專利名稱：：利用抗-EphA4抗體效應(yīng)物作用損傷細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用抗-EphA4抗體的效應(yīng)物作用損傷細胞的方法，還涉及對該方法有用的組合物。
背景技術(shù)：
：胰腺癌癥(pancreaticcancer)在所有惡性腫瘤中是死亡率最高者之一，患者的5年存活率為4%。每年大約28,000名患者被診斷為胰腺癌癥，幾乎所有患者都會死于該疾病(Greenlee,R.T.，"(2001)CACancerJClin,57:15-36)。此惡性腫瘤的預(yù)后不良，這是由于早期診斷困難和對目前的治療方法反應(yīng)不佳(Greenlee，R.T.,"a/.(2001)CACancerJClin,57/15-36，Klinkenbijl,J.H.,da/,(1999)AnnSurg,230:776-82;discussion782-4.)。特別是目前還沒有鑒定可在疾病的有望治愈的早期實現(xiàn)可靠篩選的腫瘤標志物。旨在闡明致癌機制的研究已揭示了許多用于研制抗腫瘤劑的候選靶分子。例如，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)已被證明可有效治療動物模型中Ras依賴型腫瘤(SunJa/.,(1998)Oncogene,16:1467-73)。這種藥物被開發(fā)用于抑制與Ras相關(guān)的生長信號通路，該生長信號通路依賴于轉(zhuǎn)錄后的法尼基化。在人體臨床試驗中，為了對抗原癌基因HER2/neu，將抗肺瘤劑與抗-HER2單克隆抗體曲妥單抗(trastuzumab)聯(lián)合應(yīng)用，已經(jīng)成功地改善了臨床反應(yīng)，提高了乳腺癌患者的總體存活率。酪氨酸激酶抑制劑STI-571是一種選擇性失活bcr-abl融合蛋白的抑制劑。該藥物被開發(fā)用于治療慢性髓細胞樣白血病，該病中bcr-abl酪氨酸激酶的持續(xù)活化在白細胞的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。此類藥物被設(shè)計用于抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(MolinaMA,a/.,(2000)CancerRes,16:4744-9)。因此，在癌細胞中，表達升高的基因產(chǎn)物通常是開發(fā)新型抗肺瘤劑的潛在靶標。另一種癌癥治療策略涉及應(yīng)用與癌細胞結(jié)合的抗體。以下是抗體介導(dǎo)的癌癥治療的代表機制導(dǎo)彈療法(missiletherapy):在該方法中，將藥物與能夠特異性結(jié)合癌細胞的抗體結(jié)合，從而使所述藥物得以特異性作用于癌細胞。通過這種定向分布，即使有較強副作用的藥物也能集中地作用于癌細胞。除藥物之外，還報道了將藥物前體、將前體代謝成活性形式的酶等與抗體結(jié)合的方法。靶向功能分子的抗體的應(yīng)用這種方法利用例如結(jié)合生長因子受體或生長因子的抗體來抑制生長因子與癌細胞之間的結(jié)合。一些癌細胞的增殖高度依賴于生長因子。例如，已知一些癌癥的細胞生長依賴于表皮生長因子(EGF)或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。對于這樣的癌癥，預(yù)期抑制生長因子與癌細胞之間的結(jié)合可有治療作用。抗體細胞毒性在癌細胞中，與某些種類抗原結(jié)合的抗體可獲得細胞毒性。對于所述抗體類型，抗體分子本身具有直接的抗肺瘤作用。顯示對癌細胞的細胞毒性的抗體作為預(yù)期高效抗腫瘤的抗體試劑，正逐漸引起關(guān)注。發(fā)明的公開本發(fā)明人先前公開是與胰腺癌癥有關(guān)的基因，其在胰腺癌癥細胞中表達是上調(diào)的。參見WO2004/031412,其全文以提述方式并入本說明書。本發(fā)明人進一步^^開了針對的siRNA抑制胰臟細胞增殖。參見WO2005/0830S6，其全文以提述方式并入本說明書。在本文中，本發(fā)明人研究了能夠誘導(dǎo)細胞毒性的抗體，集中關(guān)注在癌細胞中顯示表達增強的基因，例如五//l^。結(jié)果顯示，當(dāng)使EphA4表達細胞與抗-EphA4抗體接觸時，可以在所述細胞中誘導(dǎo)強細胞毒性，從而完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明涉及以下藥物組合物或方法一種損傷EphA4表達細胞的藥物組合物，所述組合物包含抗-EphA4抗體作為活性成分，其中抗體具有抗體效應(yīng)物作用；[1]的藥物組合物，其中EphA4表達細胞是胰腺癌癥細胞；[3][l]的藥物組合物，其中抗-EphA4抗體是單克隆抗體；[4][l]的藥物組合物，其中抗體效應(yīng)物作用或者是抗體依賴性細胞毒性，或者是補體依賴細胞毒性，或者兩者都是；[1]的藥物組合物，其中抗體由VH鏈和VL鏈組成，每條VH鏈和VL鏈具有被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，稱作CDR1、CDR2和CDR3，每條VH鏈和VL鏈中各CDR的氨基酸序列選自下組人VHCDR1:ELS顧(SEQIDNO:10)，人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11),人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12),人VLCDR1::SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15),人VLCDR2::SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3::AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDR1:SNSAA額(SEQIDNO:20)，人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22),人VLCDR1::SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2:DNNKRPS(SEQIDNO:25)，人VLCDR3::GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26);[5]的組合物，其中人VH對應(yīng)于SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，人VL對應(yīng)于SEQIDNO:28或30的氨基酸序列；[5]的組合物，其中抗體進一步包含人IgGl的Fc域；[8]—種抗體，其由VH鏈和VL鏈組成，每條VH鏈和VL鏈有被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，稱作CDR1、CDR2和CDR3，每條VH鏈和VL鏈中各CDR的氨基酸序列選自下組人VHCDRl:ELSMH(SEQIDNO:10)，人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11),人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12),人VLCDRl:SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15)，人VLCDR2:SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3:AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDRl:SNSAA額(SEQIDNO:20),人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22)，人VLCDR1:SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2:DNNKRPS(SEQIDNO:25),人VLCDR3:GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26);[8]的抗體，其中人VH對應(yīng)于SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，人VL對應(yīng)于SEQIDNO:28或30的氨基酸序列；[8]的抗體，其中抗體進一步包含人IgGl的Fc域；一種分離的多核苷酸，其編碼[8]的抗體；—種載體，其包含[ll]的多核香酸；—種分離的宿主細胞，其包含[12]的載體；一種產(chǎn)生抗體的方法，其包含如下步驟培養(yǎng)[13]的宿主細胞從而表達多核苷酸，并從宿主細胞培養(yǎng)物回收抗體；—種用于損傷EphA4表達細胞的藥物組合物，其中該組合物包含[ll]的多核苷酸，或者包含[ll]的多核苷酸的載體；[16]—種用于損傷EphA4表達細胞的方法，其包含以下步驟a)使EphA4表達細胞與抗-EphA4抗體接觸，和b)利用已與細胞結(jié)合之抗體的效應(yīng)物作用來損傷EphA4表達細胞；[17]—種免疫原性組合物，用于誘導(dǎo)針對EphA4表達細胞具有效應(yīng)物作用的抗體，其中所述組合物包含EphA4、其免疫學(xué)活性片段、或者可表—種用于誘導(dǎo)針對EphA4表達細胞具有效應(yīng)物作用的抗體的方法，其中該方法包含施用EphA4、其免疫學(xué)活性片段，或者可表達EphA4或其免疫學(xué)活性片段的細胞或DNA的步驟；和一種用于治療或預(yù)防受試者中胰腺癌癥的方法，其包含對所述受試者施用藥學(xué)有效量的抗-EphA4抗體或其免疫學(xué)活性片段的步驟，其中所述抗體具有抗體效應(yīng)物作用。物，其中組合物包含抗-EphA4抗體作為活性成分。本發(fā)明還涉及抗-EphA4抗體用于產(chǎn)生藥物組合物的用途，其中所述藥物組合物利用抗-EphA4抗體效應(yīng)物作用來損傷EphA4表達細胞。本發(fā)明的藥物組合物由抗-EphA4抗體8和藥物可接受的載體組成。本發(fā)明人使用CDNA微陣列，對從前列腺癌和胰腺癌癥患者收集的前列腺癌或胰腺癌癥細胞和正常細胞進行了基因表達分析。接著鑒定出若干在胰腺癌癥細胞中表達明顯增強的基因。從這些在胰腺癌癥細胞中表達改變的基因中選擇了一種基因，即在主要器官中低水平表達的編碼細胞膜蛋白的Eph受體A4(本說明書中稱為"EphA4")基因，作為胰腺癌癥治療的候選乾基因(NakamuraT,etal.(2004)Oncogene.2004Mar25;23(13):2385-400)。推測通過選擇在主要器官中低水平表達的基因可以避免副作用的危險。在由以這種方式選擇的基因編碼的蛋白質(zhì)中，確認抗-EphA4抗體具有針對EphA4表達細胞的抗體效應(yīng)物作用。本發(fā)明人得到的結(jié)果顯示，在強制表達系統(tǒng)(forcedexpressionsystem)中，帶c-myc-His標簽的EphA4定位于細胞膜中，這是利用免疫焚光顯微技術(shù)證實的。EphA4基因編碼一種預(yù)期在其N-末端作為信號肽發(fā)揮作用的氨基酸序列。如上所述，觀察到這種蛋白質(zhì)主要定位于細胞膜中，因此，推定其是一種跨膜蛋白。此外，這種基因在主要器官中低水平表達，在胰腺癌癥細胞中高水平表達，確保了EphA4成為一種有用的臨床標志物和治療輩巴標。舉例來說，利用效應(yīng)物作用破壞癌癥細胞所需的條件如下-大量抗原分子在癌癥細胞膜表面表達，-抗原在癌組織中均勻分布，與抗體結(jié)合的抗原在細胞表面存留較長時間。更具體地說，例如，由抗體識別的抗原必須在細胞膜表面表達。此外，優(yōu)選在形成癌組織的細胞中抗原陽性細胞的比例盡可能高。理想狀態(tài)下，所有癌細胞都是抗原陽性的。當(dāng)癌癥細胞群中摻雜了抗原陽性和抗原陰性細胞時，對其特異的抗體的臨床療效會大大減少。通常，當(dāng)在細胞表面表達最大可能數(shù)目的分子時，可預(yù)期強力的效應(yīng)物作用。與這樣的抗原結(jié)合的抗體不被攝入細胞這一點也很重要。一些受體與配體結(jié)合后被攝入細胞(胞吞作用)。同樣地，與細胞表面抗原結(jié)合的抗體也可被攝入細胞。這種抗體被攝取進入細胞的現(xiàn)象稱為內(nèi)化作用(internalization)。內(nèi)化作用發(fā)生時，抗體恒定(Fc)區(qū)被攝取進入細胞。然而，效應(yīng)物作用所必需的細胞或分子保留在抗原表達細胞外。因此，內(nèi)化作用抑制抗體效應(yīng)物作用。所以，當(dāng)需要抗體效應(yīng)物作用時，選擇一種產(chǎn)生有限的抗體內(nèi)化作用的抗原是很重要的。本發(fā)明人首次顯示，EphA4是具有這樣的性質(zhì)的靶抗原。除非另有特定的說明，本說明書中使用的詞語"一個(a)"或"一種(an)"或"該(the)"是指至少一個或至少一種。"分離的"或"純化的"多肽是基本上不含細胞物質(zhì)(例如糖類、脂質(zhì)或來源于該蛋白所由來的細胞或組織源的其它污染蛋白)的多肽，和/或在其為化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)的多肽。術(shù)語"基本上不含細胞物質(zhì)，，包括多肽的制備物，其中該多肽與細胞(該多肽分離自該細胞或者在該細胞中重組表達)的細胞組分分開。因此，基本上不含細胞物質(zhì)的多肽包括這樣的多肽制備物，其中多肽制備物含異源蛋白(本說明書中也稱為"污染蛋白，，)少于約30%、20%、10%或5%(以干重計)。當(dāng)多肽為重組產(chǎn)生時，還優(yōu)選其基本上不含培養(yǎng)基，包括培養(yǎng)基少于蛋白質(zhì)制備物體積的約20%、10%或5%的多肽制備物。當(dāng)多肽是由化學(xué)合成產(chǎn)生時，優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，包括這樣的多肽制備物，其中蛋白合成中涉及的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)少于蛋白質(zhì)制備物體積的約30%、20%、10%或5%(以干重計)。例如，通過隨后對蛋白制備物進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳及凝膠考馬斯亮藍染色，出現(xiàn)單一條帶，可以證明蛋白制備物含有分離的或純化的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段是分離的或純化的。"分離的"或"純化的"核酸分子是與該核酸分子的天然源中存在的其它核酸分子相分離的核酸分子。當(dāng)由重組技術(shù)產(chǎn)生"分離的"或"純化的"核酸分子(例如cDNA分子)時，其可基本上不含其它細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)其由化學(xué)合成時，其可基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明的抗體或其片段的核酸分子是分離的或純化的。"抗體，，和"免疫球蛋白"是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w顯示對特異性抗原的結(jié)合專一性，而免疫球蛋白包括抗體和抗原特異性還沒有得到確定的其它類抗體分子。例如，屬于后一種類的多肽由例如淋巴系統(tǒng)低水平產(chǎn)生，而由骨髓瘤以更高的水平產(chǎn)生。"天然抗體和免疫球蛋白，，通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與一條重鏈連接，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數(shù)目可不同。每條重鏈和輕鏈也具有間隔規(guī)則的鏈內(nèi)二碌u鍵。每條重鏈的一端有一個可變域(VH)，其后是許多恒定域(CH)。每條輕鏈的一端有一個可變域(VL)，其另一端有一個恒定域(CL);輕鏈的恒定域與重鏈的第一個恒定域?qū)R，輕鏈的可變域與重鏈的可變域?qū)R。有人認為，某些氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的界面(Chothiaef(1985)JMolBiol.;186:651-63;NovotnyandHaber,(1985)ProcNatlAcadSciUSA.;82:4592-6)。術(shù)語"可變的，，指這樣一個事實，即可變域的某些部分在序列上在抗體之間有很大的不同，.因此推定這些部分與每一特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性有關(guān)。然而，可變性并不是平均分布于抗體的整個可變區(qū)。相反，在輕鏈可變域和重鏈可變域中，可變性通常集中在三個區(qū)段，稱為"互補決定區(qū)"(也稱為"CDRs")或超變區(qū)?？勺冇蛑斜Ｊ匦愿叩牟糠址Q為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域分別包括4個框架區(qū)，它們主要采取卩-折疊構(gòu)型，由3個CDR連接，這3個CDR形成環(huán)，這些環(huán)連接該卩-折疊結(jié)構(gòu)，在一些情況下構(gòu)成p-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的CDR被框架區(qū)緊密保持在一起，并與來自于其它鏈的CDR—道促成抗體的三維抗原結(jié)合4立點的形成(Kabat"/，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.)。恒定區(qū)不直接參與抗體和抗原的結(jié)合，但是顯示各種效應(yīng)物作用，例如在抗體依賴性細胞毒性中抗體的參與。木瓜蛋白酶消化抗體得到兩個相同的具有單一抗原結(jié)合位點的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab，，片段，和一個殘余的"Fc，，片段。胃蛋白酶處理得到一個F(ab，)2片段，其具有兩個抗原結(jié)合位點。"Fv"是包含完整的抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。這個區(qū)域通常是由一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域緊密非共價聯(lián)系而成的二聚體所組成。正是在這種構(gòu)型中，每個可變域的3個CDR相互作用，從而在VH-VL二聚物表面上定義出一個抗原結(jié)合位點。6個CDR共同使抗體具有抗原結(jié)合特異性。然而，即使單一的可變域(或Fv的一半，僅包括3個對抗原特異的CDR)也能識別和結(jié)合抗原，雖然親和力比完整的結(jié)合位點低。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一個恒定域(CH-1)。Fab，片段與Fab片段不同，其重鏈CH-1域的C-末端增加了幾個殘基，包括來自于抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。本說明書中，F(xiàn)ab，-SH用來指稱恒定區(qū)的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab，。F(ab，)2抗體片段最初是作為中間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab，片段產(chǎn)生的?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)在本領(lǐng)域中也是眾所周知的?；谄浜愣▍^(qū)的氨基酸序列，可將源自所有脊推動物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"分為兩種明顯不同的類型，分別稱為k(kappa)和X(lambda)。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分成不同種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中幾類可進一步分成亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同種類免疫球蛋白相應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱為a、S、s、y和p。不同種類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型在本領(lǐng)域中是眾所周知的。本說明書中使用的術(shù)語"單克隆抗體"指從基本上同種的抗體群體獲得的抗體，即，除了少量存在的可能自然發(fā)生的突變之外，群體中的個體抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異的，定向針對單個抗原位點。此外，每種單克隆抗體定向針對抗原上的單個決定簇，這與傳統(tǒng)(多克隆)抗體制備物不同，傳統(tǒng)(多克隆)抗體制備物通常包括定向針對不同決定簇(表位)的不同抗體。除了它們的特異性之外，單克隆抗體的有利之處還在于它們可通過雜交瘤細胞培養(yǎng)合成，不會受其它免疫球蛋白污染。因此，修飾語"單克隆的，，表示抗體系獲自基本上同一的抗體群體這一特征，并不解釋為要求用任何特殊方法生產(chǎn)抗體。例如，本發(fā)明的單克隆抗體可通過由Kohler和Milstein(1975)Nature.;256:495-7首次提出的雜交瘤方法制備，或者可通過重組DNA方法制備(Cabillyda/.,(1984)ProcNatlAcadSciUSA.;81:3273-7)。本說明書所述單克隆抗體具體包括"嵌合"抗體或免疫球蛋白，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或者屬于特定抗體種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而該鏈的剩余部分與源自別的物種或者屬于別的抗體種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們顯示所需的生4勿；舌'〖生(Cabillya/"supra;Morrisonefa/"(1984)ProcNatlAcadSciUSA.;81:6851-5),還包括所述抗體的片段。最常見的嵌合抗體或免疫球蛋白由人和鼠抗體片段組成，通常是由人的恒定區(qū)和鼠的可變區(qū)組成。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式是包含源自非人免疫球蛋白最小序列的特異性的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段。所述片段還包括Fv、Fab、Fab，、F(ab，)2以及抗體的其它抗原結(jié)合序列。大多數(shù)情況下，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種的CDR的殘基(供體抗體)所取代，所述非人物種例如具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的小鼠、大鼠或兔。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基可以被相應(yīng)的非人殘基所取代。在本發(fā)明的上下文中，人源化抗體中僅有少數(shù)框架，兩個，或優(yōu)選一個框架，被非人殘基的框架所取代。此外，人源化抗體可含有既不是在受體抗體中也不是在引入的CDR中發(fā)現(xiàn)的殘基或框架序列。通常引入這些修飾以進一步改良和優(yōu)化抗體性能。一般而言，人源化抗體基本上全部包含至少一個，通常是兩個可變域，其中所有或基本上所有與非人免疫球蛋白CDR區(qū)對應(yīng)的CDR區(qū)以及所有或基本上所有框架區(qū)具有人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還優(yōu)選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳情參見Jones&(1986)Nature.;321:522-5;Riechmann&a/.,(1988)Nat腦.;332:323-7;Presta,(1992)CurrOpinStructBiol.2:593-6。"單鏈Fv，，或"sFv"抗體片段由抗體的VH域和VL域組成，其中所述域存在于單個多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進一步包括VH域和VL域之間的接頭，其使sFv能夠形成抗原結(jié)合所需的三維結(jié)構(gòu)。已經(jīng)挺出許多方法以識別化學(xué)結(jié)構(gòu)，用于將由來于抗體V區(qū)的、天然聚集但化學(xué)上分離的輕多肽鏈和重多肽鏈轉(zhuǎn)化為sFv分子，后者會折疊成基本上類似于抗原結(jié)合位點結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)(美國專利5,091,513、5,132,405和4,946,778;PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenbergandMooreeds.,Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994))。如上所述的Fc區(qū)(,拔、^T潛^)源自抗體的"Y"的柄部，由兩條重鏈組成，每條重鏈貢獻2-3個恒定域(依賴于抗體的種類)。Fc與各種細胞受體和補體蛋白結(jié)合。其以這種方式介導(dǎo)抗體不同的生理效應(yīng)(調(diào)理作用，細胞溶解，肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞脫顆粒，以及其它過程)。一些細胞(例如肥大細胞和吞噬細胞)表面具有結(jié)合抗體的特異性受體。這些稱為Fc受體，顧名思義，這些受體與一些抗體(例如IgA、IgG、IgE)的Fc區(qū)相互作用。特定的抗體與特定細胞上的Fc受體的結(jié)合會觸發(fā)所述細胞的效應(yīng)物作用(例如吞噬細胞吞噬，肥大細胞脫顆粒)，最終會導(dǎo)致入侵微生物的破壞。Fc受體是同種型特異的，這給了免疫系統(tǒng)非常大的靈活性，因為不同的情況僅需要某些免疫機制對抗原應(yīng)答。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"效應(yīng)物作用，，指與抗體的Fc區(qū)有關(guān)的細胞毒性?；蛘?，效應(yīng)物作用也可解釋為一種決定由抗體的抗原識別觸發(fā)的生物活性的作用。例如，驅(qū)動結(jié)合于抗原的抗體的Fc區(qū)損傷表達所述抗原的細胞的作用，也可稱為抗體效應(yīng)物作用。本說明書中優(yōu)選的靶細胞是癌細胞?？贵w與抗原的結(jié)合常常沒有直接的生物學(xué)效應(yīng)。相反，顯著的生物學(xué)效應(yīng)是抗體繼發(fā)的"效應(yīng)物作用"的結(jié)果。免疫球蛋白介導(dǎo)許多種這樣的效應(yīng)物作用。通常，要實現(xiàn)特定效應(yīng)物作用，需要抗體與其抗原結(jié)合。然而，并非每種免疫球蛋白都會介導(dǎo)所有效應(yīng)物作用。已知的抗體效應(yīng)物作用的例子包括抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、補體依賴細胞毒性和中和活性。每一種作用描述如下?？贵w依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC):由各種抗體的Fc區(qū)實現(xiàn)的效應(yīng)細胞功能極大地依賴于抗體種類。存在包含對免疫球蛋白類IgG、IgE或IgA特異的Fc受體的細胞。IgG、IgE和IgA類抗體的Fc區(qū)各自與特異的Fc受體結(jié)合，表達相應(yīng)Fc受體的細胞識別并與結(jié)合到細胞膜等的抗體結(jié)合。結(jié)果，例如，具有Fc受體的細胞被活化，并在細胞間抗體轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用。舉例來說，IgG類抗體被T細胞、NK細胞、中性粒細胞和巨噬細胞上的Fc受體所識別。這些細胞與IgG類抗體的Fc區(qū)結(jié)合并被它活化，并針對所述抗體結(jié)合的細胞表達細胞毒性。通過抗體效應(yīng)物作用獲得細胞毒性的細胞，例如T細胞、NK細胞、中性粒細胞和巨噬細胞，稱為效應(yīng)細胞。特別是IgG類抗體通過效應(yīng)細胞上的Fc受體活化這些細胞，然后殺死抗體的可變區(qū)所結(jié)合的耙細胞。這稱為抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)?？苫谛?yīng)細胞的類型將ADCC劃分如下ADMC:IgG依賴巨噬細胞介導(dǎo)的細胞毒性，和ADCC:IgG依賴NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性。在本發(fā)明的ADCC中，對效應(yīng)細胞類型沒有限制。換言之，本發(fā)明的ADCC還包括ADMC,其中巨噬細胞是效應(yīng)細胞。已知抗體的ADCC是產(chǎn)生抗腫瘤作用的一種重要機制，特別是在應(yīng)用抗體的癌癥治療中(ClynesRA,da/.,(2000)NatureMed.，6:443-6.)。例如，抗-CD20抗體嵌合抗體的療效與ADCC之間的密切關(guān)系已有報道(CartronG,da/.,(2002)Blood,99:754-8.)。因此，在本發(fā)明的上下文中，ADCC在抗體效應(yīng)物作用中也是特別重要的。ADCC對于單克隆抗體臨床療效是一種關(guān)鍵的效應(yīng)物作用，特別是在癌癥治療領(lǐng)域。例如，人們認為ADCC是已經(jīng)開始臨床應(yīng)用的美羅華(Rit,n)、赫賽汀(Herceptin)等的抗腫瘤作用中的一種重要機制。美羅華和赫賽汀是已知的治療藥，分別用來治療非何杰金氏淋巴瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺癌。目前，ADCC介導(dǎo)的細胞毒性的機制大致解釋如下通過結(jié)合至細胞表面的抗體將效應(yīng)細胞橋聯(lián)到靶細胞上，認為效應(yīng)細胞通過投遞某種致死信號至耙細胞從而誘導(dǎo)耙細胞凋亡。更具體地說，主要通過一組具有激活和抑制活性的緊密相關(guān)的Fey受體介導(dǎo)ADCC。無論如何，在本發(fā)明的上下文中具有效應(yīng)物作用的抗體中都包括通過效應(yīng)細胞誘導(dǎo)細胞毒性的抗體。為了評價所述分子的ADCC活性，可進行體外ADCC試驗，例如美國專利5,500,362或5,821,337中所描述的?？蛇x地，或另外，可在體內(nèi)如在動物模型中，評價所述分子的ADCC活性，例如Clynes"a/.,(1998)ProcNatlAcadSciUSA.;95:652-56中顯示的。補體依賴細胞毒性(CDC):已知與抗原結(jié)合的免疫球蛋白的Fc區(qū)激活補體途徑。也已經(jīng)顯示激活途徑可能根據(jù)免疫球蛋白的種類而不同。例如，在人抗體中，IgM和IgG激活經(jīng)典途徑。另一方面，IgA、IgD和IgE則不激活該途徑。即，激活補體的功能局限于IgM和IgG類抗體。特別地，對抗體可變區(qū)所結(jié)合的細胞的溶解作用稱為補體依賴細胞毒性(CDC)?；罨难a體通過若干反應(yīng)產(chǎn)生C5b-9膜攻擊復(fù)合物(MAC),其具有損傷細胞膜的活性。人們認為以這種方式產(chǎn)生的MAC損傷病毒顆粒和細胞膜，而不依賴于效應(yīng)細胞。MAC介導(dǎo)的細胞毒性的機制的基礎(chǔ)如下所述。MAC對細胞膜具有強親和力。與細胞膜結(jié)合的MAC在細胞膜中開孔，使得水容易流進和流出細胞。結(jié)果使細胞膜不穩(wěn)定，或使?jié)B透壓改變，從而細胞被破壞?；罨难a體所致的細胞毒性僅延及位于已結(jié)合抗原的抗體附近的膜。因此，MAC介導(dǎo)的細胞毒性依賴于抗體特異性。ADCC和CDC可表達彼此獨立的細胞毒性。但事實上，這些細胞毒性可在生物體中復(fù)合發(fā)揮作用。為了評價所述分子的CDC活性，可進行CDC試驗，例如Gazzano-Santorod(1997)JImmunolMethods.;202:163-71中所描述的。中和活性能夠使病原體喪失感染性和毒素喪失活性的抗體在本領(lǐng)域中是眾所周知的?？贵w介導(dǎo)的中和可以通過抗原可變區(qū)與抗原的結(jié)合來實現(xiàn)，或者，可能需要補體的介導(dǎo)。例如在某些情況下，抗病毒抗體需要補體介導(dǎo)從而使病毒喪失其感染性。Fc區(qū)對于補體的參與是必不可少的。因此，所述抗體具有需要Fc用于中和病毒和細胞的效應(yīng)物作用。在這些效應(yīng)物作用中本說明書優(yōu)選的是ADCC和/或CDC。本發(fā)明基于某些抗-EphA4抗體與EphA4表達細胞結(jié)合，然后表達效應(yīng)物作用這一發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明還涉及損傷EphA4表達細胞的方法，所述方法包括以下步驟1)使EphA4表達細胞與抗-EphA4抗體接觸，和2)利用與細胞結(jié)合的抗體的效應(yīng)物作用損傷EphA4表達細胞。在本發(fā)明的方法或藥物組合物中，任何EphA4表達細胞都可被損傷或殺死。例如，優(yōu)選月夷腺癌癥細胞(pancreaticcancercell)作為本發(fā)明的EphA4表達細月包。其中，優(yōu)選胰腺癌(pancreaticcarcinomacell)細胞。細胞和抗體可在體內(nèi)或體外接觸。當(dāng)靶向體內(nèi)作為EphA4表達細胞的癌細胞時，本發(fā)明的方法實際上是癌癥的治療方法或預(yù)防方法。具體地，本發(fā)明提供癌癥的治療方法，其包括以下步驟1)向癌癥患者施用結(jié)合EphA4的抗體，和2)利用與癌癥細胞結(jié)合的抗體的效應(yīng)物作用損傷癌癥細胞。本發(fā)明人確認了結(jié)合EphA4的抗體藉效應(yīng)物作用有效地損傷EphA4表達細胞，特別是胰腺癌癥細胞。本發(fā)明人還確認了EphA4有很大可能性在胰腺癌細胞中高表達。此外，EphA4在正常組織中表達水平較低。合起來，該信息表明施用抗-EphA4的胰腺癌治療方法可能有效，幾乎沒有副作用之虞。包括IgA、IgE或IgG的Fc區(qū)的抗體對于表達ADCC是必不可少的。同樣地，IgM或IgG的抗體Fc區(qū)對于表達CDC是優(yōu)選的。然而，本發(fā)明的抗體不受限制，只要所述抗體具有所需的效應(yīng)物作用。通過例如對殘基或序列進行各種取代，可以構(gòu)建Fc部分的變體、類似物或衍生物。特別地，本發(fā)明考慮到了由Fc變體構(gòu)成的抗體，這些Fc變體經(jīng)過改造而具有優(yōu)化的Fcy受體親和性，^t人而增強由此產(chǎn)生的效應(yīng)物作用變體(或類似物)多肽包括Fc氨基酸序列中加入一個或多個氨基酸殘基的插入變體。插入可位于蛋白質(zhì)的任一或兩個末端，或者可位于Fc氨基酸序列的內(nèi)部區(qū)域中。在任一或兩個末端有額外氨基酸序列的插入變體可包括例如融合蛋白和含氨基酸標記或標簽的蛋白質(zhì)。例如，F(xiàn)c分子可選地包含N-末端Met，特別是當(dāng)分子在細菌細胞(例如大腸桿菌(五.co//))中重組表達時。在Fc缺失變體中，F(xiàn)c多肽中一個或多個氨基酸殘基被去除。缺失可能在Fc多肽的一個或兩個末端發(fā)生，或者去除Fc氨基酸序列內(nèi)的一個或多個殘基。因此，缺失變體包括Fc多肽序列的所有片段。在Fc取代變體的情況中，F(xiàn)c多肽的一個或多個氨基酸殘基被去除，并代之以備選的殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，對一個氨基酸序列進行個別的添加、缺失、插入或取代，改變單個氨基酸或小部分的氨基酸，結(jié)果導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)得以保留。它們被稱為"保守取代，，或"保守修飾"，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生有類似功能的蛋白質(zhì)。保守取代表提供功能上類似的氨基酸，其在
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的。氨基酸側(cè)鏈特性的例子是疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T),以及具有下述功能團或共同特性的側(cè)鏈月旨肪族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P);含側(cè)鏈的鞋基(S、T、Y);含側(cè)鏈的硫原子(C、M);含側(cè)鏈的羧酸和酰胺(D、N、E、Q);含側(cè)鏈的石威基(R、K、H);以及含側(cè)鏈的芳香族(H、F、Y、W)。此外，以下8組各自包含彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、曱硫氨酸(M)(參見例如Creighton，Proteins(1984))。在一個方面中，取代本質(zhì)上是保守的。但本發(fā)明并不局限于此，還包括非保守的取代，只要多肽保留必要的抗體效應(yīng)物作用。親本多肽Fc區(qū)優(yōu)選人Fc區(qū)，例如天然序列的人Fc區(qū)人IgGl(A和非A同種異型)或人IgG3Fc區(qū)。在一個實施方案中，ADCC提高的變體與帶有天然序列的IgGl或IgG3Fc區(qū)和該變體的抗原結(jié)合區(qū)的抗體相比，介導(dǎo)ADCC實質(zhì)上更有效。優(yōu)選地，變體包括對Fc區(qū)的298、333和334位點的殘基中兩個或三個殘基的取代，或基本上由它們組成。免疫球蛋白重鏈中殘基的編號方式是如Kabatefa/.,(見上文)中所述的EU索引的編號方式，明確地以^是述方式將其并入本文。更優(yōu)選地，取代298、333和334位點處的殘基(例如用丙氨酸殘基)。此外，為了產(chǎn)生ADCC活性提高的Fc區(qū)變體，人們通常會通過重組產(chǎn)生對FcyRIII(其被認為是介導(dǎo)ADCC的一個重要的FcR)的親和力提高的Fc區(qū)變體。例如，可在氨基酸位點256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430中任何一個或多個位點處將氨基酸修飾(例如插入、缺失或取代)引入親本Fc區(qū)，以產(chǎn)生這樣的變體。對FcyRIII親和力提高的變體還可能對FcYRII的親和力降低，特別是對抑制性的FcYRIIb受體親和力降^[氐。為了保留必要的抗體效應(yīng)物作用，優(yōu)選只對少量或小部分的氨基酸進行修飾(添加、缺失、插入或取代)。盡管如此，很多變體氨基酸插入、缺失和/或取代(例如，從l-50個氨基酸，優(yōu)選從l-25個氨基酸，更優(yōu)選從l-10個氨基酸)都被本發(fā)明所考慮到，并落入本發(fā)明的范圍。或者，修飾的氨基酸百分比優(yōu)選20%或更少，更優(yōu)選15%或更少，更優(yōu)選10%，甚至更優(yōu)選1%-5%。通常優(yōu)選保守的氨基酸取代，但本發(fā)明并不局限于此。此外，改變的形式可以是改變的氨基酸，例如模擬肽或D-氨基酸。或者，在本發(fā)明中，可通過修飾除氨基酸序列之外的生物化學(xué)性質(zhì)，例如添加至Fc區(qū)的糖鏈，來增強ADCC活性。例如據(jù)報道，IgG無巖藻糖殘基可增強ADCC活性(Shinkawa"a/.,(2003)J.Biol.Chem.:278(5):3466-73.)。因此，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選缺乏Fc區(qū)巖藻糖殘基的抗體。更具體地說，為了增強ADCC活性，可去除附接于Fc區(qū)的CH2域的巖藻糖殘基?？墒褂贸鼵HO以外的細胞作為宿主細胞，來表達無Fc區(qū)巖藻糖殘基的抗體。這里，巖藻糖殘基被CHO中高表達的a,l-6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶CFUT8)添加至抗體。因此，本發(fā)明中優(yōu)選屬于這些種類的人源抗體。利用從人或移植人抗體基因的嵌合動物收集的產(chǎn)生抗體的細胞，可獲得人抗體(IshidaI，etal.，(2002)CloningandStemCells.,4:91-102.)。此外，抗體Fc區(qū)可與任意可變區(qū)聯(lián)結(jié)。具體地，不同動物物種的可變區(qū)與人恒定區(qū)結(jié)合的嵌合抗體是本領(lǐng)域公知的?；蛘?，通過將源于人的可變區(qū)與任意恒定區(qū)結(jié)合也可獲得人-人嵌合抗體。另外，CDR移植技術(shù)也是眾所周知的，其中將對應(yīng)于人抗體可變區(qū)的互補決定區(qū)(CDRs)用異源4元體的CDR耳又4戈("Immunoglobulingenes",AcademicPress(London),pp260-274,1989;RoguskaMA,"a/.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:969-73.)。通過替換CDR而替換了抗體結(jié)合特異性。即，轉(zhuǎn)入了人EphA4結(jié)合抗體的CDR的人源化抗體會識別人EphA4。這些經(jīng)轉(zhuǎn)移的抗體也可稱為人源化抗體。這樣獲得的并帶有效應(yīng)物作用所必需的Fc區(qū)的抗體均可用作本發(fā)明的抗體，不管其可變區(qū)的來源如何。例如，本發(fā)明中優(yōu)選包括人IgGFc的抗體，即使它們的可變區(qū)包括源自另一種類或其它物種的免疫球蛋白的氨基S交序列。本發(fā)明的抗體VH和VL域各包括3個被框架區(qū)所分隔的CDRs,稱為CDR1、CDR2和CDR3。對CDRs的氨基酸序列不做特別限定，只要抗體可特異地與EphA4結(jié)合即可。優(yōu)選的CDR氨基酸序列的實例包括但不限于人VHCDR1:ELS固(SEQIDNO:10),人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11)，人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12)，人VLCDR1:SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15),人VLCDR2:SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3:AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDR1:SNSAAWN(SEQIDNO:20)，人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22),人VLCDR1:SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2:DNNKRPS(SEQIDNO:25),人VLCDR3:GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26).在一個更優(yōu)選的實施方案中，VH對應(yīng)于SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，VL對應(yīng)于SEQIDNO:28或30的氨基酸序列。如上所述，本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。即使施用于人時，人多克隆抗體也可利用上述用人抗體基因轉(zhuǎn)移的動物獲得。可選地，還可應(yīng)用利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的免疫球蛋白，例如人源化抗體、人-非人嵌合抗體和人-人嵌合抗體。此外，通過克隆人產(chǎn)生抗體的細胞獲得人單克隆抗體的方法也是眾所周知的。EphA4或包括其部分肽的片段可用作免疫原，以獲得本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的EphA4可源自任何物種，優(yōu)選源自哺乳動物，如人、小鼠、大鼠或兔，更優(yōu)選源自人。人EphA4核苷酸序列和氨基酸序列在本領(lǐng)域中是眾所周知的。為此，在SEQIDNO:1中描述EphA4的cDNA核苦酸序列(GenBankAccessionNo.NM—004438),在SEQIDNO:2中描述由所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.NP—004429)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可按常規(guī)分離包含規(guī)定的核苷酸序列的基因，制備所需序列的片段，獲得相應(yīng)于靶氨基酸序列的蛋白質(zhì)。舉例來說，可將編碼EphA4蛋白或其片段的基因插入已知的表達載體中，用來轉(zhuǎn)化宿主細胞?？赏ㄟ^任意和標準方法>夂人宿主細胞內(nèi)或細胞外回收所需蛋白質(zhì)或其片段，還可將其用作抗原。此外，蛋白質(zhì)、其裂解物以及化學(xué)合成的蛋白質(zhì)也可用作抗原。而且，表達EphA4蛋白或其片段的細胞本身也可用作免疫原。當(dāng)使用肽片段作為EphA4免疫原時，特別優(yōu)選包括據(jù)預(yù)測為胞外域的區(qū)域的氨基酸序列。推測EphA4的N-末端存在信號肽，從位點1延伸至位點19。因此，優(yōu)選以例如除N-末端信號肽(即開始的19個氨基酸殘基)以外的區(qū)域作為免疫原來獲得本發(fā)明的抗體。換句話說，優(yōu)選與EphA4胞外域結(jié)合的抗體作為本發(fā)明的抗體。因此，本發(fā)明中優(yōu)選的抗體是帶有效應(yīng)物作用所必需的Fc和能夠與細胞外EphA4區(qū)結(jié)合的可變區(qū)的抗體。當(dāng)目的是施用于人時，優(yōu)選帶有IgGFc。可用所述抗原免疫任意哺乳動物。但優(yōu)先考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。通常優(yōu)選嚙齒類(rodents)，兔形目(lagomorphs)或靈長類(primates)動物。嚙齒目包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形目包括例如家兔。靈長類包括例如狹鼻猿(東半球猴)如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴(Macacamulatta)、狒狒(sacredbaboons)和黑猩猩(chimpanzees)。用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫動物的標準方法。具體地，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸液與適量的標準佐劑如弗氏(Freund，s)完全佐劑混合，乳化后施用于哺乳動物。其后優(yōu)選每4至21天多劑量施用與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。還可以使用合適的載體進行免疫。如上述進行免疫后，可以用標準方法檢驗血清中所需抗體的水平的增加?？梢詮囊褭z查了血清中所需抗體的增加的經(jīng)免疫哺乳動物制備針對EphA4蛋白的多克隆抗體。為此可以義人這些動物收集血液，或通過使用任意常規(guī)的方法從它們的血液中分離血清。在本發(fā)明的上下文中，多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，以及含有從所述血清中分離的多克隆抗體的級分。IgG和IgM可從識別EphA4蛋白的級分中制備，例如使用與EphA4蛋白偶聯(lián)的親和柱，并進一步用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。在本發(fā)明中，抗血清可用作多克隆抗體?？蛇x地，還可應(yīng)用純化的IgG、IgM等。為了制備單克隆抗體，可從用抗原免疫的哺乳動物收集免疫細胞，檢查血清中所需抗體水平的升高(如上所述)，并用于細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞優(yōu)選來自脾。其它優(yōu)選的用于與上述免疫原融合的親本細胞包括但不限于哺乳動物骨髓瘤細胞，更優(yōu)選獲得了便于用藥物選擇融合細胞的性質(zhì)的骨髓瘤細胞。根據(jù)已知的方法，如Milstein等(Galfre,G.andMilstein,C.,(1981)Methods.Enzymol.:73,3-46.)的方法，可將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞進行融合。對于細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤，可通過在標準選擇培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基(由次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷組成的培養(yǎng)基)中進行培養(yǎng)而加以選擇。細胞培養(yǎng)通常在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進行數(shù)天至數(shù)周，這段時間足以殺死除了所需的雜交瘤細胞之外的所有細胞(非融合的細胞)。然后，可以進行標準的有限稀釋，篩選并克隆生產(chǎn)所需抗體的雜交瘤細胞。上述方法中可用抗原免疫非人動物以制備雜交瘤。此外，可以在體外用蛋白、表達蛋白的細胞或它們的懸液免疫來自于EB病毒等感染細胞的人淋巴細胞。然后，可使免疫后的淋巴細胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細胞(U266等)融合，從而獲得產(chǎn)生所需的能與所述蛋白結(jié)合的人抗體的雜交瘤細胞(特公昭63-17688)。(未審查的曰本公開專利申請(JP-A)Sho63-17688)然后可將獲得的雜交瘤細胞移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。獲得的單克隆抗體可以應(yīng)用例如好u酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)了本發(fā)明的蛋白的親和柱進行純化。本發(fā)明的抗體不僅可以用于純化和檢測本發(fā)明的蛋白，還可以作為本發(fā)明的蛋白的激動劑和拮抗劑的候選物。這些抗體還可以用于與本發(fā)明的蛋白相關(guān)的疾病的抗體治療。當(dāng)將獲得的抗體施用于人體時(抗體治療)，優(yōu)選使用人抗體或人源化抗體，因為它們的免疫原性低。例如，可以用選自蛋白、表達蛋白的細胞或它們的懸液的抗原免疫具有人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物。然后，可從該動物收集產(chǎn)生抗體的細胞，將其與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤，從這些雜交瘤可制備抗-蛋白的人抗體(參見國際公布號92-03918，94-02602,94-25585,96-33735和96-34096)?；蛘?，可以通過癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細胞，如經(jīng)免疫的淋巴細胞無限增殖化(immortalize),并用于制備單克隆抗體。以這種方式獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程方法制備(例如參見Borrebaeck，C.A.K.andLarrick，J.W"(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies,MacMillanPublishers,UK)。例如，可以從免疫細胞(如產(chǎn)生抗體的雜交瘤或經(jīng)免疫的淋巴細胞)克隆編碼抗體的DNA;然后將這些DNA插入合適的載體；并轉(zhuǎn)入宿主細胞，從而制備重組抗體。本發(fā)明還考慮到了如上所述制備的重組抗體?？贵w可以通過與各種分子，如聚乙二醇(PEG),結(jié)合進行修飾。以這種方式修飾的抗體也可用于本發(fā)明?？赏ㄟ^將抗體進行化學(xué)修飾來獲得修飾抗體。這些修飾方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)的。還可以用其它蛋白質(zhì)修飾抗體。用蛋白質(zhì)分子修飾的抗體可以利用基因工程產(chǎn)生。即，可以通過將抗體基因與編碼修飾蛋白的基因融合來表達耙蛋白。例如，抗體效應(yīng)物作用可以在與細胞因子或趨化因子結(jié)合時得到增強。事實上，與IL-2、GM-CSF等融合的蛋白，其抗體效應(yīng)物作用的增強已得到證實(PenichetML,a"/.，(2001)HumanAntibodies,10:43-9.)。增強效應(yīng)物作用的細胞因子或趨化因子包括IL-2、IL-12、GM-CSF、TNF、嗜酸性粒細胞趨化物質(zhì)(eosinophilchemotacticsubstance)(RANTES)等。的恒定區(qū)的嵌合抗體，或者作為含有源自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、源知方法產(chǎn)生?！梢岳梅肿由飳W(xué)的標準技術(shù)來制備編碼嵌合產(chǎn)物和CDR-移植產(chǎn)物的DNA序列。例如可以利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)從產(chǎn)生抗體的細胞的RNA合成可變區(qū)，來制備編碼感興趣的抗體的CDR的基因(參見例如Larricketal.，"Methods:aCompaniontoMethodsinEnzymology",vol.2:page106(1991);Courtenay扁Luck,"GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies"inMonoclonalAntibodies:Production,EngineeringandClinicalApplication;Ritteretal.(eds.)，page166(CambridgeUniversityPress,1995)，和Wardetal.，"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies"inMonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications;Birchetal.(eds.)，page137(Wiley-Liss，Inc.,1995))。可以利用寡核香酸合成技術(shù)完全或部分合成編碼嵌合產(chǎn)物和CDR-移植產(chǎn)物的DNA序列?？梢暻闆r應(yīng)用定點誘變和聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)。例如，可以應(yīng)用如Jones等(1986)Nature.;321:522-5所描述的寡核普酸定向合成。還可以應(yīng)用如Verhoeyen等(1988)Science.;239:1534-6或Riechmannetal.,(同上文)所描述的事先存在的可變區(qū)的寡核苷酸定向突變。還可以應(yīng)用如Queen等(1989)ProcNatlAcadSciUSA.;86:10029畫33;PCT公布WO90/07861所描述的利用T4DNA聚合酶填補有缺口的寡核苷酸?？梢杂萌我夂线m的宿主細胞/載體系統(tǒng)來表達編碼CDR移植重鏈和輕鏈的DNA序列?？梢詰?yīng)用細菌(例如大腸桿菌)和其它微生物系統(tǒng)，特別是用于表達抗體片段如Fab和(Fab，》片段，尤其是Fv片段和單鏈抗體片段如單鏈Fv。可以應(yīng)用真核(例如哺乳動物)宿主細胞表達系統(tǒng)，特別用于產(chǎn)生大的CDR移植抗體產(chǎn)物，包括完整的抗體分子。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞和骨髓瘤或雜交瘤細胞系?？梢詫⑷缟汐@得的抗體純化至均質(zhì)。例如，可根據(jù)用于純化和分離蛋白質(zhì)的一般方法純化或分離抗體。例如，可以利用適當(dāng)選擇的柱層析組合，包括但不限于親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電〉永、等電聚焦，來分離^t體(Antibodies:ALaboratoryManual,HarlowandDavid,Lane(edit.),ColdSpringHarborLaboratory,1988)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的使用的蛋白A柱包括HyperD、POROS和SepharoseFF(Pharmacia)。例示性的層析(除親和層析外)包括離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析和吸附層析("StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual"DanielR.Marshaka/"(1996)ColdSpringHarborLaboratoryPress.)?？梢园凑找合鄬游?如HPLC或FPLC)程序進行層析。舉例來說，可以采用吸光度測定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、酶免疫原結(jié)合活性。在ELISA中，通常將本發(fā)明的抗體固定在平板上，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)施加到平板上，再施加含有所需抗體的樣品(如產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)上清液或純化的抗體)。然后施加帶有酶(如堿性磷酸酶)標簽的識別第一抗體的第二抗體，并溫育平板。洗滌后，在平板中加入酶底物如磷酸對硝基苯酯，測定吸光度，評價樣品的抗原結(jié)合活性。可按照與蛋白質(zhì)相同的方式使用蛋白質(zhì)片段(C-末端或N-末端片段等)。可以使用BIAcore(Pharmacia)評價本發(fā)明抗體的結(jié)合活性。此外，按照實施例中概述的方法，也可以評價抗體效應(yīng)物作用。例如，可以在意名欠評價其效應(yīng)物作用的抗體存在的條件下，將靶EphA4表達細胞與效應(yīng)細胞溫育。如果;f全測到耙細胞的^C壞，可以確認所述抗體具有誘導(dǎo)ADCC的效應(yīng)物作用?？梢詫⒃跓o抗體或無效應(yīng)細胞的條件下觀察到的把細胞石皮壞的水平作為對照與效應(yīng)物作用水平比4交。明顯地表達EphA4的細胞可以用作靶細胞。具體地，可以應(yīng)用許多種在實施例中證實表達EphA4的細胞系。所述細胞系可以從細胞庫獲得。此外，可選摔具有更強效應(yīng)物作用的單克隆抗體。在本發(fā)明中，抗-EphA4抗體可作為藥物施用于人或其它動物。本發(fā)明中可以施用抗體的除人之外的動物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、貓、犬、羊、豬、牛、猴、狒狒和黑猩猩?？贵w可直接施用于受試者，另外可以利用已知的藥物制備方法配制成劑型。例如，根據(jù)需要，可將藥物以可注射形式，如與水或者任何其它藥物可接受的液體所成的無菌溶液或混懸液，進行非胃腸道施用。例如，可將這種化合物與可接受的載體或溶劑混合制成一般接受的用作藥物所需的單位劑型，所述載體或溶劑如無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑、溶劑、防腐劑、黏合劑等。包括生理鹽水、葡萄糖和佐劑(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉)等的其它等張溶液可用作注射用水溶液。還可將它們與適當(dāng)?shù)脑鋈軇┮黄鹗褂?，所述增溶劑例如醇，特別是乙醇和多元醇(例如丙二醇和聚乙二醇)，和非離子型表面活性劑(例如聚山梨酯80tm或HCO-50)。麻油或大豆油可用作油質(zhì)液體，可包括苯曱酸千酯或苯曱醇作為增溶劑。配方中可包括緩沖溶液(磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液等)、鎮(zhèn)痛藥(鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(苯甲醇、苯酚等)和抗氧化劑。制備的注射劑可以裝入到合適的安瓿中。在本發(fā)明中，可以給患者施用抗-EphA4抗體，例如動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、局部或肌內(nèi)施用。通過滴注或注射血管內(nèi)(靜脈內(nèi))給藥是給胰腺癌癥患者全身施用抗體的一般方法的一個例子。使抗體管鏡檢查)進行的局部注射和在CT引導(dǎo)下或用胸腔鏡檢查進行的局部注射。使抗體試劑局部集中于肝中原發(fā)性病灶或轉(zhuǎn)移灶的方法包括利用肝門靜脈注射或動脈輸注進行的局部注射。此外，將動脈內(nèi)導(dǎo)管插入供給癌癥細胞營養(yǎng)的靜脈附近從而局部注射抗腫瘤劑如抗體試劑，這種方法作為局部控制療法對于胰腺癌的原發(fā)性病灶和轉(zhuǎn)移灶有效。雖然劑量和施用方法根據(jù)患者的體重、年齡和施用方法而變化，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)確定這些參數(shù)。另外，可將編碼抗體的DNA插入用于基因治療的載體中，并施用該載體以進行治療。劑量和施用方法根據(jù)患者的體重、年齡和狀況而變化；不過本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)選擇它們。細胞毒性得到證實的量施用于活體。例如，雖然根據(jù)癥狀有一定程度的差別，但抗-EphA4抗體通常劑量范圍為0.1mg/kg-250mg/kg每天。通常，用于成年人(體重60kg)的劑量為5mg-17.5g每天，優(yōu)選為5mg-10g每天，更優(yōu)選為100mg-3g每天。服藥日程為以2-10天的間隔給藥1-10次，并在例如給藥3-6次后觀察進展。雖然本發(fā)明的抗體保留效應(yīng)物作用，但是在某些實施方案中，可使用公知的技術(shù)將細胞毒劑與抗體結(jié)合。細胞毒劑數(shù)量多且種類多，包括但不限于細胞毒類藥物、毒素或所述毒素的活性片段。合適的毒素及其相應(yīng)片段包括但不限于白喉A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)、auristatin等。細胞毒劑還包括放射化學(xué)試劑，所述放射化學(xué)試劑是通過將放射性同位素與本發(fā)明的抗體綴合或?qū)⒎派湫院怂嘏c共價附接于抗體的螯合劑結(jié)合而制得的。制備所述綴合物的方法是本領(lǐng)域公知的。或者，可以施用編碼抗體或其功能衍生物的核酸序列，通過基因治療的方式來治療或預(yù)防與EphA4表達細胞有關(guān)的疾病，例如胰腺癌。基因治療指通過給受試者施用被表達的(expressed)或可表達的(expressible)核酸而進行的治療。在本發(fā)明的這個實施方案中，核酸產(chǎn)生其編碼的抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段進而介導(dǎo)預(yù)防或治療效果。性的方法描述如下。關(guān)于基因治療方法的綜述，參見Goldspide^/.,(1993)Clin.Pharm.;12:488-505;WuandWu，(1991)Biotherapy.;3:87畫95;Tolstoshev,(1993)AnnRevPharmacolToxicol.;32:573-96;Mulligan,(1993)Science.;260:926-32;MorganandAnderson,(1993)AnnRevBiochem.;62:191國217;ClareRobinsonTrendsBiotechnol.;ll(5):155-215。重組DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
中普遍7>知的可應(yīng)用的方法描述于Ausubela/,(eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993》Kriegler，GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990)。在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的組合物包括編碼抗體的核酸，所述核酸是表達載體的組成部分，所述表達載體在合適的宿主中表達所述抗體或者其片段或嵌合蛋白質(zhì)或者重鏈或輕鏈。特別是，這樣的核酸具有與抗體編碼區(qū)可操作地連接的啟動子，優(yōu)選異源啟動子，所述啟動子是誘導(dǎo)型或組成型，以及，可選地，是組織特異型的。在另一特定的實施方案中，應(yīng)用這樣的核酸分子，其中在抗體編碼序列和任何其它期望的序列兩側(cè)有促進在基因組中的期望位點發(fā)生同源重組的區(qū)域，從而使編碼抗體的核酸能夠在染色體內(nèi)表達(KollerandSmithies,(1989)ProcNatlAcadSciUSA.;86:8932-5;Zijlstraetal.，(1989)Nature.;342:435-8)。在具體的實施方案中，所表達的抗體分子是單鏈抗體；或者，核酸序列可以包括編碼抗體的重鏈和輕鏈二者或它們的片段的序列。核酸分子投遞至受試者的方式可以是直接的，或者是間接的，直接的情況下，受試者直接暴露于核酸或攜帶核酸的載體，間接的情況下，首先用核酸在體外轉(zhuǎn)化細胞，然后將細胞移植進入受試者。所述兩種方法分別被稱為體內(nèi)基因治療或回體基因治療。在一個實施方案中，核酸序列可在體內(nèi)直接施用，其在體內(nèi)表達產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這可以通過本領(lǐng)域已知的眾多方法中任何一種來實現(xiàn)，例如，通過將核酸序列構(gòu)建為適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_載體的組成部分，并施用該載體從而使它們進入細胞內(nèi)，例如通過使用缺陷型或減毒的反轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體感染(參見U.S.Pat.No.4,980,286),或者通過直接注射棵露DNA,或者使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic,Dupont)，或者通過用脂質(zhì)或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包覆，封裝在脂質(zhì)體、微?；蛭⒘ｓw中，或者通過與已知進入核的肽相連結(jié)來施用，或者通過與易受到受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體(可用于靶向特異表達該受體的細胞類型)相連結(jié)來施用(參見例如WuandWu，(1987)JBiolChem.;262:4429-32)等。在另一個實施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，其中配體包括融合病毒肽用以破壞內(nèi)體，使得核酸免受溶酶體降解。在另一實施方案中，可通過靶向特異受體使核酸在體內(nèi)定向，以實現(xiàn)細胞特異性攝取和表達(參見例如PCT公布WO92/06180,WO92/22635，WO92/20316,W093/14188或WO93/20221)?；蛘?，可將核酸引入細胞內(nèi)，并通過同源重組摻入到宿主細胞DNA中表達(KollerandSmithies,(1989)ProcNatlAcadSciUSA.;86:8932畫5;Zijlstraetal"(1989)Nature.;342:435-8)。在一個實施方案中，應(yīng)用含有編碼本發(fā)明的抗體或其片段的核酸序列的病毒載體。例如，可應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Milleretal.,(1993)MethodsEnzymol.;217:581-99)。所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體包含使病毒基因組正確包裝和整合到宿主細胞DNA中所必需的組分。將編碼意欲用于基因治療的抗體的核酸序列克隆至一個或多個載體，這有利于將基因投遞至受試者。關(guān)于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的詳情可在Boesenetal.,(1994)Biotherapy.;6:291-302找到，其描述應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdr1基因投遞至造血干細胞，從而使這些干細胞對化療更有抵抗力。其它說明反轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中應(yīng)用的參考資料有Clowesetal.,(1994)JClinInvest.;93:644-51;Kiemetal"(1994)Blood.;83:1467-73;SalmonsandGunzberg,(1993)HumGeneTher.;4:129-41;GrossmanandWilson,(1993)CurrOpinGenetDev.;3:l10-4?？捎糜诨蛑委煹牧硪徊《据d體例子是腺病毒。腺病毒對于將基因投遞至呼吸道上皮而言是特別引人注目的載體。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在呼吸道上皮引起輕度疾病。用于基于腺病毒的遞藥系統(tǒng)的其它靶標有肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和肌肉。腺病毒具有能感染不分裂細胞的優(yōu)點。Kozarsky和Wilson,(1993)CurrOpinGenetDev.;3:499-5034是出一篇關(guān)于基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout等(1994)HumGeneTher.;5:3-10演示了應(yīng)用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至恒河猴的呼吸道上皮。其它在基因治療中應(yīng)用腺病毒的實例可在Rosenfeldetal.,(1991)Science.;252:431-4;Rosenfeldetal.,(1992)Cell.;68:143-55;Mastrangelietal,,(1993)JClinInvest.;91:225-34;PCT公布W094/12649;Wangetal,,(1995)GeneTher.;2:775-83中找到。在一個優(yōu)選的實施方案中應(yīng)用腺病毒載體。也有人提出將腺伴隨病毒(AAV)用于基因治療(Walshetal.，(1993)ProcSocExpBiolMed.;204:289-300;美國專利No.5,436,146)。另一種基因治療的方法涉及將基因轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)中的細胞，通過如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸4丐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染等方法。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將可選標記轉(zhuǎn)移至細胞。然后使細胞置于選擇下，以分離出已攝取了轉(zhuǎn)移基因并正在表達它的細胞。然后可將所述細胞投遞至受試者。在本實施方案中，將核酸引入細胞，然后在體內(nèi)施用產(chǎn)生的重組細胞。所述引入可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法進行，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用含核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化、微細胞介導(dǎo)(microcdlmediated)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球仿J^口LoefflerandBehr,(1993)MethodsEnzymol.;217:599-618;Cotton"o/.，1993,MethodsEnzymol.;217:618-44;ClineMJ.PharmacolTher.1985;29(l):69-92.)，并且可以根據(jù)本發(fā)明加以應(yīng)用，只要不破壞受體細胞必需的發(fā)育和生理功能。所述技術(shù)應(yīng)可使核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至細胞，以便核酸能夠被所述細胞表達，優(yōu)選能夠被其細胞后代遺傳和表達?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的各種方法將產(chǎn)生的重組細胞投遞至受試者。重組血細胞(例如造血干細胞或祖細胞)優(yōu)選由靜脈內(nèi)施用。預(yù)計應(yīng)用的細胞量依賴于期待的效果、患者狀態(tài)等，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。為基因治療目的而引入核酸的細胞包括任何期望的、可用的細胞類型，包括但不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、肌細胞、肝細胞；血細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨嗟細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種干細胞或祖細胞，特別是造血干細胞或祖細胞，例如從骨髓、臍帶血、外周血、胎肝等獲得的。在優(yōu)選的實施方案中，用于基因治療的細胞是受試者自體的。在重組細胞用于基因治療的一種實施方案中，可將編碼抗體或其片段的核S吏序列引入細胞，以便它們可由所述細胞或它們的后代表達，然后將重組細胞在體內(nèi)施用以取得療效。在特定的實施方案中，應(yīng)用干細胞或祖細胞。任何可在體外分離和保持的千細胞和/或祖細胞都有可能根據(jù)本發(fā)明的該實施方案應(yīng)用(參見例如PCT公布WO94/08598;StempleandAnderson,(1992)Cell.;71:973-85;Rheinwald，(1980)MethodsCellBiol.;21A:229-54;PittelkowandScott，(1986)MayoClinProc.;61:771-7)。在一個優(yōu)選的實施方案中，為基因治療目的而意欲引入的核酸包括與編碼區(qū)可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，以便可以通過控制適當(dāng)轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的有無來控制核酸的表達。此外，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)抗體的免疫原性組合物，所述抗體具有針對EphA4表達細胞的效應(yīng)物作用，其中組合物包含作為活性成分的EphA4或免疫學(xué)活性EphA4片段，或者可表達EphA4或免疫學(xué)活性EphA4片段的DNA或細胞。或者，本發(fā)明涉及EphA4或免疫學(xué)活性EphA4片段，或者效應(yīng)物作用的抗體。施用抗-EphA4抗體通過所述抗體的效應(yīng)物作用損傷癌細胞。因此，如果可在體內(nèi)誘導(dǎo)EphA4抗體，則可取得相當(dāng)于施用抗體的療效。當(dāng)施用由抗原組成的免疫原性組合物時，可在體內(nèi)誘導(dǎo)靶抗體。因此本發(fā)明的免疫的免疫原性組合物作為，例如，用于胰入腺癌癥治療的疫苗組合物是有效的。活性成分。在本發(fā)明的上下文中，免疫學(xué)活性EphA4片段指能誘導(dǎo)抗-EphA4抗體的片段，所述抗-EphA4抗體識別EphA4并具有效應(yīng)物作用。以下，將EphA4和免疫學(xué)活性EphA4片段描述為免疫原性蛋白。給定的片段是否誘導(dǎo)耙抗體，可以通過實際免疫動物，并確認被誘導(dǎo)的抗體的活性來確定。例如，可以利用實施例中所述的方法進行抗體誘導(dǎo)和其活性的確認。本發(fā)明的免疫原性復(fù)合物除包含免疫原性蛋白活性成分外，可包含藥物可接受的載體。必要時，還可將組合物與佐劑組合。滅活的結(jié)核菌、白喉類毒素、皂苷等可用作佐劑?；蛘?，可以使用編碼免疫原性蛋白的DNA或保持可表達狀態(tài)的所述DNA的細胞作為免疫原性復(fù)合物。利用表達靶抗原的DNA作為免疫原(即所謂的DNA疫苗)的方法是眾所周知的?？梢酝ㄟ^將編碼EphA4或其片段的DNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體而獲得DNA疫苗。反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、仙臺病毒載體等是合適載體的實例。此外，可以將如下所述的DNA作為棵露DNA直接引入細胞，然后表達在該DNA中，編碼免疫原性蛋白的DNA功能性地連接于啟動子的下游?？梢詫⒖寐禗NA包裹在核糖體或病毒#:膜載體中引入細胞。本發(fā)明的EphA4多肽和多核苷酸還可以用于在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，包括抗體和特異性針對EphA4表達細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的產(chǎn)生。在所述方法中，期望的肽對CTL的誘導(dǎo)可以通過在體內(nèi)或者回體由抗原呈遞細胞(APC)將所述肽呈遞到T細胞來實現(xiàn)。舉例來說，可收集患者的血細胞，如外周血單個核細胞(PBMC),利用可表達免疫原性蛋白的載體將它們轉(zhuǎn)化，并返回至患者。然后，經(jīng)轉(zhuǎn)化的血細胞在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性蛋白，并誘導(dǎo)靶抗體?；蛘撸梢允占颊叩腜BMC，使其以回體方式與多肽接觸，誘導(dǎo)APC或CTL之后，可將所述細胞施用于受試者。施用體外^"導(dǎo)的APC或CTL之前可將它們克隆。通過克隆和培養(yǎng)具有較高靶細胞損傷活性的細胞，可更有效地進行細胞免疫療法。此外，用這種方式分離的APC和CTL不僅可用于針對細胞所來源的個體的細胞免疫療法，還可用于針對來自于其它個體的相似類型的腫瘤的細胞免疫療法。通常，當(dāng)多肽用于細胞免疫療法時，已知通過組合多數(shù)具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并使它們與APC(特別是樹突狀細胞)接觸可增強CTL誘導(dǎo)的效率。因此，用蛋白質(zhì)片段刺激APC時，使用多種類型的片段的混合物是有利的?？赏ㄟ^觀察針對腫瘤的抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)來確認由多肽誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫。例如，當(dāng)以多肽免疫的實驗動物中誘導(dǎo)了針對該多肽的抗體時，以及腫瘤細胞的生長受所述抗體抑制時，認為多肽有能力誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。當(dāng)用編碼免疫原性蛋白的DNA或用該DNA轉(zhuǎn)化的細胞作為本發(fā)明的免疫原性復(fù)合物時，可將它們與免疫原性蛋白和增強其免疫原性的載體蛋白組合。如上所述，本發(fā)明提供誘導(dǎo)抗體的方法，所述抗體具有針對EphA4表達細胞的效應(yīng)物作用，其中所述方法包括施用EphA4、免疫學(xué)活性EphA4本發(fā)明的方法誘導(dǎo)具有損傷EphA4表達細胞(如胰腺癌癥)的效應(yīng)物作用的抗體。結(jié)果可以獲得對胰腺癌等的療效。每天，可以口服或非胃腸道施用0.1-250mg/kg的本發(fā)明的免疫原性組合物。非胃腸道施用包括皮下注射和靜脈注射。施用于單個成年人的劑量通常為5mg-17.5g每天，優(yōu)選5mg-10g每天，更優(yōu)選100mg-3g每天。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防受試者中癌癥的方法。在某些實施方案中，所述方法包括如下步驟施用藥學(xué)有效量的抗-EphA4抗體或其免疫學(xué)活性片段，其中所述抗體具有抗體效應(yīng)物作用。本說明書提及的所有現(xiàn)有技術(shù)的參考資料皆以提述方式全文并入本說明書。圖1的照片顯示了胰腺癌癥細胞系中EphA4基因半定量RT-PCR分析的結(jié)果。圖2顯示了ADCC試驗的結(jié)果，所述ADCC試驗利用針對EphA4過表達和低表達的胰腺癌癥細胞系(MIAPaca-2和PK-45P)的赫賽汀和抗-EphA4人抗體65和336。實施本發(fā)明的最佳方式以下參考本發(fā)明的實施例詳細地描述本發(fā)明。但是，本文所述的材料、方法等僅說明本發(fā)明的各個方面，決非意欲限制本發(fā)明的范圍。同樣地，在實施或^H全本發(fā)明時可使用與本文所述類似或等同的材料、方法等。細胞系人結(jié)腸癌或胰腺癌細胞系在含10%胎牛血清的適當(dāng)培養(yǎng)基中單層增殖。實驗所用的細胞系如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*1東北大學(xué)發(fā)育、衰老和癌癥研究所(InstituteofDevelopment,AgingandCancer,TohokuUniversity)*2Eagle氏基本必需培養(yǎng)基*3McCoy氏5A培養(yǎng)基(改良過)此外，以下細胞系在應(yīng)用抗-EphA4抗體的ADCC試驗中使用胰腺癌MIAPaca-2。人抗體應(yīng)用培養(yǎng)細胞篩選噬菌體表達文庫對于針對EphA4的人scFV抗體的篩選，使用編碼人scFV抗體(WO01/62907)的嗟菌體文庫AIMS4。篩選方法在P2005-185281A中描述。對于第一次錄選，首先，將高表達EphA4的MIAPaca-2細胞培養(yǎng)于15cm平皿中，用含2mg/ml膠原酶I(GibcoBRL)的細胞解離液(GibcoBRL)收集細胞，用冷PBS洗滌細胞。將人抗體噬菌體文庫溶液(2x1013cfii)與4xl07個所述細胞、BSA和NaN3/MEM混合。然后調(diào)節(jié)終濃度至1.6ml總體積中1%BSA-0.1%NaN3/MEM，4。C輕輕振蕩混合物4小時。之后，將一半反應(yīng)液分到兩個管中，在有機溶劑(鄰苯二曱酸二丁酯環(huán)己烷=9:1)層之上3000卬m離心2分鐘。棄上清后，將細胞重懸于0.7ml1%BSA/MEM中，在相同體積的弱極性有機溶劑層之上離心。此步驟重復(fù)兩次。棄上清，細胞重懸于0.3mlPBS中，液氮冷凍，37。C溶解。用這些噬菌體感染20ml大腸桿菌DH12S(OD0.5)1小時，將受感染細胞轉(zhuǎn)移到600ml2xYTGA培養(yǎng)基(2xYT、200(ig/ml硫酸氨千青霉素、1。/。葡萄糖)中，30°C過夜培養(yǎng)。將其中的10ml加到200ml2xYTA培養(yǎng)基(2xYT、200昭/ml硫酸氨千青霉素)中，37°C培養(yǎng)1.5小時。附加培養(yǎng)后，加入lxl0"個輔助噬菌體KO7，37。C再培養(yǎng)l小時。按上述方法培養(yǎng)1小時后，加入800ml2xYTGAK(2xYT、200嗎/ml硫酸氨千青霉素、0.05%葡萄糖、50(ig/ml卡那霉素)，30。C過夜培養(yǎng)。將該培養(yǎng)物8000rpm離心10分鐘。上清與200mlPEG液體(20%聚乙二醇6000、2.5MNaCl)混合，8000rpm離心IO分鐘沉淀噬菌體。將該沉淀混懸于10mlPBS中，將部分懸液用于檢驗被噬菌體感染的大腸桿菌數(shù)量。對于第二次篩選，使用0.8ml反應(yīng)液(l%BSA-0.1%NaN3/MEM)、培養(yǎng)細胞(2xl(^個)和第一次篩選的噬菌體(lxl(T個)。反應(yīng)液的總體積是第一次篩選所用的一半。第三次篩選過程與第二次篩選類似，除了用EPHA4轉(zhuǎn)染2xl07個293T細胞以及利用lxl(f個第二次篩選的噬菌體之外。DNA序列測定、表達檢測和抗體克隆的細胞ELISA如上文所述的經(jīng)篩選和稀釋的大腸桿菌隨后在含100pg/ml氨千青霉素的營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)。分離所得的菌落，用2xYTGA培養(yǎng)基3(TC溫育過夜。利用PI-50(Kurabo)從培養(yǎng)物中得到DNA，以雙脫氧法測定了DNA序列。此外，用1.2ml2xYTAI(2xYT、200嗎/ml硫酸氨千青霉素、0.5mMIPTG)于30。C培養(yǎng)0.05ml培養(yǎng)物，15000rpm離心5分鐘收集上清。檢測到抗體表達為cp3融合蛋白。更具體地說，上清與Maxisorp(NUNC)于37。C反應(yīng)2小時，吸出反應(yīng)液。用5%BSA于37。C將帶有抗體的平板封閉2小時，棄封閉溶液。用含0.05%Tween的PBS將兔抗-cp3抗體(MBL)1:2000稀釋后，加到平板中，室溫反應(yīng)1小時之后，用PBS洗滌。用含0.05%Tween的PBS將標記HRP(辣根過氧化物酶)的山羊抗兔IgG抗體(MBL)l:2000稀釋后，加到平板中，室溫反應(yīng)l小時之后，用PBS洗滌。向平板中加入100filOPD溶液，室溫反應(yīng)15分鐘，加入2M硫酸銨光度從而檢測了融合蛋白。細月包ELISA操作如下。首先，在96孔板中過夜培養(yǎng)lxl()S個細胞，將培養(yǎng)基替換為200|_il的5。/。脫脂乳/PBS。在冰上靜置3小時后，將100pl上清和100|_1110%脫脂乳混合，置水上過夜。將細胞用水上保存的PBS洗滌5次后，與100(il5嗎/ml小鼠抗-cp3單克隆抗體、5%脫脂乳/PBS于4'C反應(yīng)2小時。用冰上保存的PBS洗滌5次后，將由25pi過氧化物酶標記的ENVISION+聚合物試劑和75(_d15。/。脫脂乳/PBS組成的溶液與細胞于4。C反應(yīng)2小時。用冰上保存的PBS洗滌5次后，加入2M硫酸銨以終止反應(yīng)，用SPECTRAmax340PC(MolecularDevices)測定反應(yīng)混合物在492nm處的吸光度。流式細胞術(shù)證實為與抗原陽性反應(yīng)的人scFV抗體在IFA中轉(zhuǎn)化為完整的IgG形式。這兩個克隆具有如下的氨基酸序列。65:SEQIDNO:9(VH)和SEQIDNO:14(VL)336:SEQIDNO:19(VH)和SEQIDNO:23(VL)這些人scFV抗體在IFA中轉(zhuǎn)化為完整的IgG形式。以下氨基酸序列用作重鏈恒定區(qū)(CH)和輕鏈恒定區(qū)(CL)。CH(CHl、CH2和CH3):ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAPHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:13)CL:TECS(SEQIDNO:18)EphA4的半定量RT-PCR:用Rneasy⑧試劑盒(QIAGEN)從細胞系中提取總RNA。另外，用Oligo(dT)-纖維素柱(AmershamBiosciences)從總RNA中純化mRNA，應(yīng)用SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystem(Invitrogen)通過反專爭錄(RT)合成第一鏈cDNA。制備每條第一鏈cDNA的適當(dāng)稀釋物用于之后的PCR擴增，監(jiān)測GAPDH和P-肌動蛋白，作為定量對照。所用的引物序列如下5，-GAAGGCGTGGTCACTAAATGTAA-3，(SEQ.ID,N0.3)和5，-TTTAATTTCAGAGGGCGAAGAC-3，(SEQ.ID.N0.4)用于EphA4，5，-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3，(SEQ.ID.NO.5)和5，-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3，(SEQ.ID.N0.6)用于GAPDH，5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ.ID.NO.7)和5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQ.ID.NO.8)用于j3-肌動蛋白。所有PCR反應(yīng)均包括94。C初始變性2分鐘，并由94。C30s，58°C30s和72。C1min組成，在GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(PEAppliedBiosystems)上進行，對GAPDH進行21個循環(huán)，對于(3-肌動蛋白進行20個循環(huán)，或者對于EphA4進行28-32個循環(huán)。在胰腺癌細胞系Miapaca-2中發(fā)現(xiàn)EphA4過表達(圖1)。另外，確認了EphA4的表達，以闡明抗-EphA4人抗體對各種癌癥的功效。流式細胞術(shù)分析將癌細胞(5x10勺與純化的多克隆抗體(pAb)、單克隆抗體(mAb)、兔IgG(pAb的對照)或小鼠IgG(mAb的對照)4。C溫育30分鐘。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細胞，然后將細胞在FITC-標記的AlexaFluor488中4°C溫育30分鐘。將細胞再次用PBS洗滌后，用流式細胞儀(FACSCalibur②，BectonDickinson)分析，然后用BDCellQuestTMPro軟件(BectonDickinson)分析。平均熒光強度(MFI)定義為流式細胞計數(shù)強度的比(對每個蛋白特異性抗體的強度/對兔IgG的強度)。利用EphA4過表達細胞，研究細胞表面抗-EphA4抗體的結(jié)合率。結(jié)果表明，抗-EphA4人抗體65和336與MIAPaca-2纟田胞(MFI分別為12.64和15.54)的結(jié)合比例高于人IgG(對照)。ADCC測定將靶細胞與0.8鈣熒光素乙酰氧曱基酯(Calcein-AM，DOJINDO)于37。C接觸30分鐘。Calcein-AM由細胞酯酶切割產(chǎn)生焚光性衍生物鈣熒光素后發(fā)出熒光。靶癌細胞加入試-驗前洗滌兩次，然后鋪至96孔U型底板(每孔4乂103個細胞)上。人外周血單個核細胞(PMBC)采集于健康人，用Ficoll-Paque(AmershamBiosciences)密度梯度離心分離后，用作效應(yīng)纟田月包。用96孔板在250plAIM-V培養(yǎng)基中將靶癌細胞(T)和效應(yīng)細胞(E)與不同濃度的抗-EphA4人抗體(0嗎/孔、0.01(xg/孔、0.1嗎/孔、l嗎/孔、10嗎/孔、100昭/孔)或?qū)φ湛贵w赫賽汀(Herceptin)(Roche)共溫育，E和T的比值為100:1。該培養(yǎng)平行做三份，在250plAIM-V培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Inc)中37。C培養(yǎng)6小時。對照試驗包括將靶細胞僅與抗-EphA4人抗體或效應(yīng)細胞培養(yǎng)。有些實驗中用赫賽汀作為對照。采用INCellAnalyzer1000(AmershamBioscience)快速獲得活細胞的熒光圖像，根據(jù)熒光圖像評估抗-EphA4人抗體(65和336)對這些細胞的ADCC^丈應(yīng)。應(yīng)用Developertoolver.5.21^/f牛(AmershamBioscience)^"焚光物體或嚢泡進行計數(shù)，從而將這些圖像在數(shù)值上轉(zhuǎn)化為活細胞計數(shù)(對于輩巴細胞為細胞面積)。在一些實驗中用Herceptin作為對照。沒有觀察到由65和336抗-EphA4人抗體本身所致的MIAPaca-2細胞的直接細胞損傷。但是，65和336抗-EphA4人抗體在EphA4過表達的MIAPaca-2細胞中誘導(dǎo)ADCC(圖2)，而對EphA4低表達的PK-45P細胞沒有影響(圖2)。工業(yè)實用性本發(fā)明是基于，至少部分基于，EphA4表達細胞可被抗體細胞毒性損傷這一發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人鑒定了EphA4為在胰腺癌中強表達的基因。因此，如胰腺癌)的治療。事實上由本發(fā)明人確認的結(jié)果，顯示在EphA4抗體存在下由于胰腺癌細胞系中ADCC效應(yīng)所致的細胞毒性。盡管已經(jīng)詳細地并且參考本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然可以對本發(fā)明進行各種變化和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍，其界限由所附的權(quán)利要求書來指明。權(quán)利要求1.一種用于損傷EphA4表達細胞的藥物組合物，該組合物包含抗-EphA4抗體作為活性成分，其中抗體具有抗體效應(yīng)物作用。2.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述EphA4表達細胞是胰腺癌癥細胞。3.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述抗-EphA4抗體是單克隆抗體。4.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述抗體效應(yīng)物作用是抗體依賴性細胞毒性，或者是補體依賴性細胞毒性，或者是上述兩者。5.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述抗體包含VH鏈和VL鏈，每條VH鏈和VL鏈包含被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，稱作CDR1、CDR2和CDR3,每條VH鏈和VL鏈中各CDR的氨基酸序列選自下組人VHCDR1:ELSMH(SEQIDNO:10),人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11)，人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12)，人VLCDR1:SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15),人VLCDR2:SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3::AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDR1:SNSAAWN(SEQIDNO:20),人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22)，人VLCDR1::SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2::DNNKRPS(SEQIDNO:25),人VLCDR3::GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26),6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述人VH包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，人VL包含SEQIDNO:28或30的氨基酸序列。7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗體進一步包含人IgGl的Fc域。8.—種抗體，其包含VH鏈和VL鏈，每條VH鏈和VL鏈包含被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，稱作CDR1、CDR2和CDR3，每條VH鏈和VL鏈中各CDR的氨基酸序列選自下組人VHCDR1:ELSMH(SEQIDNO:10),<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述人VH包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，所述人VL包含SEQIDNO:28或30的氨基酸序列。10.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體進一步包含人IgGl的Fc域。11.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求8的抗體。12.—種載體，其包含權(quán)利要求11的多核苷酸。13.—種分離的宿主細胞，其包含權(quán)利要求12的載體。14.一種產(chǎn)生抗體的方法，其包含如下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求13的宿主細胞從而表達多核香酸，并從宿主細胞培養(yǎng)物回收抗體。15.—種用于損傷EphA4表達細胞的藥物組合物，其中該組合物包含權(quán)利要求ll的多核苷酸，或者包含權(quán)利要求11的多核苷酸的載體。16.—種用于損傷EphA4表達細胞的方法，其包含以下步驟a)使EphA4表達細胞與抗-EphA4抗體接觸，和b)利用已與細胞結(jié)合之抗體的效應(yīng)物作用來損傷EphA4表達細胞。17.—種免疫原性組合物，用于誘導(dǎo)針對EphA4表達細胞具有效應(yīng)物作用的抗體，其中所述組合物包含EphA4、其免疫學(xué)活性片段、或者可表達EphA4或其免疫學(xué)活性片段的DNA作為活性成分。方法包含施用EphA4、其免疫學(xué)活性片段、或者可表達EphA4或其免疫學(xué)活性片段的細胞或DNA。18.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>19.一種用于治療或預(yù)防受試者中胰腺癌癥的方法，其包含如下步驟對所述受試者施用藥學(xué)有效量的抗-EphA4抗體或其免疫學(xué)活性片段，其中所述抗體具有抗體效應(yīng)物作用。全文摘要本發(fā)明涉及利用基于抗-EphA4抗體的效應(yīng)物作用的細胞毒性。特別是，本發(fā)明提供包括抗-EphA4抗體的方法和藥物組合物，其中抗-EphA4抗體作為利用抗體效應(yīng)物作用損傷EphA4表達細胞的活性成分。由于EphA4在胰腺癌細胞中強表達，所以本發(fā)明在胰腺癌治療中特別有用。文檔編號A61K39/395GK101432022SQ20078001536公開日2009年5月13日申請日期2007年2月22日優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日發(fā)明者中鶴修一,吉川惠美,廣島真一申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司