本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及l(fā)ncrna作為生物標志物在肝癌診療中的用途，具體的涉及生物標志物loc101927480。

背景技術：

原發(fā)性肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居所有癌癥的第六位，死亡率居所有癌癥的第二位。根據(jù)病理分型，原發(fā)性肝癌可分為肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)、肝內膽管細胞癌、肝細胞癌-肝內膽管細胞癌混合型等不同類型。原發(fā)性肝癌中超過90％為肝細胞癌。肝癌的發(fā)生是一個多步驟、復雜的過程，多是在肝臟既有慢性炎癥及其改變了的肝臟微環(huán)境基礎上，眾多癌基因或抑癌基因發(fā)生突變，特別是其表達逐漸發(fā)生改變，最終誘發(fā)肝癌的發(fā)生。由于在肝癌的早期，患者多沒有典型臨床癥狀和體征，臨床上難以發(fā)現(xiàn)，而一旦出現(xiàn)典型癥狀，多已是中、晚期肝癌，此時往往伴隨著肝癌的肝內外轉移，由于肝癌細胞對化療的不敏感性，目前對全身播散的肝癌細胞尚無有效治療方法。隨著現(xiàn)代細胞分子生物學的進展，現(xiàn)已證明肝癌的形成多伴隨一系列分子及信號通路的異常。因此，從分子水平探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機制，并將特征性分子作為抗腫瘤靶點，可為臨床預防和治療肝癌開辟新的途徑。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，對肝癌全基因組及轉錄組測序的結果表明肝癌具有顯著的分子特征異質性，如有些肝癌樣本中只存在少至5個基因的突變，也有些肝癌樣本中存在多至121個基因的突變，但是肝癌中尚沒有發(fā)現(xiàn)普遍存在的的基因突變。因此基因的表達調控，特別是表觀遺傳修飾，如dna甲基化、組蛋白修飾及非編碼rna表達的異常，對肝癌中眾多差異表達基因的調控作用值得深入探討。

長鏈非編碼rna(longnoncodingrna,1ncrna)是一類轉錄本長度超過200nt的，不具有蛋白質編碼能力的rna分子。相對于蛋白編碼序列及microrna，lncrna的研究還處于起步階段，其功能有待進一步闡明。最近有研究表明在許多病理情況下，包括腫瘤中，lncrnas的表達水平發(fā)生改變，并且在生理及病理情況下lncrnas可有多種功能，如調節(jié)細胞增殖、凋亡、細胞周期、細胞遷移等。lncrnas參與基因組印記、染色質修飾、轉錄調控、mrna穩(wěn)定性、蛋白質翻譯調節(jié)、microrna功能調節(jié)、蛋白質功能調節(jié)等多種重要的信號轉導調控過程。因此研究lncrna在肝癌中的作用，對于揭示肝癌發(fā)病的分子機制以及肝癌的治療具有重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種診斷早期肝癌的產(chǎn)品，使患者在早期就得以治療，進而提高生存率和生活質量。

本發(fā)明的目的之二，提供一種治療手段和藥物組合物，實現(xiàn)肝癌的精準分子治療。

本發(fā)明的目的之三，提供一種篩選預防或治療肝癌潛在物質的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明提供了檢測loc101927480的試劑在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應用。所述試劑包括rt-pcr、實時定量pcr、原位雜交、northernblotting、芯片或高通量測序平臺檢測loc101927480表達水平用試劑。

進一步，所述試劑選自：

特異性識別loc101927480的探針；或

特異性擴增loc101927480的引物。

進一步，所述特異性擴增loc101927480的引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

本發(fā)明提供了一種診斷肝癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品所述產(chǎn)品包括檢測樣本中l(wèi)oc101927480表達水平的試劑。所述“樣本”包括(但不限于)細胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。

進一步，所述產(chǎn)品包括芯片、制劑或試劑盒；其中，所述芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測loc101927480轉錄水平的針對loc101927480的寡核苷酸探針；所述試劑盒包括用于檢測loc101927480轉錄水平的引物或芯片。

固相載體可采用基因芯片領域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。

“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的分子。除非另有指出，術語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

所述探針具有與靶點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。這里，所謂“互補”，只要是雜交即可，可以不是完全互補。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是dna，也可以是rna，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注冊商標，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交聯(lián)化核酸)、ena(注冊商標，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本發(fā)明中基因檢測試劑盒或基因芯片可用于檢測包括loc101927480基因在內的多個基因(例如，與肝癌相關的多個基因)的表達水平，將肝癌的多個標志物同時進行檢測，可大大提高肝癌診斷的準確率。

本發(fā)明提供了loc101927480在篩選預防或治療肝癌潛在物質中的應用。

進一步，使用loc101927480篩選預防或治療肝癌潛在物質的方法包括：

用候選物質處理表達或含有l(wèi)oc101927480基因的體系；和

檢測所述體系中l(wèi)oc101927480基因的表達；

其中，若所述候選物質可降低loc101927480基因的表達水平(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質是預防或治療肝癌的潛在物質。所述體系選自：細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

所述候選物質包括(但不限于)：針對loc101927480基因或其上游或下游基因設計的干擾分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本發(fā)明提供了loc101927480在制備治療肝癌的藥物組合物中的應用。

進一步，所述藥物組合物包括loc101927480功能性表達的抑制劑，所述抑制劑能夠抑制loc101927480或涉及l(fā)oc101927480上游或下游途徑的物質的表達。

進一步，所述抑制劑是針對loc101927480的sirna。

在本發(fā)明中，sirna可以包括部分純化的rna、相當純的rna、合成的rna、或重組產(chǎn)生的rna、以及通過添加、刪除、替換和/或改變一個或多個核苷酸而與天然存在的rna不同的經(jīng)改變了的rna。這樣的改變可以包括添加非核苷酸材料至例如sirna的末端(一個或多個)或至sirna的一個或多個內部核苷酸，包括使sirna抵抗核酸酶消化的修飾。

本發(fā)明在篩選有效的sirna序列時，通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明人設計合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉染試劑轉染肝癌細胞系進行驗證，結果檢測出干擾效果較好的干擾分子，它們分別具有seqidno.6、seqidno.7所示的序列，進一步地在細胞水平實驗，結果證明對于細胞實驗而言抑制效率非常高。

本發(fā)明的核酸抑制物如sirna可以化學合成，也可以通過一個重組核酸結構里的表達盒轉錄成單鏈rna之后進行制備。sirna等核酸抑制物，可通過采用適當?shù)霓D染試劑被輸送到細胞內，或還可采用本領域已知的多種技術被輸送到細胞內。

本發(fā)明提供了一種治療肝癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括loc101927480功能性表達的抑制劑，所述抑制劑可以在dna水平或rna(即基因產(chǎn)物)水平上起作用。

進一步，所述藥物組合物還包括與loc101927480功能性表達的抑制劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

進一步，所述載體包括(但并不限于)：稀釋劑、賦形劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、致濕劑、吸附載體、潤滑劑等。

在本發(fā)明中，藥物組合物可以使用不同的添加劑進行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、ph控制劑。

本發(fā)明的藥物還可包括藥學上可接受的涂層材料包括(但不限于)，快速分解涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散劑。常見快速分解涂層材料包括opadry；腸溶性聚合物包括甲基內烯酸聚合物、磷羥丙甲基纖維素苯二甲酸酯、羥丙甲基纖維素乙酸酯、羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲乙基纖維素、乙酰磷苯二甲酸纖維素；增塑劑包括聚乙二醇(peg)、丙二醇等。

本發(fā)明所述的藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。

本發(fā)明的藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調節(jié)制劑的ph以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術語非胃腸道包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節(jié)內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞠內、損傷部位內、和顱內注射或輸注技術。只要能達到目標組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過任何途徑給予受體。

本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米淀粉。當口服施用水懸浮液和/或乳液時，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當時，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于降低內源性的loc101927480過表達，通過降低loc101927480的表達，從而治療因loc101927480表達上調導致的肝癌。

在本發(fā)明中，可將抑制loc101927480表達的化合物作為裸rna與遞送試劑一起作為核酸(如重組質?；虿《据d體)給受試者施用，所述核酸包含抑制loc101927480表達的序列。遞送試劑可以是親脂試劑、聚陽離子、脂質體等。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療肝癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴重程度、復發(fā)的頻率和治療方案的生理應答，調整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明所述的藥物組合物也可以脂質體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質體可有多種磷脂形成，如膽甾醇、硬脂基胺或磷脂酰膽堿。脂質體可以增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期?？蓮臉藴实男纬尚∧遗莸闹|(其通常包括中性或帶負電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的合適的脂質體。通常，通過考慮入目的脂質體的大小和血流中直追半衰期等因素，指導脂質的選擇。

用于本方法的脂質體可包含將脂質體靶向細胞的配體分子。結合癌細胞中普遍存在的受體的配體例如結合腫瘤細胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。還可對用于本發(fā)明的脂質體進行修飾，以避免被單核巨噬細胞系統(tǒng)和網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)清除。此類修飾的脂質體具有存在于表面上或整合入脂質體結構中的調理作用抑制部分。優(yōu)選的，脂質體可包含調理作用抑制部分和配體兩者。

本發(fā)明藥物組合物可以局部給藥的藥物組合物，可以配制成軟膏、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。

本發(fā)明的藥物組合物可以按藥劑學上有效的量進行給藥，本發(fā)明的用語“藥劑學上有效的量”指的是以可適用于醫(yī)學治療或預防的合理的受惠/危險比率足以治療或預防疾病的量，可根據(jù)包括疾病的嚴重程度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對藥物的敏感度、所使用的本發(fā)明組合物的給藥時間、給藥途徑及排出比率、治療時間、與所使用的本發(fā)明的組合物配合或同時使用的藥物的要素及其它醫(yī)學領域中公知的要素來決定有效用量水平。本發(fā)明的藥物組合物可作為單獨的治療劑進行給藥，或是與其它治療劑并用地進行給藥，可以與以往的治療劑依次地或同時地進行給藥。此外，可單次或多次地進行給藥。重要的是，需要對上述要素均加以考慮，并且以無副作用的最少的量可取得最大效果的量進行給藥。

本領域技術人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標志物基因可具有seqidno.1指定的cdna序列。

在本發(fā)明中，關于loc101927480的“功能性表達”，意指功能性基因產(chǎn)物的轉錄和/或翻譯。對于像loc101927480的非蛋白編碼基因，“功能性表達”可以在至少兩個水平上失調。第一，在dna水平上，例如通過基因的缺失或破壞，或者是沒有轉錄發(fā)生(在兩種情況下都阻止相關基因產(chǎn)物的合成)。轉錄的缺失可以例如由表觀遺傳的變化(例如dna甲基化)或由功能缺失性突變導致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“l(fā)of”突變是，相對于賦予蛋白質增強的或新的活性的功能獲得性突變而言，阻止、減少或消除基因產(chǎn)物的功能的突變。功能性缺失可由廣泛的突變類型引起，包括但不限于整個基因或基因部分的刪除、剪接位點突變、由小的插入和刪除引起的移碼突變、無義突變、取代了必需氨基酸的錯義突變、和阻止產(chǎn)物的正確細胞定位的突變。該定義也包括loc101927480基因的啟動子或調控區(qū)域的突變----如果這些突變干擾了基因的功能。無效突變是完全破壞基因產(chǎn)物功能的lof突變。一個等位基因中的無效突變通常將使表達水平降低50％，但可能對基因產(chǎn)物的功能具有嚴重影響。值得注意的是，功能性表達也可以因為功能獲得性突變而失調：通過賦予蛋白質新的活性，蛋白質的正常功能失調，表達的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達可以例如通過基因復制或通過缺乏dna甲基化而增加。功能性表達也可以因為功能獲得性突變而失調：通過賦予蛋白質新的活性，蛋白質的正常功能失調，表達的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達可以例如通過基因復制或通過缺乏dna甲基化而增加。

第二，在rna水平上，例如通過缺乏有效的翻譯—例如因為mrna的不穩(wěn)定(例如通過utr變體)，可以導致在轉錄物翻譯之前mrna被降解?；蛘咄ㄟ^缺乏有效的轉錄，例如因為突變誘導了新的剪接變體。

在本發(fā)明中，術語“治療”是指不以治愈為目的，而是減緩(減少)靶定的病理狀況或病癥或防止復發(fā)。如果接受治療有效量的治療劑之后，患者成功地被“治療”，患者顯示出可觀測到的和/或可度量的一種或多種特定疾病的跡象和癥狀的減少或消失。例如，癌細胞數(shù)目顯著減少或癌細胞消失，減少腫瘤尺寸；抑制(即，在某種程度上減緩，及優(yōu)選地停止)腫瘤轉移；某種程度上抑制腫瘤生長；使在一定程度上減少和/或減輕與特定癌癥相關聯(lián)的一種或多種癥狀的時間增加；減少的發(fā)病率和死亡率，以及改善生活質量。疾病的跡象或癥狀的減輕能夠為患者感知。治療可以實現(xiàn)完全反應—定義為癌癥的所有跡象消失，或部分反應—腫瘤尺寸減小，優(yōu)選減小的比例超過50％、更優(yōu)選75％。如果患者感受到疾病穩(wěn)定，患者也被視為得到治療。

在本發(fā)明的具體實施例中，實驗都是按照至少重復3次來完成的，結果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

附圖說明

圖1示利用qpcr檢測loc101927480在肝癌患者中的表達情況圖；

圖2示利用qpcr檢測loc101927480在肝癌細胞中的表達情況圖；

圖3是利用qpcr檢測轉染sirna對在肝癌細胞中l(wèi)oc101927480的表達影響圖；

圖4是利用cck8檢測loc101927480對細胞增殖的影響圖；

圖5是loc101927480對細胞的克隆形成集落的影響圖。

具體的實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與肝癌相關的基因標志物

1、樣品收集

各收集10例肝癌患者的癌組織以及癌旁組織，患者均知情同意，上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備

利用qiagen的組織rna提取試劑盒進行組織rna的提取，按說明書的具體步驟進行操作。

3、逆轉錄和標記

用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉錄成cdna，同時用cy3分別標記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用說明書的步驟進行雜交。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動以100％和10％pmt各掃描1次，2次結果agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用featureextraction進行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應用bioconductor程序包進行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后ratio值為實驗組和對照組。差異基因篩選標準：fdr<0.01，abs(log2fc)>1.5。

6、結果

與癌旁組織相比，loc101927480在肝癌組織中的表達水平顯著上調。

實施例2qpcr測序驗證loc101927480基因的差異表達

1、對loc101927480基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的樣本收集方式收集肝癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、rna提取步驟同實施例1。

3、逆轉錄：

采用25μl反應體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉錄緩沖液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)qpcr擴增檢驗

引物設計：

loc101927480基因的引物序列為：

正向引物：5’-aatctaggacttacgctctt-3’(seqidno.2)

反向引物：5’-cactgaatggcttgtctg-3’(seqidno.3)

管家基因gapdh的引物序列為：

正向引物：5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’(seqidno.5)

采用25μl反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可靠性。

配制以下反應體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。各項操作均于冰上進行。

擴增程序為：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個循環(huán)。

以sybrgreen作為熒光標記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

3、結果

結果如圖1所示，與癌旁組織相比，loc101927480基因在肝癌組織中表達上調，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，同rna-sep結果一致。

實施例3loc101927480基因在肝癌細胞系中的差異表達

1、細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株hepg2、huh7和正常肝細胞系hl-7702，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、rna的提取

1)當細胞達80-90％融合時終止培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化收集細胞于1.5m1ep管中，每管中加入lm1trizol緩慢搖動破碎細胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去dna：每個1.5m1ep管加入0.2ml三氯甲烷，搖晃15s，室溫放置10min。4℃，12000rpm離心15min。

剩余操作步驟同組織中rna提取過程。

3、逆轉錄

具體步驟同實施例2.

4、結果

結果如圖2所示，與正常肝細胞系相比，loc101927480基因在肝癌細胞hepg2、huh7中表達均上調，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，同rna-sep結果一致。

實施例4loc101927480基因的沉默

1、細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、sirna設計

針對loc101927480基因的sirna序列：

陰性對照sirna序列(sirna-nc)：

正義鏈為5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.6)，

反義鏈為5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.7)；

sirna1：

正義鏈為5’-auguugauggcguguauggua-3’(seqidno.8)，

反義鏈為5’-ccauacacgccaucaacauuu-3’(seqidno.9)；

sirna2：

正義鏈為5’-aauauccuaucuacaagagac-3’(seqidno.10)，

反義鏈為5’-cucuuguagauaggauauuuu-3’(seqidno.11)；

sirna3：

正義鏈為5’-aguaguacauuucaaagaguc-3’(seqidno.12)，

反義鏈為5’-cucuuugaaauguacuacuuc-3’(seqidno.13)

將細胞按2×10⁵/孔接種到六孔細胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中細胞培養(yǎng)24h；

在無雙抗、含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中，轉染按照脂質體轉染試劑2000(購自于invitrogen公司)的說明書轉染。

實驗分為空白對照組(hepg2)陰性對照組(sirna-nc)和實驗組(20nm)(sirna1、sirna2、sirna3)，其中陰性對照組的sirna與loc101927480基因的序列無同源性，濃度為20nm/孔，同時分別進行轉染。

3、qpcr檢測loc101927480基因的表達水平

3.1細胞總rna的提取

具體步驟同實施例3。

3.2逆轉錄步驟同實施例2。

3.3qpcr擴增步驟同實施例2。

4、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾loc101927480基因表達組與對照組之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

5、結果

結果如圖3顯示，相比hepg2、轉染空載sirna-nc、sirna2、sirna3組，sirna1組能夠顯著降低loc101927480的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例5cck8檢測細胞增殖實驗

1、細胞培養(yǎng)與轉染步驟同實施例4

2、cck8檢測細胞增殖

1)將對數(shù)增殖期的hepg2細胞接種于96孔板，每孔2×10³個細胞；

2)實驗分三組，分別是空白對照組、轉染sirna-nc組和轉染sirna2-loc101927480，每組設6個復孔；

3)分別在轉染24h、48h、72h后加入10μl/孔cck8試劑；

4)2h后使用酶標儀檢測a450的吸光值。

3、結果

結果如圖4所示：空白對照組同空載組無明顯差異，而轉染sirna1組的細胞生長速度明顯低對照組的細胞生長速度，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，上述結果表明loc101927480的表達能夠促進肝癌細胞的生長。

實施例6軟瓊脂克隆形成實驗

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，輕輕吹打使之成為單細胞懸液，離心收集細胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基重懸，適當稀釋后計數(shù)，調整細胞濃度為5×10³個/ml。

3、制備兩個濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于co2溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個/ml的穩(wěn)定感染細胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個實驗組重復4個樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃、5％co2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。

7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細胞隨機選取10個低倍視野，鏡下技術形成的細胞克隆數(shù)。

8、結果

結果如圖5所示，與對照組相比，轉染sirna1的細胞組單細胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。

sequencelisting

<110>王冬國

<120>lncrna作為生物標志物在肝癌診療中的用途

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