本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種非編碼基因生物標(biāo)記物在肝癌中的應(yīng)用，具體所述生物標(biāo)記物為ensg00000272993。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤的第五位。其發(fā)病率及死亡率較高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。肝臟移植，手術(shù)切除，栓塞，放療和化療是用于hcc治療的主流策略。盡管手術(shù)切除是最好的治療方法，但是高復(fù)發(fā)或高轉(zhuǎn)移率仍然是影響患者長期生存的主要的障礙，而大多數(shù)復(fù)發(fā)是由于腫瘤細(xì)胞在肝內(nèi)局部侵襲以及肝外轉(zhuǎn)移。肝癌患者的5年生存率仍然較低，只有3％-5％。hcc通常與病毒性感染、肝硬化、酒精、煙草等因素相關(guān)；但是，hcc的致病機制仍不清楚，許多生理生化事件與hcc進程相關(guān)。侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌的基本特征，也是影響肝細(xì)胞癌患者生存及生活質(zhì)量的重要因素。各種轉(zhuǎn)錄因子及表觀變化與hcc細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，找到預(yù)測hcc發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物，并確定干預(yù)治療的靶標(biāo)對于提高h(yuǎn)cc患者的整體生活質(zhì)量尤為重要。

隨著人類基因組計劃的完成及其序列相關(guān)分析結(jié)果表明，基因組中大約有90％以上的dna分子能夠被轉(zhuǎn)錄為rna分子，而其中編碼蛋白的基因占據(jù)基因組的很小一部分，其余的為非編碼rnas(non-codingrnas，ncrnas)。近些年來，人們深入研究了基因組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)分析，鑒定出了一類新的rna分子，即長鏈非編碼rnas(longnon-codingrnas，lncrnas)，lncrnas基因覆蓋了人基因組將近90％。隨著測序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，lncrnas引起了越來越多關(guān)注。

lncrnas通常被定義為長度上大于200nt的內(nèi)源性rna分子，缺少或無明顯的開放閱讀框(openreadingframe，orf)，缺乏編碼蛋白能力。此外，一半以上的哺乳動物非編碼轉(zhuǎn)錄本由lncrnas組成。根據(jù)lncrnas所處位置大致可分為五類：(1)正義lncrna(2)反義lncrna(3)內(nèi)含子lncrna(4)雙向lncrna(5)基因間nerna(linerna)。許多l(xiāng)ncrnas呈現(xiàn)出癌癥特異性的表達，且這些lncrnas的生物學(xué)特征表明它們可能參與人類疾病的發(fā)病機制。一些lncrnas參與到肝臟疾病，其機制包括dna印跡，x染色體失活，dna去甲基化，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生其他的rna分子(其他rna分子的前體)。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)lncrnas參與網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，能夠被表觀遺傳修飾，包括甲基化，泛素化，mirna誘導(dǎo)的調(diào)控。這些暗示了lncrna在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要功能，可作為原發(fā)性肝癌診療過程中新的診斷分子標(biāo)志物以及潛在藥物靶點，具有重要的臨床應(yīng)用前景，為基于lncrna的hcc治療的方法的潛在發(fā)展提供了理論。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種非編碼基因生物標(biāo)志物，用于肝癌的早期診斷或者靶向治療。

本發(fā)明的目的之二，提供一種篩選治療肝癌潛在藥物的方法，通過調(diào)節(jié)生物標(biāo)志物的表達水平來判斷候選物是否是潛在的治療肝癌的藥物。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測ensg00000272993表達水平的試劑在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，ensg00000272993在肝癌患者中表達水平上調(diào)。

進一步，所述試劑包括：通過rt-pcr、實時定量pcr、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測樣本中ensg00000272993基因表達水平的試劑。。

本發(fā)明提供了一種診斷肝癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括檢測樣本中ensg00000272993表達水平的試劑。本發(fā)明所述產(chǎn)品只要能夠檢測ensg00000272993的表達水平即可，而不局限于常見的檢測產(chǎn)品如芯片、核酸膜條、制劑或試劑盒等。所述“樣本”包括細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。

進一步，所述試劑包括特異性識別ensg00000272993的探針，或特異性擴增ensg00000272993的引物。

在本發(fā)明的具體實施方式中，所述試劑包括特異性擴增ensg00000272993的引物，所述特異性擴增ensg00000272993的引物序列如seqidno.2～3所示。

本發(fā)明提供了一種ensg00000272993基因的用途，用于篩選預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。

本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

用候選物質(zhì)處理表達或含有ensg00000272993基因的體系；和

檢測所述體系中ensg00000272993基因的表達；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低ensg00000272993基因的表達水平(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。所述體系選自：細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

所述候選物質(zhì)包括(但不限于)：針對ensg00000272993基因或其上游或下游基因設(shè)計的干擾分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本發(fā)明提供了一種ensg00000272993基因的用途，用于制備治療肝癌的藥物組合物。

進一步，所述藥物組合物包括ensg00000272993功能性表達的抑制劑，所述抑制劑選自：以ensg00000272993或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制ensg00000272993基因表達或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子，包括：shrna(小發(fā)夾rna)、小干擾rna(sirna)、dsrna、微小rna、反義核酸，或能表達或形成所述shrna、小干擾rna、dsrna、微小rna、反義核酸的構(gòu)建物。優(yōu)選的，所述的抑制劑為sirna。

本發(fā)明提供了一種治療肝癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括ensg00000272993功能性表達的抑制劑。

進一步，所述藥物組合物還包括與所述抑制劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

藥學(xué)上可接受的載體包括(但不限于)緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽、賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑、界面活性劑、擴散劑、消泡劑。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測ensg00000272993在肝癌患者中的表達情況圖；

圖2是利用tcga數(shù)據(jù)庫交叉驗證ensg00000272993在肝癌患者中的差異表達圖；

圖3是ensg00000272993在肝癌患者中的roc曲線圖；

圖4是利用qpcr檢測ensg00000272993在肝癌細(xì)胞中的表達情況圖；

圖5是檢測轉(zhuǎn)染sirna對肝癌細(xì)胞中ensg00000272993的表達影響圖；

圖6是利用cck8檢測ensg00000272993對細(xì)胞增殖的影響圖；

圖7是檢測ensg00000272993對細(xì)胞的克隆形成集落的影響圖；

圖8是檢測ensg00000272993對肝癌細(xì)胞凋亡的影響圖；

圖9是transwell小室檢測ensg00000272993基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移和侵襲的影響圖；

其中，圖a是ensg00000272993基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移的影響圖，圖b是ensg00000272993基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移的影響圖。

具體的實施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過高通量方法，采用目前覆蓋數(shù)據(jù)庫最廣的lncrna芯片，檢測肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncrna的表達水平，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達差異的lncrna片段，探討其與肝癌的發(fā)生之間的關(guān)系，從而為肝癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了肝癌中ensg00000272993顯著性上調(diào)。實驗證明，sirna干擾沉默ensg00000272993，能夠有效地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，為肝癌的個性化治療提供了新途徑。

ensg00000272993基因

ensg00000272993基因位于1號染色體上，在本發(fā)明的具體實施例中，一種代表性的人ensg00000272993基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明中的ensg00000272993包括野生型、突變型或其片段。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面。可以在轉(zhuǎn)錄水平上檢測生物標(biāo)志物的表達水平。

檢測技術(shù)

本發(fā)明的lncrna使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種核酸技術(shù)進行檢測，這些技術(shù)包括但不限于：核酸測序、核酸雜交和核酸擴增技術(shù)。

核酸測序技術(shù)的示例性非限制性實例包括但不限于鏈終止子(sanger)測序和染料終止子測序。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，由于rna在細(xì)胞中不太穩(wěn)定并且在實驗中更易受到核酸酶攻擊，因此在測序前通常將rna逆轉(zhuǎn)錄成dna。

本發(fā)明可在檢測前或與檢測同時地對核酸(例如，ncrna)進行擴增。核酸擴增技術(shù)的示例性非限制性實例包括但不限于：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(tma)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、鏈置換擴增(sda)和基于核酸序列的擴增(nasba)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，某些擴增技術(shù)(例如，pcr)需要在擴增前將rna逆轉(zhuǎn)錄成dna(例如，rt-pcr)，而其他擴增技術(shù)則直接擴增rna(例如，tma和nasba)。

通常稱為pcr的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用變性、引物對與相反鏈的退火以及引物延伸的多個循環(huán)，以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù)；tma的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(在基本上恒定的溫度、離子強度和ph的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個拷貝，其中靶序列的多個rna拷貝自身催化地生成另外的拷貝；lcr的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補dna寡核苷酸；其他擴增方法包括例如：通常稱為nasba的基于核酸序列的擴增；使用rna復(fù)制酶(通常稱為qβ復(fù)制酶)擴增探針分子本身的擴增；基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法；以及自我維持的序列擴增。

本發(fā)明中非擴增或擴增的核酸可通過任何常規(guī)的手段檢測。

芯片、核酸膜條、試劑盒

在本發(fā)明中芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于ensg00000272993所示的部分或全部序列。

所述固相載體包括無機載體和有機載體，所述無機載體包括但不限于有硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等；所述有機載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等。

“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

本發(fā)明中的示例性探針包括pcr引物以及基因特異性dna寡核苷酸探針，例如固定于微陣列基底上的微陣列探針、定量核酸酶保護檢驗探針、與分子條形碼連接的探針、以及固定于珠上的探針。

這些探針具有與靶點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。這里，所謂“互補”，只要是雜交即可，可以不是完全互補。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是dna，也可以是rna，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注冊商標(biāo)，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交聯(lián)化核酸)、ena(注冊商標(biāo)，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

在本發(fā)明中，核酸膜條包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探針；所述基底可以是任何適于固定寡核苷酸探針的基底，例如尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅膠晶片、微縮磁珠等。

本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測ensg00000272993的表達水平。在本發(fā)明的具體實施例中用于檢測ensg00000272993的表達水平的試劑包括特異性擴增ensg00000272993的引物，所述引物序列序列如seqidno.2～3所示。所述的試劑盒中還含有用于標(biāo)記rna樣品的標(biāo)記物，以及與所述標(biāo)記物相對應(yīng)的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取rna、pcr、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于：抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

本發(fā)明中基因檢測試劑盒或基因芯片可用于檢測包括ensg00000272993基因在內(nèi)的多個基因(例如，與肝癌相關(guān)的多個基因)的表達水平，將肝癌的多個標(biāo)志物同時進行檢測，可大大提高肝癌診斷的準(zhǔn)確率。

抑制劑和藥物組合物

基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種ensg00000272993的功能性表達抑制劑，所述抑制劑的性質(zhì)對本發(fā)明來說并不重要，只要它抑制ensg00000272993基因的功能性表達即可，這些抑制劑作為對于下調(diào)ensg00000272993有用的物質(zhì)，可用于預(yù)防或治療肝癌。

在本發(fā)明中，關(guān)于ensg00000272993的“功能性表達”，意指功能性基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。對于像ensg00000272993的非蛋白編碼基因，“功能性表達”可以在至少兩個水平上失調(diào)。第一，在dna水平上，例如通過基因的缺失或破壞，或者是沒有轉(zhuǎn)錄發(fā)生(在兩種情況下都阻止相關(guān)基因產(chǎn)物的合成)。轉(zhuǎn)錄的缺失可以例如由表觀遺傳的變化(例如dna甲基化)或由功能缺失性突變導(dǎo)致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“l(fā)of”突變是，相對于賦予蛋白質(zhì)增強的或新的活性的功能獲得性突變而言，阻止、減少或消除基因產(chǎn)物的功能的突變。功能性缺失可由廣泛的突變類型引起，包括但不限于整個基因或基因部分的刪除、剪接位點突變、由小的插入和刪除引起的移碼突變、無義突變、取代了必需氨基酸的錯義突變、和阻止產(chǎn)物的正確細(xì)胞定位的突變。該定義也包括ensg00000272993基因的啟動子或調(diào)控區(qū)域的突變，如果這些突變干擾了基因的功能。無效突變是完全破壞基因產(chǎn)物功能的lof突變。一個等位基因中的無效突變通常將使表達水平降低50％但可能對基因產(chǎn)物的功能具有嚴(yán)重影響。值得注意的是，功能性表達也可以因為功能獲得性突變而失調(diào)：通過賦予蛋白質(zhì)新的活性，蛋白質(zhì)的正常功能失調(diào)，表達的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達可以例如通過基因復(fù)制或通過缺乏dna甲基化而增加。功能性表達也可以因為功能獲得性突變而失調(diào)：通過賦予蛋白質(zhì)新的活性，蛋白質(zhì)的正常功能失調(diào)，表達的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達可以例如通過基因復(fù)制或通過缺乏dna甲基化而增加。

第二，在rna水平上，例如通過缺乏有效的翻譯，例如因為mrna的不穩(wěn)定(例如通過utr變體)，可以導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄物翻譯之前mrna被降解?；蛘咄ㄟ^缺乏有效的轉(zhuǎn)錄，例如因為突變誘導(dǎo)了新的剪接變體。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述ensg00000272993的抑制劑是一種ensg00000272993特異性的小干擾rna分子。如本文所用，所述的“小干擾rna”是指一種短片段雙鏈rna分子，能夠以同源互補序列的mrna為靶目標(biāo)降解特定的mrna，這個過程就是rna干擾(rnainterference)過程。小干擾rna可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈rna復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈rna復(fù)合物。

在篩選有效的sirna序列時，本發(fā)明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系進行驗證，選出干擾效果最佳的sirna，進一步地在細(xì)胞水平實驗，結(jié)果證明對于該sirna在能有效的抑制細(xì)胞中ensg00000272993基因的表達水平，以及肝癌細(xì)胞的增殖。

本發(fā)明的核酸抑制物如sirna可以化學(xué)合成，也可以通過一個重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達盒轉(zhuǎn)錄成單鏈rna之后進行制備。sirna等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的所述的ensg00000272993的抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制肝癌。任何前述的ensg00000272993的抑制劑均可用于藥物組合物的制備。

在本發(fā)明中，藥學(xué)上可接受的載體包括(但不限于)緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽、賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑、界面活性劑、擴散劑、消泡劑。

如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞(宿主細(xì)胞)轉(zhuǎn)染試劑。

本發(fā)明可以采用用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的抑制劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將ensg00000272993的抑制劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶ensg00000272993的抑制劑的表達單位(比如表達載體或病毒等，或sirna或shrna)遞送到靶點上，并使之表達活性的ensg00000272993抑制劑，具體情況需視所述的抑制劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明的藥物組合物可以進一步包含一種或多種抗癌劑。在具體的實施方案中，藥物組合物包含至少一種抑制ensg00000272993基因表達的化合物和至少一種化療劑。用于本發(fā)明的化療劑，包括但不限于：微管激活劑、烷化劑、抗贅生抗代謝物、鉑類化合物、dna-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，hmg-coa抑制劑，cdk抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈螺旋dna，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。

可藥用載體可包括但不限于：病毒、微囊、脂質(zhì)體、納米顆粒或聚合物及其任意組合。相關(guān)的遞送載劑可包括但不限于：脂質(zhì)體、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、無機(包括金屬)顆粒、以及細(xì)菌或病毒(例如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)、噬菌體、黏粒或質(zhì)粒載體。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療肝癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。

本發(fā)明的藥物組合物還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

統(tǒng)計學(xué)分析

在本發(fā)明的具體實施例中，實驗都是按照至少重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與肝癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集10例肝癌患者的癌組織以及癌旁組織，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備

利用qiagen的組織rna提取試劑盒進行組織rna的提取，按說明書的具體步驟進行操作。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，同時用cy3分別標(biāo)記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用說明書的步驟進行雜交。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動以100％和10％pmt各掃描1次，2次結(jié)果agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用featureextraction進行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用bioconductor程序包進行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：fdr<0.01，abs(log2fc)>1.5。

6、結(jié)果

與癌旁組織相比，ensg00000272993在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織。

實施例2qpcr測序驗證ensg00000272993基因的差異表達

1、對ensg00000272993基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的樣本收集方式收集肝癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、rna提取步驟同實施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)qpcr擴增檢驗

引物設(shè)計：

ensg00000272993基因的引物序列為：

正向引物：5’-gctgatatgagtaaggagtagt-3’(seqidno.2)

反向引物：5’-accaggagtcttcaacatt-3’(seqidno.3)

管家基因gapdh的引物序列為：

正向引物：5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’(seqidno.5)

配制25μl反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。各項操作均于冰上進行。每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

擴增程序為：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個循環(huán)。

以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

3、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與癌旁組織相比，ensg00000272993基因在肝癌組織中表達水平上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實施例3分析ensg00000272993在tcga數(shù)據(jù)庫中的表達情況

1、數(shù)據(jù)收集

從tcga數(shù)據(jù)庫中收集200例肝癌組織和50例癌旁組織的lncrna表達譜數(shù)據(jù)，分析ensg00000272993在肝癌組織和癌旁組織中的表達水平；繪制箱形圖。

2、roc曲線分析

使用r語言中的proc包分析ensg00000272993的受試者工作特征，計算二項精確置信空間，繪制roc曲線。

3、結(jié)果

ensg00000272993的表達水平如圖2所示，相比對照組，ensg00000272993在肝癌組織中表達顯著上調(diào)。

ensg00000272993的roc曲線如圖3所示，ensg00000272993的auc值高達0.936，具有較高的特異性和敏感性。

實施例4ensg00000272993基因在肝癌細(xì)胞系中的差異表達

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株hepg2、huh7和正常肝細(xì)胞系hl-7702，，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、rna的提取

1)胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打獲得的細(xì)胞經(jīng)離心、重懸、清洗后，以含10％fbs的dmem培養(yǎng)基重懸；

2)將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，添加培養(yǎng)基至2ml/孔，輕搖6孔板使細(xì)胞均勻重懸；

3)細(xì)胞貼壁生長48h，去培養(yǎng)基；

4)以1mltrizol試劑裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打6孔板壁，盡量使細(xì)胞完全裂解；

5)轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液至1.5mldepc處理過的ep管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步驟同血液中rna提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實施例2.

4、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與正常肝細(xì)胞系相比，ensg00000272993基因在肝癌細(xì)胞hepg2、huh7中表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實施例5ensg00000272993基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、sirna設(shè)計

針對ensg00000272993基因的sirna序列：

陰性對照sirna序列(sirna-nc)：

正義鏈：5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.6)，

反義鏈：5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.7)；

sirna1：

正義鏈：5’-ucauaucagcaaauagcagcu-3’(seqidno.8)，

反義鏈：5’-cugcuauuugcugauaugagu-3’(seqidno.9)；

sirna2：

正義鏈：5’-uacucauaucagcaaauagca-3’(seqidno.10)，

反義鏈：5’-cuauuugcugauaugaguaag-3’(seqidno.11)；

sirna3：

正義鏈為5’-ugacauugacuuagacaucug-3’(seqidno.12)，

反義鏈為5’-gaugucuaagucaaugucauu-3’(seqidno.13)

sirna4：

正義鏈為5’-uacuauguagcgguaauggug-3’(seqidno.14)，

反義鏈為5’-ccauuaccgcuacauaguacg-3’(seqidno.15)

將細(xì)胞按2×10⁵/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)24h；

在無雙抗、含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于invitrogen公司)的說明書轉(zhuǎn)染。

實驗分為空白對照組(hepg2)、陰性對照組(sirna-nc)和實驗組(20nm)(sirna1、sirna2、sirna3、sirna4)，其中陰性對照組sirna與ensg00000272993基因的序列無同源性，濃度為20nm/孔，同時分別進行轉(zhuǎn)染。

3、qpcr檢測ensg00000272993基因的表達水平

3.1細(xì)胞總rna的提取

具體步驟同實施例4。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。

3.3qpcr擴增步驟同實施例2。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖5顯示，相比hepg2、轉(zhuǎn)染空載sirna-nc、sirna1、sirna2、sirna4組，sirna3組能夠顯著降低ensg00000272993的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

實施例6cck8檢測細(xì)胞增殖實驗

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實施例4

2、cck8檢測細(xì)胞增殖

1)將對數(shù)增殖期的hepg2細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×10³個細(xì)胞；

2)實驗分三組，分別是空白對照組、轉(zhuǎn)染sirna-nc組和轉(zhuǎn)染sirna1，每組設(shè)6個復(fù)孔；

3)分別在轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔cck8試劑；

4)2h后使用酶標(biāo)儀檢測a450的吸光值。

3、結(jié)果

圖6所示的結(jié)果顯示：空白對照組同空載組無明顯差異，而轉(zhuǎn)染sirna3組的細(xì)胞生長速度明顯低對照組的細(xì)胞生長速度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，上述結(jié)果表明ensg00000272993的表達能夠促進肝癌細(xì)胞的生長。

實施例7軟瓊脂克隆形成實驗

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，輕輕吹打使之成為單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10³個/ml。

3、制備兩個濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于co2溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個/ml的穩(wěn)定感染細(xì)胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個實驗組重復(fù)4個樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％co2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。

7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細(xì)胞隨機選取10個低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。

8、結(jié)果

結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染sirna3的細(xì)胞組單細(xì)胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

實施例8ensg00000272993基因?qū)Ω伟┘?xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀檢測ensg00000272993基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實施例4。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例5。

3、步驟

1)將3m110×上樣緩沖液用27ml蒸餾水稀釋。

2)收集細(xì)胞樣本并用預(yù)冷的pbs清洗。

3)將細(xì)胞加入lml1×上樣緩沖液，300g離心10min，吸出緩沖液。

4)再次加入lml1×上樣緩沖液，將細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁶個/ml。

5)將細(xì)胞懸液取出100μ1，加入ep管中。

6)將5μl的annexinvfitc加入ep管中，混勻ep管中的液體，在室溫下避光孵育10min。

7)向ep管中加入5μ1pi染液，在室溫下避光5min。

8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，輕輕混勻，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進行檢測。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖8所示，實驗組與對照組相比，細(xì)胞凋亡率無顯著性變化，該結(jié)果說明，ensg00000272993的表達對肝癌細(xì)胞的凋亡影響不大。

實施例9細(xì)胞遷移及侵襲實驗

1、transwell小室制備

無菌條件下matrigel冰浴融化，用pbs進行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待matrigel膠聚合成凝膠后取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含bsa的無血清培養(yǎng)液對基底膜進行水化處理，37℃放置30min。

2、配置細(xì)胞懸液

細(xì)胞撤血清饑餓處理12-24h，對細(xì)胞進行消化處理，終止消化后進行離心，去除上層培養(yǎng)液。用pbs對沉淀細(xì)胞進行清洗，加入含有bsa的無血清培養(yǎng)基對其進行重懸。調(diào)整細(xì)胞的密度至5×l0⁵個/ml。

3、細(xì)胞接種

取細(xì)胞懸液200μ1(遷移實驗為100μ1，侵襲實驗為200μ1)加入到transwell小室中。在24孔板下室加入500μ1含fbs的1640培養(yǎng)基。把細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

4、染色

細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用dapi染色。把小室細(xì)胞先用pbs漂洗2遍，放入dapi工作液中室溫染色5-20min。用pbs漂洗2遍，放入熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖9所示，在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾rna之后，與對照組相比，實驗組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結(jié)果說明ensg00000272993能夠促進肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>一種非編碼基因生物標(biāo)記物在肝癌中的應(yīng)用

<160>15

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>671

<212>dna

<213>人源

<400>1

taggctgactgaaagagaaatcaaggattaattgtaggtttttacactgagcacttgaaa60

agagctgctatttgctgatatgagtaaggagtagtcttggaggaagaaaaccaagagtac120

tgttttgaacaaaatgttgaagactcctggtaaatatcgaagtgtaaatatcaaatagga180

agtcagaaatatgagaatctggagtttaggaaagagaagggggttaggtttgtaagatct240

catatcagtctgattcttatttttttgtagataatctaccctttctttctgtaaatgttt300

agaagcatgatgtctatgtgtgtatatatacacacacactcactcccccccgccaggact360

gcctcagttttcatctcagtatttgactaaaaccttctattcaacttcagtttcagcctt420

agaataaccagatgtctaagtcaatgtcatttggggcatctctagacttgtgcaatcaca480

aaagtcaccattaccgctacatagtacgtattatgaccaatggatatcattcagagttct540

agtttacatatgctattatcaaacatatgtaagccttttaatgtaacttgggagtgaaat600

tagtaaaattctatcaatttacataaattaattttactgtaaaaataaaatacattatga660

aagtttctgta671

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gctgatatgagtaaggagtagt22

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

accaggagtcttcaacatt19

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ccgggaaactgtggcgtgatgg22

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aggtggaggagtgggtgtcgctgtt25

<210>6

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>6

uucuccgaacgugucacgu19

<210>7

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>7

acgugacacguucggagaa19

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>8

ucauaucagcaaauagcagcu21

<210>9

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>9

cugcuauuugcugauaugagu21

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>10

uacucauaucagcaaauagca21

<210>11

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>11

cuauuugcugauaugaguaag21

<210>12

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>12

ugacauugacuuagacaucug21

<210>13

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>13

gaugucuaagucaaugucauu21

<210>14

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>14

uacuauguagcgguaauggug21

<210>15

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>15

ccauuaccgcuacauaguacg21