本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合。

背景技術(shù)：

ephrin為eph受體家族的配體成員，主要表達(dá)于細(xì)胞表面，ephrin配體有8個(gè)成員，根據(jù)它們與細(xì)胞膜的附著方式，將其分為ephrina和ephrinb兩個(gè)亞族。其中ephrina亞族有5個(gè)成員，即ephrina1-a5。

suo等研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠喂食高水平的膳食維生素a能增強(qiáng)wnt信號從而激活毛囊干細(xì)胞，成年小鼠受傷皮膚過量表達(dá)wnt可以增加再生毛囊的數(shù)量，而wnt的受體卷曲蛋白1或2的激活能刺激ephrina3的表達(dá)。yamada等研究還發(fā)現(xiàn)ephrina3在雄激素性脫發(fā)患者的毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)量明顯下降。ephrina3的表達(dá)在出生后6天的小鼠上升，14天時(shí)達(dá)到高峰，在生長期的晚期突然下降，而在第二個(gè)生長期的初期又陡然上升。但總體來說皮膚中ephrina3的表達(dá)與毛發(fā)周期是相一致。在0.5天的小鼠背部皮膚中，ephrina3表達(dá)在表皮和毛釘?shù)拿业纳掀ぜ?xì)胞中。在毛囊發(fā)育的靜止期到生長期的過渡期(20天)，ephrina3在新發(fā)育的次級毛芽中和毛囊的中部表達(dá)(例如隆突區(qū))。在第二個(gè)生長期，ephrina3在毛基質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，而在毛乳頭中無表達(dá)。ephrina3的表達(dá)量在毛發(fā)的生長期初期陡然升高，生長期中期達(dá)到高峰，靜止期又突然下降，研究還發(fā)現(xiàn)ephrina3蛋白在毛囊發(fā)育中呈時(shí)空特異性表達(dá)，注射ephrina3的新生小鼠皮膚毛囊的分化進(jìn)程明顯加快，而且毛囊的數(shù)量也明顯增多。因而，ephrina3可以加快毛囊的生長和增加毛囊的密度，表明epha-ephrina信號通路與毛囊發(fā)育緊密相關(guān)。現(xiàn)在以蛋白為檢測目標(biāo)的方法通常操作比較繁瑣，耗時(shí)。半定量反轉(zhuǎn)錄pcr需要電泳檢測，準(zhǔn)確度不夠高。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：現(xiàn)在以蛋白為檢測目標(biāo)的方法通常操作比較繁瑣，耗時(shí)。半定量反轉(zhuǎn)錄pcr需要電泳檢測，準(zhǔn)確度不夠高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，

一種用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合，包括綿羊ephrina3基因的特異性引物和gapdh基因的特異性引物；所述綿羊ephrina3基因的特異性引物的核苷酸序列為seqidno.1和seqidno.2；所述gapdh基因的特異性引物的核苷酸序列分別為seqidno.3和seqidno.4。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合的構(gòu)建方法包括：

皮膚組織總rna的提取及cdna的合成：利用trizol法提取皮膚組織總rna，并經(jīng)bioanalyzer2100檢測合格后用于cdna的合成；cdna第一鏈的合成，按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行；

實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系：每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)，以gapdh為內(nèi)參基因；采用2-△△ct法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量；

實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)程序。

進(jìn)一步，2^-△△ct法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量，具體包括：首先△ct＝目的基因平均ct值-內(nèi)參基因平均ct值；

其次，-△△ct＝實(shí)驗(yàn)組△ct-對照組△ct；

最后計(jì)算目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量2^-△△ct。

進(jìn)一步，所述按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行，具體包括：采用羅氏的sybr@premixextaqtmⅱ(2×)，采用20μl反應(yīng)體系；熒光定量pcr儀采用rochelightcycler480ⅱ。

進(jìn)一步，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)程序，包括：

94℃預(yù)變性10min，

94℃變性30s，

60℃退火30s，

72℃延伸40s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)程序運(yùn)行結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析，檢測引物擴(kuò)增的特異性。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：熒光定量pcr方法是一種高靈敏度、簡便快捷的檢測方法，操作簡單,可應(yīng)用sybrgreen染料法檢測，無需使用熒光探針，采用熒光定量pcr相對定量方法通過與表達(dá)水平相對穩(wěn)定的管家基因比較來反映目的基因的表達(dá)水平，能很好的輔助ephrina3表達(dá)水平的研究，整個(gè)pcr反應(yīng)過程只需1.2小時(shí)即可完成。gapdh為管家基因，幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，且表達(dá)量一般是恒定的，故在熒光定量計(jì)算過程中經(jīng)常作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的為不同時(shí)期細(xì)毛羊體側(cè)部皮膚中ephrina3相對表達(dá)量圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合的構(gòu)建方法流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

目前，現(xiàn)在以蛋白為檢測目標(biāo)的方法通常操作比較繁瑣，耗時(shí)。半定量反轉(zhuǎn)錄pcr需要電泳檢測，準(zhǔn)確度不夠高。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合包括綿羊ephrina3基因的特異性引物和gapdh基因的特異性引物；所述綿羊ephrina3基因的特異性引物的核苷酸序列為seqidno.1：f：gccccatcaagttctcgg；

seqidno.2：r：cggagtgcgatgtggagg；

所述gapdh基因的特異性引物的核苷酸序列分別為seqidno.3：f：aagttcaacggcacagtca；

seqidno.4：r：accacatactcagcaccagc。

如圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例提供用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合的構(gòu)建方法包括：

s101：皮膚組織總rna的提取及cdna的合成：利用trizol法提取皮膚組織總rna，并經(jīng)bioanalyzer2100檢測合格后用于cdna的合成；cdna第一鏈的合成，按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行。

s102：實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系：每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)，以gapdh為內(nèi)參基因；采用2^-△△ct法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量。

s103：實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)程序。

2^-△△ct法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量，具體包括：首先△ct＝目的基因平均ct值-內(nèi)參基因平均ct值；

其次，-△△ct＝實(shí)驗(yàn)組△ct-對照組△ct；

最后計(jì)算目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量2^-△△ct。

所述按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行，具體包括：采用羅氏的sybr@premixextaqtmⅱ(2×)，采用20μl反應(yīng)體系；熒光定量pcr儀采用rochelightcycler480ⅱ。

所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)程序，包括：

94℃預(yù)變性10min，

94℃變性30s，

60℃退火30s，

72℃延伸40s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。

所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)程序運(yùn)行結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析，檢測引物擴(kuò)增的特異性。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

本發(fā)明通過設(shè)計(jì)綿羊ephrina3基因的特異性引物和gapdh基因的特異性引物，將其用于ephrina3基因表達(dá)水平的檢測。本發(fā)明的工作原理是應(yīng)用熒光定量pcrsybrgreen熒光染料的方法根據(jù)相對定量原理，即2-△△ct法確定基因表達(dá)水平。

本發(fā)明包含ephrina3一對引物。根據(jù)genebank中綿羊相應(yīng)基因的核苷酸序列，采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，相關(guān)基因的基本信息見表1。

表1

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中不同時(shí)期細(xì)毛羊體側(cè)部皮膚中ephrina3相對表達(dá)量。

本發(fā)明實(shí)施例中采用羅氏的sybr@premixextaqtmⅱ(2×)，采用20μl反應(yīng)體系。熒光定量pcr儀采用rochelightcycler480ⅱ。利用本發(fā)明的特異性引物組合和方法檢測細(xì)毛羊皮膚中ephrina3基因表達(dá)水平時(shí)，基本操作為：

1)皮膚組織總rna的提取及cdna的合成：

利用trizol法提取皮膚組織總rna，并經(jīng)bioanalyzer2100(agilent,ca,usa)檢測合格后用于cdna的合成。cdna第一鏈的合成，按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行。

2)實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)，以gapdh為內(nèi)參基因。采用2^-△△ct法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系如表2所示：

表2實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系

3)實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)程序：(1)94℃預(yù)變性10min，(2)94℃變性30s，(3)60℃退火30s，(4)72℃延伸40s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)?？稍谶\(yùn)行結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析，檢測引物擴(kuò)增的特異性。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例一

不同時(shí)期細(xì)毛羊體側(cè)部皮膚中ephrina3相對表達(dá)量

提取皮膚總rna后，經(jīng)effendorfbiophotometerplus分光光度計(jì)檢測，od260/280在1.8-2.0，并用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，28srna和18srna均較明亮，且28s與18s兩條帶的比值接近2：1。結(jié)果表明，所提取的總rna完整性較好，且濃度和純度可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

ephrina3和內(nèi)參基因gapdh的熔解曲線峰值圖上只有1個(gè)明顯的峰，表明在實(shí)時(shí)熒光定量pcr過程中熒光信號均來自特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，ephrina3和內(nèi)參基因gapdh均沒有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，數(shù)據(jù)可靠，可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)分析。

如圖1所示，ephrina3基因在細(xì)毛羊皮膚中的表達(dá)情況：胎齡120d時(shí)顯著高于胎齡90d時(shí)(p<0.01)，出生后1d時(shí)顯著低于胎齡120d時(shí)(p<0.01)；出生后一個(gè)月時(shí)和出生后1d時(shí)差異不顯著(p>0.05)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>申請人名稱：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種用于檢測細(xì)毛羊皮膚毛囊基因表達(dá)的特異性引物組合

<160>4

<210>1

<211>18

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列g(shù)ccccatcaagttctcgg

<210>2

<211>18

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列cggagtgcgatgtggagg

<210>3

<211>19

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列aagttcaacggcacagtca

<210>4

<211>20

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列accacatactcagcaccagc。