本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種利用pcr擴增檢測結(jié)合耐高溫限制性內(nèi)切酶處理檢測血漿游離dna中egfr基因兩種缺失突變的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)是上皮生長因子(egf)細胞增殖和信號傳導的受體。egfr屬于erbb受體家族的一種，該家族包括egfr(erbb-1),her2/c-neu(erbb-2),her3(erbb-3)和her4(erbb-4)。egfr也被稱作her1、erbb1，突變或過表達一般會引發(fā)腫瘤。egfr是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，細胞膜貫通，分子量170kda。egfr位于細胞膜表面，靠與配體結(jié)合來激活，包括egf和tgfα(transforminggrowthfactorα)。許多腫瘤中有突變型egfr存在，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多種egfr突變型。突變型egfr的作用可能包括：具有配體非依賴型受體的細胞持續(xù)活化；由于egfr的某些結(jié)構(gòu)域缺失而導致受體下調(diào)機制的破壞、異常信號傳導通路的激活、細胞凋亡的抑制等。突變體的產(chǎn)生是由于egfr基因的缺失、突變和重排。循環(huán)腫瘤dna(ctdna)突變檢測是近年來興起且發(fā)展迅速的腫瘤診斷技術(shù)，稱為“液體活檢”。ctdna是指腫瘤細胞體細胞dna經(jīng)脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)；隨著基因測序的飛速發(fā)展，目前，已能在血液中對其進行檢測并計數(shù)。ctdna來自腫瘤細胞的體細胞突變，不同于遺傳突變的是其存在于體內(nèi)每個細胞。因此，ctdna是一種特征性的腫瘤生物標記物，并且還可以被定性、定量和追蹤。與組織活檢相比ctdna檢查微創(chuàng)小、無放射性污染、經(jīng)濟、新dna無防腐劑污染等優(yōu)點，并允許對治療反應實時監(jiān)測。由于ctdna含量低(<1.0％總cfdna)，片段短(180-200bp)，半衰期短(～2小時)，故其檢測對痕量核酸檢測技術(shù)提出全新的挑戰(zhàn)。目前具備極微量核酸基因突變檢測能力的技術(shù)主要有arms技術(shù)(包括super-arms)、第二代測序(ngs)和數(shù)字pcr(ddpcr，包括beaming技術(shù))等。ngs技術(shù)可檢測未知突變且檢測基因數(shù)量不受限，在腫瘤耐藥突變的監(jiān)測與研究等領域有很大的應用潛力。然而，ngs建庫技術(shù)復雜，常規(guī)建庫測序方法使得血漿中含量極低的腫瘤信號完全淹沒在背景噪聲中，建庫過程原始信息丟失嚴重或成為敏感度潛力發(fā)揮的限制因素。數(shù)字pcr技術(shù)，具有極高的敏感性，可絕對定量，但該方法檢測通量較低。由于，ctdna含量極少，且腫瘤dna分子存在的數(shù)量遠遠不及正常細胞的dna，腫瘤相關dna被來自正常細胞dna嚴重稀釋，單分子豐度僅0.01％，化驗結(jié)果特別容易被干擾。因此，能夠特異性的豐富樣品靶序列的富集技術(shù)是液體活檢技術(shù)發(fā)展的關鍵。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于富集技術(shù)的循環(huán)腫瘤dna(ctdna)egfr基因19號外顯子c.2235_2249del15和c.2239_2256del18兩種缺失突變的檢測試劑盒及方法。通過靶向富集血漿游離dna中egfr基因確實突變基因片段，提高該突變的檢測靈敏度。為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：所述檢測血漿游離dna中egfr基因兩種缺失突變的試劑盒中含有特異性引物對和耐高溫的限制性內(nèi)切酶；所述特異性引物包括序列如seqidno.1(catgcaagcttaaaattcccgtcgctatcaa)所示的正義引物和序列如seqidno.2(cgggaattcgatttccttgttggctttcg)所示的反義引物；所述耐高溫的限制性內(nèi)切酶tru1i內(nèi)切酶。所述試劑盒中還含有高保真dna聚合酶和pcr常規(guī)組件。優(yōu)選地，所述高保真dna聚合酶為hotstartaqplusdna聚合酶。所述pcr常規(guī)組件包括dntp混合液、含鎂離子的pcr反應緩沖液、去離子水?；谠噭┖袡z測血漿游離dna中egfr基因兩種缺失突變的方法包括如下步驟：(1)按照血漿游離dna常規(guī)提取方法提取血漿游離dna；(2)采用本發(fā)明所述試劑盒進行pcr反應；(3)將步驟(2)獲得的pcr產(chǎn)物送去一代測序，并通過與genebank中記錄的序列做blast一致性分析，判斷突變情況。即，利用sanger測序法分析pcr產(chǎn)物中是否有突變存在。其中，步驟(2)所述進行pcr反應的具體過程分為三步：a)采用試劑盒中的特異性引物對、高保真dna聚合酶、pcr常規(guī)組件構(gòu)成的pcr反應體系，進行pcr反應；b)在pcr反應過程中加入試劑盒中的耐高溫的限制性內(nèi)切酶，并于65℃酶切反應1h；c)酶切反應結(jié)束后繼續(xù)進行pcr反應。優(yōu)選地，步驟a中所述pcr反應的條件為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles。步驟c中所述pcr反應的條件為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃終延伸5min。下面對本發(fā)明作進一步說明：利用本發(fā)明所述試劑盒檢測時，pcr反應共分三步進行：①配置不含限制性內(nèi)切酶tru1i的pcr反應體系(25μl)，以步驟(1)獲得的血漿游離dna為模板，進行pcr擴增；pcr反應的條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec(15cycles)；②在步驟①反應結(jié)束后，往pcr反應體系中加入0.8μl限制性內(nèi)切酶tru1i；65℃反應1小時；③在步驟②反應結(jié)束后，接著進行pcr反應；95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃終延伸5min。步驟①中，每25μlpcr反應體系中的組分如下：正義引物0.4μl，反義引物0.4μl，模板dna2μl，10×pcrbuffer(含硫酸鎂)2.5μl，dntp混合液(每種10mm)0.5μl，hotstartaqplusdna聚合酶0.3μl，余量為去離子水；步驟②中所使用的限制性內(nèi)切酶tru1i是耐高溫的，在pcr反應用不會出現(xiàn)熱失活，且其特異性識別序列為t▼taa,，正好能識別egfr基因19號外顯子c.2235_2249del15和c.2239_2256del18缺失的部分，當egfr基因為野生型時，tru1i酶可將dna雙鏈切斷；當19號外顯子出現(xiàn)c.2235_2249del15和c.2239_2256del18缺失突變時，tru1i酶將不能識別該序列，不能將dna雙鏈切斷。本發(fā)明利用耐高溫的限制性內(nèi)切酶(tru1i)，tru1i內(nèi)切酶的特異性識別位點正好位于egfr基因19號外顯子缺失突變類型序列的缺失片段內(nèi)。當基因型為野生型時，ttru1i內(nèi)切酶能識別19號外顯子的序列，并將其dna雙鏈切斷；而當出現(xiàn)c.2235_2249del15和c.2239_2256del18突變時，基因序列中能被tru1i內(nèi)切酶識別的序列缺失了，tru1i內(nèi)切酶將不能識別該序列，不能將dna雙鏈切斷。通過在普通的pcr反應中，加入耐高溫的限制性內(nèi)切酶，可在反應過程中將野生型的dna片段破壞，使得野生型的pcr產(chǎn)物越來越少，而突變型的dna片段能在反應中不斷的富集，提高了低豐度突變的檢測靈敏性?？傊?，采用本發(fā)明所述檢測egfr基因兩種缺失突變的試劑盒和檢測方法檢測egfr基因兩種缺失突變，可提高突變檢測的靈敏度，減少樣本使用量，有利用臨床使用和推廣。附圖說明圖1為聯(lián)合一代測序可識別egfr基因19號外顯子15nt缺失突變中野生型：突變型拷貝數(shù)比例達到10000:1。具體實施方式egfr基因19號外顯子兩種缺失突變基因型轉(zhuǎn)化(1)在樣品模板中采用pcr方法擴增egfr基因19號外顯子缺失突變位點待識別片段，引物如下：egfrdel#1：5’-catgcaagcttaaaattcccgtcgctatcaa-3’(seqidno.1)egfrdel#2：5’-cgggaattcgatttccttgttggctttcg-3’(seqidno.2)。(2)限制性內(nèi)切酶tspri識別位點pcr反應條件：1)pcr體系如表1：表1hotstartaqplusdna0.3μl10xpcrbuffer2.5μldntp(各10mm)0.5μl上游引物(10μm)0.4μl下游引物(10μm)0.4μldna模板2μlddh2oupto25μl反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles；2)在pcr反應體系中加入限制性內(nèi)切酶trui0.8μl,65℃1小時3)95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃終延伸5分鐘。(3)pcr產(chǎn)物送去一代測序，測序結(jié)果與genebank中記錄的序列做blast一致性分析。分析結(jié)果見圖1。sequencelisting<110>郴州市第一人民醫(yī)院<120>一種檢測血漿游離dna中egfr基因突變的試劑盒及方法<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>31<212>dna<213>人工合成<400>1catgcaagcttaaaattcccgtcgctatcaa31<210>2<211>29<212>dna<213>人工合成<400>2cgggaattcgatttccttgttggctttcg29當前第1頁12