專(zhuān)利名稱(chēng)：豬細(xì)小病毒抗體間接酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種病毒抗體測(cè)定用具，特別涉及一種豬細(xì)小病毒抗體的測(cè)定用具。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(英文簡(jiǎn)稱(chēng)PPV)會(huì)引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎及胎兒木乃伊化，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害較大，感染率高，在我國(guó)經(jīng)產(chǎn)母豬及種公豬感染率高達(dá)92%。80年代以來(lái)，PPV滅活苗及弱毒苗的使用，對(duì)于控制豬細(xì)小病毒的感染起到一定的作用。近年來(lái)，隨養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，大型集約化豬場(chǎng)的相繼出現(xiàn)，該病呈上升趨勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外已建立許多檢測(cè)豬細(xì)小病毒的診斷方法主要有血凝和血凝抑制試驗(yàn)(HA和HI)、熒光抗體技術(shù)(FAT)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫微球試驗(yàn)(IBA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、銀加強(qiáng)膠體金技術(shù)(SECGA)、單克隆抗體技術(shù)、核酸探針(NAP)檢測(cè)技術(shù)、非放射性核酸雜交(NRNAH)以及多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)等。ELISA抗體測(cè)定作為一種快速的血清抗體檢測(cè)方法適用于大樣品的篩查和快速檢測(cè)，在PPV的綜合防控體系中發(fā)揮重要作用。但目前沒(méi)有合適的測(cè)定用試劑盒，以適應(yīng)高靈敏、可大規(guī)模檢測(cè)的測(cè)定要求。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種豬細(xì)小病毒抗體間接酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定用試劑盒，以適應(yīng)高靈敏、可大規(guī)模檢測(cè)的測(cè)定要求。本實(shí)用新型是這樣實(shí)現(xiàn)的，豬細(xì)小病毒抗體間接酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定用試劑盒，它有盒體，盒體上面有盒蓋，盒體內(nèi)的下部有試劑瓶安裝座，試劑瓶安裝座上面的凹槽內(nèi)安裝有試劑瓶，試劑瓶安裝座上方的盒體內(nèi)安裝有酶標(biāo)板，酶標(biāo)板上面有多排孔盒，孔盒之間有間隔墊，酶標(biāo)板上面有蓋板膜。采用上述結(jié)構(gòu)的測(cè)定試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單合理，靈敏度高，提高了檢出率，降低了抗原和酶結(jié)合物的用量，相應(yīng)地也降低了成本；檢測(cè)時(shí)間短，一般2個(gè)小時(shí)內(nèi)即可出結(jié)果；樣品無(wú)需無(wú)菌化處理；操作簡(jiǎn)便易行；檢測(cè)成本低廉，適于推廣。

圖1是本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)的示意圖。
具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖給出的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)用新型。如附圖所示，本實(shí)用新型之豬細(xì)小病毒抗體間接酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定用試劑盒，它有盒體8，盒體上面有盒蓋4，盒體內(nèi)的下部有試劑瓶安裝座6，試劑瓶安裝座上面的凹槽內(nèi)安裝有試劑瓶7，試劑瓶安裝座上方的盒體內(nèi)安裝有酶標(biāo)板1，酶標(biāo)板上面有多排孔盒2，孔盒之間有間隔墊3，酶標(biāo)板上面有蓋板膜5。[0009]酶標(biāo)板上可有12排，每排8個(gè)，共96個(gè)孔盒。本實(shí)用新型之測(cè)定試劑盒的使用包括配置、組裝、檢測(cè)步驟。1.抗原預(yù)包被條制備經(jīng)由包被、封閉、干燥過(guò)程。a.包被用pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液將病毒重組抗原稀釋為4. 25μ g/ml，按 100 μ 1/孔加于酶標(biāo)板的孔盒中，4°C溫度下放置10小時(shí)，甩干；b.封閉用含10%小牛血清、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液封閉孔盒后，甩干；c.干燥置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝物中保存?zhèn)溆谩?.酶結(jié)合物制備經(jīng)由酶標(biāo)記、酶工作液配制過(guò)程。1)酶標(biāo)記a.辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的活化用三蒸水配制HRP (RZ彡3. 0)溶液，加入高碘酸鈉溶液，2°C 8°C溫度下避光1小時(shí)；加入乙二醇，2°C 8°C溫度下反應(yīng)28 32分鐘； 加入pH4. 4的醋酸鹽緩沖液，2°C 8°C溫度下透析過(guò)夜，換透析液兩次；b.標(biāo)記將上述活化酶抗體，加入純化的兔抗豬IgG中，用pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)PH至9. 2，2°C 8°C溫度下反應(yīng)20小時(shí)；c.還原將硼氫化鈉溶液加入前述反應(yīng)混合物中，2°C 8°C溫度下反應(yīng)2小時(shí)； 結(jié)合物加入PH6. 0的磷酸鹽緩沖液2°C 8°C溫度下透析液，換透析液兩次，加中性甘油后_20°C溫度下保存。2)酶工作液配制a.緩沖液配制以三蒸水配Wi7. 4的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含2. 5%聚乙二醇；0. 1% 牛血清白蛋白(BSA) ；0. 5%。酶保護(hù)劑；0. 5%。硫柳汞鈉；b.用所配的緩沖液，按適當(dāng)濃度(通常為10倍)稀釋上述凍存的標(biāo)記酶，即為酶
工作液。3.其它試劑的配制1) 20*濃縮洗滌液用三蒸水做20倍稀釋后使用；2) 10*樣品稀釋液用三蒸水做10倍稀釋后使用；3)顯色劑本方法采用液體型TMB，市場(chǎng)上有售。4)終止液以三蒸水配2M硫酸溶液；5)陽(yáng)性對(duì)照取篩出的陽(yáng)性血清(0D450nm彡1. 00)加少量紅色染料并按1000單
位/ml加青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾；6)陰性對(duì)照取篩出的陰性血清(0D450nm ( 0. 100)，按1000單位/ml加青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾。4.組裝將1瓶20倍濃縮洗滌液、1瓶10倍樣品稀釋液、1瓶10倍酶工作液、1瓶TMB顯色劑、1瓶終止液、1瓶陽(yáng)性對(duì)照和1瓶陰性對(duì)照分別放在試劑瓶安裝座上的凹槽內(nèi)，再將1 包96孔/包的抗原預(yù)包被板(即酶聯(lián)板)放置在盒體內(nèi)，將蓋板膜放在酶標(biāo)板上面，蓋上盒蓋備用ο5.檢測(cè)1)取抗原預(yù)包被條(即酶聯(lián)板)，每個(gè)孔盒內(nèi)分別加入100 μ 1樣品稀釋液，再分別加入ι μ ι待測(cè)標(biāo)本血清，同時(shí)設(shè)空白(只加loo μ ι樣品稀釋液)、陰性對(duì)照(加loo μ 1，不加樣品稀釋液)、陽(yáng)性對(duì)照(加100 μ 1，不加樣品稀釋液)，7°C溫度下孵育60分鐘后，甩干；2)用洗滌液洗滌3 5遍，甩干；3)加1滴前述的酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37°C溫度下孵育60分鐘后，甩干；4)用洗滌液洗滌3 5遍，甩干；5)依次加100 μ 1顯色劑，37 °C避光孵育10分鐘；6)每孔加終止液100 μ 1，酶標(biāo)儀檢測(cè)0D450nm。上述的BSA可以用小牛血清和脫脂奶粉代替，優(yōu)選BSA。包被過(guò)程是在2 °C 8 °C溫度下過(guò)夜。
權(quán)利要求1.豬細(xì)小病毒抗體間接酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定用試劑盒，其特征在于，它有盒體(8)， 盒體上面有盒蓋G)，盒體內(nèi)的下部有試劑瓶安裝座(6)，試劑瓶安裝座上面的凹槽內(nèi)安裝有試劑瓶(7)，試劑瓶安裝座上方的盒體內(nèi)安裝有酶標(biāo)板(1)，酶標(biāo)板上面有多排孔盒0)， 孔盒之間有間隔墊(3)，酶標(biāo)板上面有蓋板膜(5)。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型提供了一種豬細(xì)小病毒抗體間接酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定用試劑盒，它有盒體，盒體上面有盒蓋，盒體內(nèi)的下部有試劑瓶安裝座，試劑瓶安裝座上面的凹槽內(nèi)安裝有試劑瓶，試劑瓶安裝座上方的盒體內(nèi)安裝有酶標(biāo)板，酶標(biāo)板上面有多排孔盒，孔盒之間有間隔墊，酶標(biāo)板上面有蓋板膜。這種試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單合理，靈敏度高，提高了檢出率，降低了抗原和酶結(jié)合物的用量，相應(yīng)地也降低了成本；檢測(cè)時(shí)間短，一般2個(gè)小時(shí)內(nèi)即可出結(jié)果；樣品無(wú)需無(wú)菌化處理；操作簡(jiǎn)便易行；檢測(cè)成本低廉，適于推廣。
文檔編號(hào)G01N33/569GK202159064SQ201120278960
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者吳憶春 申請(qǐng)人:濱州職業(yè)學(xué)院