本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及hic1在腫瘤診斷、治療、預(yù)后和預(yù)測復(fù)發(fā)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌高甲基化基因1(hic1)是一個新的腫瘤抑制基因，位于人類第17號染色體13區(qū)短臂，處于p53位點(diǎn)遠(yuǎn)端。在人類多種腫瘤組織中，hic1往往發(fā)生缺失或啟動子高甲基化修飾而沉默的現(xiàn)象，這其中就包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等。這種啟動子甲基化修飾并不是固定不變的，但卻與腫瘤的惡性程度以及低生存率存在一定的相關(guān)性。當(dāng)使用去甲基化試劑5-aza處理腫瘤細(xì)胞可恢復(fù)hic1的表達(dá)，并且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，hic1雜合缺失導(dǎo)致自發(fā)腫瘤與其野生等位基因啟動子的高甲基化存在關(guān)聯(lián)。但是現(xiàn)有技術(shù)中，并沒有將hic1應(yīng)用于腫瘤診斷或治療之中，上述領(lǐng)域現(xiàn)今仍是空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明一方面提供了一種腫瘤檢測試劑盒，所述的試劑盒中含有能夠定量檢測基因hic1拷貝數(shù)的試劑。

本發(fā)明另一方面提供了一種腫瘤診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有能夠定量檢測基因hic1表達(dá)水平的試劑。

較佳地，該試劑盒中含有實(shí)時熒光定量檢測基因hic1轉(zhuǎn)錄水平的引物序列。

較佳地：該試劑盒中含有實(shí)時熒光定量檢測基因hic1轉(zhuǎn)錄水平的引物序列：上游引物：5'-gtcgtgcgacaagagctacaa-3'(seqidno:1)；

下游引物：5'-cgttgctgtgcgaacttgc-3'(seqidno:2)。

本發(fā)明第三方面提供了一種腫瘤的預(yù)后試劑盒，所述的試劑盒中含有能夠定量檢測基因hic1拷貝數(shù)的試劑。

本發(fā)明第四方面提供了一種腫瘤的預(yù)后試劑盒，所述的試劑盒中含有能夠定量檢測基因hic1表達(dá)水平的試劑。

本發(fā)明第五方面提供了一種腫瘤的復(fù)發(fā)試劑盒，所述的試劑盒中含有能夠定量檢測基因hic1拷貝數(shù)的試劑。

本發(fā)明第六方面提供了一種腫瘤的復(fù)發(fā)試劑盒，所述的試劑盒中含有能夠定量檢測基因hic1表達(dá)水平的試劑。

本發(fā)明第七方面提供了一種腫瘤治療藥劑，所述的藥劑中含有恢復(fù)基因hic1表達(dá)的試劑。

較佳地，所述恢復(fù)基因hic1表達(dá)的試劑選自可恢復(fù)基因hic1的試劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了hic1在多種腫瘤如前列腺癌、肺癌、乳腺癌等中表達(dá)明顯降低。目前擁有腫瘤與臨床輔助診斷技術(shù)尚不完善，而hic11在腫瘤中與正常組織愛相比是明顯降低的。這提示hic1具有成為腫瘤輔助診斷標(biāo)記物的潛能。

本發(fā)明通過一系列分析方法發(fā)現(xiàn)：在多種腫瘤中hic1的降低與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移患者預(yù)后密切相關(guān)。通過一系列體內(nèi)功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：敲低hic1促進(jìn)體內(nèi)三陰性乳腺癌的成瘤能力，降低小鼠的生存率。提示hic1可作為乳腺癌癌治療的靶點(diǎn)。而通過恢復(fù)hic1在癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平，可以有效抑制hic1的侵襲轉(zhuǎn)移、提高小鼠的生存率。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均足以證明促進(jìn)內(nèi)源性hic1的表達(dá)顯著降低乳腺癌、前列腺癌、肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移提高患者的生存率，提示hic1具有成為診斷、治療、預(yù)后和預(yù)測復(fù)發(fā)的標(biāo)記物的潛能。可以用來制作試劑盒，促進(jìn)hic1表達(dá)的藥物在制備治療腫瘤的藥物組合極具有臨床應(yīng)用價值，為腫瘤的有效治療提供了新的藥物和方法。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中h1c1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)狀態(tài)圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中h1c1在乳腺癌組織中染色結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中的pcr檢測圖。

圖4a為本發(fā)明實(shí)施例1在nsclc細(xì)胞系95-d,a549,nci-h1975和ltep-a-2以及胚肺成纖維細(xì)胞mrc-5和wi-38中對hic1基因啟動子-624～-495bp之間存在的11個cpg位點(diǎn)的甲基化測序圖。

圖4b為本發(fā)明實(shí)施例1中對圖4a所做的統(tǒng)計圖。

圖4c為本發(fā)明實(shí)施例1中采用q-rtpcr分析不同細(xì)胞系中hic1mrna表達(dá)的高低的統(tǒng)計圖。

圖5a為本發(fā)明實(shí)施例1中對10例nsclc的癌和癌旁組織中hic1基因啟動子-624～-495bp之間存在的11個cpg位點(diǎn)的甲基化測序圖。

圖5b為本發(fā)明實(shí)施例1中對圖5a做的統(tǒng)計圖。

圖5c為本發(fā)明實(shí)施例1中采用q-rtpcr分析這10例癌和癌旁組織中hic1mrna表達(dá)的高低的統(tǒng)計圖。

圖6a為本發(fā)明實(shí)施例1中采用5-aza-cdr對細(xì)胞系a549和h292的dna進(jìn)行去甲基化處理后的結(jié)果圖。

圖6b為本發(fā)明實(shí)施例1中采用q-rtpcr和westernbolt方法檢測5-aza-cdr對a549和h292細(xì)胞系中hic1表達(dá)的影響圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中h1c1在肺腺癌和癌旁組織中的染色圖

圖8a為本發(fā)明實(shí)施例1中tcga數(shù)據(jù)庫中，hic1基因啟動子在前列腺癌組織和癌旁組織中甲基化程度比較圖。

圖8b為本發(fā)明實(shí)施例1tcga數(shù)據(jù)庫中，前列腺癌組織及癌旁組織hic1基因啟動子甲基化程度與hic1表達(dá)的相關(guān)性分析線形圖。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1中前列腺癌標(biāo)本庫中(gse21034)，癌旁組織(n＝29)、原位癌組織(n＝131)和轉(zhuǎn)移癌組織(n＝19)中hic1基因表達(dá)差異圖。

圖10a為本發(fā)明實(shí)施例1中在wt,pten^pc-/-hic1^pc+/+和pten^pc-/-hic1^pc-/-小鼠中，免疫組化檢測其前列腺上皮中hic1表達(dá)變化的染色圖。

圖10b為本發(fā)明實(shí)施例1中ten^pc-/-hic1^pc+/+和pten^pc-/-hic1^pc-/-小鼠中，h&e染色和免疫組化染色(ɑ-sma)觀察小鼠前列腺前葉組織變化圖。

圖11a為本發(fā)明實(shí)施例2中在整個乳腺癌數(shù)據(jù)庫中(wholedataset)，hic1的表達(dá)與病人總生存率之間不具有相關(guān)性的線形圖。

圖11b為本發(fā)明實(shí)施例2中在basal型乳腺癌中，hic1的低表達(dá)與病人的不良預(yù)后具有統(tǒng)計學(xué)意義的線形圖。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例2中前列腺癌標(biāo)本庫中(gse21034)，hic1基因表達(dá)量與病人生存關(guān)系的線形圖。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例3中的載體圖譜。

圖14a為本發(fā)明實(shí)施例4中westernblot和real-timepcr驗(yàn)證hic1過表達(dá)效果圖。

圖14b為本發(fā)明實(shí)施例4中的與圖14a相關(guān)的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖14c為本發(fā)明實(shí)施例4中與圖14a相關(guān)的細(xì)胞侵蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖15a為本發(fā)明實(shí)施例4中westernblot和real-timepcr驗(yàn)證mda-468細(xì)胞中hic1過表達(dá)效果圖

圖15b為本發(fā)明實(shí)施例4的與圖15a相關(guān)的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖15c為本發(fā)明實(shí)施例4中與圖15a相關(guān)的細(xì)胞侵蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖.

圖16a為本發(fā)明實(shí)施例4westernblot驗(yàn)證hic1在蛋白水平的敲除效果圖。

圖16b為本發(fā)明實(shí)施例4中real-timepcr驗(yàn)證hic1在rna水平的敲除效果圖。

圖16c為本發(fā)明實(shí)施例4中敲除hic1后細(xì)胞侵蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖16d為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計分析圖。

圖17a為本發(fā)明實(shí)施例4中westernblot驗(yàn)證hic1蛋白水平敲除效果圖。

圖17b為本發(fā)明實(shí)施例4中與圖17a相關(guān)的細(xì)胞侵蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖17c為本發(fā)明實(shí)施例4中用chamber小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖。

圖18a為本發(fā)明實(shí)施例4中hic1組小鼠活體成像圖。

圖18b為本發(fā)明實(shí)施例4中熒光值統(tǒng)計分析圖。

圖19a為本發(fā)明實(shí)施例4中肺轉(zhuǎn)移灶和肺負(fù)重統(tǒng)計圖。

圖19b為本發(fā)明實(shí)施例4中肺轉(zhuǎn)移灶切片，h&e染色結(jié)果圖

圖20a為本發(fā)明實(shí)施例4通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖20b為本發(fā)明實(shí)施例4中用staurosporine處理細(xì)胞12h來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖20c為本發(fā)明實(shí)施例4中把a(bǔ)549細(xì)胞中的hic1敲除后的侵襲實(shí)驗(yàn)圖。

圖20d為本發(fā)明實(shí)施例4中把a(bǔ)549細(xì)胞中的hic1敲除后的tunel實(shí)驗(yàn)圖。

圖21a為本發(fā)明實(shí)施例4中trans-well實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果圖。

圖21b為本發(fā)明實(shí)施例4中裸鼠左心室注射luciferase基因標(biāo)記的小鼠活體成像圖。

圖21c為本發(fā)明實(shí)施例4中x-光檢測luciferase標(biāo)記的c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1和du145^shctrl,du145^shhic1細(xì)胞對裸鼠脛骨的x光透視圖。

圖21d為本發(fā)明實(shí)施例4中對融骨發(fā)生部位的h&e染色切片圖。

圖22a為本發(fā)明實(shí)施例4中在du145和c4-2b細(xì)胞中，沉默hic1表達(dá)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖。

圖22b為本發(fā)明實(shí)施例4c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1和du145^shctrl,du145^shhic1細(xì)胞表達(dá)譜芯片檢測后emt相關(guān)marker的熱圖分析。

圖22c為本發(fā)明實(shí)施例4在lncap，du145和c4-2b細(xì)胞中，沉默hic1表達(dá)后，westernblot實(shí)驗(yàn)檢測emt相關(guān)marker(e-cadherin，slug，n-cadherin和vimentin)表達(dá)變化圖。

圖22d為本發(fā)明實(shí)施例4c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1細(xì)胞emt相關(guān)marker(e-cadherin，n-cadherin和vimentin)表達(dá)變化的免疫熒光檢測圖。

圖22e為本發(fā)明實(shí)施例4pten^pc-/-hic1^pc+/+和pten^pc-/-hic1^pc-/-小鼠中，免疫組化染色觀察小鼠前列腺前葉組織emt相關(guān)marker(e-cadherin，ck-8，n-cadherin和slug)表達(dá)變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

實(shí)施例1：hic1在腫瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)降低

一、hic1在三陰性乳腺癌細(xì)胞(tnbc)和組織中表達(dá)丟失

如圖1所示，為hic1在幾種常用的乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果顯示hic1在tnbc類型的細(xì)胞系mda-231中的表達(dá)量明顯低于luminal型的細(xì)胞系mcf-7和bt474、her2+陽性的細(xì)胞系sk-br-3，以及良性的細(xì)胞系mcf-10a。但與良性mcf-10a相比，hic1在乳腺癌細(xì)胞系的表達(dá)并未呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。

接下來，又運(yùn)用高密度組織芯片，通過免疫組化染色的方法，檢測了hic1在乳腺癌病人標(biāo)本中的表達(dá)情況。如圖2所示，染色結(jié)果顯示與良性組織、luminal型、her-2+相比，hic1在tnbc中的表達(dá)幾乎丟失。如表1所示，隨后進(jìn)行的統(tǒng)計分析也得到了相似的結(jié)論。雖然hic1在良惡性之間表達(dá)并無差別(p＝0.230)，但有意思的是，hic1的表達(dá)卻與組織染色級別tstatus以及er、pr、her-2受體的狀態(tài)呈顯著相關(guān)。具體到乳腺癌的分子分型上則是：與良性乳腺組織相比，hic1在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)丟失(p＝0.020)。

表1

idc＝invasionductalcarcinoma，ilc＝invasionlobularcarcinoma

二、hic1在非小細(xì)胞肺癌組織(nsclc)和細(xì)胞中因啟動子甲基化而表達(dá)下降

為了研究在nsclc中是否發(fā)生了hic1基因啟動子甲基化并表達(dá)下降的現(xiàn)象，抽提出nsclc細(xì)胞系95d，a549，nci-h1975和ltep-a-2的dna，并以胚肺成纖維細(xì)胞mrc-5和wi-38的dna作為正常對照進(jìn)行啟動子特異性甲基化pcr檢測，如圖3所示，結(jié)果顯示在nsclc細(xì)胞中hic1均處于甲基化狀態(tài)，而正常細(xì)胞系中hic1處于非甲基化狀態(tài)。

通過msp方法發(fā)現(xiàn)在nsclc細(xì)胞系95-d，a549，nci-h1975，ltep-a-2中hic1基因啟動子處于甲基化狀態(tài)，而胚肺成纖維細(xì)胞mrc-5，wi-38中hic1基因啟動子處于非甲基化狀態(tài)。m代表甲基化，u代表非甲基化。

為了更準(zhǔn)確的反應(yīng)在nsclc中hic1基因啟動子的甲基化程度，對hic1啟動子上-624～-495bp區(qū)域的11個cpg位點(diǎn)進(jìn)行甲基化測序分析，結(jié)果如圖4a顯示，hic1基因在癌細(xì)胞中的甲基化程度要普遍高于正常細(xì)胞。圖4b是對圖4a的統(tǒng)計圖。同時通過q-rtpcr實(shí)驗(yàn)檢測了hic1基因在細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄情況。如圖4c所示，發(fā)現(xiàn)hic1的mrna轉(zhuǎn)錄水平在癌細(xì)胞中要明顯低于正常細(xì)胞。

如圖4a所示，在nsclc細(xì)胞系95-d,a549,nci-h1975和ltep-a-2以及胚肺成纖維細(xì)胞mrc-5和wi-38中對hic1基因啟動子-624～-495bp之間存在的11個cpg位點(diǎn)進(jìn)行甲基化測序。一個黑色實(shí)心圓代表一個cpg位點(diǎn)發(fā)生甲基化修飾，一個空心圓代表一個cpg位點(diǎn)沒有發(fā)生甲基化。

如圖4b所示，不同細(xì)胞系中hic1基因啟動子甲基化程度的統(tǒng)計圖。95-d,a549，nci-h1975，ltep-a-2,mrc-5和wi-38細(xì)胞系中hic1的甲基化程度分別為42％，50％，35％，58％,20％和17％。

如圖4c所示q-rtpcr分析不同細(xì)胞系中hic1mrna表達(dá)的高低，95-d,a549，nci-h1975，ltep-a-2細(xì)胞系中hic1表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于mrc-5andwi-38細(xì)胞系。

那么hic1基因在nsclc組織中的甲基化情況又是如何？選取10例nsclc病人的癌組織和相對應(yīng)的癌旁組織。對其dna進(jìn)行同樣的甲基化測序分析，圖5a所示，發(fā)現(xiàn)hic1在癌組織中的甲基化程度要普遍高于癌旁組織。圖5b是對圖5a的統(tǒng)計。如圖5c所示，而hic1在癌組織中的mrna轉(zhuǎn)錄則普遍低于癌旁組織。

如圖5a、5b、5c所示采用bsp方法檢測10例nsclc患者癌和癌旁組織中hic1基因啟動子的甲基化程度，q-rtpcr方法檢測hic1在這10例組織中的表達(dá)情況。

對10例nsclc的癌和癌旁組織中hic1基因啟動子-624～-495bp之間存在的11個cpg位點(diǎn)進(jìn)行甲基化測序。黑色實(shí)心圓代表cpg位點(diǎn)發(fā)生甲基化修飾，空心圓則代表cpg位點(diǎn)沒有發(fā)生甲基化。

10例組織中hic1基因啟動子甲基化程度的統(tǒng)計圖。癌組織中hic1的甲基化程度要高于癌旁組織，p-value＝0.011。

q-rtpcr分析這10例癌和癌旁組織中hic1mrna表達(dá)的高低，癌組織中hic1表達(dá)普遍低于癌旁組織。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果在nsclc細(xì)胞和組織中hic1基因的甲基化程度越高，則其mrna轉(zhuǎn)錄水平越低。那么推測hic1基因發(fā)生甲基化會降低hic1的mrna轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。為了得到更直接的證據(jù)，用5-aza-cdr對細(xì)胞系a549和h292的dna進(jìn)行去甲基化處理后，如圖6a所示，發(fā)現(xiàn)hic1基因的mrna轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均有一定程度的升高，結(jié)果可以在6b中看到。說明hic1基因啟動子發(fā)生甲基化后能夠在一定程度上導(dǎo)致hic1表達(dá)下降。

圖6a所示，用10μm5-aza-cdr處理a549和h292細(xì)胞48h，沒有處理(即0μm)的細(xì)胞作為對照，通過msp的方法檢測細(xì)胞中hic1基因啟動子甲基化的變化，如圖所示，a549和h292細(xì)胞中hic1基因啟動子的甲基化程度都有所降低。

圖6b所示，q-rtpcr和westernbolt方法檢測5-aza-cdr對a549和h292細(xì)胞系中hic1表達(dá)的影響，如圖所示，經(jīng)處理后hic1的mrna和蛋白表達(dá)都有所上調(diào)。

為了檢測hic1在nsclc組織中的蛋白表達(dá)情況，圖7和表2所示，對肺腺癌的組織芯片進(jìn)行hic1的免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)在癌旁組織的細(xì)胞核中hic1的陽性率要高于癌組織，并且癌組織的惡性程度越高，hic1的陽性率越低。

表2

如圖7所示，hic1在癌旁組織細(xì)胞核中的陽性率高于癌組織，scalebar＝50μm,p-value<0.001。hic1在癌組織中的表達(dá)與癌組織的惡性度相關(guān)，惡性度越高h(yuǎn)ic1的陽性率越低，p-value＝0.011。

三、hic1基因表達(dá)缺失與前列腺癌轉(zhuǎn)移正相關(guān)

為評估hic1基因在前列腺癌組織中高度甲基化狀態(tài)，及其與基因表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步在tcga數(shù)據(jù)庫(thecancergenomeatlas)中387例前列腺癌臨床標(biāo)本進(jìn)行大樣本分析。圖8a結(jié)果顯示，癌組織中hic1基因啟動子甲基化程度明顯高于癌旁組織(p<0.005)；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，圖8b所示hic1基因啟動子甲基化程度與其表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r＝-0.243；p<0.001)(。提示，在前列腺癌組織中hic1基因高度甲基化可以促使基因表達(dá)下降。

如圖8a所示，tcga數(shù)據(jù)庫中，hic1基因啟動子在前列腺癌組織和癌旁組織中甲基化程度比較。**p<0.005。

圖8b所示，tcga數(shù)據(jù)庫中，前列腺癌組織及癌旁組織hic1基因啟動子甲基化程度與hic1表達(dá)的相關(guān)性分析。

為了進(jìn)一步探索hic1基因與前列腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對geo數(shù)據(jù)庫中帶有轉(zhuǎn)移性前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(taylor’sdataset，gse21034)。進(jìn)一步在此數(shù)據(jù)庫中比較了癌旁組織、原位癌組織和轉(zhuǎn)移癌組織中hic1基因表達(dá)差異，如圖9所示，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性前列腺癌標(biāo)本中的表達(dá)量比癌旁組織和原位前列腺癌組織明顯降低。臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果提示：1.hic1表達(dá)丟失可能參與了前列腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。

圖9為前列腺癌標(biāo)本庫中(gse21034)，癌旁組織(n＝29)、原位癌組織(n＝131)和轉(zhuǎn)移癌組織(n＝19)中hic1基因表達(dá)差異。*p<0.05。

盡管臨床數(shù)據(jù)提示hic1基因表達(dá)量降低與前列腺癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但不能說明兩者之間的因果關(guān)系。因此，使用了自發(fā)性前列腺癌小鼠模型(pten^pc-/-小鼠)來驗(yàn)證，hic1基因表達(dá)下降是否導(dǎo)致前列腺癌轉(zhuǎn)移。在pten^loxp/loxp小鼠的前列腺上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)cre重組酶(pb-cre)，導(dǎo)致前列腺上皮中pten基因組織特異性缺失(pten^pc-/-)以及akt的高度磷酸化。這些pten^pc-/-小鼠先發(fā)生前列腺上皮增生，進(jìn)而在6周內(nèi)進(jìn)展成前列腺上皮內(nèi)瘤變，9至12周時發(fā)展成浸潤性的腺癌，這與人pca的發(fā)展過程相似，因此它是目前研究pca的很好模型。已有研究表明，hic1基因純合缺失會導(dǎo)致小鼠在圍產(chǎn)期死亡。通過在hic1基因編碼區(qū)兩側(cè)插入loxp位點(diǎn)，構(gòu)建條件性hic1無效等位基因模型(hic1^loxp/loxp小鼠)。與pb-cre/pten^loxp/loxp小鼠雜交，經(jīng)過鼠尾組織dna樣本pcr鑒定(見材料和方法)和19周齡小鼠前列腺組織前葉的免疫組化分析，如圖10a所示，得到wt，pten^pc-/-hic1^pc+/+和pten^pc-/-hic1^pc-/-三種基因型小鼠。h&e染色和免疫組化(ɑ-sma特異性染色)檢測發(fā)現(xiàn)，pten^pc-/-hic1^pc+/+小鼠前列腺腺腔薄膜完整，腺腔之間界限清晰；如圖10b所示，而pten^pc-/-hic1^pc-/-小鼠前列腺包膜出現(xiàn)破損，腺腔之間界限較為模糊，呈現(xiàn)出較高的侵襲性表型?；蚯贸∈竽Ｐ徒Y(jié)果提示，hic1基因缺失可以促進(jìn)前列腺癌侵襲性增加。

圖10a為在wt,pten^pc-/-hic1^pc+/+和pten^pc-/-hic1^pc-/-小鼠中，免疫組化檢測其前列腺上皮中hic1表達(dá)變化。標(biāo)尺：50μm。

圖10b為pten^pc-/-hic1^pc+/+和pten^pc-/-hic1^pc-/-小鼠中，h&e染色和免疫組化染色(ɑ-sma)觀察小鼠前列腺前葉組織變化。標(biāo)尺：200μm(h&e)and100μm(免疫組化)。藍(lán)色箭頭指示被破壞的腺腔組織。

實(shí)施例2：hic1缺失與患者生存預(yù)后正相關(guān)

一、hic1基因表達(dá)缺失與三陰性乳腺癌病人生存預(yù)后正相關(guān)

為進(jìn)一步探索hic1與臨床病人預(yù)后及生存率之間的相關(guān)性，又分析了已公開發(fā)表的乳腺癌臨床基因芯片數(shù)據(jù)庫。截止2013年11月，該數(shù)據(jù)庫共收錄1027例乳腺癌病人芯片結(jié)果，其中有效的basal型的乳腺癌占185例(通常意義上，將tnbc等同于basal-like型)。分析結(jié)果如圖11b提示，hic1的低表達(dá)與basal-like型病人的不良預(yù)后呈明顯相關(guān)p＝0.028)，但在整個乳腺癌數(shù)據(jù)庫和其他分子亞型的乳腺癌中，如圖11b所示，hic1的表達(dá)與病人的總生存率之間不具有統(tǒng)計學(xué)意義。hic1基因在三陰性乳腺癌中表達(dá)丟失，提示hic1可能成為一個特異的分子亞型預(yù)后指標(biāo)。

圖11a顯示.，在整個乳腺癌數(shù)據(jù)庫中(wholedataset)，hic1的表達(dá)與病人總生存率之間不具有相關(guān)性。數(shù)據(jù)來源于kaplan–meierplotterdatabase。p值根據(jù)log-ranktest自動計算得出。

圖11b顯示，在basal型乳腺癌中，hic1的低表達(dá)與病人的不良預(yù)后具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＝0.028)。

二、hic1表達(dá)缺失與前列腺癌病人生存預(yù)后正相關(guān)

通過對geo該數(shù)據(jù)庫中179例標(biāo)本的hic1基因表達(dá)二代測序結(jié)果分析，如圖12所示，發(fā)現(xiàn)表達(dá)高的病人無復(fù)發(fā)生存期(recurrencefreesurvival，rfs)明顯高于表達(dá)低的病人(hr＝0.7；95％ci:0.5～1.0；p<0.05)，提示癌組織中hic1基因表達(dá)量高的病人預(yù)后較好。

如圖12所示，前列腺癌標(biāo)本庫中(gse21034)，hic1基因表達(dá)量與病人生存關(guān)系。

實(shí)施例3：構(gòu)建穩(wěn)定的高表達(dá)hic1的細(xì)胞株和構(gòu)建shhic1的細(xì)胞株。

一、構(gòu)建穩(wěn)定的hic1高表達(dá)的細(xì)胞株

1.構(gòu)建hic1過表達(dá)質(zhì)粒包裝慢病毒

(1)克隆cds：從含有hic1的非病毒表達(dá)質(zhì)粒(pc3.1骨架)中克隆出cds序列；

(2)酶切cds序列和載體(phr-sin-csigw)，膠回收酶切產(chǎn)物；

(3)將酶切過的cds序列與慢病毒載體按比例連接、轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物、挑取克隆、質(zhì)粒小抽、測序鑒定陽性克?。?/p>

(4)質(zhì)粒大抽：構(gòu)建好的目的質(zhì)粒進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提，以達(dá)到細(xì)胞轉(zhuǎn)染級別(濃度1μg以上，純度od值大于1.8)；

(5)慢病毒包裝：將慢病毒包裝質(zhì)粒(pmd2.g、pspax2)和表達(dá)質(zhì)粒hic1共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000，操作步驟參照invitrogene公司說明書。48h后收集病毒上清，3000rpm離心15min，并進(jìn)行滴度測定，病毒分裝凍存-80℃保存。

(6)病毒感染：病毒上清感染靶細(xì)胞mda-mb-231(連續(xù)兩次)，facs篩選鑒定出帶gfp的陽性細(xì)胞，并擴(kuò)增培養(yǎng)、保種。

(7)westernblot及real-timepcr檢測hic1的表達(dá)水平、以及細(xì)胞的表型變化等。

2.轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231細(xì)胞

在本實(shí)驗(yàn)中所有的sirna轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒包裝均采用invitrogene公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000。質(zhì)粒dna和lipofectamine2000的稀釋液可用公司推薦的opti-mem或者無血清的dmem都可，原理一樣，效果相差不大。整個轉(zhuǎn)染過程中均不添加抗生素。操作步驟如下：

(1)轉(zhuǎn)染前24小時在12孔板中培養(yǎng)mda-mb-231細(xì)胞,細(xì)胞密度50％；

(2)第二天取病毒上清液,每孔加500μl病毒上清液,500μl完全培養(yǎng)基,并加入終濃度8μg/mlpolybrene混勻,37℃co2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；

(3)12小時后換新鮮完全培養(yǎng)基；

(4)12小時后加入終濃度1μg/ml嘌呤霉素(shhic1)篩選陽性克隆細(xì)胞株；

(5)dmem加10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

二、構(gòu)建穩(wěn)定的hic1敲低的細(xì)胞株

針對每個基因，都設(shè)計3個敲除片段和一個空載對照。質(zhì)粒骨架為gv248，屬于慢病毒載體，帶gfp和puro抗性。載體圖譜如圖13所示：

慢病毒的包裝質(zhì)粒是pmd2.g和pspax2，病毒的包裝、細(xì)胞感染過程和之前基因過表達(dá)步驟一致。采用puro(1μg/ml)篩選4天，之后換成0.5μg/ml繼續(xù)維持。針對hic1基因敲除片段的序列如下：

上述方法轉(zhuǎn)染永生化的乳腺上皮細(xì)胞hbl-100中shrna敲除hic1。

實(shí)施例4：hic1在腫瘤細(xì)胞及裸鼠體內(nèi)的功能研究

一、hic1在三陰性乳腺癌(tnbc)細(xì)胞及裸鼠體內(nèi)中的功能研究

首先通過慢病毒系統(tǒng)在三陰性細(xì)胞系mda-231和mda-468中恢復(fù)了hic1的表達(dá)，并通過westernblot和real-timepcr驗(yàn)證過表達(dá)效果，結(jié)果如圖14a，15a所示。在構(gòu)建好細(xì)胞系后，又通過劃痕損傷實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，以及chamber實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力。如圖14b結(jié)果顯示，在mda-231細(xì)胞中恢復(fù)hic1的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的遷移能力，如圖15b顯示，但對mda-468細(xì)胞，影響并不明顯。如圖14c，圖15c顯示，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對mda-231和mda-468細(xì)胞，恢復(fù)hic1的表達(dá)都能夠明顯抑制細(xì)胞的侵襲能力。

圖14a、14b、14c顯示westernblot和real-timepcr驗(yàn)證hic1過表達(dá)效果。劃痕實(shí)驗(yàn),恢復(fù)hic1表達(dá)后，細(xì)胞的遷移能力受到抑制。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，恢復(fù)hic1表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制(p＝0.0006)。mean±sd；scarebar,200μm。

圖15a、15b、15c顯示westernblot和real-timepcr驗(yàn)證mda-468細(xì)胞中hic1過表達(dá)效果。劃痕實(shí)驗(yàn)?；謴?fù)hic1表達(dá)后，對mda-468細(xì)胞的遷移能力影響不明顯。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。恢復(fù)hic1表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制(p＝0.0061)。mean±sd；scarebar,200μm。

如圖16a、16b、16c、16d所示，相反，在永生化的乳腺上皮細(xì)胞hbl-100中通過shrna敲除hic1后，細(xì)胞的侵襲能力大大增加。與sh-control相比，片段shhic1-2和shhic1-3的敲除效果較為明顯，敲除后細(xì)胞侵襲能力也明顯增加。而片段shhic1-1的敲除效果和對細(xì)胞侵襲的影響并不明顯。另外，如圖17a、17b、17c所示，在良性乳腺上皮細(xì)胞mcf-10a細(xì)胞中聯(lián)合使用shhic1-2和shhic1-3兩個片段，敲除hic1表達(dá)后，也得到了類似的結(jié)論，即：敲除hic1的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

如圖16a、16b、16c、16d所示.westernblot驗(yàn)證hic1在蛋白水平的敲除效果。.real-timepcr驗(yàn)證hic1在rna水平的敲除效果。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，敲除hic1后，細(xì)胞的侵襲能力大大增加。scarebar,200μm。細(xì)胞計數(shù)，統(tǒng)計分析。相比sh-control和shhic1-1,片段shhic1-2和shhic1-3對細(xì)胞侵襲的影響更為明顯。mean±sd。

如圖17a、17b、17c所示敲除hic1促進(jìn)mcf-10a細(xì)胞的遷移、侵襲

westernblot驗(yàn)證hic1蛋白水平敲除效果。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合使用shhic1-2和3片段敲除hic1后，細(xì)胞的侵襲能力大大增加(p＝0.0145)。用chamber小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。敲除hic1后，細(xì)胞的遷移能力同樣明顯增加(p＝0.0008)。mean±sd；scarebar,200μm。

在細(xì)胞水平獲得初步結(jié)果后，為進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)探索hic1對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，在帶有l(wèi)uciferase標(biāo)記的mda-231細(xì)胞中，繼續(xù)使用慢病毒系統(tǒng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hic1表達(dá)質(zhì)粒。在經(jīng)過westernblot和real-timepcr對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系鑒定合格后，將對照組mda-231^gfp和實(shí)驗(yàn)組mda-231^hic1細(xì)胞通過尾靜脈注射到nudebalb/c品系小鼠。每只小鼠注射1×10⁶細(xì)胞，總體積不超過100μl，同時注意氣泡和細(xì)胞團(tuán)塊，要避免小鼠發(fā)生栓塞而急速死亡。尾靜脈注射第4周開始，如圖18a所示，通過活體成像的方法檢測腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。之后，每周檢測一次，共3次。結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞mda-231^gfp相比，注射mda-231^hic1細(xì)胞的小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的比例明顯降低。在如圖18b所示，尾靜脈注射第五周，熒光活體成像系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)，攜帶mda-231^hic1細(xì)胞的小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的病情明顯低于攜帶mda-231^gfp細(xì)胞的小鼠。

圖18a和18b所示，hic1抑制小鼠肺轉(zhuǎn)移，活體成像顯示hic1組小鼠肺轉(zhuǎn)移明顯減輕。熒光值統(tǒng)計分析。mean±sem。

在注射后的第七周，處死全部小鼠，取肺組織觀察。肺轉(zhuǎn)移灶的計數(shù)統(tǒng)計和整體的肺負(fù)重結(jié)果顯示，如圖19a所示，hic1組小鼠肺轉(zhuǎn)移情況明顯好于gfp對照組小鼠。肺組織切片的蘇木素-伊紅(h&e)染色結(jié)果，使更直觀的看到：如圖19b所示，和gfp組相比，hic1組小鼠肺轉(zhuǎn)移受到明顯的抑制。此部分結(jié)果表明，恢復(fù)hic1表達(dá)能夠顯著降低三陰乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

圖19a、19b所示.小鼠肺轉(zhuǎn)移灶、肺負(fù)重及h&e染色

肺轉(zhuǎn)移灶和肺負(fù)重統(tǒng)計。n＝8；mean±sem.肺轉(zhuǎn)移灶切片，h&e染色結(jié)果。scarebar,500μm。

二、hic1可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

已有研究表明hic1參與調(diào)控癌癥進(jìn)展中的基因損傷[28,78]，細(xì)胞遷移和侵襲[18,31]等，為了進(jìn)一步研究hic1在nsclc中由于啟動子甲基化表達(dá)下降后對癌細(xì)胞產(chǎn)生的影響，在a549和h292細(xì)胞中使用慢病毒載體恢復(fù)表達(dá)hic1。如圖20a所示，transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hic1恢復(fù)表達(dá)的細(xì)胞其侵襲遷移能力下降。而用staurosporine處理細(xì)胞12h來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，如圖20b所示tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hic1可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；并且當(dāng)把a(bǔ)549細(xì)胞中的hic1敲除后，如圖20c所示細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，如圖20d所示同時細(xì)胞的凋亡數(shù)目減少。

如圖20a、20b、20c、20d所示，hic1抑制a549和h292細(xì)胞的侵襲遷移并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在a549和h292中恢復(fù)表達(dá)hic1后可抑制細(xì)胞的侵襲遷移。通過tunel實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在a549和h292中恢復(fù)表達(dá)hic1后可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在a549中敲除hic1后促進(jìn)了細(xì)胞的遷移。通過tunel實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在a549中敲除hic1后抑制了細(xì)胞的凋亡。

侵襲實(shí)驗(yàn)圖片放大倍數(shù)：10×10(物鏡×目鏡)，劃痕實(shí)驗(yàn)圖片放大倍數(shù)：5×10(物鏡×目鏡)，tunel實(shí)驗(yàn)圖片放大倍數(shù)：10×10(物鏡×目鏡)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

三、hic1表達(dá)缺失促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)

利用前列腺癌細(xì)胞模型來進(jìn)一步驗(yàn)證hic1表達(dá)缺失與前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并初步探索其分子機(jī)制。使用轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞株c4-2b和du145做為研究對象，利用慢病毒感染細(xì)胞，建立hic1表達(dá)沉默的細(xì)胞模型，即c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1-2,c4-2b^shhic1-3和du145^shctrl,du145^shhic1-2,du145^shhic1-3。westernblot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hic1沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型成功建立(圖5a和5b)。

體外實(shí)驗(yàn)中，使用trans-well方法來檢測hic1沉默后對細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。如圖21a所示，在c4-2b和du145細(xì)胞中，沉默hic1的表達(dá)可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移能力(p<0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，使用左心室注射luciferase標(biāo)記的c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1和du145^shctrl,du145^shhic1細(xì)胞的方法，在注射6周后檢測hic1沉默對細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的變化影響。結(jié)果顯示，hic1的表達(dá)沉默后，如圖21b所示，可以顯著促進(jìn)c4-2b和du145細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移(p<0.05)。值得注意的是，hic1的表達(dá)沉默促進(jìn)了細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量增多。如圖21c所示使用x-ray方法檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)移(圖3c)。經(jīng)過對轉(zhuǎn)移部位的骨組織切片h&e染色，如圖21d所示可以看到轉(zhuǎn)移的hic1表達(dá)沉默的腫瘤細(xì)胞使骨組織出現(xiàn)了明顯的破壞。此外，同時發(fā)現(xiàn)，注射c4-2b^shhic1細(xì)胞的小鼠生存期明顯短于注射c4-2b^shctrl細(xì)胞的小鼠(p<0.01)。由此證實(shí)，hic1表達(dá)缺失與前列腺癌細(xì)胞的侵襲、骨轉(zhuǎn)移能力升高以及小鼠生存期縮短相關(guān)。

圖21a、21b、21c、21d：hic1表達(dá)缺失促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

trans-well實(shí)驗(yàn)檢測，在du145和c4-2b細(xì)胞中，沉默hic1表達(dá)細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。*p<0.05。

裸鼠左心室注射luciferase基因標(biāo)記的du145^shctrl(n＝10),du145^shhic1(n＝16)細(xì)胞，注射6周后，檢測細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，并進(jìn)行定量分析轉(zhuǎn)移灶大小。*p<0.05，n代表每組小鼠數(shù)量。

x-光檢測luciferase標(biāo)記的c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1和du145^shctrl,du145^shhic1細(xì)胞對裸鼠脛骨的融骨影響。紅色箭頭指示融骨發(fā)生部位。

對融骨發(fā)生部位的h&e染色。藍(lán)色箭頭指示轉(zhuǎn)移到骨髓腔中的腫瘤細(xì)胞。

emt的發(fā)生是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制。emt的發(fā)生，往往伴隨著細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，即細(xì)胞極性消失、細(xì)胞之間粘附性降低。發(fā)現(xiàn)hic1在c4-2b和du145細(xì)胞表達(dá)沉默后，與對照組細(xì)胞相比，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了變化：細(xì)胞之間的連接變得松散，如圖22a所示，形態(tài)由立方形變?yōu)樗笮巍Ｌ崾緃ic1沉默可能引起前列腺癌細(xì)胞emt發(fā)生。emt發(fā)生會使上皮型細(xì)胞marker表達(dá)降低，而間質(zhì)型細(xì)胞marker表達(dá)升高，這是emt發(fā)生的重要分子生物學(xué)事件。進(jìn)一步使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因表達(dá)譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)，如圖22b、22c、22d、22e所示，hic1在c4-2b和du145細(xì)胞表達(dá)沉默后可以促進(jìn)間質(zhì)型細(xì)胞的marker表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞型marker表達(dá)。

圖22a、22b、22c、22d、22e：hic1表達(dá)缺失促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞emt發(fā)生。

在du145和c4-2b細(xì)胞中，沉默hic1表達(dá)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。標(biāo)尺：50μm。

c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1和du145^shctrl,du145^shhic1細(xì)胞表達(dá)譜芯片檢測后emt相關(guān)marker的熱圖分析。

在lncap，du145和c4-2b細(xì)胞中，沉默hic1表達(dá)后，westernblot實(shí)驗(yàn)檢測emt相關(guān)marker(e-cadherin，slug，n-cadherin和vimentin)表達(dá)變化。

使用激光共聚焦顯微鏡，免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測c4-2b^shctrl,c4-2b^shhic1細(xì)胞emt相關(guān)marker(e-cadherin，n-cadherin和vimentin)表達(dá)變化。標(biāo)尺：50μm。

pten^pc-/-hic1^pc+/+和pten^pc-/-hic1^pc-/-小鼠中，免疫組化染色觀察小鼠前列腺前葉組織emt相關(guān)marker(e-cadherin，ck-8，n-cadherin和slug)表達(dá)變化。標(biāo)尺：50μm。

本發(fā)明通過一系列分析方法發(fā)現(xiàn)：在多種腫瘤中hic1的缺失與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移患者預(yù)后密切相關(guān)。通過一系列體內(nèi)功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：敲低hic1促進(jìn)體內(nèi)三陰性乳腺癌的成瘤能力，降低小鼠的生存率。提示hic1可作為乳腺癌癌治療的靶點(diǎn)。而通過促進(jìn)hic1在癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平，可以有效抑制hic1的侵襲轉(zhuǎn)移、提高小鼠的生存率。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均足以證明促進(jìn)內(nèi)源性hic1的表達(dá)顯著降低乳腺癌、前列腺癌、肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移提高患者的生存率，提示hic1具有成為診斷、治療、預(yù)后和預(yù)測復(fù)發(fā)的標(biāo)記物的潛能。可以用來制作試劑盒，恢復(fù)hic1表達(dá)的藥物在制備治療腫瘤的藥物組合極具有臨床應(yīng)用價值，為腫瘤的有效治療提供了新的藥物和方法。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>王建華

<120>hic1在腫瘤診斷、治療、預(yù)后和預(yù)測復(fù)發(fā)中的應(yīng)用

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<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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