本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種利用多重pcr富集brca1和brca2基因區(qū)域的引物、方法、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

brca1和brca2是重要的抑癌基因，參與染色體損傷修復(fù)過程。brca1和brca2的突變可能造成基因功能的降低或缺失，進而增加細胞癌變的風險?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示，這兩個基因的胚系突變是造成遺傳性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突變攜帶者一生中罹患乳腺癌的幾率可高達87％，卵巢癌的幾率可高達44％。因此，對高危人群進行brca1/2基因突變檢測，對于癌癥的預(yù)防，發(fā)現(xiàn)和治療有著重要的指導(dǎo)意義。

brca1和brca2已發(fā)現(xiàn)的突變大部分是單個堿基的突變或少量堿基的缺失和插入。這些突變可以造成基因產(chǎn)物氨基酸序列的改變、翻譯的提前終止、或信使rna加工的異常，進而影響蛋白的功能。為了檢測這些突變，常規(guī)方法是pcr擴增得到感興趣的基因片段后，以sanger法進行序列測定。全面掃描兩個基因所有編碼外顯子通常需要進行80個以上的pcr反應(yīng)，擴增片段通常采用正反雙向測序以保證準確性，工作量較大，成本較高。

越來越多的實驗室開始采用二代測序技術(shù)來檢測brca1和brca2的突變。二代測序技術(shù)由于其高通量的特性，可以覆蓋更大的基因組區(qū)域，并且在一次測序中可以完成多個樣本的突變檢測?；蚪M目的區(qū)域的富集是這一技術(shù)的關(guān)鍵。大型實驗室多采用雜交捕獲技術(shù)或微滴pcr、微流體pcr等技術(shù)。這些技術(shù)各有其優(yōu)點，但在成本和儀器要求上均有較高要求。

例如，申請?zhí)?01610334650.9公開的用于擴增人乳腺癌易感基因brca1和brca2編碼序列的pcr引物，其主要利用引物進行兩輪pcr獲得，雖然可以得到brca1和brca2基因突變的檢測結(jié)果，但是由于其擴增出的基因片段不能完全覆蓋到目的基因的全部，即其覆蓋率不能達到100％，因此可能存在不能準確檢測出每個突變位點的技術(shù)問題。

長片段擴增(long-rangepcr)技術(shù)操作簡單，成本低廉，適應(yīng)性強，同樣也是目前使用較廣的目的區(qū)域富集技術(shù)?，F(xiàn)有的應(yīng)用方式，是使用primestar等適用于長片段擴增的dna聚合酶，以10kb左右的擴增子大小覆蓋brca1和brca2整個基因組區(qū)域，共需要15-20對引物。這種方法每對引物單獨擴增，每個樣品所需的pcr反應(yīng)管數(shù)較多，不利于大批量操作，由于擴增子存在重合，且擴增長度的設(shè)置決定了多重擴增產(chǎn)物中的各個片段無法用簡單的方式，如瓊脂糖凝膠電泳，進行分析，所以也不適于以多重pcr的方式縮減反應(yīng)管數(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，舍棄了部分大跨度內(nèi)含子的中間區(qū)域，設(shè)計了一套共26對擴增范圍涵蓋brca1和brca2所有外顯子，和部分內(nèi)含子區(qū)域，互不重疊長度在2kb至8kb之間，分組同時進行多重pcr，每個片段均能通過普通的瓊脂糖凝膠電泳進行區(qū)分。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明第一方面提供一種富集brca1和brca2基因目標區(qū)域的引物，包括：

從其擴增區(qū)段包含brca1和brca2基因所有外顯子和外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子區(qū)域的多對引物中得到的五組引物對；

其中，所述五組引物對是根據(jù)所述多對引物對brca1和brca2基因擴增得到的擴增片段的大小進行分組得到的，以便將pcr反應(yīng)數(shù)降低到5個；

其中，在對待測樣品中的brca1和brca2基因進行擴增時，利用所述五組引物對中的每組引物對分別對待測樣品中的brca1和brca2基因進行多重pcr處理，得到5組的擴增產(chǎn)物，實現(xiàn)待測樣品中的brca1和brca2基因目標區(qū)域的100％富集；

其中，每組擴增產(chǎn)物的擴增片段之間長度有明顯區(qū)別，

其中，所述引物組合具有如seqidno.1、seqidno.52所示的序列。

其中，所述五組引物對包括：

如seqidno.13、seqidno.14、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.43、seqidno.44所示的第一組引物對，其中，所述seqidno.13和seqidno.14、seqidno.17和seqidno.18、seqidno.23和seqidno.24、seqidno.33和seqidno.34、seqidno.43和seqidno.44為五對互為上下游引物；

如seqidno.7、seqidno.8、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.37、seqidno.38所示的第二組引物對，其中，所述seqidno.7和seqidno.8、seqidno.11和seqidno.12、seqidno.21和seqidno.22、seqidno.27和seqidno.28、seqidno.37和seqidno.38為五對互為上下游引物；

如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.49、seqidno.50所示的第三組引物對，其中，所述seqidno.1和seqidno.2、seqidno.31和seqidno.32、seqidno.35和seqidno.36、seqidno.39和seqidno.40、seqidno.41和seqidno.42、seqidno.49和seqidno.50為六對互為上下游引物；

如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48所示的第四組引物對，其中，所述seqidno.5和seqidno.6、seqidno.15和seqidno.16、seqidno.19和seqidno.20、seqidno.25和seqidno.26、seqidno.45和seqidno.46、seqidno.47和seqidno.48為六對互為上下游引物；

如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.29、seqidno.30、seqidno.51、seqidno.52所示的第五組引物對，其中，所述seqidno.3、seqidno.4、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.29、seqidno.30、seqidno.51、seqidno.52為四對互為上下游引物。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第二方面提供一種富集brca1和brca2基因目標區(qū)域的方法，包括：

設(shè)計其擴增區(qū)段包含brca1和brca2基因所有外顯子和外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子區(qū)域的多對引物；

根據(jù)所述多對引物對brca1和brca2基因擴增處理得到的擴增片段的大小，將所述多對引物分成五組引物對，以便將pcr反應(yīng)數(shù)降低到5個；

利用所述5個引物組中的每個引物組分別對待測樣品中的brca1和brca2基因進行多重pcr處理，得到五組擴增產(chǎn)物，實現(xiàn)待測樣品中的brca1和brca2基因目標區(qū)域的100％富集。

其中，所述五組擴增產(chǎn)物中的每組擴增產(chǎn)物的擴增片段之間的長度有明顯區(qū)別，使得擴增產(chǎn)物質(zhì)量易于監(jiān)控。

其中，所述多對引物具有如seqidno.1-seqidno.52所示的序列。

其中，所述五組引物對包括：

如seqidno.13、seqidno.14、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.43、seqidno.44所示的第一組引物對，其中，所述seqidno.13和seqidno.14、seqidno.17和seqidno.18、seqidno.23和seqidno.24、seqidno.33和seqidno.34、seqidno.43和seqidno.44為五對互為上下游引物；

如seqidno.7、seqidno.8、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.37、seqidno.38所示的第二組引物對，其中，所述seqidno.7和seqidno.8、seqidno.11和seqidno.12、seqidno.21和seqidno.22、seqidno.27和seqidno.28、seqidno.37和seqidno.38為五對互為上下游引物；

如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.49、seqidno.50所示的第三組引物對，其中，所述seqidno.1和seqidno.2、seqidno.31和seqidno.32、seqidno.35和seqidno.36、seqidno.39和seqidno.40、seqidno.41和seqidno.42、seqidno.49和seqidno.50為六對互為上下游引物；

如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48所示的第四組引物對，其中，所述seqidno.5和seqidno.6、seqidno.15和seqidno.16、seqidno.19和seqidno.20、seqidno.25和seqidno.26、seqidno.45和seqidno.46、seqidno.47和seqidno.48為六對互為上下游引物；

如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.29、seqidno.30、seqidno.51、seqidno.52所示的第五組引物對組，其中，所述seqidno.3、seqidno.4、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.29、seqidno.30、seqidno.51、seqidno.52為四對互為上下游引物。

特別是，所述利用五組引物對中的每組引物對分別對待測樣品中的brca1和brca2基因進行多重pcr處理是利用包含長片段dna聚合酶的混合液，并以待測樣本的dna為模板，以所述五組引物對中的每組引物對為擴增引物分組進行。

其中，所述多重pcr處理的反應(yīng)退火溫度為62-64℃。延伸時間以最長的擴增子(8kb)為基準。

具體的，所述多重pcr處理的優(yōu)選反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性5分鐘，32個循環(huán)98℃變性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分鐘。

特別是，所述長片段dna聚合酶是指具有長片段擴增能力的dna聚合酶。

其中，所述包含長片段dna聚合酶的混合液，為現(xiàn)有技術(shù)中常用的dna聚合酶試劑盒，可以通過市售得到，例如takara公司的primestargxl產(chǎn)品，其中包含了緩沖液、dntp、dna聚合酶等成分。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第三方面提供一種用于富集brca1和brca2基因目標區(qū)域的試劑盒，其包括第一方面所述的引物，以及具有長片段擴增能力的dna聚合酶；

其中，所述引物的五組引物對中，每個引物的濃度不完全相同。

其中，所述每個引物組的用量為：在20ul的pcr反應(yīng)體系中，其用量為3.2ul。

特別是，使用所述試劑盒的退火溫度為58-64℃，延伸時間以最長的擴增子(8kb)為基準。

優(yōu)選地，所述退火溫度為62-64℃。

優(yōu)選地，所述具有長片段擴增能力的dna聚合酶為takaraprimestargxl酶

具體的，使用所述試劑盒的反應(yīng)條件優(yōu)選為：95℃預(yù)變性5分鐘，98℃變性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分鐘，32個循環(huán)。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第四方面提供一種將第一方面所述的引物用于brca1和brca2基因序列突變檢測的用途。

其中，所述將第一方面所述的引物用于brca1和brca2基因序列突變檢測包括：

提取待測樣本中的dna，獲得擴增模板；

以第一方面所述的五組引物對中的每組引物對為擴增引物，分別與所述擴增模板混合，并加入包含長片段dna聚合酶的混合液，得到五組反應(yīng)液；

將五組反應(yīng)液在pcr反應(yīng)儀器中進行多重pcr反應(yīng)，獲得五組擴增產(chǎn)物；

純化所述五組擴增產(chǎn)物，進行文庫構(gòu)建，經(jīng)高通量測序后，與數(shù)據(jù)庫比對后，獲得brca1和brca2基因序列突變信息。

尤其是，所述每個引物組中的每個引物的濃度不完全相同。

其中，所述五組擴增產(chǎn)物中的每組擴增產(chǎn)物的片段大小不均有明顯區(qū)別，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察每個片段的擴增結(jié)果。

其中，所示五組反應(yīng)液中每組反應(yīng)液的濃度使用比例為：

其中，所述多重pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，32個循環(huán)98℃變性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分鐘。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第五方面提供一種將第三方面所述的方法用于brca1和brca2基因目標區(qū)域擴增產(chǎn)物的質(zhì)量監(jiān)控的用途。

由于所述擴增產(chǎn)物富集了brca1和brca2基因的所有目標區(qū)域，并且，擴增產(chǎn)物中的不同片段分別反映了brca1和brca2基因上的不同編碼區(qū)，因此，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳就可以直接觀察獲得待測樣本的擴增產(chǎn)物是否符合要求，實時進行質(zhì)量監(jiān)控，操作簡便，成本低廉。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第六方面提供一種檢測brca1和brca2基因序列突變的方法，包括：

利用第二方面所述的方法獲得100％富集了brca1和brca2基因目標區(qū)域的擴增產(chǎn)物；

將擴增產(chǎn)物純化后進行文庫構(gòu)建，經(jīng)測序后，將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對分析，獲得brca1和brca2基因序列突變信息。

其中，所述測序方法采用高通量測序。

其中，所述數(shù)據(jù)庫為人類基因組數(shù)據(jù)庫，例如人類基因組hg19數(shù)據(jù)庫。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第七方面提供一種檢測brca1和brca2基因序列突變的試劑盒，包括第一方面所述的引物，以及具有長片段擴增能力的dna聚合酶；

其中，所述引物的五組引物對中，每組引物對中的每對引物的濃度不完全相同。

本發(fā)明所稱的待測樣本為血液，唾液，口腔拭子，新鮮組織，培養(yǎng)細胞等，不適用于甲醛固定石蠟包埋組織。

有益效果：

1、本發(fā)明提供的引物可以與brca1和brca2基因的目標區(qū)域特異性結(jié)合，擴增出brca1和brca2基因的所有外顯子及外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子，全面覆蓋了具有臨床意義的突變位點，實現(xiàn)brca1和brca2基因的目標區(qū)域的富集。

2、由于本發(fā)明提供的引物為五個引物組，僅需要5個反應(yīng)數(shù)(即使用5個反應(yīng)管)就可以實現(xiàn)目標區(qū)域的富集，而現(xiàn)有長片段擴增技術(shù)最低也需高達17個反應(yīng)，因此，本發(fā)明的提供的富集方式成本低，效率高；而且利用本發(fā)明的每個引物組對待測樣本進行檢測，所獲得的擴增產(chǎn)物中的每個擴增子均可利用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，查看每個區(qū)域均成功富集后，再進行文庫制備和測序，流程更加可靠。

3、本發(fā)明提供的富集方法簡單、結(jié)果可靠、效率高、成本低廉，普適性廣，有利于本領(lǐng)域技術(shù)人員對brca基因進行多態(tài)性分析或序列突變檢測或其他研究。

4、本發(fā)明提供的試劑盒成本低廉、富集效率高，可靠性好。

5、本發(fā)明所提供的富集方法只需5個pcr反應(yīng)即可保證對brca基因編碼區(qū)100％的均勻覆蓋，提高了檢測效率、降低了檢測成本。

附圖說明

圖1是brca1和brca2基因富集產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是二代測序文庫瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3是26對brca1和brca2引物擴增區(qū)域示意圖；

圖4是brca1與brca2各外顯子的平均覆蓋率圖。

具體實施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點，下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述。

在下面的描述中闡述了很多具體的細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是，本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其他方式來實施，因此，本發(fā)明并不限于下面公開的具體實施例的限制。

實施例1引物

1、本發(fā)明采用常規(guī)的引物設(shè)計方法設(shè)計擴增區(qū)段包含brca1和brca2基因所有外顯子和外顯子側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域的引物，該引物有多個，經(jīng)過常規(guī)篩選，獲得26個引物，引物信息如表1所示：

表1本發(fā)明提供的引物信息

其中，表1中“f”表示上游引物，“r”表示下游引物。

2、將篩選獲得的26個引物對brca1和brca2基因擴增處理得到的擴增片段的大小，將所述26個引物分成5組引物對，以便將pcr反應(yīng)數(shù)降低到5個。發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗調(diào)整，成功將26個引物分成了5組引物對，而且每組引物對中的每個引物濃度都不完全相同。

特別是，使用本發(fā)明提供的引物的退火溫度為62-64℃，延伸時間以最長的擴增子(8kb)為基準。

實施例2試劑盒

本發(fā)明提供的試劑盒包括了上述5組引物對，還包括了具有長片段擴增能力的dna聚合酶。

其中，所述具有長片段擴增能力的dna聚合酶為市售的長片段dna聚合酶試劑盒，在本發(fā)明的一個實施例中，采用的是例如takara公司的primestargxl產(chǎn)品，其中包含了緩沖液、dntp、dna聚合酶等成分。

其中，試劑盒中每個引物組的用量比例為：在總體積為20μl的反應(yīng)液中，每個引物組為3.2μl。

具體的，試劑盒中各個成分的比例優(yōu)選為：

特別是，試劑盒的使用條件是：95℃預(yù)變性5分鐘；98℃變性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分鐘，32個循環(huán)。

其中，試劑盒中每個引物組中的每個引物之間的濃度都不完全相同，如表2所示：

表2引物濃度信息

以下，結(jié)合具體的實施步驟進一步說明本發(fā)明的特點。

本發(fā)明采用已知的5株乳腺癌細胞系作為待測樣本，分別為bt-474，hcc1395，hcc1569，mda-mb-361，mda-mb-436，hcc1937，其相關(guān)信息如表3所示：

表3乳腺癌細胞系樣本

表3中已知突變信息來源為ccle，檢測方法為雜交捕獲測序。

實施例3brca1和brca2基因目標區(qū)域的富集

1、樣品的處理和基因組dna提取

從atcc購買的細胞系為帖壁細胞，在t25細胞培養(yǎng)瓶進行貼壁培養(yǎng)后，采用全式金公司的離心柱式基因組dna提取試劑盒easypuremicrogenomicdnakit提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明進行提取，得到dna提取液，將dna提取液以100微升洗脫緩沖液洗脫，并經(jīng)nanodrop2000檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，得到最終260/280值大于1.8，濃度均在30至60ng/μl之間的dna溶液。

2、擴增目的基因片段

建立擴增反應(yīng)體系：

將反應(yīng)體系在反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，98℃變性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分鐘，32個循環(huán)中進行擴增，得到五組擴增產(chǎn)物，每組擴增產(chǎn)物均各取5μl，在0.8％的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，得到圖1所示的電泳圖，根據(jù)電泳圖確認條帶。

如圖1所示的電泳圖，每個片段均能表現(xiàn)出明亮的條帶，可見，使用本發(fā)明提供的引物特異性好，通過普通的瓊脂糖凝膠電泳就可以對每個dna片段進行確認。

3、測序

3.1、純化處理

將每個樣品的5組擴增產(chǎn)物等體積混合成一管，組合成一個完整的待測樣本。取30μl，加入24μl磁珠(axypreppcrclean-upkit)，按說明書進行純化。純化后，用nanodrop2000測定濃度，并稀釋到10ng/μl。

3.2、高通量測序文庫構(gòu)建

采用諾唯贊公司的trueprepdnalibraryprepkitv2forillumina試劑盒構(gòu)建文庫。該試劑盒構(gòu)建文庫包含兩個主要步驟，首先是利用轉(zhuǎn)座酶將步驟2.3獲得的目的基因片段打斷，然后在打斷后的片段兩端加上適用于illuminahiseq測序平臺的接頭，并富集文庫，具體步驟遵循試劑盒操作說明，得到構(gòu)建后的測序文庫。

向構(gòu)建的文庫中加入0.6倍體積的磁珠(axypreppcrclean-upkit)進行磁珠純化，去除小于300bp的片段，得到如圖2所示的電泳圖。

3.3、高通量測序

在illuminahiseq2000平臺上對5個文庫測序，獲得每個文庫的數(shù)據(jù)，與樣本的已知序列信息比對，發(fā)現(xiàn)所的序列覆蓋了brca1和brca2基因上的所有外顯子及外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子，如圖3所示。

根據(jù)圖3所示的26對brca1和brca2引物擴增區(qū)域示意圖可知，擴增子完全覆蓋了brca1和brca2基因上的所有外顯子，有些甚至覆蓋了外顯子之間的內(nèi)含子。

由此可見，本發(fā)明提供的方法可以實現(xiàn)brca1和brca2基因所有外顯子及外顯子側(cè)翼內(nèi)含子的富集。

4數(shù)據(jù)分析

采用bcbio-nextgen流程對高通量測序結(jié)果數(shù)據(jù)進行分析。高通量測序得到的reads通過bwa工具與人類基因組hg19數(shù)據(jù)庫比對，通過freebayes工具進行多態(tài)位點預(yù)測，并以snpeff或varianteffectpredictor(vep)對多態(tài)進行注釋。最后生成的vcf文件，在ncbi網(wǎng)站上與clinvar數(shù)據(jù)庫交叉對比，得到樣本測序結(jié)果的總read數(shù)、gc含量％、文庫插入片段中間值、pcr重復(fù)、pcr重復(fù)比例％、成功比對read數(shù)、成功比對比例％、脫靶read數(shù)、脫靶比例％，得到如表4所示的樣本測序結(jié)果指標以及圖4所示的brca1與brca2各外顯子的平均覆蓋率圖。

表4樣本測定指標結(jié)果

根據(jù)表4所示的測定結(jié)果中的“總read數(shù)”與“成功比對read數(shù)”的比例計算值可知，超過99％的read可以比對到hg19基因組上，可見，本發(fā)明獲得樣本生物信息準確。文庫插入片段大小中間值差異較小，說明文庫構(gòu)建方法穩(wěn)定。pcr重復(fù)比例，符合預(yù)期，脫靶比例最高僅為4.1％，說明目的基因片段的多重擴增特異性滿足要求。

圖4為brca1與brca2各外顯子的平均覆蓋率?？v軸表示覆蓋乘數(shù)，以2的對數(shù)展示。橫軸1-27依次對應(yīng)brca2的1-27號外顯子，28-50依次對應(yīng)brca1的23-1號外顯子(依據(jù)兩基因在染色體上的位置和方向依次排列)。在各個外顯子上，獲得了較為均勻的覆蓋，可見，本發(fā)明提供的引物組合實現(xiàn)了brca1和brca2基因外顯子的富集。

實施例4brca1和brca2基因序列突變的檢測

應(yīng)用實施例3的方法獲得的測序結(jié)果，與人類基因組hg19數(shù)據(jù)庫比對，獲得分析結(jié)果，其中，五個細胞系中檢測到的有臨床意義的突變?nèi)绫?所示。表中包括了可能對蛋白氨基酸序列產(chǎn)生影響，或臨床致病性有文獻報道的基因突變，其中可能存在臨床致病性的突變黑體標出。

如表5所示的突變檢測結(jié)果可知，五個細胞系中已知的致病性突變均成功檢出，與樣本的突變信息結(jié)果一致，符合率100％。

本發(fā)明利用多重pcr，擴增brca1和brca2所有外顯子和毗鄰的內(nèi)含子區(qū)域，得到的pcr產(chǎn)物，利用得到的pcr產(chǎn)物構(gòu)建高通量測序文庫，經(jīng)高通量測序后，一次性檢測所有可能存在臨床意義的brca1和brca2點突變。

需要說明的是本發(fā)明將引物組合應(yīng)用于brca1和brca2序列突變的檢測，雖然在某些情況下，對這些基因的檢測對于相關(guān)癌癥的診斷、預(yù)防和治療有重要的輔助意義，但這些基因的突變不是必然導(dǎo)致所述疾病的發(fā)生，如表5所示的檢測結(jié)果，因此對這些基因的檢測并不一定涉及疾病的診斷或治療方法。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之類。

序列表

<110>北京明諦生物醫(yī)藥科技有限公司

<120>一種富集brca1和brca2基因目標區(qū)域的引物、方法、試劑盒及其應(yīng)用

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