他分析物有關(guān)的結(jié)合域的結(jié)合相對(duì)于對(duì)正確結(jié)合域的結(jié)合的交叉反應(yīng)性為<1％，更優(yōu)選<0.1％且更優(yōu)選<0.01％。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶向性試劑/靶向性試劑互補(bǔ)體包含包括互補(bǔ)性序列的一對(duì)寡核苷酸且靶向性試劑及其互補(bǔ)體在足以使靶向性試劑雜交于其互補(bǔ)體的條件下接觸。當(dāng)使用靶向性試劑時(shí)，就何時(shí)將測(cè)定法中使用的捕捉試劑固定化于固相上而言有一定靈活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)使用者提供經(jīng)由靶向性試劑–靶向性試劑互補(bǔ)體相互作用預(yù)固定化于固相上的捕捉試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以分開(kāi)的組分提供連接于靶向性試劑的捕捉試劑和支持固定化的靶向性試劑互補(bǔ)體的固相。因此，測(cè)定方法進(jìn)一步包括通過(guò)使靶向性試劑結(jié)合其互補(bǔ)體(直接或經(jīng)由橋接劑的使用)將捕捉試劑固定化于固相上的步驟。該步驟與形成檢測(cè)復(fù)合物有關(guān)的步驟可在前、同時(shí)或在后實(shí)施。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，多功能靶向劑可用于本文所述的測(cè)定方法和組分中。多功能靶向劑可以包括(a)設(shè)計(jì)成通過(guò)第一區(qū)段互補(bǔ)體與捕獲試劑結(jié)合的第一區(qū)段(即，捕獲試劑包括靶向劑互補(bǔ)體，該互補(bǔ)體與多功能靶向劑的第一區(qū)段互補(bǔ))，和(b)設(shè)計(jì)成結(jié)合擴(kuò)增子的第二區(qū)段(即，多功能靶向劑的第二區(qū)段，其用作表面上的錨定試劑)。因此，在該實(shí)施方案中，表面包括多功能靶向劑，其與通過(guò)第一區(qū)段和第一區(qū)段互補(bǔ)體之間的連接結(jié)合到靶向劑的捕獲試劑接觸。3-ABRCA/PLA測(cè)定如本文所述進(jìn)行，并且在測(cè)量步驟之前擴(kuò)增子結(jié)合多功能靶向劑的錨定區(qū)段。該方法可用于確保在測(cè)定方法中使用1:1比例的捕獲劑與錨定試劑。很多種表面適用于本發(fā)明的方法，包括結(jié)合測(cè)定領(lǐng)域中的常規(guī)表面。表面可從多種不同材料制備，包括聚合物(例如聚苯乙烯和聚丙烯)、陶瓷、玻璃、復(fù)合材料(例如碳聚合物復(fù)合材料如基于碳的墨)。合適的表面包括肉眼可見(jiàn)(macroscopic)物體的表面如測(cè)定容器(例如試管、小池、流動(dòng)池、FACS細(xì)胞分選器、筒(cartridge)、多孔板中的孔等)的內(nèi)部表面，載玻片，測(cè)定芯片(如在基因或蛋白質(zhì)芯片測(cè)量中使用的那些)、針(pin)或探針、珠、過(guò)濾介質(zhì)、側(cè)向流動(dòng)介質(zhì)(例如側(cè)向流動(dòng)測(cè)試條中使用的過(guò)濾膜)等。適宜的表面還包括通常用于基于顆粒的其他類(lèi)型測(cè)定法中的顆粒(包括但不限于膠體或珠)，例如磁性、聚丙烯和膠乳顆粒，通常用于固相合成中的材料例如聚苯乙烯和聚丙烯酰胺顆粒，和通常用于層析應(yīng)用中的材料例如硅土、鋁、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯。材料還可以是纖維如碳纖絲。微顆粒可以是無(wú)生命的或者，可以包含有生命的生物實(shí)體如細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等。用于所述方法的顆粒可由適用于附接一種或多種捕捉或檢測(cè)試劑的任意材料構(gòu)成，且其可經(jīng)由例如離心、重力、過(guò)濾或磁性收集來(lái)收集?？筛浇佑诓蹲交驒z測(cè)試劑的很多種不同類(lèi)型的顆粒是商品化的以用于結(jié)合測(cè)定法中。這些包括非磁性顆粒以及包含可磁化材料的顆粒，其允許用磁場(chǎng)收集顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，顆粒由電導(dǎo)性和/或半導(dǎo)體材料構(gòu)成，例如膠體金顆粒。微顆?？梢跃哂泻芏喾N大小和形狀。例如且不限于，微顆粒可以為5納米至100納米。優(yōu)選地，微顆粒具有20nm至10微米的材料。顆?？梢允乔蛐?、長(zhǎng)方形、桿狀等，或者其可以是形狀不規(guī)則的。用于所述方法的顆粒可以是帶編碼的，以允許在顆?；旌衔镏需b定特定顆粒或顆粒子群體。這類(lèi)編碼顆粒的使用已被用于實(shí)現(xiàn)采用顆粒作為固相支持物進(jìn)行結(jié)合測(cè)定的測(cè)定法的多重化(multiplexing)。在一個(gè)辦法中，制造顆粒以納入一種或多種熒光染料并基于在一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)處熒光發(fā)射的強(qiáng)度和/或相對(duì)強(qiáng)度來(lái)鑒定特定的顆粒群體。該辦法已用在LuminexxMAP系統(tǒng)(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.6,939,720)和BectonDickinsonCytometricBeadArray系統(tǒng)中。或者，顆粒可經(jīng)由其他物理特性如大小、形狀、包埋的光學(xué)模式等中的差異編碼。通過(guò)顆粒光學(xué)特性、大小、形狀、包埋的光學(xué)模式等，可以編碼混合物或顆粒集合中提供的一種或多種顆粒以與混合物中的其他顆粒區(qū)分。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用在多重形式中，其通過(guò)使多種不同的分析物結(jié)合多種針對(duì)那些分析物的捕捉試劑，捕捉分析物固定化于編碼的珠上，從而使得該編碼鑒定特定珠的捕捉試劑(和分析物靶物)。該方法進(jìn)一步包括對(duì)具有結(jié)合的分析物的珠的數(shù)目計(jì)數(shù)(使用本文中描述的檢測(cè)辦法)?；蛘?另外，檢測(cè)復(fù)合物和/或捕捉試劑可以直接或間接結(jié)合一種或多種固相上的不同的離散的結(jié)合域，例如如在結(jié)合陣列中，其中所述結(jié)合域是各個(gè)陣列元件，或者在一組珠中，其中所述結(jié)合域是各個(gè)珠，從而使得在每個(gè)結(jié)合域上生成并從其測(cè)量離散的測(cè)定信號(hào)。如果針對(duì)不同分析物的捕捉試劑固定化于不同的結(jié)合域中，則可以獨(dú)立測(cè)量結(jié)合那些域的不同分析物。在這類(lèi)實(shí)施方案的一個(gè)例子中，通過(guò)在一種或多種表面上固定化結(jié)合目的分析物的捕捉試劑的離散域來(lái)制備結(jié)合域。任選地，所述一種或多種表面可以部分限定保持樣品或樣品經(jīng)由其通過(guò)的容器(例如流動(dòng)池、孔、小池等)的一個(gè)或多個(gè)邊界。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在電極上形成各個(gè)結(jié)合域用于電化學(xué)或電化學(xué)發(fā)光測(cè)定法中。使用電化學(xué)發(fā)光在包含多個(gè)結(jié)合域的表面上對(duì)分析物的多重測(cè)量已用在MesoScaleDiagnostics,LLC,MULTI-和Imager產(chǎn)品線(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利Nos.7,842,246和6,977,722，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提述完整并入本文)。更進(jìn)一步地，檢測(cè)復(fù)合物和/或捕捉試劑可直接或間接結(jié)合于電極表面，其任選地包含如上文描述的不同的離散的結(jié)合域。電極表面可以是多孔壁和/或流動(dòng)池的組分。電極可包含電導(dǎo)材料，例如金屬如金、銀、鉑、鎳、鋼、銥、銅、鋁、允許導(dǎo)電物(conductiveallow)，等等。它們還可以包含涂布氧化物的金屬，例如氧化鋁涂布的鋁。電極可包括工作電極和對(duì)應(yīng)電極，其可從相同或不同材料制備，例如金屬對(duì)應(yīng)電極和碳工作電極。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，電極包含基于碳的材料如碳、碳黑、石墨碳、碳納米管、碳纖絲、石墨、石墨烯、碳纖維和其混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，電極包含元素碳，例如石墨、碳黑、碳納米管等。有利的是，它們可以包含導(dǎo)電性碳聚合物復(fù)合材料、分散在基質(zhì)中的導(dǎo)電顆粒(例如碳墨、碳膠、金屬墨、石墨烯墨(grapheneink))，和/或?qū)щ娦跃酆衔?。本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案是測(cè)定模塊，優(yōu)選為多孔板，其具有包含碳的電極(例如工作和/或?qū)?yīng)電極)，例如碳層和/或絲網(wǎng)印刷的碳墨層。本發(fā)明包括用于檢測(cè)和計(jì)算各個(gè)檢測(cè)復(fù)合物的方法。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，表面可包含針對(duì)存在于樣品中的一種或多種分析物的多種捕捉試劑，且多種捕捉試劑分布跨越在位于表面上的多個(gè)可解析的結(jié)合區(qū)域中。在用于實(shí)施和分析測(cè)量的條件下，“可解析的結(jié)合區(qū)域”是與單個(gè)結(jié)合事件有關(guān)的最小表面區(qū)域，其能夠被解析和與發(fā)生另外的單個(gè)結(jié)合事件的另一區(qū)域區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此，所述方法包括使一種或多種分析物分子與表面上的一種或多種捕捉試劑結(jié)合，測(cè)定分析物分子在表面上的多個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域中的存在或缺乏，并鑒定含有分析物分子的可解析結(jié)合區(qū)域的數(shù)目和/或不含分析物分子的分析物域的數(shù)目?？山馕鼋Y(jié)合區(qū)域可以全部或部分地進(jìn)行光學(xué)探詢，即每個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域可分別地光學(xué)探詢和/或包含多個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域的整個(gè)表面可以成像且可將該圖像內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)像素或像素分組圖譜定位(mapped)到各個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域。可解析結(jié)合區(qū)域還可以是多個(gè)微顆粒內(nèi)的微顆粒?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)鑒定在其光學(xué)簽名(signature)中顯示變化的可解析結(jié)合區(qū)域。根據(jù)檢測(cè)的種類(lèi)(例如熒光實(shí)體的類(lèi)型等)和操作波長(zhǎng)，可以采用設(shè)計(jì)用于特定波長(zhǎng)的光纖來(lái)進(jìn)行可解析結(jié)合區(qū)域的光學(xué)探詢。在其中使用光學(xué)探詢的實(shí)施方案中，系統(tǒng)可包含超過(guò)一種光源和/或多種光纖以調(diào)整波長(zhǎng)和/或光源的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用CCD照相機(jī)捕捉來(lái)自多個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域的光信號(hào)?？捎糜诓蹲綀D像的照相機(jī)成像系統(tǒng)的其他非限制性例子包括，電荷注入器件(CID)、互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)器件、科學(xué)CMOS(sCMOS)器件和延時(shí)探詢(timedelayintegration)(TDI)器件，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在一些實(shí)施方案中，可將與光電二極管或光電倍增管(PMT)偶聯(lián)的掃描鏡像系統(tǒng)用于成像。所述方法的測(cè)量步驟可包括對(duì)來(lái)自表面(或其部分)的光信號(hào)成像以生成由多個(gè)像素組成的圖像，其中每個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域圖譜定位至圖像中的一個(gè)或多個(gè)像素或像素組?？梢允褂帽绢I(lǐng)域認(rèn)可的方法完成圖像分析以鑒定具有指示結(jié)合事件(檢測(cè)復(fù)合物)的信號(hào)的像素或像素集合，所述方法例如存在的大量圖像分析算法和軟件以鑒定和計(jì)算熒光顯微鏡圖像中經(jīng)標(biāo)記的生物結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在過(guò)濾圖像以除去大規(guī)模信號(hào)梯度后，使用分割閾值將圖像轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制圖像。通過(guò)鑒定具有高于閾值強(qiáng)度的連續(xù)區(qū)域來(lái)發(fā)現(xiàn)可解析結(jié)合區(qū)域。如果結(jié)合域滿足大小和強(qiáng)度要求，則將其歸類(lèi)為結(jié)合事件。在一個(gè)實(shí)施方案中，可解析結(jié)合區(qū)域是陣列的元件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，陣列是微孔或納米孔的陣列，例如具有單一基底的各個(gè)凹坑或孔(individualdepressionsorwellsofaunitarysubstrate)。優(yōu)選地，孔的體積低于100nL，優(yōu)選低于50nL。在一個(gè)實(shí)施方案中，孔體積的范圍為約10aL–100pL。任選地，孔可以配置為存放微顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于基底上且在測(cè)定期間尋址的可解析結(jié)合區(qū)域的至少50％含有0或1個(gè)分析物分子。優(yōu)選地，至少80％，更優(yōu)選至少95％，且最優(yōu)選至少99％的可解析結(jié)合區(qū)域含有0或更多分析物分子。樣品中分析物分子的濃度至少部分使用校正曲線測(cè)定，泊松分布分析和/或高斯分布分析含有至少0或1個(gè)分析物分子的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，表面包含多個(gè)顆粒，其各自包含針對(duì)分析物分子的多種捕捉試劑，且多種顆粒分布跨越在多個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域(例如微孔或納米孔的陣列)。因此，所述方法包括：(i)使一種或多種分析物分子與表面上的一種或多種捕捉試劑結(jié)合，(ii)將多種顆粒分布跨越在可解析結(jié)合區(qū)域的陣列上；和(iii)測(cè)定每個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域中分析物分子的存在或缺乏，從而鑒定含有分析物分子的結(jié)合域的數(shù)目和/或不含有分析物分子的結(jié)合域的數(shù)目。使用本發(fā)明的一種或多種方法檢測(cè)在受限體積中的分析物也可以是有利的。在這些實(shí)施方案中，樣品中的分析物分子結(jié)合一對(duì)檢測(cè)試劑，其各自攜帶可區(qū)分的標(biāo)記物，且分析物在基底(例如板、皿、芯片、光纖，網(wǎng)格等)上的多個(gè)位置，例如孔或反應(yīng)容器(本文中稱(chēng)為“反應(yīng)容器”)上劃分開(kāi)，從而大多數(shù)反應(yīng)容器含有一個(gè)或更少的分析物。該方法允許使用者通過(guò)對(duì)含有附接于分析物的每種可區(qū)分標(biāo)記物的反應(yīng)容器的數(shù)目計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)分析物分子。在一些情況中，尋址(address)的多個(gè)反應(yīng)容器是可能含有至少1個(gè)分析物分子(比如與至少一個(gè)分析物分子聯(lián)合或不與任何分析物分子聯(lián)合)的反應(yīng)容器總量的一部分或基本全部。提及以下公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)：美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.20070259448；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.20070259385；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.20070259381；和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US07/019184；和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US09/005428。通過(guò)提述將這些公布內(nèi)容的每一個(gè)并入本文。至少一部分的反應(yīng)容器可以尋址且可以進(jìn)行指示含有至少一個(gè)分析物分子或顆粒的反應(yīng)容器的數(shù)目/百分比的測(cè)量。在一些情況中，基于數(shù)目/百分比，可以測(cè)定流體樣品中分析物分子濃度的量度。在實(shí)現(xiàn)受限體積中分析物分子檢測(cè)的一個(gè)具體的實(shí)施方案，可通過(guò)使分析物結(jié)合第一和第二檢測(cè)試劑以形成檢測(cè)復(fù)合物來(lái)檢測(cè)樣品中的分析物。每種檢測(cè)復(fù)合物包含分析物、第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑，且第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑分別具有第一和第二可檢測(cè)的標(biāo)記。檢測(cè)復(fù)合物可以同時(shí)、基本同時(shí)或序貫形成。檢測(cè)復(fù)合物跨多個(gè)反應(yīng)容器劃分從而使得多數(shù)反應(yīng)容器含有一個(gè)或更少的檢測(cè)復(fù)合物，且通過(guò)計(jì)算含有第一和第二可檢測(cè)的標(biāo)記的每種的反應(yīng)容器的數(shù)目來(lái)檢測(cè)分析物分子的數(shù)目。優(yōu)選地，檢測(cè)復(fù)合物跨多個(gè)反應(yīng)容器劃分，從而使得在同一容器中檢測(cè)未結(jié)合的第一檢測(cè)試劑和未結(jié)合的第二檢測(cè)試劑的可能性低于約十分之一，優(yōu)選低于約百分之一，更優(yōu)選低于約千分之一，且最優(yōu)選低于約萬(wàn)分之一。檢測(cè)復(fù)合物跨多個(gè)反應(yīng)容器劃分，即分成或分到部分中，例如通過(guò)在多個(gè)反應(yīng)容器中等分檢測(cè)復(fù)合物的部分手動(dòng)分開(kāi)，和/或通過(guò)使包含檢測(cè)復(fù)合物的溶液流過(guò)多個(gè)反應(yīng)容器，從而使得檢測(cè)復(fù)合物分到支持物上的各反應(yīng)容器中。在一個(gè)別的實(shí)施方案中，可通過(guò)以下檢測(cè)樣品中的分析物：(a)使分析物結(jié)合表面結(jié)合的捕捉試劑和第一和第二檢測(cè)試劑以形成檢測(cè)復(fù)合物，其中(i)每種檢測(cè)復(fù)合物包含捕捉試劑、分析物、第一檢測(cè)試劑和第二檢測(cè)試劑，和(ii)第一檢測(cè)試劑具有第一可檢測(cè)的標(biāo)記物且第二檢測(cè)試劑具有第二可檢測(cè)的標(biāo)記物。檢測(cè)復(fù)合物可通過(guò)以任意次序添加組分形成，例如通過(guò)同時(shí)或基本同時(shí)使組分接近到一起，或序貫添加每種組分以逐步方式建立檢測(cè)復(fù)合物。檢測(cè)復(fù)合物跨多個(gè)反應(yīng)容器劃分，從而使得多數(shù)反應(yīng)容器含有一個(gè)或更少的分析物，且通過(guò)對(duì)含有第一和第二可檢測(cè)的標(biāo)記物的反應(yīng)容器的數(shù)目計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)分析物分子的數(shù)目。該方法可在每個(gè)步驟后和檢測(cè)步驟之前有或無(wú)清洗的情況下進(jìn)行。表面可以是顆粒和任選地，多種捕捉試劑固定化于顆?；蚨鄠€(gè)顆粒上。在該實(shí)施方案中，劃分步驟可以多種方式進(jìn)行：(i)捕捉試劑固定化于多個(gè)顆粒上且通過(guò)使分析物結(jié)合捕捉試劑和將顆粒劃分到多個(gè)反應(yīng)容器中來(lái)實(shí)現(xiàn)分析物的劃分；或(ii)捕捉試劑固定化于多個(gè)顆粒上且通過(guò)將顆粒劃分到多個(gè)反應(yīng)容器中然后使分析物結(jié)合捕捉試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)分析物的劃分。多個(gè)反應(yīng)容器還可以包含分散在油包水乳液中的水滴。乳液可制備為具有直徑高達(dá)100um和體積近1nL的液滴。高負(fù)載，即乳液中超過(guò)1010個(gè)液滴，制備乳液的容易性和其在大范圍條件下的高穩(wěn)定性使得其成為區(qū)室化生物化學(xué)測(cè)定法的理想手段。每個(gè)水滴充當(dāng)獨(dú)立的反應(yīng)容器且任選地附接于顆粒的檢測(cè)復(fù)合物可以跨多個(gè)水滴劃分。或者，例如如果反應(yīng)容器是板的孔的話，表面位于反應(yīng)容器之一中，然后表面可以是板孔之一內(nèi)的域或區(qū)域。在該實(shí)施方案中，捕捉試劑可固定化于多個(gè)反應(yīng)容器的域或區(qū)域上，且劃分步驟通過(guò)使分析物分子結(jié)合捕捉試劑實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)反應(yīng)容器包含對(duì)其固定化有靶向性模塊的區(qū)域，捕捉試劑包含靶向性模塊互補(bǔ)體，且劃分步驟通過(guò)使靶向性模塊互補(bǔ)體結(jié)合位于多個(gè)反應(yīng)容器中的靶向模塊來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)另外的或替代的實(shí)施方案中，本文中描述的結(jié)合測(cè)定法還可以包含預(yù)濃縮步驟以改進(jìn)測(cè)定性能，例如通過(guò)增加樣品中分析物的濃度和/或通過(guò)降低可能存在于樣品中的可能阻礙測(cè)定性能的無(wú)關(guān)材料的濃度。這可以通過(guò)(a)使包含目的分析物的樣品與連接于結(jié)合分析物的第一結(jié)合試劑的顆粒接觸，由此形成包含結(jié)合于所述第一結(jié)合試劑的分析物的復(fù)合物；(b)收集該復(fù)合物；(c)將樣品未結(jié)合組分從復(fù)合物分開(kāi)；(d)釋放該復(fù)合物來(lái)完成。這種預(yù)濃縮方法可在本文中描述的結(jié)合測(cè)定法之前進(jìn)行以除去可能阻礙測(cè)定性能的雜質(zhì)。在此方面，提述美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)No.US2010/0261292，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提述并入本文。具體地，濃縮步驟包括使包含分析物的樣品經(jīng)受足以形成分析物復(fù)合物的條件，所述分析物復(fù)合物包括結(jié)合至第一檢測(cè)試劑的分析物，其中第一檢測(cè)試劑連接至第一核酸探針。然后，將在濃縮步驟結(jié)束時(shí)形成的分析物復(fù)合物結(jié)合到(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(ii)與第二核酸探針連接的用于分析物的第二檢測(cè)試劑；從而在表面上形成包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測(cè)試劑的復(fù)合物。使表面結(jié)合的復(fù)合物進(jìn)行需要第一和第二探針接近的延伸過(guò)程，延伸第二探針以形成包含與錨定序列互補(bǔ)的錨定序列互補(bǔ)體的延伸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，濃縮步驟進(jìn)一步包括：(i)將包含所述分析物的樣品與連接至靶向劑的固相接觸，所述靶向劑與第一核酸探針的至少一部分互補(bǔ)，從而形成濃縮復(fù)合物，所述濃縮復(fù)合物包含通過(guò)第一核酸探針和靶向劑間的結(jié)合反應(yīng)結(jié)合到固相的分析物。(ii)收集所述濃縮復(fù)合物；(iii)從所述濃縮復(fù)合物中分離樣品的未結(jié)合的組分；和(iv)釋放濃縮復(fù)合物以將固相與分析物分離以形成分析物復(fù)合物。如本文所使用的，收集是指混合物中材料的物理定位。收集包括通過(guò)結(jié)合反應(yīng)或吸附的材料的定位。例如，可以通過(guò)將材料吸附在固相上或通過(guò)將材料與固相上的結(jié)合試劑結(jié)合，在固相上收集混合物中的材料。然而，收集不限于定位在固相上，并且還可以包括本領(lǐng)域中用于將材料定位在較大流體體積內(nèi)的位置/體積處的技術(shù)，例如通過(guò)使用光學(xué)鑷子(opticaltweezers)(其使用光來(lái)操縱小至單個(gè)原子的微觀對(duì)象，其中來(lái)自聚焦激光束的輻射壓力能夠捕獲小顆粒)、電場(chǎng)或磁場(chǎng)、聚集流(focusedflow)、密度梯度離心等來(lái)定位材料。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括收集微粒或結(jié)合到微粒的材料。合適的收集方法包括實(shí)現(xiàn)從懸浮液中定位微粒的基于微粒的測(cè)定的領(lǐng)域中已知的許多方法。這些方法包括在重力下或通過(guò)離心沉淀，在過(guò)濾器或多孔膜上過(guò)濾、通過(guò)施加磁場(chǎng)定位(可磁化顆粒)、將顆粒結(jié)合或吸附到宏觀固相、使用光學(xué)鑷子等。如本文所用，釋放是指先前收集的材料的去定位(delocalization)。通過(guò)化學(xué)鍵或通過(guò)特異性或非特異性結(jié)合相互作用保持在定位位置的材料可以允許通過(guò)破壞鍵或相互作用而去定位，使得材料可擴(kuò)散或混合到周?chē)橘|(zhì)中。存在許多成熟的可裂解化學(xué)連接子，其可以用于提供可以在不需要苛刻條件的情況下裂解的共價(jià)鍵。例如，可以使用硫醇或其它還原劑裂解含二硫鍵的連接子，可以使用高碘酸鹽裂解包含順-二醇的連接子，可以通過(guò)改變pH或引入競(jìng)爭(zhēng)性配體來(lái)裂解金屬-配體相互作用(例如鎳-組氨酸)。類(lèi)似地，存在可以使用的許多成熟的可逆結(jié)合對(duì)(包括已經(jīng)在親和層析領(lǐng)域中鑒定的那些)。舉例來(lái)說(shuō)，許多抗體-配體對(duì)的結(jié)合可以通過(guò)pH的變化、添加蛋白質(zhì)變性劑或離液劑、添加競(jìng)爭(zhēng)性配體等來(lái)逆轉(zhuǎn)。其他合適的可逆結(jié)合對(duì)包括互補(bǔ)核酸序列，其雜交可以在多種條件下逆轉(zhuǎn)，包括改變pH、降低鹽濃度、增加溫度至高于所述對(duì)(pair)的解鏈溫度和/或添加核酸變性劑(例如甲酰胺)。此類(lèi)可逆結(jié)合對(duì)可以用作靶向劑(如上所述)，例如，可以將第一靶向劑連接到結(jié)合分析物的第一結(jié)合試劑，第二靶向劑可以連接到固相，且第一和第二靶向劑的結(jié)合相互作用可以用于將第一結(jié)合試劑可逆地固定化在固相上。釋放還包括通過(guò)例如混合、震蕩、渦旋、對(duì)流流體流動(dòng)、通過(guò)施加磁力、電力或光學(xué)力混合等的材料的物理去定位。在已經(jīng)收集微?；蚪Y(jié)合到微粒的材料的情況下，可以使用此類(lèi)物理方法將顆粒重懸在周?chē)|(zhì)中。釋放可以簡(jiǎn)單地與先前收集步驟(例如，通過(guò)上述任何機(jī)制)相反，或者收集和釋放可以通過(guò)兩種不同的機(jī)制進(jìn)行。在一個(gè)此類(lèi)實(shí)例中，結(jié)合到顆粒的材料(例如分析物或包含分析物的復(fù)合物)的收集可以通過(guò)顆粒的物理收集來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后通過(guò)切割鍵或逆轉(zhuǎn)將材料保持顆粒上的結(jié)合反應(yīng)來(lái)釋放材料。在第二個(gè)此類(lèi)實(shí)例中，通過(guò)與連接到表面的結(jié)合試劑的結(jié)合相互作用，將材料(例如包含分析物的復(fù)合物的分析物)收集在表面上。然后通過(guò)破壞鍵或?qū)⒔Y(jié)合試劑連接至表面的第二結(jié)合相互作用釋放材料。收集接著釋放可被用于濃縮和/或純化樣品中的分析物。通過(guò)在第一體積中收集并釋放到第二較小體積中，可以濃縮樣品中的分析物。通過(guò)濃縮，通?？梢燥@著提高后續(xù)測(cè)量步驟的靈敏度。通過(guò)從樣品中收集并除去一些或全部未收集的樣品，可以減少或消除樣品中的潛在測(cè)定干擾物。任選地，未結(jié)合的樣品的除去可以包括用液體試劑洗滌并將材料釋放到限定的液體試劑種(例如，測(cè)定或洗滌緩沖液)，以便為隨后的測(cè)定步驟提供均勻的基質(zhì)。如US2010/0261292的圖3(a)中所示，其通過(guò)引用并入本文，該方法包括將包含靶分析物的樣品與連接到第一結(jié)合試劑的顆粒接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合靶分析物，其中所述第一結(jié)合試劑連接到第一靶向劑，且所述顆粒連接到第二靶向劑，且第一結(jié)合試劑和顆粒通過(guò)所述第一和第二靶向劑之間的結(jié)合反應(yīng)連接以形成包含結(jié)合到所述第一結(jié)合試劑的靶分析物的復(fù)合物。然后收集復(fù)合物，并將從復(fù)合物分離樣品中的未結(jié)合組分。釋放復(fù)合物，并將釋放的復(fù)合物與結(jié)合到固相的第二結(jié)合試劑接觸，其中第二結(jié)合試劑結(jié)合復(fù)合物。該具體的實(shí)施方案如圖16所示。修飾顆粒(1601)以包括捕獲寡核苷酸序列，1602，其與近端探針的序列，1603，至少部分互補(bǔ)，其結(jié)合到檢測(cè)抗體1604。所述顆粒與近端探針混合以將捕獲序列與探針序列雜交以形成復(fù)合物，1605。然后復(fù)合物與包含分析物，1606，且任選地，一種或多種污染物，1607-1608的樣品混合。將分析物結(jié)合到檢測(cè)抗體(1609)并去除污染物(1610)。在合適的條件下從包括結(jié)合的分析物的復(fù)合物中除去顆粒，以形成與近端探針(1611)結(jié)合的濃縮的分析物溶液，其可如本文所述在免疫測(cè)定中使用，其中另外的近端探針結(jié)合到分析物，并將3-抗體復(fù)合物進(jìn)行RCA-PLA以檢測(cè)樣品中分析物的存在(1612)，例如，如圖2(a)和所附說(shuō)明所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)抗體和分析物之間的免疫測(cè)定復(fù)合物在溶液中形成，之后擴(kuò)增，且然后擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)捕獲試劑和/或錨定物粘附在顆粒上。任選地，可以過(guò)濾擴(kuò)增的產(chǎn)物和然后通過(guò)捕獲試劑和/或錨定物將其捕獲在顆粒上。這一方法示于圖17中。將分析物，A(1701)結(jié)合到檢測(cè)抗體(分別為1702和1703)，其每一個(gè)結(jié)合到近端探針(分別為1704和1705)和形成包含結(jié)合到每個(gè)檢測(cè)抗體的分析物的檢測(cè)復(fù)合物(1706)。將所述檢測(cè)復(fù)合物與兩個(gè)連接子序列(1707a和1707b)接觸，所述連接子序列的每一個(gè)包括與第一近端探針的非重疊區(qū)互補(bǔ)的末端序列以及與第二近端探針的非重疊區(qū)互補(bǔ)的末端序列。將所述連接子序列與第一和第二近端探針雜交，并連接(ligate)連接子寡核苷酸的末端序列以形成與第一和第二近端探針兩者雜交的環(huán)形靶序列(1708)。通過(guò)滾環(huán)雜交延伸第二近端探針以產(chǎn)生包含與錨定試劑互補(bǔ)的結(jié)合試劑的擴(kuò)增子。將所述擴(kuò)增子與包括捕獲試劑(1710)和錨定試劑(1711)的表面(1709)接觸，且通過(guò)使用多個(gè)標(biāo)記的探針(1712)標(biāo)記來(lái)測(cè)量結(jié)合到表面上的擴(kuò)增子的量。另外，本文描述的方法可用于寡聚體分析物的檢測(cè)和定量。如果靶抗原是均一寡聚體(homo-oligomer)，即具有兩個(gè)或多個(gè)相同亞基的抗原，則檢測(cè)抗體需要用連接模板寡核苷酸(ligationtemplatingoligonucleotide)和引物寡核苷酸兩者獨(dú)立地標(biāo)記。這可能導(dǎo)致低效率，因?yàn)閮H具有模板寡核苷酸的兩種抗體或僅具有引發(fā)(priming)寡核苷酸的兩種抗體可以結(jié)合，并且這種非生產(chǎn)性(nonproductive)復(fù)合物可以降低該方法的靈敏度。當(dāng)該方法應(yīng)用于特異性寡聚結(jié)構(gòu)的檢測(cè)時(shí)，這個(gè)問(wèn)題可能加劇，其中使用另外的特異性模板寡核苷酸以允許寡聚體的特異性檢測(cè)。因此，本文所述的方法可以包括一組檢測(cè)抗體的預(yù)形成，所述檢測(cè)抗體被配置為有效地結(jié)合所需的低聚物分析物以及用于形成滾環(huán)模板的模板。這可以使用另外的寡核苷酸序列，例如支架寡核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述寡核苷酸序列可以與抗體偶聯(lián)的寡核苷酸特異性雜交，使得抗體以寡聚體的形式被配制于檢測(cè)抗體混合物中，與靶抗原寡聚體配對(duì)(match)。這一預(yù)組織步驟允許檢測(cè)抗體與靶寡聚體的最佳結(jié)合。在檢測(cè)抗體與寡聚物抗原結(jié)合之后，可以通過(guò)外切核酸酶降解或另一種合適的化學(xué)方法或核酸內(nèi)切酶處理去除支架寡核苷酸。一旦除去支架寡核苷酸，可如本文所述進(jìn)行接近連接滾環(huán)擴(kuò)增測(cè)定。在另外的實(shí)施方案中，本文所述的測(cè)定形式還包括一種或多種對(duì)照測(cè)定?？梢栽诮Y(jié)合域上包括陰性對(duì)照，其包括不具有相應(yīng)檢測(cè)抗體的捕獲抗體，從而為所有樣品提供一致的背景信號(hào)。高于預(yù)設(shè)閾值的信號(hào)的測(cè)量可以指示不適當(dāng)?shù)臏y(cè)定處理或存在導(dǎo)致標(biāo)記的檢測(cè)探針的非特異性結(jié)合的樣品依賴(lài)性基質(zhì)效應(yīng)。此外，在人靶抗原(例如分泌的或胞內(nèi)蛋白質(zhì))的測(cè)定中也可以包括樣品樣本，其用于進(jìn)行多重對(duì)照功能。陽(yáng)性信號(hào)將指示存在人類(lèi)材料，因此測(cè)試樣品添加和質(zhì)量。人抗原還可以作為細(xì)菌抗原提取的過(guò)程對(duì)照。例如，可以選擇細(xì)胞內(nèi)人分析物作為樣本，其也需要裂解和提取以進(jìn)行檢測(cè)，例如Akt。低于預(yù)定閾值的信號(hào)的測(cè)量將表明沒(méi)有添加樣品，表明試劑或處理的失敗發(fā)生，或表明存在干擾擴(kuò)增或檢測(cè)的物質(zhì)。除了內(nèi)部對(duì)照外，外部陽(yáng)性和陰性對(duì)照也可以與方法和/或試劑盒一起使用。陽(yáng)性對(duì)照可包含非感染性細(xì)菌提取物的混合物，所述組合物代表通過(guò)多重組(multiplexedpanel)所檢測(cè)的所有特異性靶抗原，提供了測(cè)試時(shí)所有測(cè)定的陽(yáng)性信號(hào)。陰性對(duì)照包括不含任何靶蛋白的代表性基質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法分析的樣品的例子包括但不限于，食物樣品(包括食物提取物、食物勻漿物、飲料等)、環(huán)境樣品(例如油樣品、環(huán)境淤渣(sludges)、收集的環(huán)境浮質(zhì)(aerosol)、環(huán)境拭擦物(wipes)、水過(guò)濾物等)、工業(yè)樣品(例如起始材料、來(lái)自工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的產(chǎn)物或中間物)、人臨床樣品、獸醫(yī)樣品和其他具有生物起源的樣品?？煞治龅纳飿悠钒ǖ幌抻?，糞、粘膜拭樣(swab)、生理學(xué)樣品和/或含有細(xì)胞懸液的樣品。生物樣品的特定例子包括血液、血清、血漿、糞、粘膜拭樣、組織抽吸物、組織勻漿物、細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞培養(yǎng)上清(包括真核和原核細(xì)胞的培養(yǎng)物)、尿、唾液、痰和腦脊髓樣品?？墒褂帽景l(fā)明的方法測(cè)量的分析物包括但不限于，蛋白質(zhì)、毒素、核酸、微生物、病毒、細(xì)胞、真菌、孢子、糖類(lèi)、脂質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、多糖、藥物、激素、類(lèi)固醇、營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和上述分子的任何經(jīng)修飾的衍生物，或包含一種或多種上述分子或其組合的任意復(fù)合物。樣品中目的分析物的水平可以指示疾病或疾病狀況，或者其可以簡(jiǎn)單地指示患者是否暴露于該分析物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，感興趣的分析物是外來(lái)體，即，由大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型釋放的小膜囊泡。外來(lái)體的釋放和隨后的攝取是細(xì)胞與細(xì)胞間通信的方法并在許多生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)中具有作用。外來(lái)體已經(jīng)顯示含有多種的信號(hào)分子，包括但不限于表面結(jié)合的和胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)、mRNA和miRNA，并且已經(jīng)表明可以使用每種外來(lái)體中這些物質(zhì)的特性和濃度以推斷其細(xì)胞起源和功能。因此，患者的總外來(lái)體群體的基因組或蛋白質(zhì)組圖譜可以為各種病理狀況提供有價(jià)值的預(yù)后信息，包括癌癥、感染性疾病、腎臟和肝臟疾病，以及創(chuàng)傷性腦損傷等。通常在聚集體(aggregate)中測(cè)量外來(lái)體，其是通過(guò)從生物流體中分離大量的聚集體，破碎它們的膜，并通過(guò)常規(guī)方法，例如western印跡、PCR或測(cè)序來(lái)測(cè)定內(nèi)含物(contents)的方式測(cè)量的。然而，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于通過(guò)在表面上捕獲外來(lái)體以及隨后檢測(cè)由外來(lái)體表達(dá)的靶分子來(lái)表征外來(lái)體。已經(jīng)鑒定了在大多數(shù)外來(lái)體中共有的幾種蛋白質(zhì)，例如CD9、CD63、CD81、Hsp70、PDCD6IP、Tsg101，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，可以單個(gè)使用或組合使用這些靶標(biāo)以通過(guò)一種或多種捕獲試劑與一種或多種共有的外來(lái)體靶蛋白之間的結(jié)合相互作用來(lái)在表面上捕獲外來(lái)體。在替代的或另外的實(shí)施方案中，存在于外來(lái)體上或之中的疾病相關(guān)標(biāo)志物被用于通過(guò)一種或多種捕獲試劑和疾病相關(guān)的外來(lái)體標(biāo)志物之間的結(jié)合相互作用來(lái)在表面上捕獲外來(lái)體。然后可以使用一種或多種檢測(cè)試劑探測(cè)捕獲的外來(lái)體，所述檢測(cè)試劑針對(duì)一種或多種共有外來(lái)體蛋白質(zhì)，或存在于外來(lái)體的一些部分的表面內(nèi)或表面上的一種或多種另外的分子靶標(biāo)。當(dāng)選擇捕獲和檢測(cè)試劑的不同靶標(biāo)時(shí)，將僅檢測(cè)包含兩種靶標(biāo)的那些外來(lái)體，從而在鑒定或定量外來(lái)體亞群中具有另外的特異性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用的樣品是純化的外來(lái)體制備物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以使用一對(duì)檢測(cè)試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)特定的表型不同的外來(lái)體亞群的檢測(cè)，所述檢測(cè)試劑僅當(dāng)如本文所述的通過(guò)與接近的靶標(biāo)(proximaltargets)的結(jié)合相互作用而接近時(shí)才產(chǎn)生信號(hào)。在本實(shí)施方案中，所述接近的靶標(biāo)可以是相同分子上的不同表位，它們可以是在單個(gè)外來(lái)體內(nèi)部或結(jié)合在相同外來(lái)體膜中的接近的相同分子種類(lèi)的不同拷貝，或者它們可以是在單個(gè)外來(lái)體中或之上的不同的相互作用種類(lèi)，例如兩個(gè)相互作用的蛋白(例如四絲氨酸-整聯(lián)蛋白復(fù)合物)、蛋白受體和配體(如EFG和EGFR)，或mRNA分子和RNA結(jié)合蛋白(如Argonaute1-4或GW182)。另外，使用本文所述的方法允許分析多達(dá)三種不同的靶分子，這些靶分子可以不是功能性相連的，而是通過(guò)存在于單個(gè)外來(lái)體內(nèi)而連接?？梢匝娱L(zhǎng)在本文所述的PLA/RCA方法中使用的近端探針，以允許連接和隨后擴(kuò)增在外來(lái)體上或其中離得更遠(yuǎn)的靶分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用用于擴(kuò)增子的特異性熒光探針進(jìn)行PLA/RCA測(cè)定。此后，使用通用的熒光試劑(例如用于外來(lái)體中的RNA的吖啶橙)來(lái)標(biāo)記捕獲的外來(lái)體，并對(duì)捕獲外來(lái)體成像以確定兩種熒光標(biāo)記(fluorescentsignatures)之間的相關(guān)性。通用熒光試劑的使用允許基于尺寸和染色強(qiáng)度的從期望的外來(lái)體或其子集中選擇信號(hào)。為了探測(cè)內(nèi)部靶分子(載體蛋白、脂質(zhì)或RNA分子)，可以在捕獲之前或之后但在添加檢測(cè)試劑之前固定和通透(permeablized)外來(lái)體。如果使用本文所述的方法探尋(interrogate)經(jīng)通透的外來(lái)體，則檢測(cè)試劑的一種或兩種可以包含能夠結(jié)合特定RNA的寡核苷酸探針，使得能夠檢測(cè)mRNA、miRNA和/或蛋白質(zhì)和RNA之間的相互作用?？墒褂帽疚乃龇椒ㄊ褂没虿贿m用錨定試劑來(lái)測(cè)量外來(lái)體。如前所述，結(jié)合測(cè)定中錨定試劑的使用示于圖1(a)中，且如果分析物是外來(lái)體，則表面(101)包括捕獲試劑，如針對(duì)共有外來(lái)體的靶蛋白的捕獲試劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，表面還包括錨定試劑(103)。在一個(gè)或多個(gè)步驟中，將外來(lái)體結(jié)合到捕獲試劑和檢測(cè)試劑(104)，所述檢測(cè)試劑通過(guò)相同或不同的外來(lái)體靶蛋白也結(jié)合外來(lái)體，其中檢測(cè)試劑連接到核酸探針(105)。因此，在表面上形成的包括捕獲試劑、外來(lái)體和檢測(cè)試劑的復(fù)合物。延伸探針以形成包括結(jié)合錨定試劑的錨定區(qū)的延伸序列(107)。所述延伸序列結(jié)合到錨定試劑，并測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。同樣，示于圖1(b)中的方法也可用于外來(lái)體的檢測(cè)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)復(fù)合物可包括一種或多種檢測(cè)試劑以增強(qiáng)外來(lái)體測(cè)定的特異性，例如，如圖1(c)所示。在一個(gè)或多個(gè)步驟中，將外來(lái)體與捕獲試劑和兩個(gè)(或多個(gè))檢測(cè)試劑(分別為120和121)的每一個(gè)結(jié)合，其中所述檢測(cè)試劑結(jié)合外來(lái)體表達(dá)的靶蛋白，其中第一和第二檢測(cè)試劑中的每一個(gè)與核酸探針(122和123，分別為第一和第二核酸探針)連接。外來(lái)體可以同時(shí)或基本上同時(shí)或以序貫的，逐步的方式與捕獲和檢測(cè)試劑結(jié)合。因此，在表面上形成包括捕獲試劑、外來(lái)體以及第一和第二檢測(cè)試劑的復(fù)合物(124)。使用需要第一和第二探針彼此接近的延伸過(guò)程延伸第一探針以形成延伸序列(125)，所述延伸序列包含與錨定序列互補(bǔ)的錨定序列互補(bǔ)體。在倒數(shù)第二步中，將錨定序列與錨定序列互補(bǔ)體雜交并測(cè)量結(jié)合到表面的延伸序列的量。類(lèi)似地，可以使用示于圖2(a)-(c)每一個(gè)的方法檢測(cè)外來(lái)體。本發(fā)明的測(cè)定法可用于測(cè)定樣品中一種或多種，例如兩種或更多種分析物的濃度。如此，可測(cè)量同一樣品中兩種或更多種分析物?？稍谕粯悠分袦y(cè)量的分析物的組包括，例如與疾病狀態(tài)或生理學(xué)狀況有關(guān)的分析物或活性的測(cè)定的組。某些這類(lèi)組包括細(xì)胞因子和/或其受體(例如TNF-alpha、TNF-beta、ILl-alpha、ILl-beta、IL2、IL4、IL6、IL-10、IL-12、IFN-y等的一種或多種)，生長(zhǎng)因子和/或其受體(例如EGF、VGF、TGF、VEGF等的一種或多種)、濫用藥物，治療性藥物，維生素，病原體特異性抗體，自身抗體(例如針對(duì)Sm、RNP、SS-A、SS-alpha、J0-1和Scl-70抗原的一種或多種抗體)，過(guò)敏原特異性抗體，腫瘤標(biāo)志物(例如CEA、PSA、CA-125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CYFRA21-1、NSE、AFP等的一種或多種)，心臟病包括充血性心臟病和/或急性心肌梗塞的標(biāo)志物(例如肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、肌紅蛋白、CKMB、髓過(guò)氧物酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、β-利尿鈉蛋白(BNP)、alpha-利尿鈉蛋白質(zhì)(ANP)、內(nèi)皮縮血管肽、醛固酮、C-反應(yīng)性蛋白(CRP)等的一種或多種)，與止血有關(guān)的標(biāo)志物(例如Fibrin單體、D-二聚體、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物、凝血酶原片段1&2、抗因子X(jué)a等的一種或多種)，急性病毒性肝炎感染的標(biāo)志物(例如針對(duì)甲肝病毒的IgM抗體，針對(duì)乙肝核心抗原的IgM抗體、乙肝表面抗原、針對(duì)丙肝病毒的抗體等的一種或多種)，阿耳茨海默病的標(biāo)志物(alpha-淀粉樣蛋白、beta-淀粉樣蛋白、Aβ42、Aβ40、Aβ38、Aβ39、Aβ37、Aβ34、tau-蛋白質(zhì)等)，骨質(zhì)疏松癥的標(biāo)志物(例如交聯(lián)的NorC-端肽(telopeptide)、總脫氧吡啶諾林(deoxypyridinoline)、游離脫氧吡啶諾林、成骨素(osteocalcin)、堿性磷酸酶、I型膠原的C-末端前肽、骨特異性堿性磷酸酶等的一種或多種)，生育狀態(tài)或生育有關(guān)的病癥的標(biāo)志物(例如雌二醇、孕酮、促卵胞激素(FSH)、黃體化激素(LH)、促乳素、hCG、睪酮等的一種或多種)，甲狀腺病癥的標(biāo)志物(例如促甲狀腺激素(TSH)、總T3、游離T3、總T4、游離T4和逆T3的一種或多種)，和前列腺癌的標(biāo)志物(例如總PSA、游離PSA、復(fù)合PSA、前列腺酸磷酸酶、肌酸激酶等的一種或多種)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括測(cè)量例如與特定疾病狀態(tài)或生理學(xué)狀況有關(guān)的一種或多種，兩種或更多中，四種或更多種或10種或更多種分析物(例如在組中分組到一起的分析物，如上文列出的那些；例如可用于診斷甲狀腺病癥的組可以包括例如促甲狀腺激素(TSH)、總T3、游離T3、總T4、游離T4和逆T3的一種或多種)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組包括傳統(tǒng)樣品基質(zhì)中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物?？砂ㄔ诮M中的分析物的非限制性表包含，例如IL-17、IL-21、IL-31、Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Abeta寡聚體、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12/23p40、IL-12p70、INF-g、PSA、PSAc、Tau、磷酸-Tau、TNFa、肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、清蛋白、CHO-P、大腸桿菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、剩余蛋白(residualprotein)A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、胱天蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-beta、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、beta-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、alpha-2巨球蛋白、D-二聚體、ICAM-1、髓過(guò)氧物酶、肌紅蛋白、PAI-1、PCSK9、血纖維蛋白溶酶原、腎素/原腎素、tPA、CXCL1/GRO-alpha、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1alpha、CCL4/MIP-1beta、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-alpha、IFN-gamma、IL1alpha、IL-1beta、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL12(p70)、IL13、IL15、IL18、IL-22、IL-23、IL-33、c-MET、脂聯(lián)素(adiponectin)、FGF21、TSLP、GLP-1、生長(zhǎng)激素、IGF1、IGF2、胰島素、瘦素(leptin)、促乳素、HIVp24、HB-EGF、AKT、磷酸-AKT，及其組合。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組包含傳統(tǒng)樣品基質(zhì)中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物，且所述組包括下述人靶標(biāo)的一種或多種：G-CDF、GM-CSF、IFNgamma、IL-1beta、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12/23p40、IL12p70、IL-17A、IL21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-33、TNFalpha、TSLP、VEGF、復(fù)合PSA、游離PSA、Abeta42、Abeta40、Abeta38、tau、心肌肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、HIVp24、C-肽，和/或FGF21。另外，本文中描述的方法和試劑盒可用于免疫測(cè)定以檢測(cè)對(duì)抗微生物抗性標(biāo)志物(PBP2a/mecA(金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽(yáng)性)、TEM1(大腸桿菌，革蘭氏陰性)的單生物體敏感性。這些測(cè)定可用于在革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌兩者中的這類(lèi)分析物。測(cè)定中可包括牽涉對(duì)萬(wàn)古霉素、beta-內(nèi)酰胺、碳雜青霉烯(carbapenem)、氨基糖苷、和大環(huán)內(nèi)酯抗生素的抗微生物抗性的一種或多種以下靶蛋白；erm家族、vanA、vanB、aac(6’)-aph(2”)、KPC、NDM、OXA-48、VIM、OXA-23樣、OXA-40樣、OXA-58樣、CTX-M-1和CTX-M-9家族的ESBL基因，及其組合。另外，所述測(cè)定中可以包括一種或多種下述蛋白：50S核糖體蛋白L20、30S核糖體蛋白S7、30S核糖體蛋白S2、50S核糖體蛋白L21、50S核糖體蛋白L17、30S核糖體蛋白S4、50S核糖體蛋白L15、30S核糖體蛋白S5、50S核糖體蛋白L16、30S核糖體蛋白S3、50S核糖體蛋白L22、50S核糖體蛋白L4、核糖體蛋白L25、50S核糖體蛋白L5、30S核糖體蛋白S2、核糖體蛋白L30、L31和L32，及其組合。另外，可以單獨(dú)或與本文鑒別的一種或多種標(biāo)記物一同評(píng)價(jià)一種或多種下述靶，如延長(zhǎng)分子EF-TU、ACP、?；d體蛋白、RolL、核糖體蛋白GroS(MoB，65,000)、分子伴侶系統(tǒng)Gro-EL-Gro-ES和GapA的組分、糖酵解中的酶，及其組合。此外，本文所述的方法和試劑盒還可用于免疫測(cè)定以檢測(cè)與健康保健相關(guān)的感染(HAI生物體)，包括但不限于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、腸桿菌屬(Enterobacter)物種。每種HAI生物體的抗性標(biāo)記物提供在下表中：可以在本文所述的免疫測(cè)定中評(píng)估特定的外膜蛋白：此外，本文所述的方法和試劑盒可用于免疫測(cè)定中以檢測(cè)一種或多種以下類(lèi)別的生物標(biāo)志物：細(xì)胞因子、循環(huán)腫瘤特異性蛋白(circulatingtumor-specificproteins)、與一種或多種感染性疾病相關(guān)的蛋白、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物等，及其組合。更進(jìn)一步地，可使用本文所述的方法和試劑盒通過(guò)評(píng)估以下列出的一種或多種相關(guān)抗原的存在或不存在來(lái)鑒定以下自身免疫性疾病：在具體的實(shí)施方案中，所述組包含傳統(tǒng)樣品基質(zhì)中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物。所述組優(yōu)選地包含一種或多種以下分析物：IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌鈣蛋白T、及其組合。在具體的實(shí)施方案中，在樣品中檢出的分析物的濃度在0.01fM至100fM、0.03fM–50fM、或0.03fM–10fM的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可以基本準(zhǔn)確測(cè)定的樣品中分析物分子的濃度是低于約100fM、低于約10fM、低于約3fM、低于約1fM、低于約0.3fM、低于約0.1fM、低于約0.03fM、或更低。樣品中分析物分子的濃度可視為基本準(zhǔn)確測(cè)定的，如果測(cè)量的樣品中分析物分子的濃度在樣品分析物分子的實(shí)際濃度的約20％內(nèi)的話。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量的樣品中分析物分子的濃度可在樣品分析物分子的實(shí)際濃度的約10％，約3％或約1％內(nèi)。該測(cè)定的檢測(cè)限是產(chǎn)生高于背景信號(hào)至少2.5標(biāo)準(zhǔn)差的信號(hào)的濃度，且優(yōu)選地該測(cè)定可檢測(cè)樣品中約10-10,000個(gè)分子，或樣品中100-5,000個(gè)分子，或樣品中100-1000個(gè)分子。在一個(gè)別的實(shí)施方案中，本文描述的方法可用于檢測(cè)由于最近暴露和/或感染處于低豐度的分析物。由于現(xiàn)有技術(shù)如ELISA的檢測(cè)限(LOD)高于能指示疾病開(kāi)始的低豐度蛋白質(zhì)的循環(huán)濃度這一事實(shí)，對(duì)多種疾病或狀況的早期診斷受到限制，所述疾病或狀況例如癌癥，細(xì)菌感染，例如炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)(炭疽)，病毒感染，例如HIV、肝炎、HPV等，毒素暴露，例如蓖麻毒蛋白、肉毒桿菌毒素A、B或E等。所述組可包含傳統(tǒng)樣品基質(zhì)中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物。可納入組中的分析物的非限制性表包括，例如HIVgp41、HIVgp120、HIVgp160、HIVp24、HIVp66、HIVp51、HIVp17、HIVp31、Tat、Nef、Viv、肝炎A、B、C、D、或E抗原、HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和/或82、HPV-E6和E7蛋白、IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌鈣蛋白T、及其組合。仍進(jìn)一步地，該組還可包含一種或多種以下分析物，其由于最近疾病開(kāi)始、暴露和/或感染可能處于低豐度：Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Abeta寡聚體、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、INF-g、PSA、Tau、磷酸-Tau、TNFa、肌鈣蛋白I、心肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、清蛋白、CHO-P、大腸桿菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、剩余蛋白A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、胱天蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-beta、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、beta-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、alpha-2巨球蛋白、D-二聚體、ICAM-1、髓過(guò)氧物酶、肌紅蛋白、PAI-1、PCSK9、血纖維蛋白溶酶原、腎素/原腎素、tPA、CXCL1/GRO-alpha、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1alpha、CCL4/MIP-1beta、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-alpha、IFN-gamma、IL1alpha、IL-1beta、IL-3、IL-7、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-18、c-MET、脂聯(lián)素、FGF21、GLP-1、生長(zhǎng)激素、IGF1、IGF2、胰島素、瘦素、促乳素、HB-EGF、AKT、磷酸-AKT、及其組合。本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)為允許檢測(cè)很多種生物學(xué)和生化試劑，如上文描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可用于檢測(cè)病原性和/或潛在病原性病毒，細(xì)菌和毒素，包括在多種相關(guān)臨床和環(huán)境基質(zhì)中的生物戰(zhàn)劑(“BWA”)，包括但不限于，血液、痰、便、過(guò)濾物、拭樣等?？墒褂帽景l(fā)明方法分析(單獨(dú)或組合)的病原體和毒素的非限制性表是炭疽芽孢桿菌(炭疽)，鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)(瘟疫)，霍亂弧菌(Vibriocholerae)(霍亂)，F(xiàn)rancisellatularensis(兔熱病)，布魯氏菌菌種(布魯氏菌病(Brucellosis))，伯內(nèi)特考克斯體(Coxiellaburnetii)(Q熱病)，利斯特氏菌(listeria)，沙門(mén)氏菌(salmonella)，志賀氏菌(shigella)，V.cholera，沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)，類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapseudomallei)，屬正痘(orthopox)病毒包括天花病毒(smallpox)，病毒性腦炎，委內(nèi)瑞拉馬腦炎(Venezuelanequineencephalitis)病毒(VEE)，西方馬腦炎(westernequineencephalitis)病毒(WEE)，東方馬腦炎(easternequineencephalitis)病毒(EEE)，Alpha病毒，病毒性出血熱，沙粒病毒科(Arenaviridae)，本雅病毒科(Bunyaviridae)，絲狀病毒科(Filoviridae)，黃病毒科(Flaviviridae)，埃博拉(Ebola)病毒，葡萄球菌腸毒素，蓖麻毒蛋白，肉毒桿菌毒素(A，B，E)，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，真菌毒素，鐮孢菌(Fusarium)，Myrotecium，頭孢霉菌(Cephalosporium)，木霉菌(Trichoderma)，Verticimonosporium，葡萄穗霉菌(Stachybotrys)，鼻疽病(glanders)，小麥真菌，球形芽孢桿菌(Bacillusglobigii)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，黃雨(yellowrain)，單端孢霉烯(trichothecene)真菌毒素，鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)，黃曲霉毒素，Xenopsyllacheopis，Diamanusmontanus，類(lèi)天花(alastrim)，猴痘，沙粒病毒，漢坦病毒(Hantavirus)，拉沙熱(Lassafever)，阿根廷出血熱(Argentinehemorrhagicfevers)，玻利維亞出血熱(Bolivianhemorrhagicfevers)，里夫特裂谷熱(RiftValleyfever)病毒，克里米亞-剛果病毒，漢坦病毒，馬爾堡出血熱(Marburghemorrhagicfevers)，黃熱病毒，登革熱病毒，流感(包括人和動(dòng)物株，包括H5N1禽流感，流感A，流感A，H1特異性，流感A，H3特異性，流感A，H5特異性，流感A，2009-H1N1特異性，流感B)，RSV，人免疫缺陷病毒I和II(HIVI和II)，甲肝，乙肝，丙肝，肝炎(非甲、乙或丙肝)，腸道病毒，Epstein-Barr病毒，巨細(xì)胞病毒，單純皰疹病毒，沙眼衣原體，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)，陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonasvaginalis)，人乳頭狀瘤病毒，梅毒螺旋體(Treponemapallidum)，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia)，Borelliaburgdorferi，流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)，肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)，肺炎衣原體(Chlamydophilapneumoniae)，嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，葡萄球菌腸毒素B(SEB)，相思豆毒蛋白，志賀毒素1，志賀毒素2，卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)，釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)，艱難梭菌(Clostridiumdifficile)，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)，克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)，組A鏈球菌，大腸桿菌O157，冠狀病毒，柯薩奇(Coxsackie)A病毒，鼻病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒(RSV)，偏肺病毒(metapneumovirus)，牛痘和腺病毒。本文中描述的對(duì)結(jié)合測(cè)定法的改進(jìn)可用于擴(kuò)展結(jié)合測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍，即可通過(guò)系統(tǒng)或方法量化而不需稀釋或濃縮樣品或改變產(chǎn)生類(lèi)似結(jié)果的測(cè)定條件(例如采用的試劑濃度等)的流體樣品中分析物分子的濃度范圍，且其中可以基本準(zhǔn)確地測(cè)定分析物分子的測(cè)量濃度。流體樣品中分析物分子的濃度可視為基本準(zhǔn)確測(cè)定的，如果測(cè)量的流體樣品中分析物分子的濃度在流體樣品分析物分子的實(shí)際(例如真實(shí))濃度的約10％以內(nèi)的話。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量的流體樣品中分析物分子的濃度在實(shí)施方案中基本準(zhǔn)確地測(cè)定，其中測(cè)量的濃度在流體樣品分析物分子的實(shí)際濃度的約5％以內(nèi)，約4％以內(nèi)，約3％以內(nèi)，約2％以內(nèi)，約1％以內(nèi)，約0.5％以內(nèi)，約0.4％以內(nèi)，約0.3％以內(nèi)，約0.2％以內(nèi)，或約0.1％以內(nèi)。在一些情況中，測(cè)定的濃度亮度與真實(shí)(例如實(shí)際)濃度相差不超過(guò)約20％，不超過(guò)約15％，不超過(guò)約10％，不超過(guò)約5％，不超過(guò)約4％，不超過(guò)約3％，不超過(guò)約2％，不超過(guò)約1％，或不超過(guò)約0.5％。在一些實(shí)施方案中，可以確定測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，其通過(guò)使用選定的測(cè)定方法測(cè)定已知濃度的流體樣品中分析物分子的濃度并將測(cè)量濃度與實(shí)際濃度比較。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)或方法可以能在超過(guò)約1000(3log)、約10,000(4log)、約100,000(5log)、約350,000(5.5log)、1,000,000(6log)、約3,500,000(6.5log)、約10,000,000(7log)、約35,000,000(7.5log)、約100,000,000(8log)或更高的動(dòng)態(tài)范圍測(cè)量流體樣品中分析物分子的濃度。在一些實(shí)施方案中，可以基本準(zhǔn)確測(cè)定的流體樣品中分析物分子的濃度(例如未知濃度)為低于約5000fM(飛摩)、低于約3000fM、低于約2000fM、低于約1000fM、低于約500fM、低于約300fM、低于約200fM、低于約100fM、低于約50fM、低于約25fM、低于約10fM、低于約5fM、低于約2fM、低于約1fM、低于約500aM(attomolar)、低于約100aM、低于約10aM、低于約5aM、低于約1aM、低于約0.1aM、低于約500zM(zeptomolar)、低于約100zM、低于約10zM、低于約5zM、低于約1zM、低于約0.1zM，或更低。在一些情況中，檢測(cè)限(例如可在溶液中測(cè)定的分析物分子的最低濃度)為約100fM、約50fM、約25fM、約10fM、約5fM、約2fM、約1fM、約500aM(attomolar)、約100aM、約50aM、約10aM、約5aM、約1aM、約0.1aM、約500zM(zeptomolar)、約100zM、約50zM、約10zM、約5zM、約1zM、約0.1zM，或更低。在一些實(shí)施方案中，可以基本準(zhǔn)確測(cè)定的流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度為約5000fM至約0.1fM，約3000fM至約0.1fM，約1000fM至約0.1fM，約1000fM至約0.1zM，約100fM至約1zM，約100aM至約0.1zM，或更低。檢測(cè)上限(例如可在溶液中測(cè)定的分析物分子的上限濃度)為至少約100fM、至少約1000fM、至少約10pM(皮摩)、至少約100pM、至少約100pM、至少約10nM(納摩)、至少約100nM、至少約1000nM、至少約10uM、至少約100uM、至少約1000uM、至少約10mM、至少約100mM、至少約1000mM，或更大。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定的流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度為低于約50x10-15M、或低于約40x10-15M、或低于約30X10-15M、或低于約20x10-15M、或低于約10x10-15M，或低于約，或低于約1x10-15M。在一些實(shí)施方案中，可以基本準(zhǔn)確測(cè)定的樣品中分析物分子的濃度為低于約100fM,低于約10fM,低于約3fM,低于約1fM,低于約0.3fM,低于約0.1fM,低于約0.03fM，或更低。在一些實(shí)施方案中，可以基本準(zhǔn)確測(cè)定的樣品中分析物分子的濃度為約5000fM至約0.1fM，約3000fM至約0.1fM，約1000fM至約0.1fM，約1000fM至約1fM，約100fM至約1fM，約100fM至約0.1fM。樣品中分析物分子的濃度可視為基本準(zhǔn)確測(cè)定的，如果測(cè)量的樣品中分析物分子的濃度在樣品分析物分子的實(shí)際濃度的約20％以內(nèi)的話。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量的樣品中分析物分子的濃度在樣品分析物分子的實(shí)際濃度的約10％以內(nèi)，約3％以內(nèi)，或約1％以內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可以確定測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，其通過(guò)使用選定的測(cè)定方法測(cè)定已知濃度的樣品中分析物分子的濃度。優(yōu)選地，測(cè)定可檢測(cè)樣品中10-10,000個(gè)分子，優(yōu)選地樣品中100-5,000個(gè)分子，更優(yōu)選地樣品中100-1000個(gè)分子。相對(duì)于常規(guī)的夾心免疫測(cè)定技術(shù)，如例如使用相同捕捉抗體和兩種檢測(cè)抗體的任一以及相同標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)測(cè)量的，使用本文中描述的測(cè)定形式能將檢測(cè)信號(hào)和測(cè)定靈敏性改進(jìn)多達(dá)10倍，優(yōu)選地多達(dá)50倍，100倍，或多達(dá)1000倍。優(yōu)選地，使用本文中描述的測(cè)定形式能將檢測(cè)信號(hào)和測(cè)定靈敏性相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)夾心免疫測(cè)定法改進(jìn)多達(dá)100倍。本發(fā)明方法的一個(gè)有利的方面，尤其是當(dāng)與靈敏光學(xué)檢測(cè)技術(shù)偶聯(lián)時(shí)，是信號(hào)擴(kuò)增允許檢測(cè)單個(gè)結(jié)合事件為光的亮點(diǎn)。然后，對(duì)信號(hào)的定量可通過(guò)對(duì)個(gè)體事件計(jì)數(shù)(其可對(duì)低分析物濃度提供更好的靈敏性，通過(guò)提供改進(jìn)的從背景噪音對(duì)結(jié)合事件區(qū)分)或通過(guò)對(duì)于所有結(jié)合事件的信號(hào)整合(其可提供測(cè)量高分析物濃度的更好的動(dòng)態(tài)范圍)來(lái)實(shí)施。本發(fā)明的方法可在多種測(cè)定裝置和/或形式中使用。測(cè)定裝置可包含，例如測(cè)定模塊，如測(cè)定板、筒、多孔測(cè)定板、反應(yīng)容器、試管、小池、流動(dòng)池、測(cè)定芯片、測(cè)流裝置等，具有隨測(cè)定進(jìn)展添加的或預(yù)加載在測(cè)定模塊的孔、室或測(cè)定區(qū)域中的測(cè)定試劑(其可包含靶向性試劑或其他結(jié)合試劑)。這些裝置可采用多種測(cè)定形式用于特異性結(jié)合測(cè)定法，例如免疫測(cè)定或免疫層析測(cè)定。下文中描述了例示性的測(cè)定裝置和形式。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可采用以干態(tài)存儲(chǔ)的測(cè)定試劑且測(cè)定裝置/試劑盒可進(jìn)一步包含或與干燥劑材料一起供應(yīng)以維持測(cè)定試劑處于干態(tài)。預(yù)加載有測(cè)定試劑的測(cè)定裝置可極大地改進(jìn)速度和降低測(cè)定測(cè)量的復(fù)雜性，而在存儲(chǔ)期間保持極好的穩(wěn)定性。干燥的測(cè)定試劑可以是任何能干燥的測(cè)定試劑，然后在測(cè)定中使用之前重建。這些包括但不限于，可用于結(jié)合測(cè)定法的結(jié)合試劑，酶，酶底物，指示物染料和其他可用于檢測(cè)目的分析物的反應(yīng)性化合物。測(cè)定試劑還可以包含不直接牽涉檢測(cè)機(jī)制但在測(cè)定中起著輔助作用的物質(zhì)，包括但不限于，封閉劑，穩(wěn)定劑，去污劑，鹽，pH緩沖劑，防腐劑等。試劑可以以游離形式或在固相，包括測(cè)定模塊中區(qū)室(例如室、通道、流動(dòng)池、孔等)的表面或膠體、珠或其他微粒支持物的表面上支持而存在。本發(fā)明的方法可以與多種用于測(cè)量分析物的量，特別是測(cè)量結(jié)合于固相的分析物的量的方法一起使用?？墒褂玫募夹g(shù)包括但不限于，本領(lǐng)域中已知的技術(shù)如基于細(xì)胞培養(yǎng)的測(cè)定法，結(jié)合測(cè)定法(包括凝集測(cè)試、免疫測(cè)定、核酸雜交測(cè)定等)，酶測(cè)定法，比色測(cè)定法等。其他適宜的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是容易明顯的。一些測(cè)量技術(shù)允許通過(guò)肉眼檢查進(jìn)行測(cè)量，其他技術(shù)可能需要或受益于利用儀器來(lái)進(jìn)行測(cè)量。用于測(cè)量分析物的量的方法包括無(wú)標(biāo)記物技術(shù)，其包括但不限于i)測(cè)量在分析物結(jié)合表面后表面的質(zhì)量(mass)或折射率的變化的技術(shù)(例如表面聲波技術(shù)、表面等離振子共振傳感器、橢圓偏振(ellipsometric)技術(shù)等)，ii)質(zhì)譜技術(shù)(包括能測(cè)量表面上的分析物的技術(shù)如MALDI,SELDI等),iii)層析或電泳技術(shù)，iv)熒光技術(shù)(其可基于分析物的內(nèi)在熒光)，等等。用于測(cè)量分析物的量的方法還包括經(jīng)由對(duì)可能直接或間接(例如經(jīng)由使用分析物的經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合伴侶)附接于分析物的標(biāo)記物的檢測(cè)來(lái)測(cè)量分析物的技術(shù)。適宜的標(biāo)記物包括可直接可視化的標(biāo)記物(例如可肉眼看到的顆粒和生成可測(cè)量信號(hào)如光散射、光吸光度、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、放射性、磁場(chǎng)等的標(biāo)記物)?？墒褂玫臉?biāo)記物還包括酶或其他化學(xué)反應(yīng)性種類(lèi)，其具有產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)如光散射、吸光度、熒光等的化學(xué)活性。使用酶作為標(biāo)記物在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定也稱(chēng)為ELISA、酶免疫測(cè)定或EIA中是確定的。在ELISA形式中，未知量的抗原被附接于表面，然后特異性抗體從表面清洗通過(guò)，從而其可以結(jié)合抗原。該抗體連接于酶，且在最終步驟中添加物質(zhì)從而酶將其轉(zhuǎn)化成提供可檢測(cè)信號(hào)中變化的產(chǎn)物。產(chǎn)物的形成可以是可檢測(cè)的，例如由于在可測(cè)量特性如吸光度、熒光、化學(xué)發(fā)光、光散射等中相對(duì)于底物的差異?？膳c依照本發(fā)明的固相結(jié)合方法一起使用的某些(但并非所有)測(cè)量方法可能受益于或需要清洗步驟以從固相除去未結(jié)合的組分(例如標(biāo)記物)。因此，本發(fā)明的方法可包含這類(lèi)清洗步驟。在采用一對(duì)可檢測(cè)的標(biāo)記物的那些實(shí)施方案中，基于當(dāng)一對(duì)標(biāo)記物彼此接近，即各自直接或間接結(jié)合檢測(cè)復(fù)合物中的目的分析物時(shí)其可被獨(dú)立檢測(cè)的能力和/或那些物質(zhì)協(xié)同工作以生成可檢測(cè)信號(hào)的能力來(lái)選擇那些經(jīng)標(biāo)記的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一可檢測(cè)的標(biāo)記物是偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的第一酶且第二可檢測(cè)的標(biāo)記是偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的第二酶，且該方法進(jìn)一步包括添加該反應(yīng)系統(tǒng)的一種或多種底物的步驟，由此產(chǎn)生酶反應(yīng)系統(tǒng)的可檢測(cè)產(chǎn)物。包含可檢測(cè)產(chǎn)物的那些反應(yīng)容器可與不包含的那些反應(yīng)容器區(qū)分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅當(dāng)?shù)谝幻负偷诙附咏?例如低于200nm，理想地低于50nm)時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一酶是氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，第二酶是過(guò)氧化物酶，且底物包含氧化酶底物例如葡萄糖，和經(jīng)標(biāo)記的酪胺(tyramide)、AmplexRed(10-乙酰-3,7-二羥基吩噁嗪(dihydroxyphenoxazine))、或魯米諾衍生物(本文中統(tǒng)稱(chēng)為經(jīng)標(biāo)記的反應(yīng)性衍生物且在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)標(biāo)記的反應(yīng)性衍生物包含AmplexRed或魯米諾)。在該實(shí)施方案中，第一酶與底物反應(yīng)以生成產(chǎn)物，其與第二酶反應(yīng)以生成第二產(chǎn)物，該第二產(chǎn)物與經(jīng)標(biāo)記的反應(yīng)性衍生物反應(yīng)以生成可檢測(cè)的種類(lèi)。優(yōu)選地，由檢測(cè)復(fù)合物中第一和第二酶催化的反應(yīng)導(dǎo)致經(jīng)標(biāo)記的反應(yīng)性衍生物在表面上的固定化，可對(duì)此測(cè)量來(lái)測(cè)定表面上存在的分析物分子的數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)標(biāo)記的反應(yīng)性衍生物是生物素-酪胺，其該方法進(jìn)一步包括添加經(jīng)標(biāo)記的鏈霉親合素和測(cè)量鏈霉親合素上的標(biāo)記物?？捎糜谒龇椒ǖ挠忠粋€(gè)近端依賴(lài)性標(biāo)記系統(tǒng)是FRET對(duì)，例如第一可檢測(cè)的標(biāo)記物是FRET供體而可檢測(cè)的標(biāo)記物是FRET接受體。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是兩種染料分子的電子激發(fā)態(tài)之間的距離依賴(lài)性相互作用，其中激發(fā)從供體分子轉(zhuǎn)移至接受體分子而不發(fā)射光子。FRET的效率依賴(lài)于分子間間隔的倒數(shù)六次方，使得在與生物大分子尺寸可比的距離中可用。在該標(biāo)記系統(tǒng)中，近端依賴(lài)性信號(hào)通過(guò)激發(fā)FRET供體和測(cè)量從FRET接受體的發(fā)射來(lái)測(cè)量。供體和接受體分子優(yōu)選緊密接近的，例如約10-100埃，接受體的吸收光譜優(yōu)選與供體的熒光發(fā)射光譜重疊，且供體和接受體躍遷偶極(transitiondipole)取向應(yīng)大致平行。FRET對(duì)的非限制性表在下表1中提供。表1.FRET對(duì)例子對(duì)于光顯微術(shù)有多種FRET檢測(cè)方法，例如接受體光漂白、供體光漂白、比率成像、敏化發(fā)射和熒光壽命測(cè)量。可用在采用一對(duì)檢測(cè)標(biāo)記物的實(shí)施方案中的另一個(gè)適宜的標(biāo)記系統(tǒng)是其中可以獨(dú)立測(cè)量第一和第二可檢測(cè)的標(biāo)記物的系統(tǒng)。例如，第一和第二可檢測(cè)的標(biāo)記物可以是發(fā)光標(biāo)記物，其彼此的光譜特性不同。或者，第一可檢測(cè)的標(biāo)記物是與第一底物反應(yīng)以產(chǎn)生第一信號(hào)的第一酶，而第二可檢測(cè)的標(biāo)記物是與第二底物反應(yīng)以產(chǎn)生不同的第二信號(hào)的第二酶，且該方法還包括添加第一酶底物和第二酶底物，并計(jì)算其中生成第一和第二信號(hào)的反應(yīng)容器的數(shù)目。第一和第二信號(hào)可以是光吸光度中的變化和/或具有不同光譜特性的發(fā)光信號(hào)。如果第一和第二可檢測(cè)的標(biāo)記物包含第一和第二酶，則它們各自可為水解酶，例如磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶或其組合，且因此，第一和第二底物選自磷酸、硫酸、半乳糖苷和葡糖苷酸修飾的穩(wěn)定化的二氧雜環(huán)丁烷、4-甲基傘形基、熒光素或其組合?；蛘?，第一和第二酶選自辣根過(guò)氧化物酶、beta-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶?；蛘撸糜跈z測(cè)分析物分子的標(biāo)記物可以是可用于單分子熒光檢測(cè)，例如熒光相關(guān)光譜和/或熒光交互相關(guān)光譜中的熒光種類(lèi)。單分子熒光檢測(cè)包括使包含可檢測(cè)的種類(lèi)的洗脫物流過(guò)毛細(xì)管，將光源聚焦在毛細(xì)管內(nèi)的某體積上以創(chuàng)建探詢帶，并用光檢測(cè)器觀察探詢帶以檢測(cè)熒光分子經(jīng)由探詢帶的通過(guò)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用基于電化學(xué)發(fā)光的測(cè)定形式來(lái)測(cè)量樣品中的一種或多種目的分析物，例如基于電化學(xué)發(fā)光(ECL)的免疫測(cè)定法。ECL的高靈敏性、較廣的動(dòng)態(tài)范圍和選擇性是用于醫(yī)學(xué)診斷的重要因素。商品化的ECL儀器已顯示出優(yōu)越的性能，且由于其極好的靈敏性、動(dòng)態(tài)范圍、精度和對(duì)復(fù)合物樣品基質(zhì)的容忍性其已被廣泛使用。可誘導(dǎo)以發(fā)出ECL的種類(lèi)(ECL活性種類(lèi))已被用作ECL標(biāo)記物，例如i)有機(jī)金屬化合物，其中金屬來(lái)自例如組VIII的貴金屬，包括含Ru和含Os有機(jī)金屬化合物如三-聯(lián)吡啶-釕(RuBpy)模塊和ii)魯米諾和相關(guān)化合物。在ECL過(guò)程中參與ECL標(biāo)記物的種類(lèi)在本文中稱(chēng)為ECL共反應(yīng)物。常見(jiàn)使用的共反應(yīng)物包括對(duì)于來(lái)自RuBpy的ECL為叔胺(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,846,485)、草酸鹽和過(guò)硫酸鹽，對(duì)于來(lái)自魯米諾的ECL為過(guò)氧化氫(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,240,863)。通過(guò)ECL標(biāo)記物生成的光可用作診斷規(guī)程中的報(bào)告信號(hào)(Bard等,美國(guó)專(zhuān)利No.5,238,808，通過(guò)提述并入本文)。例如，ECL標(biāo)記物可以共價(jià)偶聯(lián)于結(jié)合劑如抗體、核酸探針、受體或配體；可以通過(guò)測(cè)量從ECL標(biāo)記物發(fā)出的ECL來(lái)監(jiān)測(cè)結(jié)合相互作用中結(jié)合試劑的參與。或者，來(lái)自ECL活性化合物的ECL信號(hào)可以指示化學(xué)環(huán)境(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,641,623，其描述了監(jiān)測(cè)ECL共反應(yīng)物的形成或破壞的ECL測(cè)定)。對(duì)于ECL、ECL標(biāo)記物、ECL測(cè)定法和用于進(jìn)行ECL測(cè)定法的儀器的更多背景，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,093,268；5,147,806；5,324,457；5,591,581；5,597,910；5,641,623；5,643,713；5,679,519；5,705,402；5,846,485；5,866,434；5,786,141；5,731,147；6,066,448；6,136,268；5,776,672；5,308,754；5,240,863；6,207,369；6,214,552和5,589,136和公開(kāi)的PCTNos.WO99/63347；WO00/03233；WO99/58962；WO99/32662；WO99/14599；WO98/12539；WO97/36931和WO98/57154，所有均通過(guò)提述并入本文。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于單路或其中在單一樣品中進(jìn)行多種測(cè)定測(cè)量的多重形式。可用于本發(fā)明的多重測(cè)量包括但不限于，以下多重測(cè)量i)牽涉多個(gè)傳感器的使用；ii)使用基于表面上位置可區(qū)分的表面(例如陣列)上的離散測(cè)定域；iii)牽涉使用在顆粒上包被的試劑，所述顆?；陬w粒特性如大小、形狀和顏色等可區(qū)分；iv)產(chǎn)生基于光學(xué)特性(例如吸光度或發(fā)射光譜)可區(qū)分的測(cè)定信號(hào)或v)基于測(cè)定信號(hào)的時(shí)間特性(例如信號(hào)的時(shí)間、頻率或相位)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)樣品中分析物分子濃度的量度可至少部分通過(guò)比較測(cè)量的參數(shù)與校正標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定。例如，包含分析物分子的結(jié)合表面的分?jǐn)?shù)可與校正曲線比較以測(cè)定樣品中分析物分子濃度的量度。校正曲線可通過(guò)在用于分析測(cè)試樣品的條件下完成對(duì)多個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)化樣品的測(cè)定來(lái)產(chǎn)生。對(duì)于每份標(biāo)準(zhǔn)化樣品可對(duì)與分析物分子的檢測(cè)/定量有關(guān)的信號(hào)取讀數(shù)，因此允許形成將分析物分子的檢測(cè)與已知濃度的分析物分子相關(guān)的校正曲線。然后，測(cè)定可以在包含未知濃度的分析物分子的樣品上完成，并將來(lái)自該測(cè)定的分析物分子的檢測(cè)繪制在校正曲線上，因此測(cè)定對(duì)樣品中分析物分子濃度的量度。在使用成像技術(shù)以測(cè)量光信號(hào)(如熒光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光)的一個(gè)具體情況中，結(jié)合事件可檢測(cè)為光的亮點(diǎn)源。當(dāng)點(diǎn)源的表面密度較低時(shí)(例如當(dāng)在RxR(其中R是檢測(cè)系統(tǒng)的空間分辨率)區(qū)域發(fā)現(xiàn)點(diǎn)源的概率低于10％時(shí))，可能任何觀察到的點(diǎn)源是由于單一結(jié)合事件。在這些條件下，對(duì)事件計(jì)數(shù)可以提供最靈敏的測(cè)量。當(dāng)表面密度增加時(shí)，解析和計(jì)數(shù)各個(gè)結(jié)合事件變得逐漸困難的。在這些條件下，整合結(jié)合表面上的光信號(hào)提供更準(zhǔn)確的測(cè)量。對(duì)于熟練技術(shù)人員而言明顯的是本文中描述的方法可應(yīng)用到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量免疫測(cè)定平臺(tái)?？梢哉{(diào)整免疫測(cè)定平臺(tái)的多個(gè)特征以適合具體的平臺(tái)，但那些調(diào)整是完全在普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。例如，本文中描述的方法可應(yīng)用于使用編碼顆粒的基于珠的形式。在這類(lèi)系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性或非磁性的，且珠的表面經(jīng)修飾以包含捕捉試劑的一個(gè)或多個(gè)拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測(cè)試劑是一對(duì)檢測(cè)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種檢測(cè)試劑包含可區(qū)分的熒光標(biāo)記物?；蛘撸瑑煞N檢測(cè)試劑用核酸探針修飾，如本文描述的，在該情況下，免疫測(cè)定方法包括延伸過(guò)程例如RCA-PLA以生成擴(kuò)增的產(chǎn)物，其指示可檢測(cè)的每種檢測(cè)試劑的存在。如果檢測(cè)試劑包含兩種可區(qū)分的熒光標(biāo)記物，那么測(cè)量步驟包括將珠引入流動(dòng)池，且如果珠是磁性的，就在流動(dòng)池中捕捉珠。如果檢測(cè)試劑用核酸探針修飾，則測(cè)量步驟包括在珠上形成夾心復(fù)合物，實(shí)施RCA-PLA和用熒光標(biāo)記的檢測(cè)探針標(biāo)記擴(kuò)增子。然后，將經(jīng)標(biāo)記的珠引入流動(dòng)池中且如果珠是磁性的，就在流動(dòng)池中捕捉珠。在每個(gè)實(shí)施方案中，可以基于對(duì)熒光標(biāo)記的編碼珠的鑒定來(lái)光譜多重化測(cè)定。可以使用激發(fā)光源和用于多色檢測(cè)的發(fā)射光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)每個(gè)實(shí)施方案中的結(jié)合事件，通過(guò)對(duì)具有兩種可檢測(cè)的標(biāo)記的珠或包含可檢測(cè)的經(jīng)標(biāo)記延伸產(chǎn)物的那些珠計(jì)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，且定量還通過(guò)整合的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)對(duì)所有結(jié)合事件整合信號(hào)檢測(cè)。因此，可以提供用于上文所述方法的試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁性或非磁性珠；(b)具有可區(qū)分熒光標(biāo)記物的兩種檢測(cè)試劑；和(c)任選的緩沖劑和/或稀釋劑用于測(cè)定方案?？捎糜谏衔乃龇椒ǖ牧硪辉噭┖锌稍谝粋€(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁性或非磁性珠；(b)用核酸探針修飾的兩種檢測(cè)試劑(任選地，分別提供檢測(cè)試劑且另外提供近端探針(1和2)，具有用探針修飾檢測(cè)試劑的用法說(shuō)明)；和(c)熒光標(biāo)記的探針；任選的用近端探針修飾檢測(cè)試劑所需的試劑；測(cè)定稀釋劑、校正物、環(huán)化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩沖液、ATP、BSA、Tween20、T4DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA、緩沖液、dNTP、Tween20、Phi29DNA聚合酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文中描述的方法可用于流動(dòng)池分析的基于珠的惡性是。在這類(lèi)系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性的且珠表面經(jīng)修飾以包含捕捉試劑的一個(gè)或多個(gè)拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測(cè)試劑是一對(duì)用核酸探針修飾的檢測(cè)試劑，如本文描述的，在該情況下，免疫測(cè)定方法包括延伸過(guò)程例如RCA-PLA以生成擴(kuò)增的產(chǎn)物，其指示可檢測(cè)的每種檢測(cè)試劑的存在。測(cè)量步驟包括在珠上形成夾心復(fù)合物，實(shí)施RCA-PLA和用ECL-標(biāo)記的檢測(cè)探針標(biāo)記擴(kuò)增子。然后，將經(jīng)標(biāo)記的珠引入流動(dòng)池中且在流動(dòng)池中捕捉珠。具體地，應(yīng)用磁場(chǎng)以將磁性顆粒例如珠吸引至電極表面，其可包含多種金屬例如鉑。使用電壓源來(lái)對(duì)電極應(yīng)用電壓且可以使用發(fā)射光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)結(jié)合事件；通過(guò)對(duì)具有可檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的延伸產(chǎn)物的珠計(jì)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，且定量還通過(guò)整合的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)對(duì)所有結(jié)合事件整合信號(hào)檢測(cè)。可用于上文所述方法的試劑盒在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中可包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁珠；(b)用核酸探針修飾的兩種檢測(cè)試劑(任選地，分別提供檢測(cè)試劑且另外提供近端探針(1和2)，具有用探針修飾檢測(cè)試劑的用法說(shuō)明)；和(c)ECL標(biāo)記的探針；任選的用近端探針修飾檢測(cè)試劑所需的試劑；測(cè)定稀釋劑、校正物、環(huán)化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩沖液、ATP、BSA、Tween20、T4DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA、緩沖液、dNTP、Tween20、Phi29DNA聚合酶。在流動(dòng)池分析的基于珠的形式的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將樣品與分析物特異性的生物素化單克隆捕捉抗體和分析物特異性單克隆抗體的混合物溫育，所述單克隆抗體各自綴合寡核苷酸，其反應(yīng)以形成夾心復(fù)合物。在添加用鏈霉親合素包被的微顆粒后，復(fù)合物經(jīng)由生物素和鏈霉親合素之間的相互作用變成結(jié)合固相。對(duì)該混合物添加連接混合物，并將該混合物與連接混合物溫育，清洗以除去過(guò)量的環(huán)狀寡核苷酸，并與RCA混合物溫育。清洗混合物并加入生物素-經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)探針的混合物。為了摻入適宜的標(biāo)記物例如發(fā)光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，例如SULFO-TAG，合成具有末端生物素標(biāo)記物的檢測(cè)探針并與用SULFO-TAG標(biāo)記的鏈霉親合素預(yù)結(jié)合。將反應(yīng)混合物抽吸到測(cè)量孔，該處微顆粒被磁性捕捉到電極例如金屬電極(如鉑電極)的表面上。然后用適宜的清洗緩沖液例如ProCell(含TPA的緩沖液)除去未結(jié)合的物質(zhì)。然后對(duì)電極應(yīng)用電壓誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光發(fā)射，對(duì)此通過(guò)光電倍增管測(cè)量。電壓施用和所得發(fā)射的測(cè)量可在任何適宜的流動(dòng)池例如Cobas和/或Elecsys儀器(可獲自Hoffmann-LaRocheLTD.)中完成。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的方法可應(yīng)用于基于珠的形式，伴有毛細(xì)管流動(dòng)以對(duì)個(gè)體分子數(shù)字計(jì)數(shù)。在這類(lèi)系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性的且珠的表面修飾為包含捕捉試劑的一個(gè)或多個(gè)拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測(cè)試劑是一對(duì)包含可區(qū)分的熒光標(biāo)記物的檢測(cè)試劑。測(cè)量步驟包括形成包含捕捉試劑、分析物和檢測(cè)試劑的夾心復(fù)合物，交聯(lián)檢測(cè)試劑，洗脫檢測(cè)試劑并將珠引入流動(dòng)池中?？梢允褂眉ぐl(fā)光源和用于多色檢測(cè)的發(fā)射光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)結(jié)合事件，通過(guò)關(guān)聯(lián)流動(dòng)池中兩種熒光團(tuán)的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，且定量還通過(guò)整合的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)對(duì)所有結(jié)合事件整合信號(hào)檢測(cè)。可用于上文所述方法的試劑盒可在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁珠；(b)具有可區(qū)分的熒光標(biāo)記物的兩種可交聯(lián)檢測(cè)試劑；和(c)任選的緩沖劑和/或稀釋劑用于測(cè)定方案。而且，本文描述的方法可應(yīng)用于基于珠的形式，其包含將珠分到各個(gè)納米孔中。在這類(lèi)系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性的且珠的表面修飾為包含捕捉試劑的一個(gè)或多個(gè)拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測(cè)試劑是一對(duì)包含可區(qū)分的酶標(biāo)記物的檢測(cè)試劑。測(cè)量步驟包括形成包含捕捉試劑、分析物和檢測(cè)試劑的夾心復(fù)合物，和添加兩種酶標(biāo)記物的底物。然后在各個(gè)納米孔中捕捉珠。基于具有不同光譜特性的酶產(chǎn)物的鑒定，測(cè)定可以是光譜多重化的?？梢允褂眉ぐl(fā)光源和用于多色檢測(cè)的發(fā)射光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)結(jié)合事件，通過(guò)對(duì)具有兩種酶產(chǎn)物的納米孔計(jì)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，且定量還通過(guò)整合的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)對(duì)所有納米孔整合信號(hào)檢測(cè)?？捎糜谏衔乃龇椒ǖ脑噭┖锌稍谝粋€(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁珠；(b)各用可區(qū)分的酶標(biāo)記物修飾的兩種檢測(cè)試劑，例如生物素化的檢測(cè)試劑和用半抗原綴合的檢測(cè)試劑；(c)鏈霉親合素-beta半乳糖苷酶，用抗-半抗原綴合的酶，試鹵靈(resorufin)-beta-d-半乳吡喃糖苷(galactopyranoside)；(d)陣列，例如QuanterixDVD形式陣列；(e)氟碳油；和(f)任選的緩沖劑和/或稀釋劑用于測(cè)定方案。在這種具體的實(shí)施方案中，通過(guò)將納米孔高靈敏性系統(tǒng)與基于近端的檢測(cè)系統(tǒng)組合使用來(lái)增強(qiáng)可檢測(cè)的信號(hào)。盡管使用具體的基于近端的檢測(cè)系統(tǒng)例示了這一具體的實(shí)施方案，但熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)也可以使用本文描述的其他基于近端的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)測(cè)定中的可檢測(cè)的信號(hào)這一事實(shí)，例如FRET供體/接受體系統(tǒng)；就光譜特性而言彼此不同的發(fā)光標(biāo)記物；或使用如上文描述的為水解酶的第一和第二酶，和適宜的伴隨底物。仍進(jìn)一步地，本文描述的方法可應(yīng)用于基于珠-陣列的平臺(tái)。在這類(lèi)系統(tǒng)中，使用的珠可以是非磁性的且珠的表面修飾為包含捕捉試劑的一個(gè)或多個(gè)拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測(cè)試劑是包含第一和第二核酸探針的一對(duì)檢測(cè)試劑。測(cè)量步驟包括形成包含捕捉試劑、分析物和檢測(cè)試劑的夾心復(fù)合物，延伸一種探針以形成延伸序列，其中該延伸依賴(lài)于第一和第二探針在夾心復(fù)合物中的共定位，用熒光探針標(biāo)記延伸序列，并從表面釋放延伸序列至洗脫物中?？梢允褂眉ぐl(fā)光源和用于多色檢測(cè)的發(fā)射光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)結(jié)合事件，通過(guò)對(duì)可檢測(cè)標(biāo)記的個(gè)體延伸產(chǎn)物計(jì)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，且定量還通過(guò)整合的強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)對(duì)所有結(jié)合事件整合信號(hào)檢測(cè)?？捎糜谏衔乃龇椒ǖ脑噭┖锌稍谝粋€(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的非磁性珠；(b)用核酸探針修飾的兩種檢測(cè)試劑(任選地，分別提供檢測(cè)試劑且另外提供近端探針(1和2)，具有用探針修飾檢測(cè)試劑的用法說(shuō)明)；和(c)熒光標(biāo)記的探針；任選的用近端探針修飾檢測(cè)試劑所需的試劑；測(cè)定稀釋劑、校正物、環(huán)化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩沖液、ATP,BSA,Tween20,T4DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA,緩沖液,dNTP,Tween20,Phi29DNA聚合酶。本文描述的改進(jìn)的結(jié)合測(cè)定法可使用包含測(cè)定法中采用的一組組分的一種或多種試劑盒實(shí)施。例如，在檢測(cè)樣品中分析物中使用的試劑盒在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含，包含針對(duì)分析物的捕捉試劑和錨定試劑的表面；針對(duì)分析物的檢測(cè)試劑，其連接于核酸探針。這類(lèi)試劑盒可包含錨定試劑，其包含錨定寡核苷酸序列。可用于實(shí)施本文描述的方法的另一種試劑盒在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含，表面，其包含針對(duì)分析物的捕捉試劑和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；第一檢測(cè)試劑，其連接于第一核酸探針；和第二檢測(cè)試劑，其連接于第二核酸探針?？捎糜趯?shí)施本文描述的結(jié)合測(cè)定法的再一種試劑盒在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含，包含針對(duì)分析物的捕捉試劑和錨定試劑的表面；針對(duì)分析物的第一檢測(cè)試劑，其包含第一近端探針；針對(duì)分析物的第二檢測(cè)試劑，其包含第二近端探針；和連接體序列，其包含(i)互補(bǔ)于第二近端探針的內(nèi)部序列，和(ii)互補(bǔ)于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的兩個(gè)端序列。或者，試劑盒可改為包含，包含針對(duì)分析物的捕捉試劑和錨定試劑的表面；針對(duì)分析物的第一檢測(cè)試劑，其包含第一近端探針；針對(duì)分析物的第二檢測(cè)試劑，其包含第二近端探針；和(i)第一連接寡核苷酸，和(ii)第二連接寡核苷酸，其中(x)第一連接體的第一端和第二連接體的第一端互補(bǔ)于第一近端探針的兩個(gè)非重疊性區(qū)域，和(y)第一連接體的第二端和第二連接體的第二端互補(bǔ)于第一近端探針的兩個(gè)非重疊性區(qū)域。另外，在這些試劑盒的任一或兩者中的錨定試劑可包含錨定寡核苷酸序列。而且，本文描述的方法可使用以下試劑盒實(shí)施，其在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含，包含第一可檢測(cè)的標(biāo)記的第一檢測(cè)試劑；包含第二可檢測(cè)的標(biāo)記的第二檢測(cè)試劑；配置為含有一個(gè)或更少的分析物分子的多個(gè)反應(yīng)容器；和任選地，包含捕捉試劑的表面。最后，用于使用本文描述的方法檢測(cè)分析物的試劑盒可在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含，表面，其包含固定化的捕捉試劑；包含第一可檢測(cè)的標(biāo)記的第一檢測(cè)試劑；包含第二可檢測(cè)的標(biāo)記的第二檢測(cè)試劑；和與第一和第二檢測(cè)試劑反應(yīng)性的交聯(lián)劑。交聯(lián)劑可包括多功能交聯(lián)劑，其連接附接于檢測(cè)試劑的反應(yīng)性模塊或附接于檢測(cè)試劑的結(jié)合模塊的多價(jià)結(jié)合伴侶。適宜的多功能交聯(lián)劑包括但不限于，胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來(lái)酰亞胺、點(diǎn)擊化學(xué)試劑及其組合。類(lèi)似地，多價(jià)結(jié)合伴侶的例子是多價(jià)抗物種抗體，其靶向作為該動(dòng)物物種的抗體的檢測(cè)試劑。當(dāng)與附接于檢測(cè)試劑的伴侶結(jié)合配偶成對(duì)時(shí)，交聯(lián)劑還可包括鏈霉親合素、親合素或生物素。交聯(lián)劑還可以是寡核苷酸，其包含與直接或間接結(jié)合試劑盒組分的核酸探針互補(bǔ)的序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文描述的方法中使用的試劑盒在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含，表面，其包含固定化的捕捉試劑；具有第一可檢測(cè)的標(biāo)記和第一核酸探針的第一檢測(cè)試劑，和；具有第二可檢測(cè)的標(biāo)記和第二核酸探針的第二檢測(cè)試劑；和具有互補(bǔ)于第一和第二核酸探針的區(qū)域的第三核酸。本文描述的試劑盒的表面可包含針對(duì)一種或多種分析物分子的多種捕捉試劑，其中所述捕捉試劑在位于表面上的多個(gè)可解析結(jié)合區(qū)域或反應(yīng)容器上分配，例如在陣列中、多孔板中或微孔或納米孔板中。另外，表面還可以包含多個(gè)顆粒，其各自包含針對(duì)分析物分子的多種捕捉試劑。上文描述的試劑盒可進(jìn)一步包含一種或多種以下物質(zhì)：一種或多種另外的試劑、緩沖液、聚合酶、連接酶、和/或dNTP(經(jīng)標(biāo)記或未經(jīng)標(biāo)記的)。另外，如果一種或多種檢測(cè)試劑包含可檢測(cè)的標(biāo)記，則試劑盒還可包含試劑盒中采用的可檢測(cè)的標(biāo)記的共反應(yīng)物?；蛘?，如果一種或多種檢測(cè)試劑是偶聯(lián)的酶反應(yīng)系統(tǒng)的組分時(shí)，則每種檢測(cè)試劑包含第一和第二酶且試劑盒還在一個(gè)或多個(gè)管形瓶、容器或區(qū)室中包含，偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的一種或多種底物，和任選地，配置為結(jié)合偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)的產(chǎn)物的經(jīng)標(biāo)記組分。例如，第一酶可以是氧化酶，第二酶是過(guò)氧化物酶，且試劑盒還包含氧化酶底物和經(jīng)標(biāo)記的酪胺衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二可檢測(cè)的試劑可包含近端依賴(lài)性檢測(cè)系統(tǒng)的組分，例如FRET供體和FRET接受體，或彼此就光譜特性而言不同的發(fā)光標(biāo)記物。其他的備選實(shí)施方案圖7中例示了一個(gè)另外的實(shí)施方案。小圖(a)中夾心免疫測(cè)定復(fù)合物中每個(gè)近端探針的一部分被雜交于各區(qū)段的RNA短鏈暫時(shí)保護(hù)。酶法除去RNA鏈從而使得每個(gè)近端探針可彼此雜交且使用生物素化的dNTP通過(guò)聚合酶延伸來(lái)延伸鏈(小圖(b))。摻入鏈中的每個(gè)生物素化的堿基結(jié)合于用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記的鏈霉親合素(小圖(c))。另一種方法在圖8中例示。近端探針可附接于錨定試劑和檢測(cè)試劑(如小圖(a)中顯示)或每種近端探針可附接于兩種檢測(cè)試劑，如上文描述的(未顯示)。與圖7中例示的方法大部分類(lèi)似，每個(gè)近端探針的一部分被雜交于各區(qū)段的RNA短鏈暫時(shí)保護(hù)。酶法除去RNA鏈從而使得每個(gè)近端探針可彼此雜交且使用生物素化的dNTP通過(guò)聚合酶延伸來(lái)延伸鏈(小圖(b))。摻入鏈中的每個(gè)生物素化的堿基結(jié)合于用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記的鏈霉親合素(小圖(c))。另外的實(shí)施方案在圖18中示出。在該實(shí)施方案中，使用多種短寡核苷酸作為U形序列(staplesequences)(1801)與擴(kuò)增子的一部分雜交，并從而將產(chǎn)物折疊成易于成像的緊湊結(jié)構(gòu)。每個(gè)U形序列包含至少兩個(gè)序列(分別為1802和1803)，其每一個(gè)與擴(kuò)增子的序列互補(bǔ)，且當(dāng)每個(gè)U形序列與其互補(bǔ)體雜交時(shí)，所述擴(kuò)增子如圖18所示被折疊回自身上。另外，擴(kuò)增子也可以通過(guò)與如上所述的錨定試劑(1804)的錨定相互作用而粘附到表面。通過(guò)在擴(kuò)增步驟期間將U形序列添加到反應(yīng)混合物中，可以原位(insitu)進(jìn)行裝訂(stapling)過(guò)程。因此，隨著每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的完成，U形序列自由地與新形成的擴(kuò)增子雜交并使其折疊。也可以在擴(kuò)增過(guò)程完成之后添加U形序列，使得線性擴(kuò)增子折疊成線圈或平片，這取決于U型序列及其相應(yīng)的互補(bǔ)體的設(shè)計(jì)。標(biāo)記分子，例如ECL或熒光，可以摻入到U型序列中(或者其可以如上所述并入到擴(kuò)增子中)。該實(shí)施方案將在表面上產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生更高信號(hào)密度的更小特征，其允許表面上擴(kuò)增子的更為容易地成像。實(shí)施例實(shí)施例1：用于近端連接和滾環(huán)擴(kuò)增的一般方案通過(guò)如下添加近端探針1和2修飾針對(duì)靶分析物的一對(duì)檢測(cè)抗體：對(duì)100uL緩沖液中的200ug第一檢測(cè)抗體，添加在150mM磷酸鹽緩沖液中稀釋的1.74uL23mM磺基-SMCC，且在室溫溫育30分鐘。通過(guò)大小排阻層析除去游離的磺基-SMCC。檢測(cè)抗體的最終濃度為2mg/mL或稍微更低。將九十五(95)uL的300uM用硫醇修飾的寡核苷酸(近端探針1和2)用5uL的100mM磷酸鹽緩沖液中1mMDTT，0.5mMEDTA，pH8.4在室溫還原1小時(shí)。近端探針1和2的序列為：硫醇修飾的近端探針1:SH-AAAAAAAAAAGACGCTAATAGTTAAGACGCTTUUU(SEQIDNO:1；其中3個(gè)U殘基為2’O-甲基RNA)硫醇修飾的近端探針2:SH-AAAAAAAAAATATGACAGAACTAGACACTCTT(SEQIDNO:2)。除去過(guò)量的磺基-SMCC和DTT，例如通過(guò)使用三次旋轉(zhuǎn)柱分離，并合并抗體和DNA用于共價(jià)綴合。將溶液在室溫溫育1小時(shí)伴隨混合。純化抗體-近端探針綴合物，例如通過(guò)大小排阻層析以除去未綴合的抗體和寡核苷酸。將MSDMULTI-板用適宜的封閉溶液封閉1小時(shí)并清洗。板上的每個(gè)結(jié)合域包含捕捉抗體和錨定模塊(固定化為BSA-寡核苷酸綴合物，選擇寡核苷酸為特異于滾環(huán)擴(kuò)增子)。本實(shí)施例中使用的錨定寡核苷酸的序列為5’-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/-3’(SEQIDNO:3)。對(duì)每個(gè)孔添加二十五(25)μl的每種測(cè)定稀釋劑和校正物，或樣品(按適宜的稀釋)(產(chǎn)生50ul總體積)。將板伴隨振動(dòng)溫育1-3小時(shí)并清洗每個(gè)孔。將如上文描述制備的用近端探針1和2標(biāo)記的檢測(cè)抗體的溶液添加到每個(gè)孔(25uL每孔)，并伴隨振動(dòng)溫育1-2小時(shí)(或者，每一種檢測(cè)抗體可以序貫添加，每次添加后是1小時(shí)溫育)。對(duì)每個(gè)孔添加包含以下組分的連接混合物：(i)環(huán)化寡核苷酸1(4nM),環(huán)化寡核苷酸2(4nM),連接緩沖液,ATP(1mM),T4DNA連接酶(0.15U/uL)，其中每種環(huán)化寡核苷酸為：環(huán)化寡核苷酸1：磷酸根-CTATTAGCGTCCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTAGAGCAGCCGTCAAGAGTGTCTA(SEQIDNO：4)。環(huán)化寡核苷酸2：磷酸根-GTTCTGTCATATTTAAGCGTCTTAA(SEQIDNO：5)。將板與連接混合物在室溫溫育30分鐘，清洗以除去過(guò)量的環(huán)化寡核苷酸，并在37C與RCA混合物溫育1.5小時(shí)，其中所述RCA混合物含有RCA緩沖液,dNTP(各250uM),Phi29DNA聚合酶(0.125U/ml)。清洗板和添加檢測(cè)探針的混合物并在37C溫育30分鐘，其中檢測(cè)探針混合物包含：20mMTris,1mMSDTA,250mMNaCl,0.01％Triton,BSA(200ug/ml),Tween20(0.05％),檢測(cè)探針(6.25nM)。檢測(cè)探針為序列CAGTGAATGCGAGTCCGTCT(SEQIDNO:6)。為了摻入電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物SULFO-TAG(MesoScaleDiagnostics)，檢測(cè)探針合成為具有末端生物素標(biāo)記物且與用SULFO-TAG標(biāo)記的鏈霉親合素預(yù)結(jié)合。清洗板并用150μlMSD讀數(shù)緩沖液填充且立即在MSD6000讀數(shù)器上讀數(shù)(板和讀數(shù)器由MesoScaleDiscovery,Rockville,MD提供)。使用此一般性規(guī)程來(lái)檢測(cè)以下分析物：肌鈣蛋白I、Akt(總)、磷酸-Akt(473)、磷酸-Akt(308)、流感A核蛋白(NP)、IL-12p40、IL-12p70、Abeta1-42，使用TNFalpha模式系統(tǒng)的橋接和同種型分析(bridgingandisotyping)Ig測(cè)定，使用乙肝表面抗原的橋接和同種型分析Ig測(cè)定，和使用LymeC6的橋接和同種型分析Ig測(cè)定。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)夾心免疫測(cè)定在ECL信號(hào)和測(cè)定靈敏性中的增加在測(cè)定法之間變化，但觀察到高達(dá)100倍的改進(jìn)。對(duì)于測(cè)試的某些測(cè)定，例如肌鈣蛋白-I、Akt(總)、IL-12p40、IL-12p70和Abeta1-42，錨定模塊的存在改進(jìn)了信號(hào)和/或稀釋線性，其通過(guò)防止擴(kuò)增步驟期間檢測(cè)復(fù)合物的解離。根據(jù)上述規(guī)程進(jìn)行的IL-10測(cè)定的校正曲線顯示于圖9。另外，表2(下面)顯示根據(jù)上述規(guī)程進(jìn)行的一組代表性測(cè)定的LOD(第2列，“3-ABRCA/PLA測(cè)定”)相對(duì)于來(lái)自MesoScaleDiagnostics(MSD),Rockville,MD，www.mesoscale.com(第3欄，“MSDV-Plex2-AB免疫測(cè)定方案”)的標(biāo)準(zhǔn)兩抗體免疫測(cè)定方案的LOD。表2.實(shí)施例2.有和無(wú)錨定試劑的測(cè)定方案如上文實(shí)施例1描述的將MSD7-spotMULTI-SPOT板各用肌鈣蛋白I捕捉抗體(220ug/mL)包被。將捕捉抗體在有或無(wú)錨定模塊BSA的情況下共打點(diǎn)(co-spotted)，BSA共價(jià)附接有特異于擴(kuò)增子的寡核苷酸(5ug/mL錨定物，若存在的)。對(duì)每個(gè)孔添加二十五(25)μl的每種測(cè)定稀釋劑和校正物，或樣品(按適宜的稀釋)(總共50ul)。將板伴隨振動(dòng)溫育2小時(shí)并清洗每個(gè)孔。將如上文描述制備的用近端探針1和2標(biāo)記的檢測(cè)抗體的溶液添加到每個(gè)孔(25uL每孔)，并伴隨振動(dòng)溫育1小時(shí)。對(duì)每個(gè)孔添加如在上文實(shí)施例1中描述的連接混合物。將板與連接混合物在室溫溫育30分鐘，清洗以除去過(guò)量的環(huán)化寡核苷酸，并在37C與RCA混合物溫育1.5小時(shí)，如在上文實(shí)施例1中描述的。清洗板并添加檢測(cè)探針的混合物且在37C溫育30分鐘，如在上文實(shí)施例1中描述的。清洗板并用150μlMSD讀數(shù)緩沖液填充且立即在MSD6000讀數(shù)器上讀數(shù)。從板頂部移去MSD電極用于熒光成像并用PBS和蓋片保持濕潤(rùn)。使用Zyla照相機(jī)觀察表面，20x物鏡，2x2面元(binning)，客戶過(guò)濾集(customerfilterset)，具有2二次曝光(secondexposure)。如表3(下面)中顯示的，ECL值在存在錨定試劑的情況下高4-5倍，且檢測(cè)限低3倍(更靈敏)。表3圖10(a)和(b)顯示具有(小圖(a))和沒(méi)有(小圖(b))5ug/mL錨定試劑的板表面的熒光顯微鏡圖像。該圖像顯示與個(gè)體結(jié)合事件有關(guān)的亮熒光點(diǎn)，且確認(rèn)了在存在錨定試劑的情況下RCA擴(kuò)增對(duì)于生成可觀察的結(jié)合事件更有效率。實(shí)施例3.一種相對(duì)于兩種連接子寡核苷酸的比較使用具有一個(gè)連接位點(diǎn)以形成環(huán)狀模板的單一線性連接子寡核苷酸而不是具有兩個(gè)分別的連接位點(diǎn)的兩種連接子寡核苷酸重復(fù)實(shí)施例2中描述的測(cè)定。如圖11(a)中顯示的，制備單一線性連接子寡核苷酸，其在連接位點(diǎn)1或連接位點(diǎn)2處打開(kāi)。使用實(shí)施例1和2中使用的寡核苷酸Circ-1和Circ-2的組合，并排測(cè)試兩種單一線性連接子寡核苷酸。采用實(shí)施例2中描述的方案，另外，以三種濃度測(cè)試該單一線性連接子寡核苷酸：125nM、62.5nM和31nM，而以125nM測(cè)試使用Circ-1和Circ-2寡核苷酸的組合的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。如圖11(b)中顯示的，將兩種單一線性連接子寡核苷酸以大致相同的效率成功地?fù)饺隦CA擴(kuò)增產(chǎn)物中作為兩部分連接子寡核苷酸混合物(Circ-1和Circ-2)?；谛盘?hào)強(qiáng)度、非特異性背景和總體靈敏性，在連接位點(diǎn)1打開(kāi)的單一線性連接子寡核苷酸具有與兩部分連接子混合物可比的性能。如預(yù)期的，在連接位點(diǎn)2打開(kāi)的單一線性連接子寡核苷酸具有更高的非特異性背景和更低的靈敏性。在后一情況中，連接和引發(fā)兩者均僅依賴(lài)于近端探針#1的存在；因此失去了近端擴(kuò)增辦法的一些特異性益處。實(shí)施例4.使用備選的近端探針、錨定寡核苷酸和連接子序列進(jìn)行的三抗體測(cè)定使用實(shí)施例1中列出的方案進(jìn)行測(cè)定，其使用下列備選的試劑組：表4下表5中的結(jié)果針對(duì)肌鈣蛋白測(cè)定，其中肌鈣蛋白的濃度為500pg/mL且MULTI-SPOT板的每個(gè)孔包含一個(gè)捕獲點(diǎn)，其具有來(lái)自表4中列出的組之一的錨定寡核苷酸。測(cè)定使用一種近端探針(1)和一種近端探針(2)，以與實(shí)施例1中描述的相同的濃度。組(a)-(c)的非特異性結(jié)合更高，因?yàn)樗鼈兿啾扔趯?shí)施例1中描述的濃度具有高9倍的檢測(cè)寡核苷酸-SA-STAG濃度。檢測(cè)寡核苷酸-SA-STAG的更高濃度來(lái)自于對(duì)預(yù)結(jié)合的復(fù)合物總體的滴定，而非對(duì)單獨(dú)SA-STAG的滴定，如實(shí)施例1中的。表5.PLA組(a)(b)(c)實(shí)施例1肌鈣蛋白178,560138,540189,166273,261無(wú)肌鈣蛋白41231454588實(shí)施例5.在另外的免疫測(cè)定平臺(tái)上進(jìn)行的三抗體測(cè)定(a)使用編碼顆粒的基于珠的免疫測(cè)定形式所有測(cè)定步驟均在96孔過(guò)濾板中進(jìn)行。用真空歧管(不超過(guò)10In.的Hg)從板除去液體。從不翻轉(zhuǎn)板。如果發(fā)生堵塞，使用15ml錐形管的尖端以輕柔按壓堵塞孔下面的區(qū)域，然后使用1mlPasteur吸耳球(pipetterubberbulb)或?qū)⒛粗阜旁诙氯咨弦酝ㄟ^(guò)生成壓力除去堵塞。在最后吸出步驟后，在一堆紙巾上輕敲板底部，然后用Kimwipe輕擦過(guò)濾板底部以除去殘余液體/液滴。清洗溶液制備：通過(guò)將20x工作洗滌液瓶的全部?jī)?nèi)容物用285ml去離子水稀釋來(lái)制備1x工作洗滌液。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)制備：在100％測(cè)定稀釋劑(血清和血漿樣品)或50％測(cè)定稀釋劑/50％組織培養(yǎng)基(組織培養(yǎng)上清)中重建凍干標(biāo)準(zhǔn)；重建體積：(i)1管形瓶：1ml；(ii)2管形瓶：0.5ml每管形瓶。在室溫再水合8-10分鐘。輕柔顛倒管形瓶幾次和允許管形瓶再放置3-5分鐘以確保完全水合。如果使用超過(guò)1種標(biāo)準(zhǔn)，組合等體積的每種標(biāo)準(zhǔn)并輕柔混合。實(shí)施重建標(biāo)準(zhǔn)的3倍系列稀釋以制備七點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析物捕獲：(1)渦旋(30sec)和超聲處理(30sec)10x捕獲珠儲(chǔ)液。在箔包裹的管中，將10x捕獲珠儲(chǔ)液(2.5μl每孔)在工作洗滌液(WorkingWashSolution)(25μl每孔～2,000至5,000珠/測(cè)定)中稀釋。對(duì)于更高的多重化，調(diào)整工作洗滌液的體積以適應(yīng)保留的10x捕獲珠儲(chǔ)液的額外體積。(2)用200μl的工作洗滌液預(yù)濕潤(rùn)標(biāo)準(zhǔn)和樣品孔。(3)渦旋(30sec)和超聲處理(30sec)稀釋的捕獲珠溶液。立即向每個(gè)測(cè)定孔添加25μl，接著是200μL的1x洗滌液。用200μL的工作洗滌液抽吸和重復(fù)清洗。按需要輕敲和輕擦過(guò)濾板的底部。(4)對(duì)所有測(cè)定孔添加50μl的溫育緩沖液。(5)將100μl標(biāo)準(zhǔn)添加到指定孔中。對(duì)于指定用于樣品的孔，添加50μl測(cè)定稀釋劑接著是50μl樣品。覆蓋板和在定軌式板振動(dòng)器上(500-600rpm)室溫溫育板2小時(shí)。在所有溫育期間用不透明蓋覆蓋測(cè)定板以避光。根據(jù)定軌振動(dòng)器的半徑可能需要調(diào)整速度。分析物檢測(cè)(6)制備熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體的1x混合物：在稀釋劑(100μl每孔)中稀釋10x檢測(cè)抗體混合物(10μl每孔)。混合物包含特異于目的分析物的一對(duì)檢測(cè)抗體，一種用AlexaFluor350(藍(lán)色熒光標(biāo)記物)標(biāo)記，另一種用AlexaFluor594(紅色熒光標(biāo)記物)標(biāo)記(這些熒光標(biāo)記物的每種可獲自LifeTechnologies,GrandIsland,NY,www.lifetechnologies.com)。對(duì)于更高的多重化，調(diào)整稀釋劑的體積以適應(yīng)需要的10x抗體混合物儲(chǔ)液的額外體積。用200μL的工作洗滌液抽吸和清洗測(cè)定孔兩次。向每個(gè)測(cè)定孔添加100μl稀釋的檢測(cè)抗體混合物。覆蓋板并在板振動(dòng)器(500-600rpm)上溫育1小時(shí)。測(cè)定讀數(shù)(8)用200μl工作洗滌液抽吸和清洗測(cè)定孔3次。用干凈紙巾干燥過(guò)濾板的底部以完全除去所有殘余液滴。向每個(gè)測(cè)定孔添加100μl工作洗滌液并將板置于板振動(dòng)器(500-600rpm)上2-3分鐘。(9)在多色熒光顆粒分析儀(如FACS系統(tǒng)或改動(dòng)的xMAP儀)中分析珠懸液，該分析儀包含針對(duì)每種熒光標(biāo)記物的顏色通道。為了最大靈敏性，測(cè)定在以下條件下運(yùn)行，其中任何顆?？赡芫哂袃H0個(gè)或1個(gè)結(jié)合的分析物且通過(guò)對(duì)顆粒數(shù)目計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)分析物的量定量，所述顆粒特異于包含兩種熒光標(biāo)記物的給定分析物(基于顆粒編碼)。任選地，可在多重形式中運(yùn)行測(cè)定，其使用編碼珠和針對(duì)每種分析物的另外的檢測(cè)抗體對(duì)，其中編碼指示珠上捕獲抗體的分析物特異性。在確定編碼時(shí)，如使用摻入珠中的另外熒光色在xMAP中的，分析儀應(yīng)具有另外的檢測(cè)通道用于測(cè)量另外的顏色并鑒定珠編碼。(b)使用包含錨定部分的編碼顆粒，使用用核酸探針修飾的兩種檢測(cè)試劑的基于珠的免疫測(cè)定形式如實(shí)施例5(a)中所述的，所有測(cè)定步驟在96孔過(guò)濾板中進(jìn)行。清洗溶液和測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)如實(shí)施例5(a)中描述的制備，且如實(shí)施例1中描述的通過(guò)添加近端探針1和2修飾針對(duì)靶分析物的一對(duì)檢測(cè)抗體。分析物被捕獲到捕獲珠上，如實(shí)施例5(a)中描述的。捕獲珠包含錨定模塊，固定化于珠表面為BSA-寡核苷酸綴合物，其中寡核苷酸選擇為特異于滾環(huán)擴(kuò)增子。使用的錨定寡核苷酸的序列為SEQIDNO：3。將二十五(25)μl的測(cè)定稀釋劑、校正物、或樣品(按適宜的稀釋)與捕獲珠的混合物混合。將混合物伴隨振動(dòng)溫育1-3小時(shí)并清洗。將如上文描述制備的用近端探針1和2標(biāo)記的檢測(cè)抗體的溶液添加到混合物，并伴隨振動(dòng)溫育1-2小時(shí)(或者，每一種檢測(cè)抗體可以序貫添加，每次添加后是1小時(shí)溫育)。添加如實(shí)施例1中描述的連接混合物。將該混合物與連接混合物在37C溫育30分鐘，清洗以除去過(guò)量的環(huán)化寡核苷酸，并在37C與RCA混合物溫育1.5小時(shí)，其中RCA混合物在上文實(shí)施例1中描述。清洗混合物，添加熒光素-經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)探針的混合物并在37C溫育30分鐘，其中所述檢測(cè)探針混合物在上文描述。清洗混合物并將顆粒抽吸到多通道熒光顆粒分析儀中。(c)基于珠的形式和將捕獲分析物分子分到各個(gè)納米孔中樣品在100ul25％牛血清(2-4倍稀釋)中制備，且將用捕獲抗體包被的500K珠(順磁2.7um，任選地?zé)晒饩幋a地)添加到樣品中。將樣品在23℃溫育約2hr。將樣品用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗3次，且添加經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)抗體的混合物(包含第一生物素化的檢測(cè)抗體和綴合有半抗原的抗體的混合物)。將混合物在23℃溫育約1hr。將混合物用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗3次，添加酶標(biāo)記物，還添加鏈霉親合素-beta-半乳糖苷酶(40pM)，抗半抗原綴合的酶，并將混合物在23℃溫育約30min(或在Simoaanalyzer中3min)。將混合物用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗七次并添加酶底物15ul的試鹵靈-beta-d-半乳吡喃糖苷(100uM，在加載緩沖液中)。引導(dǎo)混合物通過(guò)納米孔的陣列(由Quanterix以DVD形式提供，從cyclicolefin聚合物制備，具有24-樣品每盤(pán))，允許放置約2分鐘。將陣列用緩沖液沖洗，陣列用氟碳油密封，在23℃溫育2-5min，并在多色熒光成像儀上讀出結(jié)果。使用圖像分析來(lái)對(duì)含有兩種熒光酶產(chǎn)物的納米孔的數(shù)目計(jì)數(shù)，由此提供與樣品中分析物的濃度相關(guān)的值。(d)流動(dòng)池分析的基于珠的免疫測(cè)定形式第一溫育：10ul樣品，生物素化的分析物特異性單克隆捕獲抗體(工作溶液為2.6mg/l)，和各綴合于寡核苷酸的分析物特異性單克隆抗體的混合物(工作溶液為0.3mg/l)反應(yīng)以形成夾心復(fù)合物。分析物特異性單克隆抗體的混合物如實(shí)施例1中制備，且該混合物包含綴合于近端探針1和2的一對(duì)抗體，如上文實(shí)施例1中描述的。第二溫育：在添加用鏈霉親合素包被的微顆粒(DynalM280，2.8um，0.72mg/ml，對(duì)生物素的結(jié)合能力470ng/mg)后，復(fù)合物經(jīng)由生物素和鏈霉親合素之間的相互作用變得結(jié)合于固相。將連接混合物添加到混合物，其中連接混合物依照實(shí)施例1中所述方案制備。將該混合物與連接混合物在37C溫育30分鐘，清洗以除去過(guò)量的環(huán)化寡核苷酸，并與RCA混合物，如實(shí)施例1中描述的。清洗混合物和添加用生物素標(biāo)記的檢測(cè)探針的混合物，并在37C溫育30分鐘，其中檢測(cè)探針混合物如實(shí)施例1中所述制備。為了摻入電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物SULFO-TAG(MesoScaleDiagnostics)，檢測(cè)探針合成為具有末端生物素標(biāo)記物且與用SULFO-TAG標(biāo)記的鏈霉親合素預(yù)結(jié)合。將反應(yīng)混合物抽吸到測(cè)量孔，該處微顆粒被磁性捕獲到電極的表面上。然后用ProCell(含TPA的緩沖液)除去未結(jié)合的物質(zhì)。然后對(duì)電極應(yīng)用電壓誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光發(fā)射，對(duì)此通過(guò)光電倍增管測(cè)量。結(jié)果經(jīng)由儀器特異地由2點(diǎn)校正生成的校正曲線和經(jīng)由試劑條形碼提供的主曲線(mastercurve)測(cè)定。實(shí)施例6.HIV-1P24的檢測(cè)材料、方法和結(jié)果：將實(shí)施例1中描述的規(guī)程用于檢測(cè)HIV-1p24。從混合HIV-1的滴定性能組(可獲自SeracareLifeSciences,www.seracarecatalog.com)、HIV-1血清轉(zhuǎn)化組(也可獲自SeracareLifeSciences)、HIV抗體陽(yáng)性樣品(可獲自ProMedDx,LLC,www.promeddx.com)、和正常匹配的樣品(可獲自Bioreclamation,www.bioreclamation.com)測(cè)試約64份血清或血漿樣品。依照上文所述規(guī)程進(jìn)行的HIV-1p24測(cè)定的校正曲線顯示于圖12。發(fā)現(xiàn)測(cè)定的LOD為1.3fg/mL，LLOQ為3.0fg/mL且ULOQ為37,500fg/mL。對(duì)于25uL樣品1.3fg/mL的檢測(cè)限對(duì)應(yīng)于約650個(gè)p24分子，且每個(gè)病毒顆粒(分子)產(chǎn)生約2000個(gè)p24蛋白拷貝?；旌系牡味ㄐ阅芙MPRA204(B)由具有通過(guò)商品化測(cè)定法(bioMerieux、PerkinElmer和Zeptometrix)對(duì)HIVp24抗原的反應(yīng)性范圍從較弱到較強(qiáng)陽(yáng)性的10份標(biāo)本的組組成。將兩份陰性的標(biāo)本包含在該組中。測(cè)定的結(jié)果顯示于下表6：表6.對(duì)于大多數(shù)樣品，HIVp24水平較高且高于ULOQ。所有10份陽(yáng)性樣品均為可檢測(cè)的且與商品化的p24試劑盒是可比的，而陰性樣品(基于商業(yè)測(cè)定法，分別為PRA204(B)-10和-20)相當(dāng)?shù)?，分別為約3和2fg/mL。血清轉(zhuǎn)化組的分析結(jié)果顯示于圖13。發(fā)現(xiàn)3抗體測(cè)定形式與PCR一樣靈敏且第一陽(yáng)性樣品的檢測(cè)前時(shí)間中估測(cè)的延遲和來(lái)自PRB948和PRB962組的兩種樣品中的p24水平與PCR試劑盒可比，且比其他商業(yè)p24測(cè)定性能更好。數(shù)據(jù)顯示于表7。表7.AbbottBBI指AbbottBBIHIV-1抗原測(cè)試。CoulterBBI指CoulterBBIHIV-1抗原測(cè)試。DuPontBBI指DuPontBBIHIV-1抗原測(cè)試。Inno.指InnogeneticsR129HIV-1抗原測(cè)試。RochePCR指RochePCRHIVRNABBItest。Coulter指CoulterELISAHIV-1抗原測(cè)試。PE指PerkinElmerELISAHIV-1抗原測(cè)試。Zepto.指ZeptometrixELISAHIV-1抗原測(cè)試。RocheUltra指RocheUltrasensitiveHIV-1RNA測(cè)試。Rochestandard指theRochestandardHIV-1RNA測(cè)試。BLD＝低于檢測(cè)限和NT＝未測(cè)試。結(jié)論：新近感染HIV的患者不成比例地促進(jìn)該疾病的傳播。病毒負(fù)載在感染后頭幾周較高，而且新感染的患者不太可能知曉他們被感染且可能將疾病傳給他人。因此，對(duì)急性HIV感染的早期檢測(cè)對(duì)于公共健康具有極大重要性。PCR方法就靈敏性而言是金標(biāo)準(zhǔn)；它們能檢測(cè)少至60個(gè)HIVRNA拷貝每mL血清或血漿(30病毒顆粒每mL)。然而，PCR技術(shù)是復(fù)雜且昂貴的，因此不適用于所有背景。免疫測(cè)定法是更簡(jiǎn)單和便宜的，但目前第4代p24免疫測(cè)定法的檢測(cè)限僅為約10pg/mL，或約250百萬(wàn)殼體蛋白質(zhì)每mL。在按病毒的基礎(chǔ)上，這些免疫測(cè)定法比PCR測(cè)試靈敏性低幾千倍，盡管事實(shí)上有約2,000p24個(gè)殼體蛋白質(zhì)每病毒。如本文描述的，開(kāi)發(fā)了基于MSD的MULTI-技術(shù)的下一代電化學(xué)發(fā)光測(cè)定形式并表征了其性能。這一新的p24免疫測(cè)定法的檢測(cè)限為約1fg/mL，比目前的p24免疫測(cè)定法靈敏10,000倍。1fg/mL的靈敏度對(duì)應(yīng)于我們25uL的樣品體積中低于1個(gè)病毒顆粒。定量的下限和上限分別為3fg/mL和38,000fg/mL。板內(nèi)CV為7％，且總CV為15％。加標(biāo)回收(Spikerecovery)和稀釋線性為80％至120％。p24在32名明顯健康的供體的血清或血漿中未檢出。混合p24的滴定組顯示3-ABHIVp24測(cè)定與商業(yè)p24免疫測(cè)定之間的較好相關(guān)性。測(cè)試了兩個(gè)血清轉(zhuǎn)化組：SeraCarePRB948(第0和18天，PCR陰性；第22和23天，PCR陽(yáng)性)和PRB962(第0和2天，PCR陰性；第7、9、14和17天，PCR陽(yáng)性)。在兩種情況中，3ABHIVp24測(cè)定結(jié)果對(duì)于所有PCR陰性樣品為陰性且對(duì)于所有PCR陽(yáng)性樣品為陽(yáng)性，且感染在常規(guī)p24免疫測(cè)定之前很早就檢測(cè)到。結(jié)論是，本文中描述的3-ABHIVp24免疫測(cè)定比目前的p24ELISA的限度靈敏10,000倍，且與PCR測(cè)定的靈敏性是可比的。該測(cè)定法不需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備且可在MESOTMQuickPlexSQ120和成像儀上運(yùn)行。實(shí)施例7.分析物的濃縮，隨后是3-ABRCA/PLA測(cè)定(a)實(shí)驗(yàn)條件顯示于如下表8(a)中：表8(a).對(duì)于捕獲相對(duì)短的寡核苷酸近端探針序列(例如9-13個(gè)核苷酸長(zhǎng))而言，制備與近端探針序列的一部分互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸并在3’末端生物素化。表8(b)顯示了近端探針和捕獲寡核苷酸序列的細(xì)節(jié)：表8(b).計(jì)算的解鏈溫度示于圖8(c)中：以如下方式制備用捕獲寡核苷酸修飾的珠子：渦旋后，將五十(50)ul的DynalMyOne鏈霉親和素T1珠漿(beadslurry)加入到五個(gè)1.5mL的Eppendorf管中，每個(gè)具有用于分到兩個(gè)結(jié)合條件實(shí)驗(yàn)所需的兩倍的量。用1mlDiluent100(獲得自MesoScaleDiscovery，Rockville，MD)洗滌三次珠子，且將1.2mL的每種捕獲寡核苷酸，每種以200pmol/ml的濃度加入到每個(gè)小瓶中，所述每種捕獲寡核苷酸溶于含有EDTA的Diluent100中。通過(guò)在室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)孵育溶液，并向每個(gè)管的溶液中摻入溶于含EDTA的Diluent100中的游離生物素至5nmol/mL。通過(guò)在室溫下旋轉(zhuǎn)15分鐘孵育溶液，并用1mL的0.5MNaCl/BSA溶液洗滌珠子三次。將1mL0.5MNaCl/BSA加入管中，混合，且將每個(gè)捕獲寡核苷酸-珠子混合物等分到2個(gè)小瓶中，總共10個(gè)小瓶。從所有小瓶中吸出溶液，并向每個(gè)捕獲管中加入1mL溶于0.5M中以及1MNaCl/BSA中的1ug/mL(6.7pmol/mL)PP1(PP1序列，其結(jié)合到特異性針對(duì)HIVp24的檢測(cè)抗體)。將溶液在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育40分鐘。每個(gè)管用鹽溶液洗滌三次(不包括捕獲寡核苷酸的對(duì)照不洗滌)。將7pg/mL的1mLHIVp24加入到四個(gè)管中，而將抗原從儲(chǔ)液中加入到無(wú)捕獲物的對(duì)照管中。將溶液在4℃下旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜，并將每個(gè)具有捕獲寡核苷酸的管用鹽溶液(各1mL)洗滌三次。將每個(gè)管用洗滌緩沖液(0.1XPBS，500mMNaCl，1mMEDTA，0.1％TritonX-100，2mg/mLBSA)充入至1/3，混合，然后將400uL珠子的等分試樣加入到兩個(gè)小瓶中用于2種釋放鹽條件，總共18個(gè)管。除了沒(méi)有捕獲物的對(duì)照管之外，從所有小瓶除去洗滌緩沖液，并向管中加入400uL0.0M和10mM鹽緩沖液。將管的內(nèi)容物混合，且將來(lái)自每個(gè)管(包括不含捕獲物的對(duì)照(beans))的100ul的等分試樣加入到三個(gè)基質(zhì)板中以用于分析三種溫度釋放條件。所述板分別在25C、30C和37C下在熱振蕩器(thermoshaker)中混合5分鐘。磁力分離珠子，且將25uL的上清液加入到測(cè)定板的孔中，所述板加入有包括mIgG的5uL6XPBS(每個(gè)條件三個(gè)重復(fù))。將板在室溫下振蕩溫育1小時(shí)，并在PBS緩沖液中洗滌三次。如實(shí)施例1所述，每個(gè)位于板上的結(jié)合域包括捕獲抗體和錨定部分，并且在孵育步驟之后，在每個(gè)結(jié)構(gòu)域上形成復(fù)合物，其包括結(jié)合抗原的抗體，其結(jié)合具有PP1序列的檢測(cè)抗體(除對(duì)照結(jié)合域外)。將用PP2(或?qū)τ趯?duì)照的PP1+PP2)標(biāo)記的檢測(cè)抗體的溶液加入每個(gè)孔(25uL每孔)中，并震蕩孵育1小時(shí)，之后洗滌。如實(shí)施例1所述，將連接混合物添加到每個(gè)孔并將板與連接混合物在室溫下孵育30分鐘，洗滌以去除多余的環(huán)化寡核苷酸，并與RCA混合物在37C下孵育1.5小時(shí)。洗滌所述板，并加入檢測(cè)探針的混合物，并在37C下孵育30分鐘。洗滌所述板并加入150μlMSD讀數(shù)緩沖液(readbuffer)且立即在MSDSECTOR讀數(shù)器上讀數(shù)。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖14中。(b)進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步評(píng)價(jià)分析物的濃縮條件。一般實(shí)驗(yàn)條件描述于表9(a)中：渦旋后，將五十(50)ul的DynalMyOne鏈霉親和素T1珠漿加入到微量離心管。用1mlDiluent100洗滌珠子三次，并將1mL的捕獲寡核苷酸Cap1:9加入到包含EDTA的Diluent100中。溶液在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育1小時(shí)，且在向溶液中摻入(spike)游離的生物素至10X過(guò)量，所述生物素溶于包含EDTA的Diluent100中。通過(guò)在室溫旋轉(zhuǎn)30分鐘孵育所述溶液，并用1mL的洗滌緩沖液洗滌珠子三次。將一(1.0)mLPP1加入到結(jié)合緩沖液中，且在溶液室溫下旋轉(zhuǎn)孵育40分鐘。用洗滌緩沖液洗滌所述管三次，且將1mLDiluent2加到珠子，混合，且所述珠子溶液被分配到12個(gè)管中用于抗原水平2-4的1X、0.5X、0.25X、和0.125X珠子-PP1濃度。將珠子-PP的所需體積轉(zhuǎn)移到對(duì)照管。將HIVp24和Diluent2以所需的抗原和珠子-PP的終濃度加入到珠子溶液中，且總體積為5mL。加入(spike)無(wú)珠子對(duì)照管以包括僅1X濃度的游離的PP1和所有4種水平的抗原在4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜孵育所述管，并通過(guò)每次轉(zhuǎn)移1mL的方式將5mL珠子緩沖液轉(zhuǎn)移至1.5mLEppendorf管。用洗滌緩沖液洗滌每個(gè)管(洗滌三次)。不洗滌不含珠子的對(duì)照管。第三次洗滌后，將100uL的0鹽緩沖液加入到測(cè)試管，并將500uL的0鹽緩沖液加入到對(duì)照管，并將管在25℃下孵育6分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至測(cè)定板，并如實(shí)施例7(a)中那樣分析。所述結(jié)果示于表9(b)-(c)中：表9(b)：表9(c)：在用磁珠分析物濃縮后觀察到信號(hào)增加約50倍。非濃縮樣品#1顯示與對(duì)照#1信號(hào)相似的結(jié)果，這表明PP-抗原復(fù)合物的釋放具有最高的效率。使用分析物預(yù)濃縮，實(shí)現(xiàn)了低于0.1fg/mL的檢測(cè)，其與1病毒粒子/mL病毒載量(viralload)相當(dāng)。相反，商業(yè)病毒測(cè)定可合理地檢測(cè)約50個(gè)拷貝/mL，相當(dāng)于25個(gè)病毒/mL。具有和不具有用于該實(shí)驗(yàn)的預(yù)濃縮的校正曲線顯示在圖15中。實(shí)施例8.使用珠子沉降(Settling)方案的3-ABRCA/PLA基于珠子的測(cè)定如實(shí)施例7所述進(jìn)行IL-4的3-ABRCA/PLA測(cè)定，除了使用二氧化硅珠子(獲得自_____)替代Dynabeads。RCA和檢測(cè)溫育在MSD大點(diǎn)多孔測(cè)定板(可得自MesoScaleDiscovery，Rockville，MD)中進(jìn)行，在37℃靜置。所述珠子不包括錨定試劑。在RCA孵育步驟期間，允許珠子通過(guò)重力緩慢沉降到孔的表面上，取決于溶液體積，大約沉降時(shí)間為5-8分鐘。通過(guò)在搖擺斗離心機(jī)(swingingbucketcentrifuge)中旋轉(zhuǎn)板來(lái)洗滌所述板。初步測(cè)試表明，在旋轉(zhuǎn)后珠子均勻分散，只有很小的梯度穿過(guò)孔表面。用15對(duì)(vs.)90分鐘的RCA孵育測(cè)試所述方案。發(fā)現(xiàn)了與磁力捕獲相比，使用珠沉降方案的15分鐘RCA孵育后測(cè)定的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍提高約10倍。使用90分鐘的RCA孵育步驟進(jìn)一步改善靈敏度(高達(dá)約50-100倍)?；蛘撸绫疚乃鲞M(jìn)行3-ABRCA/PLA測(cè)定，其中珠子包括錨定試劑，并在連接步驟期間加入封閉劑(約2.5mg/ml)以減少非特異性結(jié)合?？梢允褂枚喾N封閉劑，包括但不限于，mBSA、剪切的多聚(A)、多聚BSA-I、mIgG、Tween、多聚BSA-II、酵母RNA、mBSA+多聚(a)，和/或多聚BSA+多聚(A)。實(shí)施例9.修飾的橋接免疫測(cè)定形式如上所述，實(shí)施例1中所述的方法用于使用TNFalpha模型系統(tǒng)的橋接和同種型Ig測(cè)定，使用HepB表面抗原的橋接和同型Ig測(cè)定，以及使用LymeC6的橋接和同種型Ig測(cè)定。對(duì)該程序的修改如圖19所示，其中使用如下檢測(cè)自身抗體(1901)：(i)PP2修飾的抗人Ig抗體(1902)，和(ii)PP1-標(biāo)記的自身抗原(1903)，之后進(jìn)行如實(shí)施例1所述的PLA-RCA。示于圖19的形式還顯示了使用靶向部分(1904)及其與自身抗原結(jié)合的互補(bǔ)體(1905)作為將捕獲部分(在這種情況下為自身抗原)粘附到表面(1906)的手段。同樣地，可以如實(shí)施例1所述進(jìn)行抗體(例如自身抗體)的免疫測(cè)定，其中該抗體的抗原用作捕獲部分(直接附接到表面或通過(guò)靶向部分及其互補(bǔ)體)，且兩種檢測(cè)物種是附接于PP1的同種型抗體，和附接于PP2的抗原(反之亦然)。形成夾心復(fù)合物，然后如實(shí)施例1所述的PLA-RCA。這些修飾的測(cè)定形式還可以包括錨定部分，以將擴(kuò)增子粘附到表面。實(shí)施例10.用于產(chǎn)生接近連接滾環(huán)模板的生物合成方法可以生物合成生成接近連接滾環(huán)模板。該方法利用最初高度純化和良好表征的模板，以在有效的基于溶液的連接和RCA反應(yīng)系列中產(chǎn)生RCA產(chǎn)物。該方法也可以在珠子上進(jìn)行以增強(qiáng)反應(yīng)的選擇性。在種子RCA模板的擴(kuò)增后，使用獨(dú)特的限制酶與短的合成序列組合對(duì)單鏈產(chǎn)物進(jìn)行位點(diǎn)特異性切割。因此，RCA模板從其自身產(chǎn)物產(chǎn)生。對(duì)生物合成產(chǎn)生的RCA模板進(jìn)行HPLC或凝膠純化以產(chǎn)生包含100％正確的5’和3’末端的產(chǎn)物。該方法示于圖20(a)中。該方法需要在RCA模板中添加限制性位點(diǎn)以在所需的連接位點(diǎn)處引導(dǎo)切割。限制酶，例如那些切割從距離限制性位點(diǎn)14-20個(gè)堿基的酶是優(yōu)選的。或者，也可以使用該方法與來(lái)自M13噬菌體的單鏈DNA或類(lèi)似物組合以毫克量產(chǎn)生單鏈模板。該方法可以避免進(jìn)行RCA模板的基于RCA的擴(kuò)增的需要，僅需要將模板克隆到M13載體中用于DNA的產(chǎn)生產(chǎn)。這在圖20(b)中示出。實(shí)施例11.樣品多重化(Multiplexing)本文所述方法用于基于使用光譜簽名的多重化樣品。多重化樣品為使用者提供了進(jìn)行內(nèi)部校正和對(duì)照、降低成本和增加通量的能力。通過(guò)基于空間和光譜簽名的獨(dú)特簽名(該分析物的編碼)的對(duì)分析物進(jìn)行多重化的能力也可以用于多重化樣品。使用成像擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光染料比率編碼(fluorescentdyeratiecoding)來(lái)多重化樣品。對(duì)于樣品中的每種分析物，使用能夠產(chǎn)生獨(dú)特的滾環(huán)產(chǎn)物的一組獨(dú)特的測(cè)定試劑，每種可以用獨(dú)特的檢測(cè)寡核苷酸檢測(cè)。一組獨(dú)特的測(cè)定試劑的合成和使用可以根據(jù)描述的方法，例如實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行。如圖21所示，將含有感興趣分析物的每個(gè)樣品A和B與特異于該分析物的兩種檢測(cè)抗體孵育，每種具有獨(dú)特的近端探針。該孵育步驟將一組獨(dú)特的近端探針與該樣品中的分析物連接，從而與分析物形成雙抗體復(fù)合物并“編碼(coding)”樣品。在該溫育后，合并編碼樣品，作為混合物加入到單個(gè)捕獲抗體表面，孵育并洗滌。在洗滌步驟之后，加入捕獲的三抗體復(fù)合物、用于每組近端探針的線性滾環(huán)模板，并使混合物進(jìn)行如實(shí)施例1所述的雜交條件。連接該混合物以產(chǎn)生滾環(huán)模板、洗滌、進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，和洗滌。每個(gè)滾環(huán)擴(kuò)增子與互補(bǔ)且獨(dú)特的檢測(cè)寡核苷酸雜交，所述檢測(cè)寡核苷酸用基于兩種或更多種熒光標(biāo)記比例的獨(dú)特的光譜特征編碼。在檢測(cè)探針雜交后，對(duì)測(cè)定表面進(jìn)行成像，并且基于其光譜特征(例如2種或更多種熒光標(biāo)記物的比率)對(duì)每個(gè)滾環(huán)產(chǎn)物進(jìn)行解碼，并計(jì)數(shù)。這允許確定多個(gè)樣品中的分析物水平。使用這種方法，用戶可以組合樣品和分析物多重化，允許在測(cè)試和對(duì)照樣品中同時(shí)測(cè)試多種分析物。實(shí)施例12.脂蛋白復(fù)合物的檢測(cè)本文所述的方法用于檢測(cè)和定量存在于脂蛋白復(fù)合物(例如HDL和LDL)中的蛋白質(zhì)復(fù)合物組。例如，使用實(shí)施例1中描述的方法，在脂蛋白復(fù)合物內(nèi)檢測(cè)三種不同的蛋白質(zhì)和/或表位，并因此可以分析患者脂蛋白內(nèi)的蛋白質(zhì)譜。在人體中，血液脂蛋白分為5個(gè)主要組，HDL、LDL、IDL、VLDL和乳糜微粒。其中，HDL和LDL級(jí)分作為心血管健康的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物已經(jīng)獲得了最多的臨床興趣。這些關(guān)鍵脂蛋白由多種蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的復(fù)合物組成。與這些脂蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)由對(duì)其功能構(gòu)成所必需的蛋白質(zhì)以及乘客蛋白(passengerproteins)組成。這些脂蛋白也可以進(jìn)行修飾，例如氧化，其修飾個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)特征(profile)。例如，較高水平的氧化HDL和LDL與不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。LDL通常由兩種核心蛋白Apo(a)和ApoB以及脂質(zhì)組成。升高的Apo(a)與心臟病的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)；此外，Apo(a)蛋白的長(zhǎng)度變化也與改變的風(fēng)險(xiǎn)特征相關(guān)。Apo(a)蛋白的尺寸由于尺寸多態(tài)性而不同，這是由LPA基因中可變數(shù)目的所謂的kringle重復(fù)引起的。LDL顆粒中的ApoB攜帶配體，其針對(duì)各種組織中的LDL受體。高水平的ApoB也與斑塊形成相關(guān)，導(dǎo)致心血管疾病。HDL通常由一組核心蛋白組成，包括；ApoA1、ApoE、ApoC和ApoA-II。除了這些核心蛋白，還已知HDL與也具有臨床價(jià)值的另外的蛋白質(zhì)相關(guān)。例如，HDL相關(guān)的SAA和SP-B已經(jīng)被證明與心臟事件和死亡率相關(guān)。通過(guò)升高的ApoA-II的HDL組成的變化也已經(jīng)與致動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。下列步驟描述于圖1中，用于脂蛋白復(fù)合物的多重化接近測(cè)定如圖22所示進(jìn)行。圖22例示了HDL脂蛋白復(fù)合物的檢測(cè)，其中對(duì)每種核心蛋白特異性的捕獲抗體固定到表面以將脂蛋白復(fù)合物結(jié)合到表面。添加對(duì)其他核心蛋白特異性的檢測(cè)抗體，每種檢測(cè)抗體帶有近端探針。如實(shí)施例1中所述完成測(cè)定。本發(fā)明在范圍上不受本文描述的具體實(shí)施方案的限制。事實(shí)上，除了本文描述的那些以外的對(duì)方法的多種修改將是本領(lǐng)域技術(shù)人員從前述說(shuō)明和所附附圖來(lái)看明顯的。這類(lèi)修改意圖落入權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文中引用了多種出版物，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提述完整并入本文。參考文獻(xiàn)1.美國(guó)專(zhuān)利No.7,306,9042.美國(guó)專(zhuān)利No.7,320,8603.美國(guó)專(zhuān)利No.7,351,5284.美國(guó)專(zhuān)利No.7,192,7035.美國(guó)專(zhuān)利No.6,878,5156.Zhou等,GenomeBiology(2004),5:R287.Dean等,GenomeResearch(2001),11:1095-10998.Soderberg等,Methods(2008),45:227-2329.Fredriksson等,NatureBiotech(2002),20:473-47710.Fredriksson等,NatureMethods(2007),4(4):327-32911.Vincent等,EMBOReports(2005),5(8):795-80012.Gajadjar等,Biotechniques(1010),48(22):145-15213.Schallmeiner等,NatureMethods(2007)4(2):135-13714.Ericsson等,Nucl.AcidsResearch(2008),36(8):e4515.Darmanis等,Biotechniques(2007),43:443-45016.Dahl等,Proc.Natl.Acad.Sci.(2004),101(13):4548-455317.Weibrecht等,ExpertRev.Proteomics(2010),7(3):401-40918.Spits等,NatureProtocols(2005),1(4):1965-197019.Nordengrahn等,Vet.Microbio(2008),127:227-23620.Vuoriluoto等,Mol.Oncology(2011),5:105-11121.Zhang等,ClinicaChimicaActa(2006),363:61-7022.Andras等,Mol.Biotech.(2001),19:29-4423.Schweltzer等,Proc.Natl.Acad.Sci.(2000),97(18):10113-1011924.Jeong,等,Cell.Mol.LifeSci.(2009),66:3325-333625.Gill等,Nucleosides,Nucleotides,andNucleicAcids(2008),27:224-24526.Gullberg,等,CurrentOp.inBiotech.(2003),14:82-8627.Gustafsdottir,等,ClinicalChemistry(2006),52(6):1152-116028.美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2010007586229.美國(guó)專(zhuān)利No.8,222,04730.美國(guó)專(zhuān)利No.8,236,57431.美國(guó)專(zhuān)利No.8,338,77632.美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2011021253733.美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2012019677434.美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2012028942835.Kopecky,C.,等,Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2014Nov.2536.Watanabe,J.,等,ArthritisRheum.2012Jun；64(6):1828-3737.Ribas,V.,等,Circ.Res.2004Oct.15:95(8):789-97序列表<110>中尺度技術(shù)有限責(zé)任公司<120>改進(jìn)的測(cè)定方法<130>31085<150>61/993,581<151>2014-05-15<150>62/013,823<151>2014-06-18<150>62/048,489<151>2014-09-10<150>62/049,520<151>2014-09-12<150>62/055,093<151>2014-09-25<160>22<170>PatentInversion3.5<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>Thiol-修飾的近端探針1<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(35)<223>um<400>1aaaaaaaaaagacgctaatagttaagacgcttuuu35<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>Thiol-修飾的近端探針2<400>2aaaaaaaaaatatgacagaactagacactctt32<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>錨定寡核苷酸<400>3aagagagtagtacagcagccgtcaaaaaaaaaaaa35<210>4<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1<400>4ctattagcgtccagtgaatgcgagtccgtctaagagagtagtagagcagccgtcaagagt60gtcta65<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2<400>5gttctgtcatatttaagcgtcttaa25<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>檢測(cè)探針<400>6cagtgaatgcgagtccgtct20<210>7<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>檢測(cè)寡核苷酸<400>7acatcggtagtt12<210>8<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸<220><221>polyA_位點(diǎn)<222>(1)..(10)<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>gm<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(36)<223>um<400>8aaaaaaaaaacactaagctgttagtccattaccguuu37<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位點(diǎn)<222>(1)..(10)<400>9aaaaaaaaaagctggaggttcagacgattttgcg34<210>10<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1a<400>10aacagcttagtgacatcggtagttaacagattgatcttgacacatcggtagttcgcaaaa60tcgtc65<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2a<400>11tgaacctccagctttcggtaatggact27<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>錨定寡核苷酸<400>12acagattgatcttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35<210>13<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸1<220><221>polyA_位點(diǎn)<222>(1)..(10)<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>tm<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(36)<223>um<400>13aaaaaaaaaaagagtccagaggcaaagcgtgaatuuu37<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位點(diǎn)<222>(1)..(10)<400>14aaaaaaaaaagataaggaaggggccttagcgaca34<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1b<400>15cctctggactctacatcggtagtttggaacattttattctaacatcggtagtttgtcgct60aaggc65<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2b<400>16cccttccttatctttattcacgctttg27<210>17<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>錨定寡核苷酸<400>17ggaacattttattctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸1<220><221>polyA_位點(diǎn)<222>(1)..(10)<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>tm<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(36)<223>um<400>18aaaaaaaaaaaacaactccgattgcttgcttcttuuu37<210>19<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位點(diǎn)<222>(1)..(10)<400>19aaaaaaaaaatagccctacgtgccctgcatagac34<210>20<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1c<400>20atcggagttgttacatcggtagttcgcgcaggtcgggaattacatcggtagttgtctatg60caggg65<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2c<400>21cacgtagggctatttaagaagcaagca27<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>錨定寡核苷酸<400>22gcgcaggtcgggaataaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3