本發(fā)明涉及固相載體、配體鍵合固相載體、靶物質(zhì)的檢測(cè)或分離方法以及上述固相載體的制造方法。

背景技術(shù)：

出于從血液等試樣中檢測(cè)·分離蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等靶物質(zhì)的目的，利用固相載體。作為使用固相載體的檢測(cè)·分離方法，通常是將配體固定于固相載體，使試樣與其接觸，由此使靶物質(zhì)與配體反應(yīng)的方法，但在上述接觸時(shí)，試樣中的靶物質(zhì)、雜質(zhì)有時(shí)未與配體反應(yīng)而是非特異性地吸附于固相載體的表面，其成為噪音。

因此，出于抑制上述非特異吸附的目的，提出了在磁性生物傳感器的金膜芯片表面上導(dǎo)入一定量的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)(ATRP引發(fā)基團(tuán))，將該ATRP引發(fā)基團(tuán)作為起點(diǎn)使特定的羧基甜菜堿單體聚合，由此形成聚合物刷的技術(shù)(專利文獻(xiàn)1)。

然而，具備上述聚合物刷的金膜芯片有時(shí)存在配體難以鍵合，靶物質(zhì)的捕捉變得不充分，難以檢測(cè)靶物質(zhì)的信號(hào)。

另一方面，作為臨床檢查的酶免疫測(cè)定法的診斷藥、以細(xì)胞治療為代表的細(xì)胞分離、核酸提取等中使用的固相載體，磁性粒子近年來(lái)受到矚目。雖然磁性粒子從檢體試樣等的分離較容易，但存在在水中容易凝聚的趨勢(shì)，因此，要求開發(fā)一種改善磁性粒子的水分散性的技術(shù)。

另外，由于存在疾病的早期發(fā)現(xiàn)等要求，因此，對(duì)診斷藥中使用的磁性粒子也要求能夠充分捕捉靶物質(zhì)。另外，對(duì)細(xì)胞分離中使用的磁性粒子也要求僅能夠特異性地捕捉靶細(xì)胞。在這樣的背景下，提出了通過(guò)利用ATRP使聚(羥基乙基甲基丙烯酰胺)·聚(甲基丙烯酸)嵌段共聚物等鍵合于表面而形成聚合物刷的磁性粒子(專利文獻(xiàn)2)，但對(duì)于該磁性粒子，試樣中的靶物質(zhì)、雜質(zhì)容易非特異性地吸附于粒子表面，在該方面存在改善的余地。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2009－69141號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2：日本特表2009－542862號(hào)公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種固相載體，具有高的水分散性，配體容易鍵合于反應(yīng)性官能團(tuán)，非特異吸附被抑制，在將配體鍵合而使用時(shí)能夠以高靈敏度且低噪音進(jìn)行靶物質(zhì)的檢測(cè)等。

因此，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有具有兩性離子結(jié)構(gòu)的特定的結(jié)構(gòu)單元和具有反應(yīng)性官能團(tuán)的特定的結(jié)構(gòu)單元的聚合物鍵合而成的固相載體具有高的水分散性，配體容易鍵合于反應(yīng)性官能團(tuán)，非特異吸附被抑制，在將配體鍵合而使用時(shí)能夠以高靈敏度且低噪音進(jìn)行靶物質(zhì)的檢測(cè)等，完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明提供＜1＞一種固相載體，是含有下述式(1)所示的結(jié)構(gòu)單元(以下，也稱為結(jié)構(gòu)單元(1))和下述式(2)所示的結(jié)構(gòu)單元(以下，也稱為結(jié)構(gòu)單元(2))的聚合物鍵合而成的。

〔式(1)中，

R¹表示氫原子或甲基，

R²表示具有兩性離子結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)。〕

〔式(2)中，

R³表示氫原子或甲基，

R⁴表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR⁶－*(R⁶表示氫原子或甲基，*表示與式(2)中的R⁵鍵合的位置)或亞苯基，

R⁴為－(C＝O)－O－*時(shí)，R⁵表示氫原子或具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)，R⁴為－(C＝O)－NR⁶－*或亞苯基時(shí)，R⁵表示具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)。

但是，R⁵不是具有兩性離子結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)?！?/p>

另外，本發(fā)明提供＜2＞一種配體鍵合固相載體，是使配體鍵合于上述＜1＞的固相載體而成的。

另外，本發(fā)明提供＜3＞一種檢測(cè)或分離試樣中的靶物質(zhì)的方法，其特征在于，使用上述＜2＞的配體鍵合固相載體。

進(jìn)而，本發(fā)明提供＜4＞一種制造方法，是含有結(jié)構(gòu)單元(1)和結(jié)構(gòu)單元(2)的聚合物鍵合而成的固相載體的制造方法，其特征在于，包含以下工序：

(工序1)準(zhǔn)備具有聚合引發(fā)基團(tuán)的載體的工序；以及

(工序2)將所述聚合引發(fā)基團(tuán)作為起點(diǎn)使單體聚合的工序。

本發(fā)明的固相載體具有高的水分散性，配體容易鍵合于反應(yīng)性官能團(tuán)，非特異吸附被抑制，在將配體鍵合而使用時(shí)能夠以高靈敏度且低噪音進(jìn)行靶物質(zhì)的檢測(cè)等。

另外，根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠簡(jiǎn)便制造上述本發(fā)明的固相載體。

具體實(shí)施方式

＜固相載體＞

本發(fā)明的固相載體是含有下述式(1)所示的結(jié)構(gòu)單元和下述式(2)所示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物鍵合而成的。首先，對(duì)本發(fā)明的固相載體進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

〔式(1)中，

R¹表示氫原子或甲基，

R²表示具有兩性離子結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)。〕

〔式(2)中，

R³表示氫原子或甲基，

R⁴表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR⁶－*(R⁶表示氫原子或甲基，*表示與式(2)中的R⁵鍵合的位置)或亞苯基，

R⁴為－(C＝O)－O－*時(shí)，R⁵表示氫原子或具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)，R⁴為－(C＝O)－NR⁶－*或亞苯基時(shí)，R⁵表示具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)。

但是，R⁵不是具有兩性離子結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)?！?/p>

(結(jié)構(gòu)單元(1))

式(1)中，R²表示具有兩性離子結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)。該有機(jī)基團(tuán)是指具有陽(yáng)離子性官能團(tuán)和陰離子性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)。作為具有兩性離子結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)，優(yōu)選具有季銨鹽型陽(yáng)離子性官能團(tuán)和陰離子性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)，更優(yōu)選具有季銨鹽型陽(yáng)離子性官能團(tuán)以及選自－(C＝O)O^-、－SO₃^-和－O－(O＝P－O^-)－O－中的1價(jià)或2價(jià)的陰離子性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)。其中，作為R²，從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選下述式(3)或(4)所示的有機(jī)基團(tuán)，從單體合成容易的觀點(diǎn)等出發(fā)，特別優(yōu)選下述式(3)所示的有機(jī)基團(tuán)。

〔式(3)中，

R⁷表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR¹³－*(R¹³表示氫原子或甲基，*表示與式(3)中的R⁸鍵合的位置)或亞苯基，

R⁸和R⁹各自獨(dú)立地表示單鍵或碳原子數(shù)1～10的2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)，

R¹⁰表示－(C＝O)O^-或－SO₃^-，

R¹¹和R¹²各自獨(dú)立地表示甲基或乙基?！?/p>

〔式(4)中，

R¹⁴表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR²⁰－*(R²⁰表示氫原子或甲基，*表示與式(4)中的R¹⁵鍵合的位置)或亞苯基，

R¹⁵和R¹⁶各自獨(dú)立地表示單鍵或碳原子數(shù)1～10的2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)，

R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹各自獨(dú)立地表示甲基或乙基?！?/p>

式(3)中，作為R⁷，從提高與水的親和性、抑制非特異吸附的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR¹³－*，更優(yōu)選－(C＝O)－O－*。

R¹⁰表示－(C＝O)O^-或－SO₃^-，從兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選－(C＝O)O^-。

R¹³表示氫原子或甲基，優(yōu)選氫原子。

式(3)中的R⁸和R⁹、式(4)中的R¹⁵和R¹⁶各自獨(dú)立地表示單鍵或碳原子數(shù)1～10的2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)，從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選碳原子數(shù)1～10的2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)，更優(yōu)選碳原子數(shù)1～10的2價(jià)的烴基、碳原子數(shù)2～10的2價(jià)的烴基的碳－碳原子間具有選自醚鍵、亞氨基、酰胺鍵和酯鍵中的1種以上的基團(tuán)，特別優(yōu)選碳原子數(shù)1～10的2價(jià)的烴基。

2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)為2價(jià)的烴基時(shí)，作為其碳原子數(shù)，優(yōu)選1～8，更優(yōu)選1～6，進(jìn)一步優(yōu)選1～4，特別優(yōu)選1～3。另一方面，2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)為2價(jià)的烴基的碳－碳原子間具有選自醚鍵、亞氨基、酰胺鍵和酯鍵中的1種以上的基團(tuán)時(shí)，作為該基團(tuán)中的2價(jià)的烴基的碳原子數(shù)，優(yōu)選2～8，更優(yōu)選2～6，進(jìn)一步優(yōu)選2～4，特別優(yōu)選2或3。

作為R⁸、R⁹、R¹⁵和R¹⁶中的“2價(jià)的烴基”，優(yōu)選2價(jià)的脂肪族烴基。該2價(jià)的脂肪族烴基可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀。

作為上述2價(jià)的脂肪族烴基，優(yōu)選鏈烷二基，具體而言，可舉出甲烷－1,1－二基、乙烷－1,1－二基、乙烷－1,2－二基、丙烷－1,1－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基、丙烷－2,2－二基、丁烷－1,2－二基、丁烷－1,3－二基、丁烷－1,4－二基、戊烷－1,4－二基、戊烷－1,5－二基、己烷－1,5－二基、己烷－1,6－二基等。

作為式(3)中的R¹¹和R¹²、式(4)中的R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹，優(yōu)選甲基。

式(4)中，作為R¹⁴，從提高與水的親和性、抑制非特異吸附的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR²⁰－*，更優(yōu)選－(C＝O)－O－*。R²⁰表示氫原子或甲基，優(yōu)選氫原子。

(結(jié)構(gòu)單元(2))

式(2)中，作為R⁴，從提高與水的親和性、抑制非特異吸附的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR⁶－*。R⁶表示氫原子或甲基，優(yōu)選氫原子。

另外，R⁴為－(C＝O)－O－*時(shí)，R⁵表示氫原子或具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)，R⁴為－(C＝O)－NR⁶－*或亞苯基時(shí)，R⁵表示具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)。R⁴為－(C＝O)－O－*、且R⁵為氫原子時(shí)，R⁴和R⁵的組合為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)。但是，R⁵不是R²所示這樣的具有兩性離子結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)，本說(shuō)明書中，R⁵中的反應(yīng)性官能團(tuán)是不含兩性離子結(jié)構(gòu)的概念。

作為反應(yīng)性官能團(tuán)，可舉出羧基、甲苯磺?；?、氨基、環(huán)氧基、?；?、疊氮基，上述有機(jī)基團(tuán)可以具有它們中的1種，也可以具有2種以上。其中，從鍵合的配體難以脫離的觀點(diǎn)、使用蛋白質(zhì)、核酸等分子作為配體時(shí)，能夠使用配體本來(lái)具有的官能團(tuán)與固相載體鍵合的方面出發(fā)，優(yōu)選羧基、甲苯磺酰基、氨基、環(huán)氧基，從容易簡(jiǎn)便且迅速地使配體與固相載體鍵合的方面等出發(fā)，更優(yōu)選羧基。

另外，結(jié)構(gòu)單元(2)中所含的反應(yīng)性官能團(tuán)的含量從配體鍵合量的觀點(diǎn)、兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化的觀點(diǎn)、細(xì)胞分離性能的觀點(diǎn)出發(fā)，相對(duì)于固相載體的固體成分1g，優(yōu)選為1μmol以上，更優(yōu)選為5μmol以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10μmol以上，進(jìn)一步優(yōu)選為15μmol以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20μmol以上，進(jìn)一步優(yōu)選為25μmol以上，特別優(yōu)選為30μmol以上，另外，從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)、兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為300μmol以下，更優(yōu)選為200μmol以下，進(jìn)一步優(yōu)選為190μmol以下，特別優(yōu)選為180μmol以下。

例如，反應(yīng)性官能團(tuán)為羧基時(shí)，反應(yīng)性官能團(tuán)的含量可通過(guò)電導(dǎo)率測(cè)定法等來(lái)測(cè)定，具體而言，可依照后述的實(shí)施例中記載的方法來(lái)測(cè)定。另外，反應(yīng)性官能團(tuán)為甲苯磺?；鶗r(shí)，可對(duì)導(dǎo)入于固相載體的甲苯磺?；淖贤饪梢姽馕者M(jìn)行測(cè)定等而求出，反應(yīng)性官能團(tuán)為氨基時(shí)，可使N－琥珀酰亞胺基－3－(2－吡啶基二硫)丙酸酯與氨基進(jìn)行反應(yīng)，然后進(jìn)行還原，對(duì)游離的硫代吡啶基的吸光度進(jìn)行測(cè)定等而求出。

另外，作為R⁵所示的具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)，優(yōu)選下述式(5)所示的有機(jī)基團(tuán)。

R²¹-Y(5)

〔式(5)中，

R²¹表示2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)，

Y表示反應(yīng)性官能團(tuán)?！?/p>

作為R²¹所示的2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)，可舉出2價(jià)的烴基、碳原子數(shù)2以上的2價(jià)的烴基的碳－碳原子間具有選自醚鍵、亞氨基、酰胺鍵和酯鍵中的1種以上的基團(tuán)。

2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)為2價(jià)的烴基時(shí)，作為其碳原子數(shù)，優(yōu)選1～10，更優(yōu)選1～8，特別優(yōu)選1～6。另一方面，2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)為碳原子數(shù)2以上的2價(jià)的烴基的碳－碳原子間具有選自醚鍵、亞氨基、酰胺鍵和酯鍵中的1種以上的基團(tuán)時(shí)，作為該基團(tuán)中的2價(jià)的烴基的碳原子數(shù)，優(yōu)選2～10，更優(yōu)選2～8，特別優(yōu)選2～6。

作為R²¹中“2價(jià)的烴基”，優(yōu)選2價(jià)的脂肪族烴基。該2價(jià)的脂肪族烴基可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀。

作為上述2價(jià)的脂肪族烴基，優(yōu)選鏈烷二基，具體而言，可舉出甲烷－1,1－二基、乙烷－1,1－二基、乙烷－1,2－二基、丙烷－1,1－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基、丙烷－2,2－二基、丁烷－1,2－二基、丁烷－1,3－二基、丁烷－1,4－二基、戊烷－1,4－二基、戊烷－1,5－二基、己烷－1,5－二基、己烷－1,6－二基等。

另外，作為碳原子數(shù)2以上的2價(jià)的烴基的碳－碳原子間具有選自醚鍵、亞氨基、酰胺鍵和酯鍵中的1種以上的基團(tuán)，從可簡(jiǎn)便地得到聚合物的觀點(diǎn)等出發(fā)，優(yōu)選碳原子數(shù)2以上的2價(jià)的烴基的碳－碳原子間具有酯鍵的基團(tuán)，更優(yōu)選－R^a－O(C＝O)－R^b－*所示的2價(jià)的基團(tuán)(R^a和R^b各自獨(dú)立地表示碳原子數(shù)2～4的鏈烷二基，*表示與式(5)中的Y的鍵合位置)。作為鏈烷二基的碳原子數(shù)，優(yōu)選2或3，更優(yōu)選2。鏈烷二基可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀，例如可舉出乙烷－1,2－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基。

作為Y所示的反應(yīng)性官能團(tuán)，與上述同樣地，可舉出羧基、甲苯磺酰基、氨基、環(huán)氧基、?；?、疊氮基。其中，從鍵合的配體難以脫離的觀點(diǎn)、使用蛋白質(zhì)、核酸等分子作為配體時(shí)，能夠使用配體本來(lái)具有的官能團(tuán)與固相載體鍵合的方面出發(fā)，優(yōu)選羧基、甲苯磺?；?、氨基、環(huán)氧基，從使配體容易簡(jiǎn)便且迅速地與固相載體鍵合的方面等出發(fā)，更優(yōu)選羧基。

作為上述R⁴和R⁵的組合，優(yōu)選R⁴為－(C＝O)－O－*、R⁵為氫原子或具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)的組合、R⁴為－(C＝O)－NR⁶－*、R⁵為具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)的組合，更優(yōu)選R⁴為－(C＝O)－O－*或－(C＝O)－NR⁶－*、R⁵為具有反應(yīng)性官能團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)的組合。

另外，聚合物也可以具有上述結(jié)構(gòu)單元(1)和(2)以外的結(jié)構(gòu)單元(以下，也稱為其它結(jié)構(gòu)單元)。作為其它結(jié)構(gòu)單元，可舉出來(lái)自(甲基)丙烯酸酯類、苯乙烯類、(甲基)丙烯腈類、乙酸乙烯酯等的結(jié)構(gòu)單元。

結(jié)構(gòu)單元(1)和(2)可以包含在鍵合于固相載體的相同的聚合物中，另外，也可以包含在不同的聚合物中，優(yōu)選包含在相同的聚合物中。

另外，每1條聚合物的結(jié)構(gòu)單元(1)的平均聚合度n優(yōu)選為1以上，更優(yōu)選為3以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5以上，特別優(yōu)選為10以上，另外，從配體鍵合量的觀點(diǎn)、兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化的觀點(diǎn)、細(xì)胞分離性能的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為500以下，更優(yōu)選為300以下，進(jìn)一步優(yōu)選為200以下，進(jìn)一步優(yōu)選為100以下，進(jìn)一步優(yōu)選為70以下，特別優(yōu)選為62以下。

從配體鍵合量的觀點(diǎn)出發(fā)，每1條聚合物的結(jié)構(gòu)單元(2)的平均聚合度m優(yōu)選為1以上，更優(yōu)選為3以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5以上，特別優(yōu)選為10以上，另外，從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)、兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為500以下，更優(yōu)選為300以下，進(jìn)一步優(yōu)選為200以下，進(jìn)一步優(yōu)選為100以下，進(jìn)一步優(yōu)選為70以下，特別優(yōu)選為65以下。

另外，從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)和配體鍵合量的觀點(diǎn)出發(fā)，由平均聚合度n和平均聚合度m算出的聚合比例〔m/(m+n)〕優(yōu)選為0.01以上，更優(yōu)選為0.03以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.05以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1以上，特別優(yōu)選為0.15以上，另外，從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)和配體鍵合量的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為0.75以下，更優(yōu)選為0.74以下，特別優(yōu)選為0.7以下。聚合物為嵌段聚合物時(shí)，從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)、配體鍵合量的觀點(diǎn)和兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化、特別是制成適于診斷藥用途的物質(zhì)的聚合物的觀點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1～0.5，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1～0.35，特別優(yōu)選為0.15～0.3。另一方面，聚合物為無(wú)規(guī)聚合物時(shí)，從兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化，特別是制成適于診斷藥用途的聚合物的觀點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)選為0.2～0.7，特別優(yōu)選為0.35～0.7。

平均聚合度n、m分別是指每1條聚合物的結(jié)構(gòu)單元(1)、(2)的平均聚合度，可由X射線光電子光譜分析、鍵合于每1g固相載體的聚合物的重量、聚合物的分子量和反應(yīng)性官能團(tuán)量等算出。具體而言，可依照后述的實(shí)施例中記載的方法來(lái)測(cè)定。

另外，作為聚合物，優(yōu)選鏈狀聚合物。鏈狀聚合物是指具有線狀的分子結(jié)構(gòu)的聚合物，其包含具有由長(zhǎng)的直鏈狀的主鏈和與其鍵合的較短的側(cè)鏈構(gòu)成的結(jié)構(gòu)的聚合物的概念。

另外，作為聚合物，優(yōu)選乙烯基聚合物。另外，聚合物中的結(jié)構(gòu)單元的排列的樣態(tài)沒有特別限定，可以為無(wú)規(guī)共聚物、嵌段共聚物、具有無(wú)規(guī)共聚單元和嵌段共聚單元的共聚物、交替共聚物中的任一者，從能夠簡(jiǎn)便地形成聚合物的方面等出發(fā)，優(yōu)選無(wú)規(guī)共聚物、嵌段共聚物。聚合物為無(wú)規(guī)共聚物時(shí)，細(xì)胞等的非特異吸附容易被抑制。另外，聚合物為嵌段共聚物時(shí)，抗體等的配體容易鍵合，容易兼具利用抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)中的高靈敏度化和低噪音化。得到這樣的效果的理由未必明確，但本發(fā)明人推測(cè)是因?yàn)樵谇抖喂簿畚锏那闆r下，反應(yīng)性官能團(tuán)局部存在，因此，抗體容易鍵合，容易得到夾層結(jié)構(gòu)(一次抗體－抗原－二次抗體)等高次結(jié)構(gòu)。

另外，聚合物為嵌段共聚物時(shí)，該嵌段共聚物含有由結(jié)構(gòu)單元(1)的重復(fù)而構(gòu)成的第1嵌段和由結(jié)構(gòu)單元(2)的重復(fù)而構(gòu)成的第2嵌段。作為這樣的嵌段共聚物，從進(jìn)一步容易鍵合配體的觀點(diǎn)、兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選下述式(6)所示的嵌段共聚物。

〔式(6)中，**表示固相載體側(cè)的鍵合位置，其它符號(hào)與上述符號(hào)同義?！?/p>

另外，聚合物的一側(cè)的末端只要鍵合于固相載體就沒有特別限定，優(yōu)選介由含有聚合引發(fā)基團(tuán)的殘基的2價(jià)的連接基團(tuán)鍵合于固相載體。作為聚合引發(fā)基團(tuán)，優(yōu)選可活性聚合的聚合引發(fā)基團(tuán)，更優(yōu)選活性自由基聚合引發(fā)基團(tuán)，進(jìn)一步優(yōu)選原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)、可逆加成裂解鏈轉(zhuǎn)移聚合引發(fā)基團(tuán)，特別優(yōu)選原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)。作為含有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的殘基的2價(jià)的連接基團(tuán)，可舉出下述式(7－1)或(7－2)所示的2價(jià)的基團(tuán)。

〔上述式中，

R²⁵和R²⁹表示－O－或－NH－，

R²⁶和R³⁰各自獨(dú)立地表示單鍵或亞苯基，

R²⁷和R²⁸各自獨(dú)立地表示氫原子或烷基，

**表示與聚合物的末端鍵合的位置?！?/p>

作為R²⁵和R²⁹，優(yōu)選－O－，作為R²⁶和R³⁰，優(yōu)選單鍵，作為R²⁷和R²⁸，優(yōu)選烷基。

作為R²⁷和R²⁸所示的烷基的碳原子數(shù)，優(yōu)選1～8，更優(yōu)選1～4，特別優(yōu)選1或2。烷基可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀，具體而言，可舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。

另一方面、聚合物的另一側(cè)的末端沒有特別限定，優(yōu)選鹵原子。作為鹵原子，可舉出溴原子、氯原子、氟原子等。

聚合物優(yōu)選在固相載體表面上形成聚合物刷。從抑制非特異吸附的觀點(diǎn)、配體鍵合量的觀點(diǎn)、兼具檢測(cè)的高靈敏度化和低噪音化的觀點(diǎn)出發(fā)，相對(duì)于本發(fā)明的固相載體的表面，上述聚合物占有的密度優(yōu)選為0.01條/nm²以上，更優(yōu)選為0.05條/nm²以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1條/nm²以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.3條/nm²以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.4條/nm²以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5條/nm²以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.6條/nm²以上，特別優(yōu)選為0.7條/nm²以上，另外，從聚合物刷的形成簡(jiǎn)便的方面出發(fā)，優(yōu)選為2條/nm²以下，更優(yōu)選為1.6條/nm²以下，進(jìn)一步優(yōu)選為1.2條/nm²以下。

上述聚合物的密度例如可由下述式算出。具體而言，可通過(guò)水解等使聚合物從固相載體游離，依照后述的實(shí)施例中記載的方法來(lái)測(cè)定。

聚合物的密度(條/nm²)＝鍵合于1g載體的聚合物的條數(shù)(條)/1g載體的總表面積(nm²)

另外，作為聚合物的數(shù)均分子量(Mn)，優(yōu)選1000～100000，更優(yōu)選3000～50000，進(jìn)一步優(yōu)選5000～30000。

另外，作為聚合物的重均分子量(Mw)，優(yōu)選1000～100000，更優(yōu)選3000～50000，特別優(yōu)選為5000～30000。

另外，作為分子量分布(Mw/Mn)，從抑制非特異吸附和提高鍵合于固相載體的配體的活性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選1.0～2.5，更優(yōu)選1.0～2.0，進(jìn)一步優(yōu)選1.0～1.5。

應(yīng)予說(shuō)明，數(shù)均分子量、重均分子量是指通過(guò)水解等使聚合物從固相載體游離，通過(guò)凝膠滲透色譜測(cè)得的換算為聚乙二醇的平均分子量。例如，預(yù)先通過(guò)后述的實(shí)施例中記載的這樣的方法測(cè)定反應(yīng)性官能團(tuán)導(dǎo)入前的聚合物的分子量，由該分子量、導(dǎo)入有反應(yīng)性官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元的摩爾數(shù)和用于反應(yīng)性官能團(tuán)的導(dǎo)入的化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算等而算出。

構(gòu)成本發(fā)明的固相載體的上述聚合物以外的部分可以為有機(jī)物，也可以為金屬、金屬氧化物等無(wú)機(jī)物，沒有特別限定，本發(fā)明的固相載體優(yōu)選除上述聚合物以外還含有樹脂。作為樹脂，可以為由瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等多糖類構(gòu)成的天然高分子，也可以為合成高分子。

另外，本發(fā)明的固相載體的形態(tài)沒有特別限定，可以為粒子、整塊(monolith)、膜、纖維、屑片(chip)等中的任一者，從靶物質(zhì)的檢測(cè)或分離的容易性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選粒子，更優(yōu)選磁性粒子。

本說(shuō)明書中“磁性粒子”是指具有磁性體的粒子。本發(fā)明的固相載體即使在磁性粒子的形態(tài)下也具有高的水分散性。另外，制成磁性粒子時(shí)，可在不使用離心分離器等的情況下使用磁石等進(jìn)行分離，因此，能夠?qū)⒆栽嚇拥墓滔噍d體的分離簡(jiǎn)化或自動(dòng)化。

另外，磁性體可以為強(qiáng)磁性、順磁性、超順磁性中的任一者，從使利用磁場(chǎng)的分離和去除磁場(chǎng)后的再分散容易的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為超順磁性。作為磁性體，可舉出鐵素體、氧化鐵、鐵、氧化錳、錳、氧化鎳、鎳、氧化鈷、鈷等金屬或合金。

另外，作為磁性粒子，具體而言，可舉出將上述聚合物鍵合于以下的(i)～(iv)中的任一粒子而成的磁性粒子。優(yōu)選為多孔或非多孔的磁性聚合物粒子。

(i)磁性體微粒在含有樹脂等非磁性體的連續(xù)相中分散的粒子

(ii)將磁性體微粒的2次凝聚物作為核、將樹脂等非磁性體作為殼的粒子

(iii)將具有由樹脂等非磁性體構(gòu)成的核粒子和設(shè)置于該核粒子的表面的含有磁性體微粒的磁性體層(2次凝聚物層)的母粒子作為核，在該母粒子的最外層設(shè)有樹脂等非磁性體層作為殼(以下，也稱為最外層殼)的粒子

(iv)可以在粒子的最外層設(shè)置樹脂等非磁性體層作為殼的、磁性體微粒在由樹脂、二氧化硅等構(gòu)成的多孔的粒子的孔內(nèi)分散的粒子

應(yīng)予說(shuō)明，(i)～(iv)的粒子均是公知的，可依照常規(guī)方法來(lái)制造。

作為上述(iii)的核粒子和(iv)的多孔粒子中的樹脂，可舉出來(lái)自選自單官能性單體和交聯(lián)性單體中的1種或2種以上的樹脂。

作為上述單官能性單體，例如可舉出苯乙烯、α－甲基苯乙烯、鹵化苯乙烯等單官能性芳香族乙烯基系單體；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯、(甲基)丙烯酸環(huán)己酯、(甲基)丙烯酸異冰片酯等單官能性(甲基)丙烯酸酯系單體。

作為上述交聯(lián)性單體，例如可舉出二乙烯基苯等多官能性芳香族乙烯基系單體；乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇六(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烯丙酯等多官能性(甲基)丙烯酸酯系單體；丁二烯、異戊二烯等共軛二烯烴等。

另外，作為上述(i)和(ii)中的樹脂以及上述(iii)和(iv)的最外層殼中的樹脂，優(yōu)選具有選自縮水甘油基、氨基和羥基中的1種或2種以上的官能團(tuán)的樹脂。上述官能團(tuán)可以通過(guò)對(duì)樹脂的化學(xué)修飾來(lái)導(dǎo)入，也可以通過(guò)至少含有具有上述官能團(tuán)的單體1種或2種以上的單體組成的聚合來(lái)導(dǎo)入。作為上述化學(xué)修飾，例如可舉出通過(guò)縮水甘油基的水解的羥基的生成、通過(guò)硝基的還原的氨基的生成。作為具有上述官能團(tuán)的單體組成，更優(yōu)選至少含有含縮水甘油基單體的單體組成(以下，也將上述最外層殼中的樹脂為由至少含有含縮水甘油基單體的單體組成形成的樹脂的粒子稱為含縮水甘油基磁性粒子)。應(yīng)予說(shuō)明，也可以進(jìn)一步含有選自上述單官能性單體和交聯(lián)性單體中的1種或2種以上。

作為含縮水甘油基單體，可舉出(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、烯丙基縮水甘油醚等。作為含氨基單體，可舉出(甲基)丙烯酸－2－氨基乙酯等。作為含羥基單體，可舉出1,4－環(huán)己烷二甲醇單(甲基)丙烯酸酯等。

另外，本發(fā)明的固相載體為粒子時(shí)的平均粒徑(體積平均粒徑)優(yōu)選為0.1～500μm，更優(yōu)選為0.2～50μm，進(jìn)一步優(yōu)選為0.3～10μm。通過(guò)為這樣的范圍，固相載體為磁性粒子時(shí)，聚磁速度(集磁速度)變快，操作性得到改善，另外，配體鍵合量變大，檢測(cè)靈敏度等變得良好。另外，平均粒徑的變動(dòng)系數(shù)只要為20％以下左右即可。

另外，比表面積只要為1.0～2.0m²/g左右即可。

應(yīng)予說(shuō)明，上述平均粒徑和比表面積可通過(guò)激光衍射·散射粒徑分布測(cè)定等來(lái)測(cè)定。

＜固相載體的制造方法＞

本發(fā)明的固相載體可將常規(guī)方法適當(dāng)組合而進(jìn)行制造，作為本發(fā)明的固相載體的制造方法，從將相對(duì)于固相載體的表面的聚合物占有的密度高密度化且進(jìn)一步抑制非特異吸附的觀點(diǎn)、將分子量分布窄的聚合物鍵合于固相載體鍵合且進(jìn)一步抑制非特異吸附的觀點(diǎn)、提高鍵合于固相載體的配體的作用的觀點(diǎn)等出發(fā)，優(yōu)選包含以下工序的方法：(工序1)準(zhǔn)備具有聚合引發(fā)基團(tuán)的載體(以下，也稱為含聚合引發(fā)基團(tuán)載體)的工序；以及(工序2)將上述聚合引發(fā)基團(tuán)作為起點(diǎn)使單體聚合的工序。

作為上述制造方法，具體而言，可舉出以下的方法＜PR－1＞和＜PR－2＞。以下，關(guān)于這些方法，例舉結(jié)構(gòu)單元(2)中所含的反應(yīng)性官能團(tuán)為羧基、氨基或甲苯磺酰基的情況進(jìn)行說(shuō)明。

＜PR－1＞(工序1)準(zhǔn)備含聚合引發(fā)基團(tuán)載體，(工序2－1－1)使構(gòu)成結(jié)構(gòu)單元(1)的單體(11)和具有可導(dǎo)入羧基、氨基或甲苯磺?；墓倌軋F(tuán)(例如，羥基、環(huán)氧基、酯基、氨基、羧酸保護(hù)基等)的單體(12)以上述聚合引發(fā)基團(tuán)作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合，(工序2－1－2)通過(guò)加成反應(yīng)、取代反應(yīng)、縮合反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)對(duì)導(dǎo)入于固相載體的聚合物(14)導(dǎo)入羧基、氨基或甲苯磺?；姆椒?。

＜PR－2＞(工序1)準(zhǔn)備含聚合引發(fā)基團(tuán)載體，(工序2－2－1)通過(guò)加成反應(yīng)、取代反應(yīng)、縮合反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)對(duì)具有可導(dǎo)入羧基、氨基或甲苯磺?；墓倌軋F(tuán)的單體(12)導(dǎo)入羧基、氨基或甲苯磺?；玫綐?gòu)成結(jié)構(gòu)單元(2)的單體(13)，(工序2－2－2)使該單體(13)和單體(11)以上述聚合引發(fā)基團(tuán)作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合的方法。應(yīng)予說(shuō)明，使用具有羧基、氨基或甲苯磺?；膯误w時(shí)，可不進(jìn)行(工序2－2－1)地進(jìn)行制造。作為具有羧基、氨基或甲苯磺?；膯误w，可舉出(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸鹽、(甲基)丙烯酸氨基乙酯等。

(工序1)

含聚合引發(fā)基團(tuán)載體可以使用市售品，也可以合成來(lái)使用。例如可通過(guò)使具有聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物與具有選自羥基、氨基、環(huán)氧基和羧基中的1種或2種以上(以下，也將其總稱為羥基等)的原料載體(以下，也稱為原料載體)接觸，將上述羥基等中所含的氫原子轉(zhuǎn)換為聚合引發(fā)基團(tuán)而得到(以下，也將該反應(yīng)稱為聚合引發(fā)基團(tuán)導(dǎo)入反應(yīng))。應(yīng)予說(shuō)明，上述原料載體中，具有羥基的原料載體例如可通過(guò)使上述含縮水甘油基磁性粒子與無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸等酸接觸，將縮水甘油基開環(huán)等而得到。

另外，含聚合引發(fā)基團(tuán)載體也可將含有具有聚合引發(fā)基團(tuán)的單體的單體組成進(jìn)行聚合而得到。作為具有聚合引發(fā)基團(tuán)的單體，可舉出甲基丙烯酸－2－(2－溴異丁酰氧基)乙酯等。

作為上述具有聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物，優(yōu)選具有可活性聚合的聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物，更優(yōu)選具有活性自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物，進(jìn)一步優(yōu)選具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物、具有可逆加成裂解鏈轉(zhuǎn)移聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物，特別優(yōu)選具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物。作為具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物，例如可舉出2－溴異丁酰溴、4－(溴甲基)苯甲酸、2－溴異丁酸乙酯、2－溴丙酰溴、對(duì)甲苯磺酰氯等。

聚合引發(fā)基團(tuán)導(dǎo)入反應(yīng)中，具有聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物的合計(jì)使用量相對(duì)于原料載體，通常為0.001～100質(zhì)量倍左右，優(yōu)選為0.01～50質(zhì)量倍左右。

聚合引發(fā)基團(tuán)導(dǎo)入反應(yīng)優(yōu)選在三乙胺、N,N－二甲基－4－氨基吡啶、二異丙基乙基胺、吡啶等堿性催化劑存在下進(jìn)行。應(yīng)予說(shuō)明，可單獨(dú)使用這些堿性催化劑中的1種或組合使用2種以上。

堿性催化劑的合計(jì)使用量相對(duì)于具有聚合引發(fā)基團(tuán)的化合物，通常為1～10摩爾當(dāng)量左右，優(yōu)選為1～5摩爾當(dāng)量左右。

另外，聚合引發(fā)基團(tuán)導(dǎo)入反應(yīng)優(yōu)選在溶劑存在下進(jìn)行。作為溶劑，可舉出四氫呋喃、1,4－二烷、1,3－二烷等醚系溶劑；二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等質(zhì)子性溶劑，這些溶劑可單獨(dú)使用1種或組合使用2種以上。

另外，聚合引發(fā)基團(tuán)導(dǎo)入反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間通常為30分鐘～24小時(shí)左右，反應(yīng)溫度只要在溶劑的沸點(diǎn)以下適當(dāng)選擇即可。

(工序2－1－1)

工序2－1－1中的聚合反應(yīng)的聚合法只要根據(jù)聚合引發(fā)基團(tuán)的種類選擇即可，從簡(jiǎn)便且容易得到目的物的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選活性聚合，更優(yōu)選活性自由基聚合，進(jìn)一步優(yōu)選原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP聚合)、可逆加成裂解鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT聚合)，特別優(yōu)選原子轉(zhuǎn)移自由基聚合。通過(guò)利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合進(jìn)行聚合，能夠使聚合物簡(jiǎn)便地鍵合于種類繁多的載體，而且，由于對(duì)得到的固相載體賦予生物相容性、高壓縮彈性、低摩擦特性、尺寸排阻特性，且使相對(duì)于固相載體的表面的聚合物占有的密度高密度化，因此，難以非特異吸附。

應(yīng)予說(shuō)明，通過(guò)在使單體(11)聚合后，將形成的聚合物的末端的聚合引發(fā)基團(tuán)作為起點(diǎn)使單體(12)聚合或者在使單體(12)聚合后，將形成的聚合物末端的聚合引發(fā)基團(tuán)作為起點(diǎn)使單體(11)聚合，能夠?qū)⑶抖喂簿畚飳?dǎo)入于固相載體。

作為單體(11)，可舉出[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基](氧負(fù)離子羰基甲基)二甲基銨、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基](氧負(fù)離子羰基乙基)二甲基銨、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基](氧負(fù)離子羰基丙基)二甲基銨、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺甲基)氫氧化銨、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺乙基)氫氧化銨、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺丙基)氫氧化銨、(O－[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基磷酸]膽堿等。應(yīng)予說(shuō)明，可以單獨(dú)使用這些單體中的1種或組合使用2種以上。

作為單體(12)，可舉出2－羥基乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸－2－羥基乙酯、(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸氨基乙酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等。應(yīng)予說(shuō)明，可以單獨(dú)使用這些單體中的1種或組合使用2種以上。

單體(11)、(12)的各合計(jì)使用量各自相對(duì)于鍵合于載體的聚合引發(fā)基團(tuán)，通常為5～10000摩爾當(dāng)量左右，優(yōu)選為10～5000摩爾當(dāng)量左右。

另外，通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合進(jìn)行工序2－1－1中的聚合反應(yīng)時(shí)，從反應(yīng)效率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在過(guò)渡金屬化合物和配位體的存在下進(jìn)行反應(yīng)。

作為過(guò)渡金屬化合物，優(yōu)選銅化合物。作為銅化合物，除溴化亞銅(I)、溴化銅(II)、氯化亞銅(I)、氯化銅(II)等鹵化銅之外，還可舉出三氟甲磺酸亞銅(I)、三氟甲磺酸銅(II)等。應(yīng)予說(shuō)明，可以單獨(dú)使用這些過(guò)渡金屬化合物中的1種或組合使用2種以上。過(guò)渡金屬化合物的合計(jì)使用量在反應(yīng)體系中，通常為1～10000ppm左右。

作為配位體，優(yōu)選在同一分子內(nèi)含有2個(gè)以上的氮原子的配位體。作為在同一分子內(nèi)含有2個(gè)以上的氮原子的配位體，可舉出三(2－吡啶基甲基)胺、聯(lián)吡啶、聯(lián)吡啶衍生物、三[2－(二甲基氨基)乙基]胺等。應(yīng)予說(shuō)明，這可以單獨(dú)使用些配位體中的1種或組合使用2種以上。配位體的合計(jì)使用量相對(duì)于過(guò)渡金屬化合物，通常為0.5～10摩爾當(dāng)量左右。

另外，從反應(yīng)效率的觀點(diǎn)出發(fā)，工序2－1－1中的聚合反應(yīng)優(yōu)選在還原劑、溶劑存在下進(jìn)行。

作為還原劑，可舉出抗壞血酸、葡萄糖、肼、銅等，這些還原劑可單獨(dú)使用1種或組合使用2種以上。

作為溶劑，可舉出水；二甲基甲酰胺等酰胺系溶劑；甲醇、乙醇等醇系溶劑等，這些溶劑可單獨(dú)使用1種或組合使用2種以上。

另外，作為聚合反應(yīng)的反應(yīng)體系的pH，優(yōu)選為3～10。聚合反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間通常為30分鐘～12小時(shí)左右，反應(yīng)溫度只要在溶劑的沸點(diǎn)以下適當(dāng)選擇即可。聚合反應(yīng)在25～60℃左右的溫和的條件下也能進(jìn)行。

(工序2－1－2)

工序2－1－2是通過(guò)加成反應(yīng)、取代反應(yīng)、縮合反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)對(duì)導(dǎo)入于固相載體的聚合物(14)導(dǎo)入羧基、氨基或甲苯磺?；墓ば?。

作為導(dǎo)入羧基的方法，可舉出使用具有羥基或氨基的單體作為單體(12)，使羧酸酐與得到的聚合物(14)進(jìn)行加成反應(yīng)的方法；使用具有環(huán)氧基的單體作為單體(12)，將得到的聚合物(14)水解而生成羥基，然后使羧酸酐進(jìn)行加成反應(yīng)的方法；使用具有環(huán)氧基的單體作為單體(12)，使具有巰基、氨基等親核基團(tuán)和羧基的化合物與得到的聚合物(14)進(jìn)行加成反應(yīng)的方法；使用羧基被保護(hù)的單體作為單體(12)，將得到的聚合物(14)進(jìn)行脫保護(hù)的方法等。

作為羧酸酐，例如可舉出琥珀酸酐、馬來(lái)酸酐、戊二酸酐、鄰苯二甲酸酐、六氫鄰苯二甲酸酐等。其中，從與羥基、氨基的反應(yīng)容易進(jìn)行的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選琥珀酸酐。羧酸酐等的合計(jì)使用量，相對(duì)于來(lái)自單體(12)的結(jié)構(gòu)單元，通常為0.1～2000摩爾當(dāng)量左右，優(yōu)選為1～1000摩爾當(dāng)量。

作為具有巰基、氨基等親核基團(tuán)和羧基的化合物，可舉出巰基丙酸、氨基酸。作為羧基被保護(hù)的單體，可舉出(甲基)丙烯酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸－N－羥基琥珀酰亞胺酯。應(yīng)予說(shuō)明，脫保護(hù)方法可根據(jù)保護(hù)基以眾所周知的方法實(shí)施，可舉出水解等。

作為導(dǎo)入氨基的方法，可舉出使用具有環(huán)氧基的單體作為單體(12)，使氨或具有2個(gè)以上的氨基的化合物與得到的聚合物(14)進(jìn)行加成反應(yīng)的方法。作為具有2個(gè)以上的氨基的化合物，可舉出乙二胺。

作為導(dǎo)入甲苯磺?；姆椒ǎ膳e出使用具有羥基或氨基的單體作為單體(12)，使對(duì)甲苯磺酰氯與得到的聚合物(14)進(jìn)行加成的方法；使用具有環(huán)氧基的單體作為單體(12)，將得到的聚合物(14)水解而生成羥基，然后使對(duì)甲苯磺酰氯進(jìn)行加成的方法等。

另外，工序2－1－2優(yōu)選在與工序1同樣的堿性催化劑、溶劑存在下進(jìn)行。工序2－1－2的反應(yīng)時(shí)間通常為30分鐘～24小時(shí)左右，反應(yīng)溫度只要在溶劑的沸點(diǎn)以下適當(dāng)選擇即可。

應(yīng)予說(shuō)明，工序2－2－1只要按照工序2－1－2進(jìn)行即可，工序2－2－2只要按照工序2－1－1進(jìn)行即可。

而且，如上得到的本發(fā)明的固相載體具有高的水分散性，配體容易鍵合于反應(yīng)性官能團(tuán)，非特異吸附被抑制。而且，在將配體鍵合而使用時(shí)，能夠提高靶物質(zhì)的檢測(cè)等中的S/N(信號(hào)/噪音)比，能夠使檢測(cè)等高靈敏度且低噪音化。另外，能夠?qū)形镔|(zhì)的分離高純度化。另外，將配體鍵合而使用時(shí)，能夠以高的比例特異性地捕捉靶細(xì)胞。

因此，通過(guò)將本發(fā)明的固相載體作為親和載體，能夠廣泛利用于以酶免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定等利用了抗原抗體反應(yīng)的免疫測(cè)定；蛋白質(zhì)、核酸等的檢測(cè)；細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等生物體相關(guān)物質(zhì)的生物分離；藥物探索；生物傳感器等為代表的體外診斷、生物化學(xué)領(lǐng)域中的研究等。本發(fā)明的固相載體特別適合用于免疫測(cè)定、用于生物分離(特別是細(xì)胞分離)以及用于核酸檢測(cè)。

＜配體鍵合固相載體＞

本發(fā)明的配體鍵合固相載體是使配體鍵合于本發(fā)明的固相載體而成的。

上述配體只要是與靶物質(zhì)鍵合的分子即可，例如可舉出抗體；抗原；DNA、RNA等核酸；核苷酸；核苷；蛋白A、蛋白G、(鏈霉)親和素、酶、凝集素等蛋白質(zhì)；胰島素等肽；氨基酸；肝素等糖或多糖；脂質(zhì)；生物素等維生素；藥物；基質(zhì)；激素；神經(jīng)遞質(zhì)；合成分子等。

這些配體中，從制成適合于診斷藥用等的配體鍵合固相載體的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選抗體、抗原。抗體、抗原只要與靶物質(zhì)鍵合即可，例如可舉出抗(抗纖溶酶)抗體、抗D二聚體抗體、抗FDP抗體、抗tPA抗體、抗(凝血酶·抗凝血酶復(fù)合物)抗體、抗FPA抗體等凝血纖溶相關(guān)檢查用抗體或與其對(duì)應(yīng)的抗原；抗BFP抗體、抗CEA抗體、抗AFP抗體、抗TSH抗體、抗鐵蛋白抗體、抗CA19－9抗體等腫瘤相關(guān)檢查用抗體或與其對(duì)應(yīng)的抗原；抗載脂蛋白抗體、抗β2－微球蛋白抗體、抗α1－微球蛋白抗體、抗免疫球蛋白抗體、抗CRP抗體、抗EpCAM抗體等血清蛋白相關(guān)檢查用抗體或與其對(duì)應(yīng)的抗原；抗HCG抗體等內(nèi)分泌功能檢查用抗體或與其對(duì)應(yīng)的抗原；抗地高辛抗體、抗利多卡因抗體等藥物分析用抗體或與其對(duì)應(yīng)的抗原；HBs抗原、HCV抗原、HIV－1抗原、HIV－2抗原、HTLV－1抗原、支原體抗原、弓形蟲抗原、鏈球菌溶血素O抗原等感染病相關(guān)檢查用抗原或與其對(duì)應(yīng)的抗體；DNA抗原、人熱變性IgG等自身免疫相關(guān)檢查用抗原或與其對(duì)應(yīng)的抗體等。應(yīng)予說(shuō)明、抗體可以為多克隆抗體，也可以為單克隆抗體。

配體的鍵合只要依照常規(guī)方法進(jìn)行即可，優(yōu)選以共價(jià)鍵法進(jìn)行。例如，反應(yīng)性官能團(tuán)為羧基、配體具有氨基時(shí)，可以使用脫水縮合劑使其鍵合。

本發(fā)明的配體鍵合固相載體能夠廣泛利用于體外診斷、生物化學(xué)領(lǐng)域中的研究等。本發(fā)明的配體鍵合固相載體特別適合用于免疫測(cè)定、用于生物分離(特別是細(xì)胞分離)以及用于核酸檢測(cè)。

＜靶物質(zhì)的檢測(cè)或分離方法＞

本發(fā)明的檢測(cè)或分離試樣中的靶物質(zhì)的方法的特征在于，使用本發(fā)明的配體鍵合固相載體。

靶物質(zhì)只要與配體鍵合即可，具體而言，可舉出抗原；單克隆抗體、多克隆抗體等抗體；細(xì)胞(正常細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞、血中循環(huán)癌細(xì)胞等癌細(xì)胞)；DNA、RNA等核酸；蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、糖、多糖、脂質(zhì)、維生素等生物體相關(guān)物質(zhì)，也可以為成為創(chuàng)新藥物目標(biāo)的藥物、生物素等小分子化合物。應(yīng)予說(shuō)明，靶物質(zhì)可以被熒光物質(zhì)等標(biāo)記。

應(yīng)予說(shuō)明，試樣只要是含有上述靶物質(zhì)或具有含有靶物質(zhì)的可能性的物質(zhì)即可，具體而言為血液、血漿、血清、含有靶物質(zhì)的緩沖溶液等。

本發(fā)明的檢測(cè)或分離方法除使用本發(fā)明的配體鍵合固相載體以外，只要依照常規(guī)方法進(jìn)行即可。例如，可舉出包含以下工序的方法：將含有本發(fā)明的配體鍵合固相載體和靶物質(zhì)的試樣進(jìn)行混合等使其接觸的工序(接觸工序)；以及使用磁石等將捕捉了靶物質(zhì)的配體鍵合固相載體從試樣分離的工序(分離工序)。應(yīng)予說(shuō)明，在該分離工序之后，也可以包含檢測(cè)靶物質(zhì)的工序或使配體與靶物質(zhì)解離的工序。

實(shí)施例

以下，舉出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例中的各分析條件如以下所示。

＜鏈狀聚合物的分子量測(cè)定＞

鏈狀聚合物的分子量通過(guò)使用氫氧化鈉水溶液進(jìn)行水解，使鏈狀聚合物從粒子游離之后進(jìn)行測(cè)定。

即，在4g氫氧化鈉水溶液(1N，pH14)中分散1g粒子，在25℃下攪拌3小時(shí)，使鏈狀聚合物從粒子游離。使用磁力分離粒子，回收溶解有鏈狀聚合物的上清。接下來(lái)，在該鏈狀聚合物溶液中加入1M的鹽酸進(jìn)行中和直至溶液的pH成為7。為了用于算出鏈狀聚合物的重量，預(yù)先由加入的1M鹽酸的重量計(jì)算生成的氯化鈉的重量，通過(guò)將中和后的溶液冷凍干燥而制成粉末，得到含有氯化鈉的鏈狀聚合物。另外，為了用于算出鏈狀聚合物的重量，預(yù)先測(cè)定粉末的重量。

將上述粉體作為檢體，使用TOSOH公司制的TSKgel G3000PWXL柱和日本分光公司制的Chrom NAV色譜數(shù)據(jù)工作站程序，利用凝膠滲透色譜(Gel Permeation Chromatography：GPC)在以下的條件下測(cè)定，由此測(cè)定在粒子表面形成的鏈狀聚合物的Mn和Mw。

(測(cè)定條件)

流量：0.8mL/分鐘

洗脫溶劑：0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)

柱溫：25℃

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：TOSOH公司制的TSK gel標(biāo)準(zhǔn)聚(環(huán)氧乙烷)SE－試劑盒及和光純藥工業(yè)公司制的聚乙二醇4000

＜鏈狀聚合物在粒子表面所占的聚合物密度＞

通過(guò)下述式由從粒子游離的鏈狀聚合物的重量、鏈狀聚合物的數(shù)均分子量和粒子的表面積算出聚合物密度。

〔鏈狀聚合物在粒子表面所占的密度(條/nm²)〕＝〔與粒子1g鍵合的鏈狀聚合物的條數(shù)(條)〕/〔每1g粒子的總表面積(nm²)〕

應(yīng)予說(shuō)明，鍵合于1g粒子的鏈狀聚合物的條數(shù)和1g粒子的總表面積的算出方法如以下所示。

(鍵合于1g粒子的鏈狀聚合物的條數(shù))

通過(guò)下述式(α)算出鍵合于每1g粒子的鏈狀聚合物重量，通過(guò)下述式(β)和(γ)由得到的值算出鍵合于每1g粒子的鏈狀聚合物的條數(shù)。

(α)：鍵合于每1g粒子的鏈狀聚合物重量(mg)＝冷凍干燥后的粉末的重量(mg)－氯化鈉的重量(mg)

(β)：鍵合于每1g粒子的鏈狀聚合物的條數(shù)(mol)＝{鍵合于每1g粒子的鏈狀聚合物重量(mg)÷鏈狀聚合物的數(shù)均分子量(g/mol)}÷1000

(γ)：鍵合于每1g粒子的鏈狀聚合物的條數(shù)(條)＝鍵合于每1g粒子的鏈狀聚合物的條數(shù)(mol)×6.02×10²³(阿伏伽德羅常數(shù))

(每1g粒子的總表面積)

通過(guò)下述式(δ)～(θ)算出。應(yīng)予說(shuō)明，式(ε)中的粒子的比重由聚合物的比重、磁性體的比重和聚合物和磁性體在粒子中所占的比率計(jì)算。

(δ)：每1個(gè)粒子的體積(μm³)＝4/3×π×{粒子的體積平均半徑(μm)}³

(ε)：每1個(gè)粒子的質(zhì)量(g)＝每1個(gè)粒子的體積(μm³)×粒子的比重(g/μm³)

(ζ)：每1個(gè)粒子的粒子數(shù)(個(gè))＝1g/每1個(gè)粒子的質(zhì)量(g)

(η)：每1個(gè)粒子的表面積(nm²)＝4×π×{粒子的半徑(nm)}²

(θ)：每1g粒子的總表面積(nm²)＝每1個(gè)粒子的表面積(nm²)×每1g粒子的粒子數(shù)(個(gè))

＜反應(yīng)性官能團(tuán)含量＞

使用電導(dǎo)率測(cè)定法(Metrohm公司，794Basic Titrino)測(cè)定從粒子游離的鏈狀聚合物中所含的反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的含量，由此求出每1g粒子固體成分的反應(yīng)性官能團(tuán)的含量。

＜聚合比例〔m/(m+n)〕＞

m/(m+n)的值根據(jù)由下述式(A)、(B)和(C)得到的平均聚合度n和由下述式(D)得到的平均聚合度m算出。

(A)：每1g粒子的結(jié)構(gòu)單元(2)的重量(g)＝每1g粒子的反應(yīng)性官能團(tuán)量(mol)×結(jié)構(gòu)單元(2)的分子量(g/mol)

(B)：每1g粒子的結(jié)構(gòu)單元(1)的重量(g)＝每1g粒子的鏈狀聚合物的重量(g)－每1g粒子的結(jié)構(gòu)單元(2)的重量(g)

(C)：n＝{每1g粒子的結(jié)構(gòu)單元(1)的重量(g)/結(jié)構(gòu)單元(1)的分子量(g/mol)}/每1g粒子的聚合物條數(shù)(條)

(D)：m＝每1g粒子的反應(yīng)性官能團(tuán)量(mol)/每1g粒子的聚合物條數(shù)(條)

＜體積平均粒徑＞

各粒子的體積平均粒徑利用激光衍射·散射粒徑分布測(cè)定裝置(Beckman Coulter LS13320)測(cè)定。

〔合成例1表面具有羥基的磁性粒子的合成〕

將過(guò)氧化二(3,5,5-三甲基己酰)75％溶液(“PEROYL 355－75(S)”，日油株式會(huì)社制)2g與十二烷基硫酸鈉1質(zhì)量％水溶液20g混合，利用超聲波分散機(jī)進(jìn)行微細(xì)乳化。將其放入裝有聚苯乙烯粒子(數(shù)均粒徑：0.77μm)13g和水41g的反應(yīng)器，在25℃下攪拌12小時(shí)。

接下來(lái)，在另一容器容器中，利用十二烷基硫酸鈉0.1質(zhì)量％水溶液400g使苯乙烯96g和二乙烯基苯4g乳化，將其放入上述反應(yīng)器，在40℃下攪拌2小時(shí)后，升溫至75℃聚合8小時(shí)。冷卻至室溫后，通過(guò)離心分離僅取出粒子，將該粒子水洗、干燥。將該粒子作為核粒子(數(shù)均粒徑：1.5μm)。

接下來(lái)，在另一容器中，在油性磁性流體(“EXP Series，EMG”，株式會(huì)社Ferrotec制)中加入丙酮使粒子析出沉淀后，將其干燥，由此得到具有經(jīng)疏水化處理的表面的鐵素體系的磁性體微粒(平均一次粒徑：0.01μm)。

接下來(lái)，利用混合機(jī)將上述核粒子15g和上述經(jīng)疏水化處理的磁性體微粒15g充分混合，將該混合物使用Hybridization System NHS－0型(株式會(huì)社奈良機(jī)械制作所制)以葉片(攪拌葉片)的圓周速度100m/秒(16200rpm)處理5分鐘，得到在表面具有由磁性體微粒構(gòu)成的磁性體層的母粒子(數(shù)均粒徑：2.0μm)。

接下來(lái)，將十二烷基硫酸鈉0.50質(zhì)量％水溶液250g投入500mL可分離式燒瓶，接下來(lái)，添加上述具有磁性體層的母粒子10g，利用均質(zhì)機(jī)分散后，加熱至60℃并保持溫度。

接下來(lái)，在另一容器中，放入十二烷基硫酸鈉0.50質(zhì)量％水溶液75g、甲基丙烯酸甲酯(以下，稱為“MMA”。)13.5g、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯(以下，稱為“TMP”。)1.5g和過(guò)氧化二(3,5,5-三甲基己酰)75％溶液(“PEROYL 355－75(S)”，日油株式會(huì)社制)0.3g，使其分散而得到預(yù)乳液。將該預(yù)乳液經(jīng)2小時(shí)全部滴加于保持在60℃的上述500mL可分離式燒瓶。滴加結(jié)束后，保持在60℃并攪拌1小時(shí)。

然后，在另一容器中，放入十二烷基硫酸鈉0.50質(zhì)量％水溶液37.5g、甲基丙烯酸縮水甘油酯(以下稱為“GMA”。)6.56g、TMP 0.94g和過(guò)氧化二(3,5,5-三甲基己酰)75％溶液(“PEROYL 355－75(S)”，日油株式會(huì)社制)0.15g，使其分散而得到預(yù)乳液。將該預(yù)乳液經(jīng)1小時(shí)20分鐘全部滴加于保持在60℃的上述500mL可分離式燒瓶。然后，升溫至75℃后，進(jìn)一步持續(xù)聚合2小時(shí)，使反應(yīng)結(jié)束。接著，向該500mL可分離式燒瓶放入1mol/L的硫酸水溶液10mL，在60℃下攪拌6小時(shí)。接下來(lái)，使用磁力將上述500mL可分離式燒瓶中的粒子分離后，使用蒸餾水反復(fù)清洗。

通過(guò)以上操作，得到表面具有羥基的磁性粒子。

〔合成例2表面具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的磁性粒子的合成(1)〕

將合成例1中得到的表面具有羥基的磁性粒子10g投入燒瓶，在氮?dú)饬飨录尤朊撍臍溥秽?2mL和三乙胺7.5mL并攪拌。將該燒瓶浸入冰浴中，經(jīng)30分鐘滴加2－溴異丁酰溴6.3mL。在室溫下反應(yīng)6小時(shí)后，使用磁力將燒瓶?jī)?nèi)的粒子分離后，將粒子再分散于丙酮。進(jìn)一步進(jìn)行多次磁力分離和再分散后，將粒子分散于十二烷基硫酸鈉0.10質(zhì)量％水溶液。通過(guò)熒光X射線分析，檢測(cè)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)(2－溴異丁?；?中所含的Br。

通過(guò)以上操作，得到表面具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)(2－溴異丁?；?的磁性粒子。將該粒子作為粒子(A)。

〔合成例3表面具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的磁性粒子的合成(2)〕

將合成例1中得到的表面具有羥基的磁性粒子10g投入燒瓶，在氮?dú)饬飨录尤朊撍臍溥秽?2mL和三乙胺0.4mL并攪拌。將該燒瓶浸入冰浴中，加入2－溴異丁酰溴0.2mL。在室溫下反應(yīng)6小時(shí)后，使用磁力將燒瓶?jī)?nèi)的粒子分離后，將粒子再分散于丙酮。進(jìn)一步進(jìn)行多次磁力分離和再分散后，將粒子分散于十二烷基硫酸鈉0.10質(zhì)量％水溶液。通過(guò)熒光X射線分析，檢測(cè)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)(2－溴異丁酰基)中所含的Br。

通過(guò)以上操作，得到表面具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)(2－溴異丁?；?的磁性粒子。將該粒子作為粒子(B)。

〔合成例4表面具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)的磁性粒子的合成(3)〕

將合成例1中得到的表面具有羥基的磁性粒子10g投入燒瓶，在氮?dú)饬飨录尤朊撍臍溥秽?2mL和三乙胺0.2mL并攪拌。將該燒瓶浸入冰浴中，經(jīng)30分鐘滴加2－溴異丁酰溴0.1mL。在室溫下反應(yīng)6小時(shí)后，使用磁力將燒瓶?jī)?nèi)的粒子分離后，將粒子再散于丙酮。進(jìn)一步進(jìn)行多次磁力分離和再分散后，將粒子分散于十二烷基硫酸鈉0.10質(zhì)量％水溶液。通過(guò)熒光X射線分析，檢測(cè)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)(2－溴異丁?；?中所含的Br。

通過(guò)以上操作，得到表面具有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)基團(tuán)(2－溴異丁?；?的磁性粒子。將該粒子作為粒子(C)。

〔實(shí)施例1〕

(鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)(1))

依照以下的合成路線進(jìn)行鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)。

即，使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入[2－(甲基丙烯酰氧基)乙基](氧負(fù)離子羰基甲基)二甲基銨(以下稱為“CBMA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺與0.05mol/L的溴化銅(II)的混合水溶液0.40mL。接著，加入L－抗壞血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密閉并開始反應(yīng)。在45℃下攪拌4小時(shí)后，開封暴露于空氣中使反應(yīng)停止。使用磁力分離粒子，將未反應(yīng)的單體、催化劑等除去。

(鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)(2))

接下來(lái)，依照以下的合成路線進(jìn)行鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)。

即，使上述得到的粒子分散于磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入2－羥基乙基丙烯酰胺(以下，稱為“HEAA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺與0.05mol/L的溴化銅(II)的混合水溶液0.40mL。接著，加入L－抗壞血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密閉并開始反應(yīng)。在45℃下攪拌3小時(shí)后，開封暴露于空氣中使反應(yīng)停止。使用磁力分離粒子，除去未反應(yīng)的單體、催化劑等，由此得到CBMA和HEAA的嵌段共聚物鍵合于表面的磁性粒子。體積平均粒徑為3.0μm。測(cè)定CBMA和HEAA的嵌段共聚物的Mn、Mw、Mw/Mn和嵌段共聚物的聚合物密度。測(cè)定結(jié)果示于表1。

(縮合反應(yīng))

接下來(lái)，依照以下的合成路線進(jìn)行縮合反應(yīng)。

即，使上述得到的粒子1.5g分散于二甲基亞砜(DMSO)8mL，向其中加入溶解了琥珀酸酐1.5g的DMSO溶液7.2mL和三乙胺0.3mL開始反應(yīng)。在25℃下攪拌4小時(shí)后，使用磁力分離粒子，將過(guò)量的原料除去。

通過(guò)以上操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子1。測(cè)定羧基含量和聚合比例〔m/(m+n)〕。測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔實(shí)施例2〕

將利用HEAA使鏈狀聚合物伸長(zhǎng)的鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)(2)的反應(yīng)時(shí)間由3小時(shí)變更為1小時(shí)，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子2。體積平均粒徑為3.0μm。

應(yīng)予說(shuō)明，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行的體積平均粒徑以外的各測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔實(shí)施例3〕

將利用HEAA使鏈狀聚合物伸長(zhǎng)的鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)(2)的反應(yīng)時(shí)間由3小時(shí)變更為30分鐘，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子3。體積平均粒徑為3.0μm。

應(yīng)予說(shuō)明，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行的體積平均粒徑以外的各測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔實(shí)施例4〕

將利用HEAA使鏈狀聚合物伸長(zhǎng)的鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)(2)的反應(yīng)時(shí)間由3小時(shí)變更為15分鐘，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子4。體積平均粒徑為3.0μm。

應(yīng)予說(shuō)明，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行的體積平均粒徑以外的各測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔實(shí)施例5〕

使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入CBMA 0.5g、HEAA 0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺與0.05mol/L的溴化銅(II)的混合水溶液0.40mL。接著，加入L－抗壞血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密閉并開始反應(yīng)。在45℃下攪拌4小時(shí)后，開封暴露于空氣使反應(yīng)停止。使用磁力分離粒子，將未反應(yīng)的單體、催化劑等除去，由此得到CBMA和HEAA的無(wú)規(guī)共聚物鍵合于表面的磁性粒子。測(cè)定CBMA和HEAA的無(wú)規(guī)共聚物的Mn、Mw、Mw/Mn和無(wú)規(guī)共聚物的聚合物密度。測(cè)定結(jié)果示于表1。

使上述得到的粒子1.5g分散于二甲基亞砜(DMSO)8mL，向其中加入溶解了琥珀酸酐1.5g的DMSO溶液7.2mL和三乙胺0.3mL開始反應(yīng)。在25℃下攪拌4小時(shí)后，使用磁力分離粒子，將過(guò)量的原料除去。

通過(guò)以上操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子5。體積平均粒徑為3.0μm。測(cè)定羧基含量和聚合比例〔m/(m+n)〕。測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔實(shí)施例6〕

分別將CBMA的使用量由0.5g變更為0.8g，將HEAA的使用量由0.5g變更為0.2g，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例5同樣的操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子6。體積平均粒徑為3.0μm。

應(yīng)予說(shuō)明，與實(shí)施例5同樣地進(jìn)行的體積平均粒徑以外的各測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔實(shí)施例7〕

將粒子(A)變更為合成例3中得到的粒子(B)，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例2同樣的操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子7。體積平均粒徑為3.0μm。

應(yīng)予說(shuō)明，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行的體積平均粒徑以外的各測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔實(shí)施例8〕

(鏈狀聚合物鏈伸長(zhǎng)反應(yīng)(1))

使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入[2－(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺丙基)氫氧化銨(以下稱為“SBMA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺與0.05mol/L的溴化銅(II)的混合水溶液0.40mL。接著，加入L－抗壞血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密閉并開始反應(yīng)。在45℃下攪拌4小時(shí)后，開封暴露于空氣使反應(yīng)停止。使用磁力分離粒子，除去未反應(yīng)的單體、催化劑等。

(鏈狀聚合物伸長(zhǎng)反應(yīng)(2))

接下來(lái)，使上述得到的粒子分散于磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入HEAA0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺與0.05mol/L的溴化銅(II)的混合水溶液0.40mL。接著，加入L－抗壞血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密閉并開始反應(yīng)。在45℃下攪拌30分鐘后，開封暴露于空氣，由此使反應(yīng)停止。使用磁力分離粒子，將未反應(yīng)的單體、催化劑等除去，由此得到SBMA和HEAA的嵌段共聚物鍵合于表面的磁性粒子。體積平均粒徑為3.0μm。測(cè)定SBMA和HEAA的嵌段共聚物的Mn、Mw、Mw/Mn和嵌段共聚物的聚合物密度。測(cè)定結(jié)果示于表1。

(縮合反應(yīng))

接下來(lái)，使上述得到的粒子1.5g分散于二甲基亞砜(DMSO)8mL，向其中加入溶解了琥珀酸酐1.5g的DMSO溶液7.2mL和三乙胺0.3mL并開始反應(yīng)。在25℃下攪拌4小時(shí)后，使用磁力分離粒子，將過(guò)量的原料除去。

通過(guò)以上操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子8。測(cè)定羧基含量和聚合比例〔m/(m+n)〕。測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔比較例1〕

使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入甲基丙烯酸－2－羥基乙酯(以下，稱為“HEMA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺與0.05mol/L的溴化銅(II)的混合水溶液0.40mL。接著，加入L－抗壞血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密閉并開始反應(yīng)。在45℃下攪拌4小時(shí)后，開封暴露于空氣，由此使反應(yīng)停止。使用磁力分離粒子，除去未反應(yīng)的單體、催化劑等。通過(guò)以上操作，得到HEMA的均聚物鍵合于表面的磁性粒子9。體積平均粒徑為3.0μm。

〔比較例2〕

將CBMA變更為甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季化物(Light Ester DQ－100共榮社化學(xué)株式會(huì)社制(利用氯甲烷將甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季化而成的物質(zhì)))，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例2同樣的操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子10。體積平均粒徑為3.0μm。

應(yīng)予說(shuō)明，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行的體積平均粒徑以外的各測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔比較例3〕

將CBMA變更為甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季銨化物(Light Ester DQ－100共榮社化學(xué)株式會(huì)社制造(利用氯甲烷將甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季銨化的物質(zhì)))，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例6同樣的操作，得到將HEAA末端的羥基轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性官能團(tuán)(羧基)的磁性粒子11。體積平均粒徑為3.0μm。

應(yīng)予說(shuō)明，與實(shí)施例5同樣地進(jìn)行的體積平均粒徑以外的各測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔比較例4〕

使合成例1中得到的表面具有羥基的磁性粒子1g分散于1,3－二氧戊環(huán)4.8mL，向其中加入使三乙胺0.2mL和琥珀酸酐0.08g溶解于1,3－二氧戊環(huán)4.8mL而成的溶液。在25℃下反應(yīng)4小時(shí)后，使用磁力分離粒子，將粒子分散于水。通過(guò)以上操作，得到不具有鏈狀聚合物的含反應(yīng)性官能團(tuán)磁性粒子12。測(cè)定羧基含量。測(cè)定結(jié)果示于表1。

〔比較例5〕

使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入CBMA0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺與0.05mol/L的溴化銅(II)的混合水溶液0.40mL。接著，加入L－抗壞血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密閉并開始反應(yīng)。在45℃下攪拌4小時(shí)后，開封暴露于空氣，由此，使反應(yīng)停止。使用磁力分離粒子，除去未反應(yīng)的單體、催化劑等。通過(guò)以上操作，得到CBMA的均聚物鍵合于表面的磁性粒子13。體積平均粒徑為3.0μm。

〔試驗(yàn)例1(水分散性)〕

使各實(shí)施例和比較例中得到的磁性粒子100mg分別分散于水1mL。比較例1中得到的磁性粒子在水中分散性差、凝聚。關(guān)于其它磁性粒子，沒有凝聚而分散。評(píng)價(jià)結(jié)果示于表2。

〔試驗(yàn)例2(非特異吸附抑制效果)〕

使各實(shí)施例和比較例2～5中得到的磁性粒子1mg分別分散于水2mL。將該水分散液投入Eppendorf管，使用磁力分離粒子，除去上清液。接下來(lái)，向粒子加入Jurkat細(xì)胞破碎液(含有蛋白質(zhì)夾雜物100μg)100μL，培養(yǎng)30分鐘，然后使用磁力分離粒子，除去上清液，利用TBS－T(0.05質(zhì)量％Tween20)緩沖液將粒子清洗5次。進(jìn)一步使用磁力分離粒子，除去上清液后，加入十二烷基苯磺酸鈉水溶液(0.5質(zhì)量％)，從粒子剝離非特異吸附的蛋白質(zhì)夾雜物。將該剝離溶液進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠進(jìn)行CBB染色，通過(guò)目視確認(rèn)非特異吸附于粒子的蛋白質(zhì)的量，通過(guò)以下的基準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。蛋白質(zhì)的量越少的粒子越可以說(shuō)是非特異吸附少的良好的粒子。評(píng)價(jià)結(jié)果示于表2。

(評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn))

◎：基本沒有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的吸附，非常良好

○：沒怎么發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的吸附，良好

Δ：稍微發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的吸附，略微良好

×：明顯確認(rèn)到蛋白質(zhì)的吸附，不良

〔試驗(yàn)例3(抗體鍵合量)〕

使各實(shí)施例和比較例2～5中得到的磁性粒子1mg分別分散于水2mL。將該水分散液投入Eppendorf管，使用磁力分離粒子，除去上清液。接下來(lái)，使粒子分散于MES緩沖液(100mM，pH5.0)990μL，加入1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(10mg/mL)10μL，在室溫下培養(yǎng)30分鐘。使用磁力分離粒子，除去上清液，使其分散于MES緩沖液(100mM，pH5.0)1mL，加入抗TSH抗體(Funakoshi公司制)15μg。在室溫下培養(yǎng)12小時(shí)后，使用磁力分離粒子，除去上清液。利用TBS－T(0.05質(zhì)量％Tween20)緩沖液清洗5次，得到抗體鍵合粒子。

接下來(lái)，通過(guò)BCA測(cè)定求出抗體鍵合量。即，使抗體鍵合粒子1mg分散于BCA蛋白測(cè)定試劑試劑盒(BCA Assay Reagent Kit)(Thermo Fisher制)的A/B混合液1mL，在37℃下顛倒混合30分鐘。使用磁力分離粒子，除去上清液，測(cè)定570nm處的吸光度。另外，分別混合溶解了抗TSH抗體0μg、2μg、4μg、8μg、16μg的抗體溶液和上述A/B混合液1mL，在37℃下顛倒混合30分鐘后，測(cè)定反應(yīng)溶液的570nm處的吸光度。由得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出鍵合于磁性粒子的抗體鍵合量。將結(jié)果示于表2。

〔試驗(yàn)例4(CLEIA)〕

在試管中取試驗(yàn)例3中得到的抗體鍵合粒子的分散液5μL(相當(dāng)于粒子50μg)，混合添加有胎牛血清(FCS)50μL的200μIU/mL的TSH抗原溶液(FUJIREBIO公司制的LUMIPULSE TSH－III標(biāo)準(zhǔn)TSH溶液)50μL，在25℃下反應(yīng)10分鐘。使用磁力分離粒子，除去上清液后，作為2次抗體添加用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗TSH抗體(FUJIREBIO公司制的LUMIPULSE TSH－III免疫反應(yīng)盒附屬)40μL，在25℃下反應(yīng)10分鐘。使用磁力分離粒子，除去上清液后，使利用PBS重復(fù)3次清洗而得到的粒子分散于50μL的0.01％TritonX－100，轉(zhuǎn)移至新的管。加入堿性磷酸酶的基質(zhì)液(FUJIREBIO公司制的LUMIPULSE基質(zhì)液)100μL，在37℃下反應(yīng)10分鐘后，作為信號(hào)測(cè)定化學(xué)發(fā)光量。化學(xué)發(fā)光的測(cè)定使用Berthold Japan公司制的化學(xué)發(fā)光測(cè)定裝置(Lumat LB9507)。另外，采用0μIU/mL的TSH校準(zhǔn)器代替上述中的200μIU/mL的TSH抗原溶液，除此以外，同樣地作為噪音測(cè)定化學(xué)發(fā)光量。進(jìn)而，算出信號(hào)(S)除以噪音(N)的值S/N。將結(jié)果示于表2。

〔試驗(yàn)例5(細(xì)胞捕捉率)〕

使各實(shí)施例和比較例2～5中得到的磁性粒子1mg分別分散于水2mL。將該水分散液投入Eppendorf管，使用磁力分離粒子，除去上清液。接下來(lái)，使粒子分散于MES緩沖液(100mM，pH5.0)990μL，加入1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(10mg/mL)10μL，在室溫下培養(yǎng)30分鐘。使用磁力分離粒子，除去上清液，使其分散于MES緩沖液(100mM，pH5.0)1mL，加入抗EpCAM抗體5μg。在室溫下培養(yǎng)12小時(shí)后，使用磁力分離粒子，除去上清液。利用TBS－T(0.05質(zhì)量％Tween20)緩沖液清洗5次，得到抗體鍵合粒子。

將該抗體鍵合粒子利用PBS(－)緩沖液清洗4次后，使其分散于PBS(－)緩沖液250μL。接下來(lái)，將分散于Dulbecco’s PBS(－)緩沖液50μL的大腸癌細(xì)胞(HT－29)90000cells與抗體鍵合粒子混合，在4℃下攪拌30分鐘進(jìn)行細(xì)胞捕捉。使用磁力分離粒子，除去上清液，利用PBS(－)緩沖液清洗4次，由此得到細(xì)胞捕捉粒子。接下來(lái)，將Proteinase K 50μL加入于細(xì)胞捕捉粒子在55℃下反應(yīng)15分鐘，接著在100℃下反應(yīng)20分鐘，由此將細(xì)胞內(nèi)部的DNA洗脫。使用磁力分離粒子，回收上清液后，加入將β－珠蛋白作為靶的PCR雞尾酒(PCR Cocktail)實(shí)施PCR，根據(jù)由Ct值求出的捕捉細(xì)胞數(shù)算出特異性細(xì)胞捕捉率。將結(jié)果示于表2。

另外，不使EpCAM抗體鍵合于粒子，除此以外，進(jìn)行與上述同樣的操作，由捕捉細(xì)胞數(shù)算出非特異性細(xì)胞捕捉率。將結(jié)果示于表2。

[表1]

[表2]

如表1和2所示，實(shí)施例1～8的磁性粒子具有高的水分散性，非特異吸附被抑制，且配體容易鍵合于反應(yīng)性官能團(tuán)。另外，S/N(信號(hào)/噪音)比高，能夠以高靈敏度且低噪音化檢測(cè)抗原。另外，實(shí)施例1～8的磁性粒子能夠以高的比例特異性地捕捉靶細(xì)胞，且能夠抑制非特異性吸附。