本申請要求2014年8月13日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/037,006和2015年1月8日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/101,143的利益，所述臨時(shí)專利申請通過引用以其整體并入本文中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及電化學(xué)傳感領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在過去的40年中，慢性壓力(stress)已經(jīng)與廣泛和不斷增長的各種人類最致命和改變生活的疾病具有越來越多的牽連。所述疾病包括嚴(yán)重的病癥如糖尿病，阿爾茨海默氏癥，心臟病發(fā)作，抑郁癥，骨質(zhì)疏松癥和免疫抑制，以及非致命性、但仍不幸的問題如普通感冒，背痛，甚至勃起功能障礙。實(shí)際上，科技文獻(xiàn)顯示在發(fā)達(dá)國家壓力對壽命預(yù)期的影響超過遺傳學(xué)和行為因素例如吸煙。

鑒于壓力對全球的人類生命和健康的影響巨大，在人口大規(guī)模檢測和治療壓力方面具有很大的潛力。雖然壓力通常被描述為主觀情緒狀態(tài)，但它在醫(yī)學(xué)上具有重要的生化和生理效應(yīng)。這些效應(yīng)可以被量化，例如一組特定的激素包括糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺的增長水平。然而，即使在升高的情況下，這些激素在眼淚、唾液和血清中的生理濃度經(jīng)常極低(分別為38.9±15.5，46.3±16.0和489.7±177.4nM)，使得精確測量是持續(xù)的技術(shù)挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

已經(jīng)制備了使用微流體淚液捕捉系統(tǒng)的改進(jìn)的電化學(xué)傳感器，以檢測與壓力和/或創(chuàng)傷有關(guān)的生物分子，例如皮質(zhì)醇。另外，可以利用其他體液例如唾液或血液。

在一個(gè)實(shí)施方式中，使用零長度交聯(lián)劑N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺和10mM N-羥基磺基琥珀酰亞胺將單克隆抗體共價(jià)連接至16-巰基十六烷酸官能化的金工作電極。在磷酸鹽緩沖鹽水(模擬淚液)中使用簡單的亞鐵氰化物試劑在18.73pM的檢測下限和小于10％的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差下檢測皮質(zhì)醇。本文中示出的皮質(zhì)醇測定法以無標(biāo)記且快速響應(yīng)的構(gòu)造保持高的重現(xiàn)性和極低的檢測水平，具有高于眼淚皮質(zhì)醇檢測所足夠的靈敏度。

本文公開的實(shí)施方式的這些和其他方面將在參考以下詳細(xì)的說明和附圖的情況下變得更清楚。

附圖說明

圖1.A.具有三電極系統(tǒng)的設(shè)備的實(shí)施方式的基本方案，所述三電極系統(tǒng)包括(a)Ag/AgCl參比電極，(b)感測井，(c)樣品，(d)Au工作電極，(e)GDE和(f)Pt對電極。注意所有材料是示例性的并且可以被其他適合的材料所代替。另外，示意性地描繪了與該設(shè)備呈可操作連接的可多路復(fù)用的電化學(xué)阻抗光譜術(shù)(multiplexible electrochemical impedance spectroscopy)(MEIS)系統(tǒng)。B.具有靶(a)皮質(zhì)醇的樣品被放置在金工作電極表面上的共價(jià)固定單克隆抗體(MAb)的表面上的感測井內(nèi)，其中利用16-MHDA(c)和EDC/NHS將MAb(b)共價(jià)固定在金表面(d)上。樣品中的皮質(zhì)醇(a)靶與MAb結(jié)合。

圖2.在皮質(zhì)醇靶溶液中運(yùn)行九種不同的MAb固定的電極的尼奎斯特(Nyquist)圖，所述皮質(zhì)醇靶溶液為：(a)0pg/ml，(b)1pg/ml，(c)5pg/ml，(d)10pg/ml，(e)50pg/ml，(f)100pg/ml，(g)500pg/ml，(h)1000pg/ml，(i)5000pg/ml，和(j)10000pg/ml，在具有100mM亞鐵氰化鉀氧化還原探針的PBS緩沖液中。

圖3A描繪了從濃度梯度，相對于頻率得到和繪制的(a)斜率和(b)R平方(擬合的密封性)的計(jì)算以確定檢測的最佳頻率。

圖3B.使用了在1.184Hz下的阻抗并且在生理范圍以及超出生理范圍的范圍上相對于PBS中的皮質(zhì)醇的濃度繪圖，顯示傳感器的動態(tài)范圍(n＝3)。在最高濃度方差處觀察到31.672歐姆/pg/ml的斜率，R2為0.9532，RSD為10％。

圖4.A.具有三電極系統(tǒng)的設(shè)備的實(shí)施方式的基本方案，所述三電極系統(tǒng)包括(a)Ag/AgCl參比電極，(b)感測井，(c)樣品，(d)Au工作電極，(e)GDE和(f)Pt對電極。注意所有材料是示例性的并且可以被其他適合的材料所代替。另外，示意性地描繪了與該設(shè)備呈可操作連接的可多路復(fù)用的電化學(xué)阻抗光譜術(shù)(MEIS)系統(tǒng)。B.具有靶(a)皮質(zhì)醇的樣品被放置在金工作電極表面上的共價(jià)固定單克隆抗體(MAb)的表面上的感測井內(nèi)，其中利用16-MHDA(c)和EDC/NHS將MAb(b)共價(jià)固定在金表面(d)上。樣品中的皮質(zhì)醇(a)靶與MAb結(jié)合。

圖5A-5I.在模擬淚液中的生物標(biāo)記物的檢測。用于皮質(zhì)醇設(shè)備中以將測得的阻抗與皮質(zhì)醇的濃度關(guān)聯(lián)的校正曲線，以及顯示通過本發(fā)明的設(shè)備對許多不同生物分子進(jìn)行檢測的圖。

圖6A-6F顯示了血液中的生物標(biāo)記物檢測數(shù)據(jù)的示意圖。

圖7描繪了生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)的總結(jié)。

圖8.皮質(zhì)醇干擾物試驗(yàn)結(jié)果。描繪了相對于提供的標(biāo)準(zhǔn)從使用IgG抗-皮質(zhì)醇抗體的ELISA測定法得到的信噪比，通常皮質(zhì)醇梯度，和各分析物的在200pg/mL下的試驗(yàn)干擾物。

圖9描繪了應(yīng)用循環(huán)伏安法的壓力生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)的總結(jié)。

圖10描繪了應(yīng)用測量電流技術(shù)的壓力生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)。

圖11描繪了應(yīng)用SWV(方波伏安法)技術(shù)的壓力生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

雖然血液已經(jīng)在歷史上作為標(biāo)準(zhǔn)的診斷試驗(yàn)液體，但近年來由于三個(gè)主要原因，淚液作為有力的感測介質(zhì)已經(jīng)獲得了關(guān)注。首先，淚膜包括大量的生物標(biāo)記物。第二，相比從患者處獲得血液來說，獲得淚液相對容易，這使得淚液成為診斷試驗(yàn)中血液的理想替代物。最后，淚液，與唾液相似，在組成上比血液更簡單，并且包括更少的可能干擾電化學(xué)感測的蛋白質(zhì)。

雖然在使用淚液時(shí)具有一些缺點(diǎn)(例如可獲得體積和靶濃度遠(yuǎn)小于血液)，但由于其更容易且更少侵入的取樣和來自非靶物質(zhì)的較少的背景干擾導(dǎo)致的更好的傳感器性能的優(yōu)點(diǎn)勝過了這些缺點(diǎn)，證明了淚膜是用于壓力傳感器的的理想診斷液體，同時(shí)仍然包括可檢測水平的皮質(zhì)醇。

因此，在本文公開的一個(gè)方面中，絲網(wǎng)印刷電極(其一個(gè)實(shí)施方式如圖1A-B所示)，通過將樣品帶到試劑的新型微流體捕捉系統(tǒng)捕捉淚液樣品，且被封裝在傳感器自身的介孔碳墨中的用于皮質(zhì)醇(或在眼淚中發(fā)現(xiàn)的其他壓力標(biāo)記物)的一種或多種分子識別單元已經(jīng)使用快速的、無標(biāo)記且可多路復(fù)用的電化學(xué)阻抗光譜術(shù)(MEIS)得到發(fā)展，其可以用于護(hù)理/損傷的點(diǎn)處。分子識別單元可以包含抗體、適體、肽、合成抗體(synbody)、核酸、觸手探針、蛋白質(zhì)等中的一種或多種。并且，介孔碳墨已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)阻擋干擾物，得到更好的試驗(yàn)結(jié)果。

雖然壓力經(jīng)常被描述為主觀情緒狀態(tài)，但已經(jīng)顯示它具有重要的生化和生理效應(yīng)，對人體健康具有驚人的影響。因此，通過感測生化標(biāo)記物來監(jiān)測壓力水平在對壓力管理產(chǎn)生驚人影響的方面具有潛力。電化學(xué)阻抗光譜術(shù)(EIS)是一種這樣的感測方法，其成功地用于多種極低濃度靶的無標(biāo)記檢測中，所述極低濃度靶包括全細(xì)胞、蛋白生物標(biāo)記物，和小分子靶。相比其他電化學(xué)方法，EIS具有的優(yōu)勢包括速度(每次測試90秒)、簡單性(不像“夾心”測定法那樣需要標(biāo)記)和靈敏度(低于許多其他方法的檢測限的皮摩爾-濃度靶的檢測)。該無標(biāo)記感測能力和極低的檢測限使得EIS成為用于眼淚中皮質(zhì)醇的理想的感測機(jī)制。

實(shí)施例1

將標(biāo)準(zhǔn)的三電極系統(tǒng)用于阻抗光譜術(shù)檢測。該系統(tǒng)包含Ag/AgCl參比電極(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)，金盤工作電極(GDE)(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)，和鉑對電極(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)，抗-皮質(zhì)醇抗體(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)共價(jià)連接到工作電極表面以檢測樣品溶液中的皮質(zhì)醇。1000μL移液頭(VWR International公司，拉德諾，賓夕法尼亞州)帶有被剃刀減掉的尖端并且被緊密地安裝到GDE上以形成能夠盛放大約0.2ml樣品液體的塑料“井”。該系統(tǒng)的示意圖顯示在圖1中。

除非另外指明，將pH為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(EMD Biosciences公司，拉霍亞，加利福尼亞州)用于制備所有溶液。為了將抗-皮質(zhì)醇抗體固定到金盤電極(GDE)的表面上，將GDE首先在3μm氧化鋁磨粒(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)上進(jìn)行120次8字形濕磨，并且用蒸餾水洗滌。接著利用1μm以及接下來的0.05μm的磨粒(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)重復(fù)120次8字形打磨，之后將GDE在蒸餾水中超聲20分鐘。接著，將100μL的1mM 16-巰基十六烷酸(16-MHDA)(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)的試劑級乙醇溶液放入感測井內(nèi)并且在室溫下用石蠟?zāi)っ芊?小時(shí)。接下來，將GDE的表面和側(cè)面和感測井仔細(xì)地利用蒸餾水洗滌。對照EIS檢測在16-MHDA-官能化的GDE上實(shí)施，使用在PBS緩沖液中的100mM亞鐵氰化鉀(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)的“氧化還原探針”以確保足夠并且相似量的MHDA被固定到每個(gè)GDE上。這通過分析每個(gè)單個(gè)的GDE的阻抗響應(yīng)以獲得彼此的相似性來確定。

接著，將100μL包含40mM N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)(Pierce Biotechnology公司)和10mM N-羥基磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)(VWR international公司)的PBS溶液放入感測井內(nèi)。在室溫下溫育1個(gè)小時(shí)后，將電極用PBS緩沖液洗滌。接著，將抗皮質(zhì)醇IgG(Aldrich公司)在PBS緩沖液中的10μg/ml溶液的100μL液滴放在電極上并且在室溫下放置1小時(shí)，接著用PBS緩沖液沖洗。最后，將100μL的1mM乙醇胺(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)的蒸餾水溶液加入感測井內(nèi)并且在室溫下溫育30分鐘以阻擋16-MHDA和EDC/NHS的所有未反應(yīng)的羧基基團(tuán)。接著將電極用PBS緩沖液仔細(xì)地洗滌并且在4℃下存放于PBS中直至使用。

電化學(xué)阻抗測量使用CHI660C電化學(xué)工作站(CH儀器公司，休斯頓，德克薩斯州)實(shí)施。在氧化還原探針溶液中制備濃度從0到10,000pg/mL(0至27.59nM)的皮質(zhì)醇(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)樣品并存放于4℃下直至使用。接著將每個(gè)皮質(zhì)醇濃度在每個(gè)抗體固定電極上檢測。

對于每個(gè)檢測，將100μL的皮質(zhì)醇和氧化還原探針溶液放置在抗體固定GDE的感測井內(nèi)。施加到樣品的AC電壓具有5mV的振幅，式電位(DC偏移)為150mV，通過在具有氧化還原探針的裸(固定前)電極上運(yùn)行CV來確定。在從1到100,000Hz的頻率范圍內(nèi)于90秒掃描內(nèi)施加AC電壓，并且對于該樣品在各頻率下記錄阻抗大小和相位。對于每個(gè)樣品于尼奎斯特圖中計(jì)算和繪制實(shí)部(real)和虛部(imaginary)阻抗。在每次檢測后，在加入下一個(gè)樣品前將GDE和感測井用PBS徹底洗滌。

對于每個(gè)電極在每個(gè)AC頻率下測試，將在每個(gè)皮質(zhì)醇濃度下的阻抗大小與log(濃度)關(guān)聯(lián)，并計(jì)算斜率和R²。將阻抗斜率和R²值相對于頻率分別繪制，從而尋找導(dǎo)致高斜率和R²的最佳平衡的頻率。在該“最佳”頻率下檢測的阻抗值接著被用于產(chǎn)生最終的濃度梯度，從而使得能夠從阻抗估測得到皮質(zhì)醇濃度。

裸、固定了抗體、并結(jié)合了生物標(biāo)記物(皮質(zhì)醇)的電極的AC掃描產(chǎn)生了尼奎斯特圖。結(jié)合到一個(gè)代表性電極上的9種不同濃度的皮質(zhì)醇的尼奎斯特圖顯示于圖2中。隨著樣品皮質(zhì)醇濃度的增加，更多的皮質(zhì)醇結(jié)合到電極表面上的抗體，由此在所有頻率下阻抗大小增加，并將尼奎斯特圖從原點(diǎn)進(jìn)一步拉遠(yuǎn)。

如所期望的，當(dāng)離體的和因此結(jié)合到抗體的生物標(biāo)記物濃度增加時(shí)，通過系統(tǒng)檢測到的阻抗(和因此得到的信號)也會增加。

阻抗對靶濃度的關(guān)聯(lián)圖的斜率和R²作為AC電壓頻率的函數(shù)而變化。一個(gè)代表性電極顯示于圖3a中。較大的斜率是期望的，因?yàn)樗c較大的信號大小對應(yīng)(在不同皮質(zhì)醇濃度之間的阻抗值的較大差別)，其更容易在低的相對誤差下檢測。較大的R²是期望的，因?yàn)樗硎驹谒鰴z測中提供的皮質(zhì)醇濃度的估計(jì)值具有更高的準(zhǔn)確度。在圖3a中可以看到R²對于低于100Hz的頻率范圍來說是相當(dāng)高的，但是斜率在非常低的頻率處尤其是最好的(最大)，并且斜率隨著頻率增加迅速降低。對于所有被測電極來說，對于最大斜率的最佳頻率被發(fā)現(xiàn)是1.18Hz。因此，這是評估的最佳頻率，在此頻率下皮質(zhì)醇-抗體相互作用通過EIS被最有效地檢測。

在該頻率(1.18Hz)下，匯編了多個(gè)傳感器的阻抗數(shù)據(jù)，并相對于響應(yīng)濃度繪圖，以生成阻抗梯度，如圖3b所示。該梯度顯示了該方法在檢測淚液中極低濃度的皮質(zhì)醇方面的無可挑剔的準(zhǔn)確度。從檢測下限(LLD)的標(biāo)準(zhǔn)分析定義，即3.3*斜率除以標(biāo)準(zhǔn)偏差，在每個(gè)樣品90秒檢測時(shí)間下確定了6.79pg/mL(18.73pM)的LLD。這以高準(zhǔn)確度清楚地鑒定了所測眼淚的皮質(zhì)醇水平，并且在每個(gè)濃度下傳感器間的差異＜10％。

18.73pM的LLD比淚液中約40nM的典型皮質(zhì)醇濃度范圍低三個(gè)整數(shù)量級，這乍一看對于淚液感測應(yīng)用似乎是非常高的靈敏度水平。但實(shí)際上，這種超靈敏檢測正是使該皮質(zhì)醇測定法可從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)變?yōu)槲锢碚鎸?shí)世界傳感器裝置所需要的?？芍噩F(xiàn)和可靠的傳感器需要不僅在電化學(xué)測定法而且在物理裝置實(shí)現(xiàn)中的小的差異。眼淚樣品大小不太可能超過10微升體積，因?yàn)闆]有很多淚液可以被收集，并且一些體積將不可避免地由于粘附到將樣品從眼表面帶到感測電極所需的采樣系統(tǒng)或其他流體裝置的壁而損失。

結(jié)果是，確保在電化學(xué)感測區(qū)域(官能化的電極)中的一致的可重現(xiàn)體積的液體在沒有增加體積-通過已知系數(shù)(其可以接著被考慮以計(jì)算原始樣品濃度)稀釋靶濃度的情況下是極度困難的。另外，眼淚不包括高濃度的氧化還原中介物，例如亞鐵氰化物，其在電化學(xué)工作中是需要的。因此，對于實(shí)際的傳感器裝置來說以下是困難的：避免用另外的試劑稀釋40nM左右的皮質(zhì)醇，以便將總液體體積增加到確保每次均能夠達(dá)到官能化的電極區(qū)域的一致體積的可工作量，并且提供用于傳感器電化學(xué)的足夠的中介物濃度。為此，商業(yè)上可行的淚液皮質(zhì)醇傳感器必須提供不在1-100nM范圍內(nèi)，而是在低于10nM范圍(例如當(dāng)具有不正常低的皮質(zhì)醇水平的樣品被設(shè)備在處理過程中甚至進(jìn)一步稀釋)內(nèi)的可重復(fù)測量。

這正是本文提出的基于EIS的測定法所允許的。具有低于0.02nM的LLD，具有40nM皮質(zhì)醇的10μL眼淚樣品可以被稀釋100x，并且仍然良好地處在基于EIS的皮質(zhì)醇傳感器的線性范圍內(nèi)。此處所示的皮質(zhì)醇測定法因此更能夠滿足辨別眼淚中低皮質(zhì)醇濃度的技術(shù)挑戰(zhàn)。

在該工作中，非常低濃度的皮質(zhì)醇的檢測通過使用簡單的且無標(biāo)記的基于EIS的生物傳感器被證明具有重現(xiàn)性和高靈敏度。復(fù)制的傳感器組件在1.184Hz處具有最佳結(jié)合，具有重現(xiàn)性，具有在10％相對標(biāo)準(zhǔn)偏差下的最高變異性。匹配程度被檢測為0.9532，具有31.672歐姆/pg/mL的響應(yīng)率和18.73pM的檢測下限。該工作表明對皮質(zhì)醇水平的微小變化可以準(zhǔn)確和快速的測量，即使少到如通常在人類淚液里發(fā)現(xiàn)的那些一樣，也是在技術(shù)上可行的；即使在考慮為了重現(xiàn)性性能，可能需要進(jìn)一步稀釋已經(jīng)低濃度的靶的物理傳感器設(shè)計(jì)的實(shí)用性之后，其也是可行的。

在本文公開的另一個(gè)方面中，絲網(wǎng)印刷電極(其一個(gè)實(shí)施方式如圖4所示)，通過將樣品帶到試劑的新型微流體捕捉系統(tǒng)捕捉體液樣品，且被封裝在傳感器自身的介孔碳墨中的用于皮質(zhì)醇(或在液體中發(fā)現(xiàn)的其他壓力標(biāo)記物)的一種或多種分子識別單元已經(jīng)使用快速的、無標(biāo)記且可多路復(fù)用的電化學(xué)阻抗光譜術(shù)(MEIS)得到發(fā)展，其可以用于護(hù)理/損傷的點(diǎn)處。雖然在該實(shí)施方式中使用了淚液，但血液也可以被使用，如圖6中所示。

分子識別單元可以包含抗體、適體、肽、合成抗體、核酸、觸手探針、蛋白質(zhì)等中的一種或多種。并且，介孔碳墨已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)阻擋干擾物，得到更好的試驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)施例2

雖然以下實(shí)施例是用于皮質(zhì)醇的檢測，但類似的方案被用于檢測其他目標(biāo)生物分子。淚液或血液被用于該實(shí)施例，但是也可以使用其他體液。

將標(biāo)準(zhǔn)的三電極系統(tǒng)用于阻抗光譜術(shù)檢測。該系統(tǒng)包含Ag/AgCl參比電極(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)，金盤工作電極(GDE)(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)，和鉑對電極(CH儀器，奧斯汀，德克薩斯州)，抗-皮質(zhì)醇抗體(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)共價(jià)連接到工作電極表面以檢測樣品溶液中的皮質(zhì)醇。1000μL移液頭(VWR International公司，拉德諾，賓夕法尼亞州)帶有被剃刀減掉的尖端并且被緊密地安裝到GDE上以形成能夠盛放大約0.2ml樣品液體的塑料“井”。該系統(tǒng)的示意圖顯示在圖4中。

除非另外指明，將pH為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(EMD Biosciences公司，拉霍亞，加利福尼亞州)用于制備所有溶液。為了將抗-皮質(zhì)醇抗體固定到金盤電極(GDE)的表面上，將GDE首先在3μm氧化鋁磨粒(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)上進(jìn)行120次8字形濕磨，并且用蒸餾水洗滌。接著利用1μm以及接下來的0.05μm的磨粒(CH儀器公司，奧斯汀，德克薩斯州)重復(fù)120次8字形打磨，之后將GDE在蒸餾水中超聲20分鐘。接著，將100μL的1mM 16-巰基十六烷酸(16-MHDA)(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)的試劑級乙醇溶液放入感測井內(nèi)并且在室溫下用石蠟?zāi)っ芊?小時(shí)。接下來，將GDE的表面和側(cè)面和感測井仔細(xì)地利用蒸餾水洗滌。對照EIS檢測在16-MHDA-官能化的GDE上實(shí)施，使用在PBS緩沖液中的100mM亞鐵氰化鉀(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)的“氧化還原探針”以確保足夠且相似量的MHDA被固定到每個(gè)GDE上。這通過分析每個(gè)單個(gè)的GDE的阻抗響應(yīng)以獲得彼此的相似性來確定。

接著，將100μL包含40mM N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)(Pierce Biotechnology公司)和10mM N-羥基磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)(VWR international公司)的PBS溶液放入感測井內(nèi)。在室溫下溫育1個(gè)小時(shí)后，將電極用PBS緩沖液洗滌。接著，將抗皮質(zhì)醇IgG(Aldrich公司)在PBS緩沖液中的10μg/ml溶液的100μL液滴放在電極上并且在室溫下放置1小時(shí)，接著用PBS緩沖液沖洗。最后，將100μL的1mM乙醇胺(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)的蒸餾水溶液加入感測井內(nèi)并且在室溫下溫育30分鐘以阻擋16-MHDA和EDC/NHS的所有未反應(yīng)的羧基基團(tuán)。接著將電極用PBS緩沖液仔細(xì)地洗滌并且在4℃下存放于PBS中直至使用。

電化學(xué)阻抗測量使用CHI660C電化學(xué)工作站(CH儀器公司，休斯頓，德克薩斯州)實(shí)施。在氧化還原探針溶液中制備濃度從0到10,000pg/mL(0至27.59nM)的皮質(zhì)醇(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)樣品并存放于4℃下直至使用。接著將每個(gè)皮質(zhì)醇濃度在每個(gè)抗體固定電極上檢測。

對于每個(gè)檢測，將100μL的皮質(zhì)醇和氧化還原探針溶液放置在抗體固定GDE的感測井內(nèi)。施加到樣品的AC電壓具有5mV的振幅，式電位(DC偏移)為150mV，通過在具有氧化還原探針的裸(固定前)電極上運(yùn)行CV來確定。在從1到100,000Hz的頻率范圍內(nèi)于90秒掃描內(nèi)施加AC電壓，并且對于該樣品在各頻率下記錄阻抗大小和相位。對于每個(gè)樣品于尼奎斯特圖中計(jì)算和繪制實(shí)部和虛部阻抗。在每次檢測后，在加入下一個(gè)樣品前將GDE和感測井用PBS徹底洗滌。

對于每個(gè)電極在每個(gè)AC頻率下測試，將在每個(gè)皮質(zhì)醇濃度下的阻抗大小與log(濃度)關(guān)聯(lián)，并計(jì)算斜率和R²。將阻抗斜率和R²值相對于頻率分別繪制，從而尋找導(dǎo)致高斜率和R²的最佳平衡的頻率。在該“最佳”頻率下檢測的阻抗值接著被用于產(chǎn)生最終的濃度梯度，從而使得能夠從阻抗估測得到皮質(zhì)醇濃度。

如所期望的，當(dāng)離體的和因此結(jié)合到抗體的生物標(biāo)記物濃度增加時(shí)，通過系統(tǒng)檢測到的阻抗(和因此的信號)也會增加。參見圖5A-5I到圖8。

在該工作中，非常低濃度的皮質(zhì)醇的檢測通過使用簡單的和無標(biāo)記的基于EIS的生物傳感器被證明具有重現(xiàn)性和高靈敏度。復(fù)制的傳感器組件在1.184Hz處具有最佳結(jié)合，具有重現(xiàn)性，具有在10％相對標(biāo)準(zhǔn)偏差下的最高變異性。匹配程度被檢測為0.9532，具有31.672歐姆/pg/mL的響應(yīng)率和18.73pM的檢測下限。該工作表明即使為了重現(xiàn)性性能，考慮到可能需要進(jìn)一步稀釋已經(jīng)低濃度的靶的物理傳感器設(shè)計(jì)的實(shí)用性之后，準(zhǔn)確和快速地測量皮質(zhì)醇水平的微小變化，甚至是通常在人淚液中發(fā)現(xiàn)的那些，在技術(shù)上也是可行的。

并且，如圖7總結(jié)的，許多目標(biāo)生物分子可以被檢測，例如皮質(zhì)醇、葡萄糖、乳酸、乳鐵蛋白、IgE、兒茶酚胺、S-100β、神經(jīng)元特異性烯醇酶、膠質(zhì)纖維蛋白和腫瘤壞死因子-α。

轉(zhuǎn)到圖9-11，描述了壓力生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)的總結(jié)。循環(huán)伏安法(CV)是檢測在電壓超過能斯特方程預(yù)測的電壓的條件下在電化學(xué)電池中產(chǎn)生的電流的電化學(xué)技術(shù)。CV通過使工作電極的電壓循環(huán)實(shí)施，并且檢測得到的電流。圖9顯示了A EP，B NE，C DA和D Cort的CV疊加(參見圖中的結(jié)構(gòu))。DA、EP、Cort和NE的濃度分別是0.04M，0.04M，0.04M和0.1M。信號的最小疊加通過E表示，其中F表示信號峰的大疊加。

圖10描繪了來自測量電流技術(shù)的壓力生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)。在化學(xué)和生物化學(xué)中的電流分析法是基于電流或電流的變化來檢測溶液中的離子。(嵌入)DA的Amp-it，其中在CV的氧化峰值處施加的電壓為0.52V，在AMP-it期間在A 2秒，B 12秒，C 20秒時(shí)。外面的圖是校正曲線，其中繪制了電流對DA濃度，在AMP-it期間的時(shí)間(a)、(b)和(c)處。該校準(zhǔn)曲線在不同時(shí)間A，B和C的對數(shù)擬合分別具有0.9566、0.9547和0.9540的R²。

圖11描繪了SWV(方波伏安法)技術(shù)在30Hz處用于確定EP濃度對氧化峰(0.23V)處的電流。SWV技術(shù)在20Hz處被用于確定DA濃度對氧化峰(0.22V)處的電流。SWV技術(shù)在20Hz處被用于確定NE濃度對氧化峰(0.23V)處的電流。SWV技術(shù)在15Hz處被用于確定Cort的濃度對氧化峰(0.18V)處的電流。

以上所述的實(shí)施方式不是意在限制性的。