本發(fā)明主張于2014年7月24日申請的美國臨時申請案第62/028,633號的優(yōu)先權(quán)，該發(fā)明的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。

【現(xiàn)有技術(shù)】

川崎氏癥(KD)(一種于較小兒童中觀測到的多系統(tǒng)炎癥)可導(dǎo)致急性血管炎，最為顯著影響冠狀動脈。在沒有治療的情況下，大約20至25％的罹患KD的兒童發(fā)展成冠狀動脈畸形(CAA)。靜脈注射用免疫球蛋白(IVIG)治療可將CAA的發(fā)病率減低至約5％，然而早期檢測是必要的。

KD診斷是困難的，尤其于早期階段。目前，KD診斷是基于臨床癥狀，包括發(fā)燒持續(xù)≥5天、兩側(cè)結(jié)膜充血無滲出物、多形性疹、唇及口變化(唇紅斑及皸裂、草莓舌、和口咽黏膜擴(kuò)散性充血)、四肢變化(手足紅斑及水腫)、以及頸部淋巴結(jié)病變(直徑≥1.5cm)。然而，KD與其他病狀間的臨床特征及實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的重疊使診斷難以確定，及尚無特定實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)。

因此，經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室分析鑒別特異性生物標(biāo)記以促進(jìn)KD診斷對于預(yù)防嚴(yán)重KD后遺癥，尤其是CAA具有價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文所述的是一種診斷個體的川崎氏癥的方法。該方法包括檢測來自疑似罹患川崎氏癥的個體的樣品中的生物標(biāo)記量，該生物標(biāo)記是IL-7F、sCD40L、MPIF-1、E-選擇素、IP-10、或IL-33；及將該量與截止量進(jìn)行比較；其中若該量高于或低于該截止量，則該個體確定為罹患川崎氏癥。于一實(shí)施例中，該生物標(biāo)記是IP-10并且若該量高于該截止量，則該個體確定為罹患川崎氏癥。該樣品可在自該個體開始發(fā)燒的0至10天(例如，5天)內(nèi)自該個體獲得。

此外，本文描述一種治療個體的川崎氏癥的方法。該方法包括檢測來自疑似罹患川崎氏癥的個體的第一樣品中的生物標(biāo)記第一量，該生物標(biāo)記是IL-7F、sCD40L、MPIF-1、E-選擇素、IP-10、或IL-33，其中該第一量高于或低于截止量；及向該個體施用針對川崎氏癥的治療。于一實(shí)施例中，該生物標(biāo)記是IP-10并且該第一量高于該截止量。該治療是靜脈注射用免疫球蛋白(IVIG)或IVIG及類固醇。第一樣品可自該個體開始發(fā)燒的0至10天(例如，5天)內(nèi)自該個體獲得。該方法可進(jìn)一步包括在施用該治療之后自該個體獲得第二樣品；檢測于該第二樣品中的生物標(biāo)記量；并且若于該第二樣品中的量高于該截止量，則繼續(xù)該治療或施用不同治療。

本文中亦揭示一種監(jiān)測個體的川崎氏癥的治療的方法。該方法包括檢測于該治療之前或期間第一時間點(diǎn)時自該個體獲得的第一樣品中的生物標(biāo)記第一量，該生物標(biāo)記是IL-7F、sCD40L、MPIF-1、E-選擇素、IP-10、或IL-33；檢測在第二時間點(diǎn)時自該個體獲得的第二樣品中的生物標(biāo)記第二量；將該第一量及與第二量進(jìn)行比較；并且基于該比較制定治療決策。該生物標(biāo)記可以是IP-10并且該治療是靜脈注射用免疫球蛋白(IVIG)。

于任一以上方法中，該樣品可以是體液樣品(例如，血液、血清、血漿、腦脊髓液、尿液、或唾液樣品)。免疫測定法可用于檢測該樣品中的生物標(biāo)記量。例如，該免疫測定法可以是ELISA、蛋白質(zhì)陣列、流式細(xì)胞計數(shù)法、建立于磁珠上的多重免疫測定、蛋白質(zhì)印跡、點(diǎn)印跡、或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)。IP-10的1,318pg/mL的截止血漿量可用于任一以上方法中。于一實(shí)施例中，該患者群體是漢族。

本文亦描述一種用于診斷個體的川崎氏癥或監(jiān)測個體的川崎氏癥的治療的試劑盒。該試劑盒可包括用于檢測生物標(biāo)記量的試劑(例如，抗體)或裝置(例如，試驗(yàn)條、固態(tài)載體、芯片或盤)。該生物標(biāo)記可以是IL-7F、sCD40L、MPIF-1、E-選擇素、IP-10或IL-33。

一或多個實(shí)施例的細(xì)節(jié)于下列描述中進(jìn)行闡述。

【附圖簡單說明】

圖1是一組顯示于川崎氏癥(KD)的急性階段期間蛋白質(zhì)量的圖。于非KD發(fā)燒對照(n＝20)及KD患者(n＝37)中使用Bio-Plex系統(tǒng)測量血漿細(xì)胞因子量。發(fā)燒對照(n＝20)及KD病例(n＝37)中的自蛋白質(zhì)陣列鑒定的血漿E-選擇素、MPIF-1、及IP-10的量是經(jīng)由酶聯(lián)免疫吸附測定法來確定。IL-17F、IL-33、sCD40L、E-選擇素、MPIF-1、及IP-10的p值分別為1.5×10^-2、4.7×10^-3、2.8×10^-2、8.6×10^-3、2.3×10^-8、及4.1×10^-11。每個點(diǎn)表示自單個個體變化＜5％標(biāo)準(zhǔn)偏差下的3次分析的平均值。*，p＜0.05、**，p＜0.01、***，p＜0.001；不成對史都登氏(Student′s)t試驗(yàn)。

圖2是一組顯示自發(fā)現(xiàn)及重復(fù)研究的發(fā)燒對照及KD患者的組合數(shù)據(jù)及具有IP-10的血漿量的川崎氏癥的預(yù)測模型的接受者操作特征(ROC)曲線的圖。于發(fā)燒對照(n＝57)及KD患者(n＝40)中的血漿IP-10量是經(jīng)由使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)來確定。發(fā)燒對照(n＝77)及KD病例(n＝77)中的那些亦使用ELISA測量。***，p＜0.001；不成對史都登氏T試驗(yàn)。每個點(diǎn)表示自單個個體變化＜5％(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)下的3次測定的平均值?；谠摻M合數(shù)據(jù)，于KD患者中的血漿IP-10量的ROC曲線是相對發(fā)燒對照繪制。生物標(biāo)記的最佳截止值是作為其最大敏感性及特異性的總和來測定。

圖3是顯示于盲法驗(yàn)證研究中的IP-10的血漿量的圖。于該驗(yàn)證研究(患者＜6歲)中(其包括發(fā)燒對照(C-F，n＝37)、不完全KD患者(K-1，n＝3)、及KD患者(K，n＝20))的血漿IP-10量是使用酶聯(lián)免疫吸附測定法來確定。誤差線表示三個平行值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖4A是顯示自開始發(fā)燒＜4天(平均值，3.4±0.90天；范圍，1至4天)或開始發(fā)燒＞5天(平均值，6.0±1.05天；范圍，5至8天)獲得的KD患者血液中的IP-10血漿量的位圖。每個點(diǎn)表示自單個個體變化＜5％(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均)下的3次分析的平均值。

圖4B是顯示在IVIG治療之前或一周之后45個KD患者的血漿IP-10量的圖。

圖5是一組顯示于急性KD患者的T細(xì)胞中的細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR3的圖。左圖：開口曲線表示經(jīng)抗CXCR3抗體染色的CD3+T細(xì)胞的熒光活化細(xì)胞篩檢器直方圖。患者KD-1至KD-6是KD的急性階段。HD表示健康供體。右圖：匯總自3個健康供體及6個急性KD患者的CD3+T細(xì)胞中的CXCR3的平均熒光強(qiáng)度的柱狀圖。**，p＜0.01，不成對史都登氏t試驗(yàn)。

【實(shí)施方式】

出乎意料地發(fā)現(xiàn)罹患KD的個體中的特定生物標(biāo)記量不同于非KD發(fā)燒癥狀個體中的。

生物標(biāo)記包括IL-17F(Genbank登錄號NP_443104)、IL-33(Genbank登錄號NP_001186570)、sCD40L(Genbank登錄號NP_001289682)、CCL23/MPIF-1(Genbank登錄號NP_665905)、E-選擇素(Genbank登錄號NP_000441)、及CXCL10/IP-10(Genbank登錄號NP 001556)。已發(fā)現(xiàn)KD患者中的IL-7F、sCD40L、MPIF-1、E-選擇素、及IP-10的量高于非KD發(fā)燒個體中的。KD患者中的IL-33量低于非KD發(fā)燒個體中的。

因此，可檢測疑似罹患KD的個體(例如顯示KD癥狀的個體)的樣品中的一或多種生物標(biāo)記量，及與其對應(yīng)預(yù)定的截止量進(jìn)行比較以判定該個體是否罹患KD。例如，若個體中的IP-10量高于對應(yīng)截止量，則指示該個體罹患KD。本文所述的任何生物標(biāo)記可用于與其他診斷試驗(yàn)、生物標(biāo)記或KD的風(fēng)險因素組合以診斷KD。

樣品可以是體液樣品，例如血液、血清、血漿、腦脊髓液、尿液、或唾液樣品。樣品中的生物標(biāo)記量可使用多種方法測定，例如ELISA、蛋白質(zhì)陣列、流式細(xì)胞計數(shù)法、建立于磁珠上的多重免疫測定法、蛋白質(zhì)印跡、點(diǎn)印跡、或ELISPOT。于一個例示性方法中，將個體的血漿或血液樣品點(diǎn)于濾紙上，其可經(jīng)干燥及儲存。然后經(jīng)干燥的血液或血漿斑點(diǎn)可用于ELISA中以檢測及量化該樣品中的生物標(biāo)記量。參見例如Aabye等人，PLoS ONE，7(6)；e39228，2012年6月。特異性識別上述生物標(biāo)記的抗體是市售的或可使用相關(guān)技藝中已知方法生產(chǎn)。

生物標(biāo)記的預(yù)定截止量(其表示非KD個體中的相同生物標(biāo)記量)可基于KD患者及非KD個體組中的生物標(biāo)記的代表量確定。非KD個體可包括具有與KD的臨床特征及/或?qū)嶒?yàn)室參數(shù)重疊的疾病或癥狀(例如，持續(xù)發(fā)燒、皮疹、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特定病毒及細(xì)菌感染(諸如猩紅熱及毒性休克癥候群)，及示于下表2中的癥狀)的個體。應(yīng)用適合統(tǒng)計分析于所獲得的生物標(biāo)記量以確定區(qū)分KD患者與非KD個體(尤其具有臨床上類似KD的癥狀的非KD個體)的截止量。

本文所述的生物標(biāo)記(例如，IP-10)可用于KD的早期診斷。例如，疑似罹患KD的個體中的生物標(biāo)記量可于該個體開始發(fā)燒的0至10天內(nèi)(例如，小于3天、小于4天、小于5天、或小于10天)檢測。然后將經(jīng)檢測的生物標(biāo)記量與對應(yīng)截止量進(jìn)行比較以確定該個體是否罹患KD。如上所述，早期診斷及因此早期介入治療可預(yù)防KD的嚴(yán)重并發(fā)癥。

一些KD患者不顯示KD的所有典型癥狀。上述方法可用于此種KD病例(即，不完全或非典型KD)的診斷。

使用一或多種上述生物標(biāo)記確定個體罹患KD之后，可施用針對KD的治療給該個體。早期治療降低個體的冠狀并發(fā)癥的風(fēng)險。IVIG已顯示可使患者退燒及降低發(fā)展冠狀畸形的風(fēng)險。此外，可用阿司匹林控制發(fā)燒。一些患者可能需要第二劑量的IVIG以退燒。一些患者對IVIG無反應(yīng)。在那些情況中，可向該個體施用其他治療。此種替代治療包括抗TNF-α抗體(例如，英利昔單抗(Infliximab))及IVIG與類固醇的組合。

任何上述生物標(biāo)記亦可用于監(jiān)測KD的治療。經(jīng)歷KD治療(例如，IVIG)的患者中的KD生物標(biāo)記量可在多個時間點(diǎn)(例如，在治療之前及在開始治療之后的一周內(nèi)的一或多個時間點(diǎn))處測定。在治療期間，生物標(biāo)記量趨向其對應(yīng)截止量的變化指示該治療是有效的。例如，于一時間點(diǎn)處的患者的IP-10量比于早期時間點(diǎn)處的量更低指示該治療是有效的。若于后期時間點(diǎn)處的生物標(biāo)記量等于或不顯著不同于在早期時間點(diǎn)處的量(例如，于開始治療之前或剛好于開始治療之后)，則指示該治療需繼續(xù)(例如，等于或高于前劑量的IVIG的另一劑量)或需施用替代治療。換言之，在治療期間的個體中的KD生物標(biāo)記量可用于制定治療決策(例如，繼續(xù)或終止治療，或施用不同治療)。

此外，任何上述生物標(biāo)記亦可用于評估針對KD的候選化合物或治療的療效。KD生物標(biāo)記量可于向個體施用該化合物或治療之前、期間、及/或之后測定。

用于診斷或監(jiān)測KD的治療的試劑盒可包括用于檢測KD生物標(biāo)記(例如，IP-10)量的試劑或裝置(例如，試驗(yàn)條、固態(tài)載體、或盤)。該試劑可以是特異性針對KD生物標(biāo)記的抗體。該裝置亦可包括(例如，涂覆)特異性針對KD生物標(biāo)記的抗體。

下列具體實(shí)例僅視為說明，而不絕以任何方式限制本發(fā)明剩余部分。在沒有進(jìn)一步詳細(xì)闡述情況下，據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于本文的說明，最大限度地利用本發(fā)明。本文所引述的所有公開案以全文引用的方式并入本文中。此外，以下所提出的任何機(jī)制不以任何方式限制本申請專利范圍的范圍。

實(shí)施例

我們登記214名具有發(fā)燒及KD臨床特征暗示的兒童。他們中僅100名經(jīng)診斷為KD。使用無偏、大規(guī)模、定量蛋白質(zhì)陣列全面分析其血漿樣品的細(xì)胞因子、趨化因子、及細(xì)胞黏附分子。此研究分3個階段進(jìn)行：發(fā)現(xiàn)、重復(fù)、及盲法驗(yàn)證。于發(fā)現(xiàn)階段期間[n(KD)＝37，n(對照)＝20]，相比于對照，KD患者在急性階段期間的介白素-17F、sCD40L、E-選擇素、CCL23(MPIF-1)、及CXCL 10(IP-10)的表達(dá)上調(diào)。觀察到IP-10量的顯著增加(KD，3,037±226.7pg/mL；對照，672±130.4pg/mL；p＝4.1×10^-11)。組合的發(fā)現(xiàn)及重復(fù)數(shù)據(jù)(n(KD)＝77，n(對照)＝77)的接受者操作特征分析顯示，IP-10量具有高曲線下面積值(0.94[95％置信區(qū)間，0.9055-0.9778]；敏感性，100％；及特異性，77％)。在最佳截止值為1,138pg/mL下，盲法驗(yàn)證研究證實(shí)IP-10量是KD的良好預(yù)測器。在靜脈注射用免疫球蛋白治療下，IP-10量回到正常。IP-10、CXCR3的下游受體于急性KD患者的T細(xì)胞中被活化。

該研究是由中國醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(China Medical University Hospital)、高雄長庚紀(jì)念醫(yī)院(Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital)、及臺灣中央研究院的機(jī)構(gòu)評審組(Institutional Review Board)及機(jī)構(gòu)評審組的倫理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。自個體及其家長獲得書面知情同意書。

患者

我們登記214名具有發(fā)燒及KD臨床特征暗示的漢族兒童。他們中僅100名經(jīng)最終診斷為KD。此種KD兒童的人口統(tǒng)計學(xué)及臨床特征顯示于表1。最終診斷為非KD的114名兒童顯示于表2。

參與該研究的兒童是自臺灣的不同地理區(qū)域的醫(yī)療中心招募，長庚紀(jì)念醫(yī)院系統(tǒng)(包括于臺灣南部及北部的四個醫(yī)院)及中國醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)療中心(包括于臺灣中部的3個地區(qū)醫(yī)院)。KD是使用已知臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。參見Newburger等人，Pediatrics.2004；114：1708-1733；及Kim及Dedeoglu，Curr Opin Pediatr.2005；17：695-702。100個KD患者中，37個是包含于研究的發(fā)現(xiàn)階段，40個包含于重復(fù)階段，及23個包含于盲法驗(yàn)證階段，其包括3個具有不完全KD表現(xiàn)的患者(iKD是定義為存在≤4種日本標(biāo)準(zhǔn)的主要癥狀)。參見Newburger等人，Circulation.2004；110：2747-2771。

表1 此研究中登記的患者的人口統(tǒng)計學(xué)及臨床特征

所有變量數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。KD，川崎氏癥；FC，發(fā)燒對照。

表2. 214例兒童患者的最終診斷

細(xì)胞因子、趨化因子、及細(xì)胞黏附分子的多重分析及量化

將獲自研究個體的新鮮肝素化血樣以2,000g離心10min。然后將血漿樣品分成等分試樣及儲存于-80℃以供進(jìn)一步分析。樣品以一式兩份使用Bio-Plex Pro^TM人類Th-17細(xì)胞因子板15-Plex(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)運(yùn)行。將細(xì)胞因子的完整清單(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、IFN-γ、sCD40L、及腫瘤壞死因子[TNF]-α)以此種分群量化，其檢測限值及再現(xiàn)性提供于產(chǎn)品手冊中。使用15不同組載有對各細(xì)胞因子特異的捕捉單抗的熒光染色珠粒。使用Bio-Plex蛋白質(zhì)陣列系統(tǒng)(Bio-Rad)測量及量化信號。使用與Bio-Plex管理軟件版本3.0(Bio-Rad)整合的Bio-Plex蛋白質(zhì)陣列系統(tǒng)進(jìn)行分析。使用Bio-Plex校準(zhǔn)試劑盒(Bio-Rad)調(diào)整報告子共軛物發(fā)射波長。使用Bio-Plex驗(yàn)證試劑盒版本3.0(Bio-Rad)驗(yàn)證個別珠粒特征的流體力學(xué)性能、一致光學(xué)對準(zhǔn)、雙黏體(doublet)辨別及鑒定。針對初始篩選，使用人類蛋白質(zhì)陣列(AAH-CYT-G8-8；Raybiotech Inc.，Norcross，GA，USA)檢測6個KD患者的血漿，該陣列評估54種趨化因子及CAM以鑒定在KD中顯示表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)。完全趨化因子/CAM名稱可于raybiotech.com網(wǎng)站中得到。經(jīng)由使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)來進(jìn)一步量化剩余KD患者中經(jīng)鑒定的上調(diào)基因，即，IL-9、IP-10、E-選擇素、及MPIF-1。E-選擇素、MPIF-1、及IP-10ELISA的檢測限度分別是30pg/mL、7pg/mL、及8pg/mL。驗(yàn)證IP-10的再現(xiàn)性(組內(nèi)測定法(intra-assay)：CV＜10％；組間測定法(inter-assay)：CV＜12％)及特異性；此ELISA試劑盒顯示與所試驗(yàn)的任何細(xì)胞因子無交叉反應(yīng)性。根據(jù)制造商說明書(RayBiotech Inc.)，稀釋范圍為1∶2至1∶20。

流式細(xì)胞計數(shù)法

周邊血液單核細(xì)胞是經(jīng)由Ficoll-Isopaque密度梯度分離法(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)自肝素化血液分離。使用識別人類CD3(UCHTI；BD Biosciences，San Jose，CA，USA)或CXCR3(IC6/CXCR3；BD Biosciences)的獨(dú)特?zé)晒馊玖暇Y合的單抗進(jìn)行免疫表型分析。在PBMC細(xì)胞經(jīng)稀釋抗體(1∶200)于室溫下培養(yǎng)1小時后，其經(jīng)由使用FACS Calibur裝置(BD Biosciences)的多色流式細(xì)胞計數(shù)法檢測。使用CellQuest獲取軟件(BD Biosciences)獲得數(shù)據(jù)，及針對每個實(shí)驗(yàn)中的分析記錄0.5至2.0×10⁶個結(jié)果。

統(tǒng)計分析

使用不成對史都登氏t試驗(yàn)及Prism4軟件(GraphPad，San Diego，CA，USA)評估統(tǒng)計顯著性。使用SAS軟件，版本9.3(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)進(jìn)行接受者操作特征(ROC)曲線分析。ROC曲線繪制敏感性及1-特異性的圖及提供敏感性及特異性跨連續(xù)預(yù)測器的一系列截止點(diǎn)的匯總。使用方差分析及邏輯回歸分析測定組間差異。每個候選生物標(biāo)記的最佳截止值作為其最大敏感性及特異性的總和來測定。

血漿譜：發(fā)現(xiàn)研究

使用細(xì)胞因子多重系統(tǒng)及蛋白質(zhì)陣列，總共分析69個炎癥細(xì)胞因子。在初始篩選中，測定20個非KD發(fā)燒對照及37個KD患者中的15個細(xì)胞因子的血漿量。KD患者中的IL-17F及sCD40L的量顯著高于發(fā)燒對照。參見圖1。發(fā)現(xiàn)僅一個細(xì)胞因子IL-33下調(diào)。參見圖1。雖然IL-1β在KD小鼠模型中的冠狀病變發(fā)展中具關(guān)鍵性，于本研究中，急性KD患者中的IL-1β的血漿量沒有顯著提高(數(shù)據(jù)未顯示)。

針對剩余54種炎癥細(xì)胞因子及CAM，使用蛋白質(zhì)組方法來鑒定于隨機(jī)選自發(fā)現(xiàn)階段的6個KD患者的急性階段期間所獲得的一組血漿樣品中的候選生物標(biāo)記。將此種數(shù)據(jù)與那些具有非KD發(fā)燒及皮疹的對照進(jìn)行比較。KD患者中的10種細(xì)胞因子或CAM的平均表達(dá)量至少高于對照1.3倍。參見表3。于這10種蛋白質(zhì)中，KD患者中的IL-9、IP-10、E-選擇素、及MPIF-1的平均表達(dá)顯示至少增加2倍，及于所有6個所試驗(yàn)患者中發(fā)現(xiàn)此結(jié)果。此外，急性階段KD患者中的PDGF-AA、IL-2R-α、CD14、IGF-II、及Siglec-5基因下調(diào)，此顯示比對照下降至少1.8倍(＜60％，數(shù)據(jù)未顯示)。然后以較大樣品尺寸(20個非KD發(fā)燒對照及37個KD患者)進(jìn)行ELISA以量化候選生物標(biāo)記(IL-9、IP-10、E-選擇素、及MPIF-1)。針對急性階段KD患者，與蛋白質(zhì)陣列數(shù)據(jù)一致，IP-10、MPIF-1、及E-選擇素量存在顯著增加。參見圖1。然而，當(dāng)樣品尺寸增加時，IL-9量的增加變得不顯著(數(shù)據(jù)未顯示)。于6個候選KD生物標(biāo)記(IL-17F、IL-33、sCD40L、E-選擇素、MPIF-1、及IP-10)中，相比于對照(672±130.4pg/mL)，KD患者中的IP-10(3,037±226.7pg/mL)顯示最顯著的增加(KD患者的值相對于非KD發(fā)燒對照的值，p值＝4.1×10^-11)。參見圖1。

表3 自急性階段川崎氏癥(KD)患者的血漿的10種所選擇的編碼趨化因子及CAM的候選基因的信號強(qiáng)度

所有測試以一式兩份進(jìn)行。內(nèi)部陰性對照用于測定正信號的截止率。使用蛋白質(zhì)陣列篩選6個KD患者及2個對照(Ctr)個體。Ctr-1是具有非KD發(fā)燒的兒童個體。Ctr-2是正常健康個體。僅顯示超過1.3的趨化因子及CAM的KD/Ctr比(KD患者的平均值/對照病例的平均值)。

IP-10量：重復(fù)研究及組合研究

為了進(jìn)一步驗(yàn)證IP-10的作用，進(jìn)行包含額外40個KD患者及57個非KD發(fā)燒對照的重復(fù)研究。如圖2顯示(上左圖)，此研究亦顯示相對在那些發(fā)燒對照中的，KD患者中的IP-10量顯著增加。當(dāng)將自重復(fù)研究的數(shù)據(jù)與那些發(fā)現(xiàn)研究中的組合時(組合研究)，相比于77個非KD發(fā)燒對照(921±106.2pg/mL)，77個KD患者的IP-10量(3,587±210.2pg/mL)顯著增加(KD患者的值相對于非KD發(fā)燒對照的值，p值＝2.8×10^-20)。參見圖2(上右圖)。

為了進(jìn)一步確認(rèn)IP-10作為KD診斷中的生物標(biāo)記的作用，使用自組合研究的IP-10值進(jìn)行ROC曲線分析。當(dāng)非KD發(fā)燒患者用作對照時，IP-10顯示0.94的極高的曲線下面積(AUC)值(95％置信區(qū)間，0.9055-0.9778)。參見圖2(下圖)。如經(jīng)由最大敏感性及特異性的總和所定義，以1,138pg/mL的血漿IP-10量作為最佳截止值，相比于非KD發(fā)燒對照，IP-10顯示高敏感性(100％)及特異性(77％)。參見圖2(下圖)。

盲法驗(yàn)證研究

最后研究階段使用來自60個疑似罹患KD的兒童的血漿樣品進(jìn)行。測量以盲法方式示蹤的樣品中的血漿IP-10量，及結(jié)果是非盲法及進(jìn)行分析。使用1,318pg/mL的截止值，29個樣品是IP-10陽性且31個是IP-10陰性。29個IP-10陽性樣品中的22個經(jīng)成功診斷為KD(包括2個iKD病例)；剩余7個樣品經(jīng)診斷為非KD發(fā)燒。參見圖3。31個IP-10陰性樣品中30個來自非KD發(fā)燒對照及1個是iKD患者?？傃灾?，1,318pg/mL的IP-10截止值顯示良好區(qū)分23個KD患者及37個非KD發(fā)燒對照的能力(敏感性，96％[22/23]；特異性，81％[30/37])。

血漿IP-10量與發(fā)燒時限及靜脈注射用免疫球蛋白治療的關(guān)聯(lián)

為了確定增加的IP-10量是否可于KD早期階段檢測到，檢測自開始發(fā)燒的4天內(nèi)(平均值，3.4±0.90天；范圍，1至4天)獲得的37個KD樣品，及將結(jié)果與疾病后期階段(平均值，開始發(fā)燒的6.0±1.05天；范圍，5至8天)獲得的46個樣品的那些進(jìn)行比較。于早期疾病階段的IP-10量顯著增加(3,054±331.0pg/mL)。參見圖4A。使用1,318pg/mL作為最佳截止值，37個KD患者中81％(30個)于非常早期階段(＜4天)經(jīng)鑒定，同時46個KD患者中96％(44個)于急性階段(＞5天)中經(jīng)鑒定。

亦于開始IVIG治療之前或一周之后檢測45個患者中的IP-10量。在IVIG治療下，于治療之前的高IP-10量回歸正常(治療之前，3,323±224.9pg/mL；治療之后，348±64.8pg/mL)，除1個抵抗第一輪IVIG治療及需要第二次治療的KD患者之外。參見圖4B。

于T細(xì)胞中的細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR3

IP-10下調(diào)于T細(xì)胞中的細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR3。為了確定KD患者的增加的IP-10量的下游效應(yīng)，分析于6個KD患者的T細(xì)胞中的CXCR3的細(xì)胞表面表達(dá)。測量CD3⁺T細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)，及相比于3個健康供體的MFI，急性階段KD患者中的MFI3.3倍下降。參見圖5。于撤消階段，CXCR3的表達(dá)量恢復(fù)正常(數(shù)據(jù)未顯示)。

其他實(shí)施例

本說明書揭示的所有特征可以任何組合組合。本說明書揭示的每個特征可經(jīng)由用于相同、相當(dāng)、或類似目的的替代特征替代。因此，除非另有明確說明，否則所揭示的每個特征僅是一系列相當(dāng)或類似特征的一實(shí)例。

許多實(shí)施例已進(jìn)行描述。然而，應(yīng)了解可在不偏離本發(fā)明之精神及范圍下作出多種改良。因此，其他實(shí)施例于下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。