本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種檢測(cè)p.pro189ala位點(diǎn)基因型的引物組及其檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居各種腫瘤之首，嚴(yán)重威脅居民健康和生命安全。最新的研究數(shù)據(jù)表明，全球范圍內(nèi)每年肺癌新發(fā)病例約180萬；而在我國(guó)，2015年新發(fā)肺癌患者達(dá)73.3萬例。由于肺癌常伴早期轉(zhuǎn)移，70％的肺癌病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，其5年生存率的平均水平低于20％。研究表明，肺癌是多因素、多基因疾病，是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結(jié)果。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前已發(fā)現(xiàn)了大量的肺癌易感基因，但是其生物學(xué)機(jī)制仍未闡明。肺癌的早期診斷和預(yù)防仍未得到很好的解決。因此，尋找肺癌早期發(fā)病、診斷和治療的特異性生物標(biāo)志物，促進(jìn)肺癌的科學(xué)防治，顯得尤為重要。

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)，主要是指一類基于單堿基變異引起的dna序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。snp是基因組最廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，它以高密度以及二態(tài)性所適宜的快速、大規(guī)模的篩查和易于分型的特點(diǎn)決定了它比其他多態(tài)性標(biāo)志更適合對(duì)復(fù)雜性疾病的研究。證據(jù)表明，snp作為第三代遺傳標(biāo)記，對(duì)疾病、毒物的易感性和耐受性、疾病臨床表型的多樣性，以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性都有著重要的影響。目前常規(guī)用于疾病易感基因變異的主要檢測(cè)方法包括pcr-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(rflp)和實(shí)時(shí)熒光定量pcr法。rflp法的原理是當(dāng)突變影響到某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)時(shí)，可通過酶切處理患者的pcr產(chǎn)物繼而電泳檢測(cè)是否有突變。但這種方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)。而應(yīng)用于snp檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，還實(shí)現(xiàn)了判斷結(jié)果的自動(dòng)性?？衫脽晒舛縫cr技術(shù)研發(fā)快速檢測(cè)疾病易感性的試劑盒。

吸煙是肺癌發(fā)病的主要環(huán)境危險(xiǎn)因素。煙草暴露含有的致癌物質(zhì)多環(huán)芳香烴可與體內(nèi)的芳香烴受體(aryl-hydrocarbonreceptor，ahr)結(jié)合并且激活機(jī)體內(nèi)ahrr信號(hào)通路，參與多種致畸、致癌、致突變等反應(yīng)。芳香烴受體抑制因子(aryl-hydrocarbonreceptorrepressor，ahrr)是受ahr信號(hào)通路激活的轉(zhuǎn)錄因子，其通過負(fù)反饋機(jī)制抑制ahr依賴的下游基因表達(dá)。研究表明，ahrr基因作為ahr信號(hào)通路的關(guān)鍵抑制分子，可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡、免疫炎癥及血管生成等過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮著重要的作用。此外，有證據(jù)顯示，位于ahrr基因的單核苷酸多態(tài)可影響ahrr基因的結(jié)構(gòu)與功能，從而與復(fù)雜疾病的發(fā)生有關(guān)。

人類芳香烴受體抑制因子ahrr基因位于第5號(hào)染色體5p15.33區(qū)域，全長(zhǎng)約134kb，包含12個(gè)外顯子，編碼719個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。有研究報(bào)道顯示，ahrr基因編碼區(qū)的遺傳變異位點(diǎn)p.pro189ala(rs2292596；565c>g)可降低對(duì)ahrr基因的抑制效率，增加口腔癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而p.pro189ala位點(diǎn)是否與肺癌發(fā)病相關(guān)，需要我們進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種檢測(cè)ahrr基因編碼區(qū)p.pro189ala位點(diǎn)基因型的引物組；該引物組特異性高，擴(kuò)增效率高，可準(zhǔn)確鑒別p.pro189alasnp位點(diǎn)的基因型。

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)ahrr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)p.pro189ala基因型的引物組。

本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)p.pro189ala位點(diǎn)基因型的方法。

本發(fā)明的再一目的目是提供一種肺癌易感性檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供ahrr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)p.pro189ala在個(gè)體肺癌易感性評(píng)估中的應(yīng)用或在作為個(gè)體肺癌易感性評(píng)估的靶點(diǎn)方面的應(yīng)用。

本發(fā)明通過大樣本的中國(guó)南方人群肺癌病例對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)p.pro189ala位點(diǎn)與肺癌發(fā)病顯著相關(guān)，并且呈基因劑量-反應(yīng)關(guān)系。即使在調(diào)整年齡、性別、吸煙、腫瘤家族史等多種混雜因素后，這種相關(guān)性仍然存在。

具體地，所述應(yīng)用為首先提取樣本基因組dna，再通過snp基因分型技術(shù)測(cè)定p.pro189ala位點(diǎn)的基因型，若pro189ala位點(diǎn)的編碼的氨基酸為ala，則樣本為肺癌易感性。

優(yōu)選地，所述snp基因分型技術(shù)為taqman-mgb探針法。

一種檢測(cè)ahrr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)p.pro189ala基因型的引物組，所述引物組包括一對(duì)特異性引物及兩條野生型和突變型熒光探針，其序列依次如seqidno：1～4所示。

所述

特異性引物f：5’-acacccacctgtctccaagg-3’(seqidno：1)

特異性引物r：5’-gcaccagaacatttatgactac-3’(seqidno：2)

野生型熒光探針：fam-cggggcctgcccaaaca-mgb(seqidno：3)

突變型熒光探針：hex-cgggggctgcccaaacacc-mgb(seqidno：4)

同時(shí)，本發(fā)明所述p.pro189ala位點(diǎn)基因型的檢測(cè)引物在在肺癌易感性檢測(cè)和/或在制備肺癌易感性檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

一種ahrr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)p.pro189ala基因型的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1.提取待測(cè)樣本dna；

s2.以步驟s1所述dna為模板，用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定p.pro189ala位點(diǎn)的基因型。

優(yōu)選地，步驟s2所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：dna模板2μl，10μm特異性引物各0.3μl，5μm熒光探針各0.1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.05μl，20mmdntp0.1μl，25mmmgcl20.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，去離子水4.0μl，共10μl。

優(yōu)選地，步驟s2所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共50個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選地，所述熒光定量pcr檢測(cè)儀器為abi7900ht型熒光定量pcr儀，其自帶軟件sds(sequencedetectionsystems)v2.3判讀基因型，自動(dòng)分析結(jié)果。

此外，所述檢測(cè)方法在肺癌易感性檢測(cè)和/或在制備肺癌易感性檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

具體地，所述應(yīng)用為利用上述的p.pro189ala基因型的檢測(cè)方法對(duì)樣本的p.pro189ala進(jìn)行基因型檢測(cè)，若pro189ala位點(diǎn)的編碼的氨基酸為ala，則樣本為肺癌易感型。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種肺癌易感性檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含上述檢測(cè)p.pro189ala1位點(diǎn)基因型的引物組。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包含有熒光定量pcr所需試劑。

更優(yōu)選地，所述熒光定量pcr所需試劑為taqdna聚合酶，dntp混合液，mgcl2溶液，熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液和去離子水。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還包含有樣本基因組dna提取所需試劑。

更優(yōu)選地，所述試劑盒中還包含有硅膠吸附法提取基因組dna所需耗材。

作為一種優(yōu)選地可實(shí)施方式，本發(fā)明所述肺癌易感性檢測(cè)試劑盒的使用方法如下：

s1.提取待測(cè)樣本dna；

s2.以步驟s1所述dna為模板，用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定p.pro189ala位點(diǎn)的基因型。

s3.若pro189ala位點(diǎn)的編碼的氨基酸為ala，則樣本為肺癌易感型。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：dna模板2μl，10μm特異性引物各0.3μl，5μm熒光探針各0.1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.05μl，20mmdntp0.1μl，25mmmgcl20.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，去離子水4.0μl，共10μl。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共50個(gè)循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的p.pro189ala位點(diǎn)基因型檢測(cè)引物特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高。所述檢測(cè)方法可檢測(cè)人群p.pro189ala位點(diǎn)基因型，評(píng)估攜帶不同基因型的人群肺癌發(fā)生的易感性；檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行、高效，可用于肺癌高危人群的疾病預(yù)防指導(dǎo)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明肺癌易感性檢測(cè)流程圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例各引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖。a位組別1引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖；b為組別2引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖；c為組別3引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1ahr基因編碼區(qū)p.pro189ala位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

1、引物設(shè)計(jì)

本實(shí)施通過比對(duì)ahrr基因編碼區(qū)序列，根據(jù)ahr基因上的p.pro189alasnp位點(diǎn)的上下游序列，通過大量研究，設(shè)計(jì)了如表1所示的擴(kuò)增引物及taqman-mgb探針。

表1

2、熒光定量pcr檢測(cè)

(1)將步驟1設(shè)計(jì)的3對(duì)引物，按照以下熒光定量pcr反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)?？傮w積為10μl，包括dna模板(20ng/μl)2μl，10μm特異性引物對(duì)(兩條)各0.25μl，5μm特異性探針對(duì)(兩條)各0.1μl，(5unit/μl)taqdna聚合酶0.03μl，20mmdntp混合液0.1μl，25mmmgcl2溶液0.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.37μl，去離子水4.3μl。

(2)在abi7900ht型熒光定量pcr儀是進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后在abi7900ht型熒光定量pcr儀讀取熒光量。

(3)采用abi7900ht型熒光定量pcr儀自帶軟件sds(sequencedetectionsystems)v2.3判讀基因型。

3、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，組別1的引物和探針設(shè)計(jì)良好，能擴(kuò)增出pcr目的產(chǎn)物，可讀取熒光信號(hào)值。而組別2和3的引物探針擴(kuò)增不出目的片段，無熒光信號(hào)。

實(shí)施例2p.pro189ala位點(diǎn)檢測(cè)方法在肺癌易感性檢測(cè)中的應(yīng)用

1、dna的提取

對(duì)被檢測(cè)者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測(cè)者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)慣問卷表。常規(guī)方法抽取被檢測(cè)者edta抗凝血5ml。用硅膠吸附法提取血液標(biāo)本的基因組dna。

2、基因分型檢測(cè)

使用實(shí)施例1的檢測(cè)方法，對(duì)被檢測(cè)者dna的ahrr基因編碼區(qū)p.pro189ala多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定該位點(diǎn)的基因型。

3、指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌

通過對(duì)被檢測(cè)者基因型的分析，出具基因分型檢測(cè)報(bào)告和對(duì)被檢測(cè)者個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告。基因分型檢測(cè)報(bào)告詳細(xì)說明了被檢測(cè)者肺癌易感程度的高低以及患病概率大小。個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告以被檢測(cè)者的基因分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問卷調(diào)查結(jié)果，評(píng)估被檢測(cè)這肺癌遺傳易感的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)制定出針對(duì)被檢測(cè)者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，包括在飲食習(xí)慣、生活方式生活的改進(jìn)建議等，并為被檢測(cè)者普及預(yù)防肺癌的健康知識(shí)。

4、結(jié)果

本發(fā)明通過病例-對(duì)照研究分析ahrr基因p.pro189ala位點(diǎn)與肺癌易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p.pro189ala位點(diǎn)與肺癌發(fā)病顯著相關(guān)。表2為此次研究中肺癌和正常對(duì)照人群的基本資料，結(jié)果顯示吸煙、吸煙量和飲酒在病例組和對(duì)照組中的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而其他因素如年齡、性別、腫瘤家族史等變量在兩組間無顯著性差異。表3結(jié)果顯示，與pro/pro野生型基因型相比，攜帶ala/pro或ala/ala變異基因型的個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。表明pro189ala位點(diǎn)是肺癌發(fā)病的遺傳易感標(biāo)記物。

表2肺癌和對(duì)照人口學(xué)特征及主要因素的分布

p^a值是雙側(cè)的χ²檢驗(yàn)。

表3p.pro189ala位點(diǎn)的基因型頻率分布及與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

^a對(duì)照組中，所選取位點(diǎn)的基因型頻率均符合hardy-weinberg平衡(p均>0.05)；^b在logistic回歸模型中的校正因素包括年齡、性別、吸煙、飲酒和家族癌癥史。

實(shí)施例3肺癌易感性檢測(cè)試劑盒

1、一種肺癌易感性檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含以下組分：p.pro189ala位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物，突變型和野生型熒光探針，taqdna聚合酶，dntp混合液，mgcl2溶液，熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液和去離子水；

引物序列如下：

特異性引物f：5’-acacccacctgtctccaagg-3’(seqidno：1)

特異性引物r：5’-gcaccagaacatttatgactac-3’(seqidno：2)

野生型熒光探針：fam-cggggcctgcccaaaca-mgb(seqidno：3)

突變型熒光探針：hex-cgggggctgcccaaacacc-mgb(seqidno：4)

2、所述試劑盒的使用方法

s1.提取待測(cè)樣本dna；

s2.以步驟s1所述dna為模板，用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定p.pro189ala位點(diǎn)的基因型。

s3.若p.pro189ala位點(diǎn)編碼的氨基酸為ala，則樣本為肺癌易感型。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：10μm特異性引物各0.25μl，5μm熒光探針各0.1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.03μl，20mmdntp混合液0.1μl，25mmmgcl20.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.37μl，去離子水4.3μl，共10μl。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45個(gè)循環(huán)。

sequencelisting

<110>廣州醫(yī)科大學(xué)

<120>一種檢測(cè)p.pro189ala位點(diǎn)基因型的引物組及其檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acacccacctgtctccaagg20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcaccagaacatttatgactac22

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cggggcctgcccaaaca17

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgggggctgcccaaacacc19