本發(fā)明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種用于羅森沙門菌(s.rissen)的crisprs子分型檢測試劑盒。

背景技術：

沙門菌是最重要的人獸共患病原菌之一，可以導致嚴重的公共衛(wèi)生問題，鼠傷寒、腸炎和德爾卑沙門菌是常見的血清型。近年來，羅森沙門菌(s.rissen)也在全國各地食源性暴發(fā)中頻繁檢出，導致感染者的痢疾和腹瀉，威脅人類健康。

快速、有效、準確地對沙門菌進行子分型，以判定其同源性，追溯致病食品的共同來源，可以從根本上控制食源性疾病的傳播，最大限度地減少對消費者健康的損害。常見的沙門菌分型有多位點基因序列分析(multilocussequencetyping，mlst)和脈沖場凝膠電泳(pulsefieldgelelectrophoresis，pfge)。mlst是基于沙門菌管家基因的變異來生成不同的等位基因譜，從而對不同沙門菌進行分型，盡管快速、簡單，但是測序成本高且分辨率低。pfge基于基因組的酶切片段在脈沖場電泳后的排布對沙門菌進行分型，被認為是沙門菌分型的金標準，具有高分辨力、重復性好等優(yōu)點，但是操作復雜、費時。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速快速、有效、準確地對羅森沙門菌(s.rissen)進行子分型的試劑盒。

羅森沙門菌(s.rissen)中存在規(guī)律間隔的短回文重復序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，crisprs)是羅森沙門菌(s.rissen)中存在的一種免疫防御系統(tǒng)，羅森沙門菌(s.rissen)存在crispr1和crispr2，均由間隔子(spacer)和重復子(dr)組成。本發(fā)明所述試劑盒采用crisprs子分型技術，基于規(guī)律間隔的短回文重復序列中的間隔子的排布對羅森沙門菌(s.rissen)進行分型，操作簡單、快速，且分辨力高，重復性好，不要需要昂貴的儀器，有望會成為未來的主流分型技術。

為了實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于羅森沙門菌(s.rissen)的crisprs子分型檢測試劑盒，所述試劑盒中包括crispr1檢測引物對和crispr2檢測引物對。

優(yōu)選地，所述crispr1檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物。

優(yōu)選地，所述crispr2檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的反向引物。

本發(fā)明的試劑盒采用pcr技術擴增羅森沙門菌(s.rissen)兩個crispr位點(crispr1和crispr2)，根據(jù)測序結(jié)果及后續(xù)分析，得出crispr結(jié)構中的spacers的排列方式，以此作為分型依據(jù)。因此，引物對的設計是本發(fā)明試劑盒及分型方法的關鍵。

基于本發(fā)明所述試劑盒是采用pcr技術來進行分型的，所以試劑盒中還可以包括其他一些pcr所需要的常規(guī)試劑，如：超純水、taqmastermix、樣品基因組dna提取試劑等常用pcr反應試劑中的一種或多種。由于此類pcr常用試劑均可經(jīng)市場途徑單獨購得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)客戶實際需要配置，為方便起見，也可全部裝配入試劑盒。

本發(fā)明的試劑盒，可以是含有獨立包裝的引物對，也可以是含有配置好的含有引物對的pcr反應體系。

所述pcr反應體系可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用pcr反應體系加入引物對獲得。例如，所述試劑盒中還可以包括超純水、taqmastermix、樣品基因組dna提取試劑。加入本發(fā)明的引物對、待檢樣本dna提取物或者樣本菌液即可獲得pcr反應體系。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還可含有陽性對照。例如，所述陽性對照可以是羅森沙門菌的dna樣本。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還可含有陰性對照。陰性對照可為其他血清型沙門菌的dna樣本。

本發(fā)明的第二方面，提供了前述用于羅森沙門菌(s.rissen)的crisprs子分型檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

(1)提取樣品基因組dna；

(2)加樣：將樣品基因組dna加入裝有pcr反應體系的pcr管中，獲得對應的樣品反應管，所述pcr反應體系中含有前述crispr1檢測引物對或crispr2檢測引物對；

(3)pcr反應：反應管置于pcr儀上，設置循環(huán)參數(shù)，進行pcr反應；

(4)pcr反應結(jié)束后，測序，分析結(jié)果。

優(yōu)選地，所述方法為非疾病診斷目的的方法。

步驟(1)中，提取樣品基因組dna為現(xiàn)有技術。

優(yōu)選地，步驟(2)中，pcr反應體系包括：2×taqmastermix(dyeplus)11μl,超純水11μl,正向引物1μl，反向引物1μl，樣品基因組dna1μl。

優(yōu)選地，步驟(3)中，pcr反應的條件設置為：94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min30s，27個循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明的第三方面，提供了前述試劑盒在制備羅森沙門菌(s.rissen)的crisprs子分型檢測產(chǎn)品中的用途。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的試劑盒及分型方法簡單，實驗工作主要集中在pcr擴增特異產(chǎn)物，所有只要會pcr操作的人員均可以采用本發(fā)明的試劑盒進行羅森沙門菌的分型。本發(fā)明方法快速且高通量，因為只需要進行pcr實驗以及后續(xù)測序，消耗時間一般在2至3天，就可以完成大量羅森沙門菌的子分型。本發(fā)明方法代價低廉，所需儀器僅僅只是一臺pcr儀。并且重復性好，分辨率較高。

附圖說明

圖1：羅森沙門菌的pcr擴增產(chǎn)物的特異性；其中，泳道m(xù)為：dl3000marker；泳道1-11為：不同羅森分離株。

圖2：羅森沙門菌crispr1的分型樹狀圖；其中包括46個spacers，黑色填充表示“存在”，空白表示“不存在”；共有兩個子分型(1和2)；在信息欄“來源”中，有豬糞便(pigfaeces)、豬拭子(pigswab)、豬腸內(nèi)容物(pigintestinalcontents)和人糞便(humanfaeces)；在信息欄“位置”中，包括豬場(farm)和屠宰場(slaughterhouse)；在信息欄“地區(qū)”中，有徐州(xuzhou)、淮安(huaian)、上海(shanghai)、揚州(yangzhou)和亳州(bozhou)。

圖3：羅森沙門菌crispr2的分型樹狀圖；其中包括31個spacers，黑色填充表示“存在”，空白表示“不存在”；共有四個子分型(3、4、5和6)；信息欄等同于上。

圖4：羅森沙門菌crispr1和2的分型樹狀圖；包括77個spacers，黑色填充表示“存在”，空白表示“不存在”；共有五個子分型(a、b、c、d、e+)；信息欄等同于上。

具體實施方式

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

實施例1試劑盒的制備

引物設計與合成：以羅森沙門菌的crisprs序列為依據(jù)，分別設計crispr1和crispr2的正反向引物，其核苷酸序列如下表1所示：

表1

上述引物對可單獨包裝，也可以配成pcr反應體系。所述pcrpcr反應體系中，上述引物對的量采用本領域技術人員所知悉的常規(guī)用量即可。

也就是說，本發(fā)明的試劑盒，可以是含有上述獨立包裝的引物對，也可以是含有配置好的含有引物對的pcr反應體系。

進一步地，所述試劑盒還可以含有超純水、taqmastermix、樣品基因組dna提取試劑等等。

實施例2試劑盒的使用

一、pcr擴增特異性產(chǎn)物時的體系配制和反應程序

進行pcr反應前的樣品基因組dna模板可采用現(xiàn)有的基因組提取試劑盒對樣品(羅森沙門菌s.rissen)進行提取。

采用實施例2所述試劑盒中的引物對，配置pcr擴增特異性產(chǎn)物時的體系(亦即pcr反應體系)。各對引物對分別配置成相對應的pcr反應的體系。

使用時用超純水稀釋引物對干粉，每對引物對稀釋比例為1：100(nmol：μl)。

含有每對引物對的pcr反應的體系配制為(25μl)：2×taqmastermix(dyeplus)11μl,超純水11μl，正向引物1μl，反向引物1μl，樣品基因組dna1μl。

pcr程序為：94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min30s，27個循環(huán)；72℃10min。

所獲得的pcr產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，pcr電泳結(jié)果表明為單一的條帶，可以用于下一步的測序使用(如圖1所示)。

二、測序結(jié)果的處理及分析

測序完成后，下載相應序列結(jié)果文件，運用crisprsfinderonline(http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/server/)網(wǎng)站中的crisprsfinder工具查找到每個crisprs序列中的重復子(dr)序列和間隔子(spacer)序列，選擇最佳的dr序列，使用crisprtionary工具獲得不同樣品菌株的序列分布，并生成二進制excel文件，最后使用bionumerics7.0軟件繪制菌株的聚類分析圖和spacer序列分布圖。

實施例3試劑盒在豬源沙門菌分離株中的應用

采用實施例2中的試劑盒及建立的方法，應用于58株分離于豬源的羅森沙門菌，可簡單快速且低成本地完成子分型。具體步驟如下：

1)沙門菌的分離

本實驗中樣品分離株采集自江蘇不同豬場、屠宰場，以及一株人源羅森沙門菌分離株，樣品采集、增菌、選擇性分離、生化鑒定以及血清型鑒定參考已有方法(cai,etal.internationaljournaloffoodmicrobiology,2016；zhou,etal.foodcontrol,2017)，共分離鑒定了58株羅森沙門菌。

2)crisprs子分型方法應用于羅森沙門菌

將分離得到的沙門菌三區(qū)劃線于lb普通培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16小時。用接種環(huán)挑取lb瓊脂平板線上單菌落接種于lb液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm恒溫搖床，培養(yǎng)12-16小時。按照細菌基因組dna提取試劑盒說明書提取沙門菌基因組dna，提取后的基因組用于后續(xù)pcr實驗。pcr反應的體系配制為(25μl)：2×taqmastermix(dyeplus)11μl,超純水11μl,正向引物1μl，反向引物1μl，樣品基因組dna1μl。pcr程序為94℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min30s，27個循環(huán)；72℃10min。實驗中所用引物參考表1。將pcr產(chǎn)物送至公司測序，若存在產(chǎn)物條帶較大的情況可以讓公司設計walking引物進行測序。測序結(jié)果得到后，運用crisprsfinderonline網(wǎng)站中的crisprfinder工具查找到每個crisprs序列中的重復子(dr)序列和間隔子(spacer)序列，選擇最佳的dr序列，使用crisprtionary工具獲得不同樣品菌株的序列分布，并生成二進制excel文件，最后使用bionumerics7.0軟件繪制菌株的聚類分析圖和spacer序列分布圖，其聚類方法使用非加權組平均法(unweightedpair-groupmethodwitharthmeticmeans,upgma)。

在本實施例中，成功將58株沙門菌分離株進行crisprs子分型(如圖2、3、4所示)，整個過程完成僅需要2天(48h)時間。結(jié)果顯示存在5個crisprs型(a、b、c、d、e)。c、d、e中的分離株分別是2016、2014、2015年，且分別分離自淮安(一株來自上海)、揚州、徐州或亳州(如圖4所示)，這證明了此分型方法對時間和地區(qū)有一定的分辨度。另外，此方法對親緣關系近的分離株有一定的聚類作用，比如a中，包括分離自2013、2014、2016、2017年，分離自徐州、淮安、揚州、上海，分離自豬場和屠宰場，分離自豬源和人源的沙門菌(如圖4所示)，這為沙門菌污染源頭的追溯和傳播方式的確定提供了技術支持。

綜上所述，本發(fā)明的試劑盒及子分型方法相較于常見的子分型方法有很大優(yōu)勢：

本發(fā)明的試劑盒及分型方法的分辨力高于mlst方法，且一株沙門菌只需要擴增2種產(chǎn)物，而mlst要擴增7種產(chǎn)物。實施例3中所有的菌株經(jīng)mlst分型鑒定均是st469，而采用本發(fā)明的方法在此st型中分辨出五種子分型，分辨率更高(如圖4所示)。

較于被譽為“金標準”的pfge,其快速高通量的優(yōu)點得以凸顯，大量樣品(58株)的子分型僅僅需要2-3天，而pfge只能在3天時間內(nèi)完成12株樣品的子分型，耗時耗力，且需要專業(yè)人員操作。

并且，此發(fā)明方法對分離自不同時間和地區(qū)的分離株有一定的區(qū)分度，還可以將親緣關系相近的分離株進行聚類，這為沙門菌流行病學調(diào)查提供了技術支持。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。

sequencelisting

<110>揚州大學

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