專利名稱：用于治療il4介導(dǎo)疾病的重組il4抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總體而言本發(fā)明涉及融合蛋白領(lǐng)域，涉及用于治療和診斷IL-4介導(dǎo)和過(guò)量IgE產(chǎn)生的疾病的蛋白質(zhì)，特別涉及嵌合和人源化IL4抗體。
背景技術(shù)：
異位變應(yīng)性疾病包括相對(duì)小的疾病如季節(jié)性鼻炎和結(jié)膜炎，及至較為嚴(yán)重的疾病如特應(yīng)性皮炎和異位性哮喘，以及威脅生命的疾病如過(guò)敏性休克。機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的免疫反應(yīng)將這些疾病相關(guān)聯(lián)在一起，該反應(yīng)包括在遺傳上易感染個(gè)體(特應(yīng)性)中兔疫球蛋白E(IgE)抗體的產(chǎn)生。在變應(yīng)性疾病的特定免疫療法中使用具脫敏作用的疫苗以抑制IgE的產(chǎn)生已成為一個(gè)長(zhǎng)久間目標(biāo)。然而，近年來(lái)人們已懷疑疫苗療法的安全性和有效性，但要降低IgE水平的希望仍未減弱。
白細(xì)胞介素4(IL4)是淋巴系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)介體。對(duì)來(lái)自特應(yīng)性個(gè)體的淋巴細(xì)胞的研究表明，在對(duì)刺激產(chǎn)生的反應(yīng)中存在著高于正常數(shù)目的T淋巴細(xì)胞，其具有分泌IL4的能力，且刺激之后分泌出較大量的IL4 。
人們已發(fā)現(xiàn)抗-IL4抗體能抑制IgE，但不能抑制IgG1或IgG2[Finkelman等，Ann.Rev.Immunol.8303(1990)]，及能抑制IL5分泌T細(xì)胞的產(chǎn)生[Maggi等，J.Immunol.1482142(1992)]。并且，最近的數(shù)據(jù)顯示出IL4可能會(huì)影響組織中嗜曙紅細(xì)胞的積累。參見(jiàn)如Tepper等Cell.62457(1990)Tepper等，Cell，57503(1989)。
本領(lǐng)域仍需求一種高度親合性IL4拮抗劑，其通過(guò)減少IL5分泌細(xì)胞的繁殖和抑制嗜曙紅細(xì)胞可能在組織中累積的貼壁機(jī)制，從而減少嗜曙紅細(xì)胞的發(fā)炎，并且能用于治療、預(yù)防和診斷特應(yīng)性反應(yīng)。
發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供了一種具有與人白細(xì)胞介素-4的結(jié)合親合性的融合蛋白，其含有源自非人類的中和單克隆抗體(MAb)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和第一融合配體，所述單克隆抗體的特征在于與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2×10-10M；所述第一融合配體的至少一個(gè)并優(yōu)選所有互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)被非人類單克隆抗體(MAb)的CDRs取代。非人類中和單克隆抗體可選自3B9和6A1，其更詳細(xì)地描述于《詳細(xì)說(shuō)明》部分。優(yōu)選地，該融合蛋白還可操縱地與第二融合蛋白相連，其含有所有的或部分的免疫球蛋白不變鏈。
相關(guān)方面，本發(fā)明提供了源自非人類中和單克隆抗體(MAb)的CDRs，該單克隆抗體與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2×10-10M，并且本發(fā)明提供了編碼該CDRs的核酸分子。
在另一方面，本發(fā)明提供了人源化抗體，其具有至少一種且優(yōu)選六種源自非人類中和單克隆抗體(MAb)的互補(bǔ)決定區(qū)，該單克隆抗體的特征在于與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2×10-10M。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗體，其含有人重鏈和輕鏈恒定區(qū)及源自非人類中和單克隆抗體(MAb)的重鏈和輕鏈可變區(qū)，該單克隆抗體的特征在于與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2×10-10M。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其含有上述一種(或多種)融合蛋白或MAbs(如人源化，嵌合等等)及一種藥物上可接受的載體。
進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種通過(guò)給藥于人有效量的本發(fā)明藥物組合物對(duì)人類進(jìn)行治療和/或預(yù)防變應(yīng)性疾病的方法。
還有一方面，本發(fā)明提供了融合蛋白，MAbs(如人源化的，嵌合的等等)，其CDRs、Fab或F(ab)2或其類似物的重組生產(chǎn)的方法及用于此重組生產(chǎn)中的成份，其中所述類似物源自非人類中和單克隆抗體(MAb)，該單克隆抗體特征在于與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2×10-10M。其中所述的這些成份包括分離出的編碼相同蛋白的核酸序列，含有在選擇性調(diào)節(jié)序列控制下的該核酸序列的重組質(zhì)粒，此調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，以及用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動(dòng)物的)。生產(chǎn)方法包括在一定條件下培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系以使抗體，優(yōu)選人源化抗體在所述細(xì)胞中被表達(dá)，以及從中分離出被表達(dá)的產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一方面是診斷變應(yīng)性和其它與人體中過(guò)量免疫球蛋白E產(chǎn)生相關(guān)的疾病的方法，其包括將生物液體樣品與融合蛋白，MAbs(如人源化的嵌合抗體等)及本發(fā)明的Fabs接觸，并分析所述融合蛋白，MAb或Fab與人白細(xì)胞介素4間的結(jié)合是否存在。
在本發(fā)明另一相關(guān)方面是提供了一種篩選對(duì)人白細(xì)胞介素4具有高滴度的單克隆抗體的方法，篩選方法包括(a)制備以人白細(xì)胞介素4的單克隆抗體的分泌作用為特征的雜交瘤細(xì)胞系；(b)用醛偶聯(lián)的人白細(xì)胞介素-4或生物素化的人白細(xì)胞介素-4篩選所述的雜交瘤細(xì)胞系。優(yōu)選地，以生物素化的人白細(xì)胞介素-4篩選雜交瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明還提供了與IL4具有高度親和性的中和MAb，其Fab片斷或F(ab′)2片斷，其通過(guò)以醛偶聯(lián)的人白細(xì)胞介素-4或生物素化的人IL4篩選雜交瘤產(chǎn)品庫(kù)而制得。
在另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)人白細(xì)胞介素-4具有特異性且具有以解離常數(shù)等于或小于約2×10-10M的結(jié)合親和力的嚙齒動(dòng)物中和單克隆抗體。這類單抗的例子有鼠MAb，3B9和大鼠MAb，6A1和其它具有相同識(shí)別性質(zhì)的MAbs(即以特異性地與人IL4結(jié)合于3B9或6A1的相同表位，解離常數(shù)等于或小于約2×10-10M)。本發(fā)明的另一方面是雜交瘤3426A11C1B9。
本發(fā)明的其它方面及優(yōu)點(diǎn)均在下面優(yōu)選實(shí)施方案中被進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行了描述。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1[SEQ ID NOS1和2]表明了鼠IL4抗體3B9的輕鏈可變區(qū)(氨基酸21-132)，和人/鼠3B9嵌合抗體以及天然信號(hào)序列(氨基酸1-20)。下劃線部分表示CDRs[SEQ ID NOS15和16；SEQ ID NOS17和18和SEQ ID NOS19和20]。
圖2[SEQ ID NOS3和4]表明了鼠3B9的重鏈可變區(qū)(氨基酸20-140)，和天然信號(hào)序列(氨基酸1-19)。下劃線部分表示CDRs[SEQ ID NOS21和22；SEQ ID NOS23和24；和SEQ ID NOS25和26]。
圖3[SEQ ID NOS9和10]表明了人/鼠3B9嵌合抗體的重鏈可變區(qū)(氨基酸21-141)及其信號(hào)序列(氨基酸1-19SEQ ID NOS5和6)。下劃線部分表示源自3B9的CDRs[SEQ IDNOS21和22；SEQ ID NOS23和24；SEQ ID NOS25和26]。
圖4[SEQ ID NOS11和12]表明了人源化3B9抗體的重鏈可變區(qū)(氨基酸20-141)及信號(hào)序列(氨基酸1-19SEQ IDNOS5和6)。下劃線部分表示源自3B9的CDRs[SEQ ID NOS54和22；SEQ ID NOS55和24SEQ ID NOS56和26]。
圖5[SEQ ID NOS13和14]表明了人源化3B9抗體的輕鏈可變區(qū)(氨基酸21-131)及信號(hào)序列(氨基酸1-20SEQ IDNOS7和8)。下劃線部分表示源自3B9的CDRs[SEQ ID NOS53和16；SEQ ID NOS17和18；和SEQ ID NOS27和28]。
圖6A[SEQ ID NOS5和6]是用于下述實(shí)施例4的重鏈信號(hào)序列。
圖6B[SEQ ID NOS7和8]是用于下述實(shí)施例4的輕鏈信號(hào)序列。
圖7是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用來(lái)表達(dá)嵌合IL4重鏈的質(zhì)粒pIL4chhc3-pcd的示圖。該質(zhì)粒含有β-內(nèi)酰胺酶基因(BETA LAC)，SV-40的復(fù)制起點(diǎn)(SV40)，巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子序列(CMV)，信號(hào)序列，SEQ ID NOS9和10的嵌合可變重鏈，人重鏈恒定區(qū)，來(lái)自牛生長(zhǎng)激素(BGH)的聚腺苷酸信號(hào)，β珠蛋白啟動(dòng)子(beta glopro)，二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，和背景pUC19中的另一BGH序列聚腺苷酸信號(hào)。
圖8是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用來(lái)表達(dá)SEQ ID NOS1和2的嵌合IL4輕鏈可變區(qū)質(zhì)粒pIL4chlc-pcdn的示圖。該質(zhì)粒不同于圖7所示的質(zhì)粒，其含有嵌合輕鏈可變區(qū)而不是嵌合重鏈可變區(qū)，人輕鏈可變區(qū)和新霉素基因(Neo)及DHFR。
圖9是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用來(lái)表達(dá)SEQ ID NOS11和12的合成IL4重鏈可變區(qū)質(zhì)粒pIL4hzhc-1-pcd的示圖。該質(zhì)粒不同于圖7所示的質(zhì)粒，其含有人源化重鏈可變區(qū)，而不是嵌合重鏈的可變區(qū)。
圖10是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用來(lái)表達(dá)SEQ ID NOS13和14的人源化IL4輕鏈可變區(qū)質(zhì)粒pIL4hzlc-O-Pcn的示圖。該質(zhì)粒不同于圖8所示的質(zhì)粒，其含有人源化輕鏈可變區(qū)，而不是嵌合輕鏈的可變區(qū)，并且沒(méi)有編碼DHFR基因。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供了各種抗體，抗體片斷和融合蛋白，特別是人源化抗體，其特征在于具有人IL4結(jié)合特異性，中和活性及與人IL4的高度親和性，正如鼠MAb 3B9或大鼠MAb 6A1所例示一樣。這些產(chǎn)品可用于治療和藥物組合物中，以治療IL-4介導(dǎo)的和IgE-介導(dǎo)的變應(yīng)性反應(yīng)。這些產(chǎn)品也可用于IL-4介導(dǎo)的癥狀的診斷中，通過(guò)在人體內(nèi)測(cè)量循環(huán)的內(nèi)源性IL4水平來(lái)診斷(如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA))。
I.定義“融合蛋白”是指被融合分子編碼的蛋白質(zhì)，可通過(guò)在所選擇宿主細(xì)胞中的表達(dá)而獲得。這種融合蛋白為基因工程抗體，如嵌合或人源化抗體，或是缺少全部或部分免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體片斷，如Fv、Fab或F(ab)2等等。
“融合分子”是指編碼源于非人類免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的核酸序列，該CDRs被插在含有人可變構(gòu)架序列的第一融合配體中?？蛇x擇地，該第一融合配體可操縱地與第二融合配體相連接。
“第一融合配體”是指編碼人的構(gòu)架或人免疫球蛋白可變區(qū)的核酸序列，其中天然的(或天然產(chǎn)生的)CDRs被供體抗體的CDRs代替。該人可變區(qū)可以是免疫球蛋白重鏈、輕鏈(或兩條鏈均有)，其類似物或功能片斷。該位于抗體(免疫球蛋白)可變區(qū)內(nèi)的CDRs或CDR區(qū)可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)確定。例如Kabat等人，[Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，NationalInstitutes of Health(1987)]，描述的確定CDRs位置的規(guī)則。此外，用于辯認(rèn)CDR區(qū)/結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是熟知的。
術(shù)語(yǔ)“高滴度”是指具有結(jié)合親合性的抗體，其特征在于與人IL4的Kd等于或小于2×10-10M。
“與人IL4的結(jié)合特異性”是指與人IL4而不是?；蚴驣L4的高滴度(或親合性)。
“第二融合配體”是指編碼蛋白或肽的另一核苷酸序列，第一融合配體在構(gòu)架中或通過(guò)一可任意選擇的常規(guī)連接序列(即可操縱地連接)與其融合優(yōu)選第二融合配體為免疫球蛋白。第二融合配體可包括編碼相同抗體(即同源的-得自同一來(lái)源的第一、第二融合蛋白)整個(gè)恒定區(qū)或附加的(即異源的)感興趣的抗體。它可以是免疫球蛋白重鏈或輕鏈(或兩條鏈作為信號(hào)多肽部分)。第二融合配體不限定于特別的免疫球蛋白類或同種型。此外，第二融合配體可包括免疫球蛋白恒定區(qū)部分，如發(fā)現(xiàn)于Fab或F(ab)2中的恒定區(qū)(即適當(dāng)?shù)娜撕愣▍^(qū)或構(gòu)架區(qū)的分離部分)。此第二融合配體也可包括編碼暴露于宿主細(xì)胞外層的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的序列，如噬菌體展示庫(kù)部分，或編碼用于分析或診斷檢測(cè)的蛋白質(zhì)的序列，如辣根過(guò)氧化物酶，β-半乳糖苷酶等等。
術(shù)語(yǔ)“Fv、Fc、Fab，或F(ab)2均為其標(biāo)準(zhǔn)含義(參見(jiàn)，如Harlow等，Antibodies A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，(1988))。
正如此處所用的“基因工程抗體”描述了一類融合蛋白，即合成抗體(如嵌合的或人源化抗體)，其中所選擇的受體抗體的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)部分被來(lái)自一個(gè)或多個(gè)供體抗體的類似部分所取代，所述供體抗體與所選表位具有特異性。例如，這類分子可包括抗體，其特征在于人源化重鏈與非修飾的輕鏈(或嵌合輕鏈)相關(guān)，或反之也是如此?；蚬こ炭贵w也可被編碼受體抗體輕鏈和/或重鏈可變區(qū)域構(gòu)架區(qū)的核酸序列改變，以獲得供體抗體結(jié)合特異性。這些抗體可包括以此處所描述的供體抗體的CDRs置換受體抗體的一種或多種CDRs(優(yōu)選全部)。
“嵌合抗體”指一種基因工程抗體，其含有來(lái)自供體抗體的天然產(chǎn)生的可變區(qū)(輕鏈或重鏈)，所述供體抗體與來(lái)自受體抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)。
“人源化抗體”是指一類基因工程抗體，具有源自非人類供體免疫球蛋白的CDRs，存留的由免疫球蛋白衍生的分子部分源自一種(或多種)人免疫球蛋白。此外，構(gòu)架支撐殘基可被更換為保持結(jié)合親合性(參見(jiàn)，如Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8610029-10032(1989)，Hodgson等，Bio/Technology，9421(1991))。
術(shù)語(yǔ)“供體抗體”是指一種抗體(多克隆，單克隆或重組)，其為第一融合配體提供可變區(qū)，CDRs或其它功能片斷或其類似物的核酸序列，如此以提供融合分子和最終被表達(dá)的具有抗原特異性和中和活性供體抗體特征的融合蛋白。適用于本發(fā)明的一種供體抗體是非人類中和單克隆抗體(即鼠的)指定為3B9?？贵w3B9被定義為一種高滴度，人-IL4特異的(即不識(shí)別?；蚴驣L4)，同型IgG1的中和抗體，其在適當(dāng)?shù)氖驣gG恒定區(qū)具有SE ID NOS1和2的可變輕鏈DNA和氨基酸序列，和SEQ ID NOS3和4的可變重鏈DNA和氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“受體抗體”是指一種與供體抗體異源的抗體(多克隆、單克隆或重組抗體)，其為第二融合配體提供了編碼其重和/或輕鏈構(gòu)架區(qū)和/或重和/或輕鏈恒定區(qū)的核酸序列。優(yōu)選人抗體是受體抗體。
“CDRs”定義為抗體的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，其是免疫球蛋白重和輕鏈的高變區(qū)，參見(jiàn)，如Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第4版，U.S.Department ofHealth and Human Services，National Institues of Health(1987)。在免疫球蛋白可變部分有三條重鏈和三條輕鏈CDRs(或CDR區(qū))。因此，這里用的“CDRs”指所有的三條重鏈CDRs，或所有三條輕鏈CDRs(或如果適當(dāng)?shù)脑?，所有的重鏈和所有的輕鏈CDRs)。
CDRs為抗體與抗原或表位的結(jié)合提供了大部分的接觸殘基。本發(fā)明中感興趣的CDRs源于供體抗體的可變重鏈和輕鏈序列，并包括天然產(chǎn)生CDRs的類似物，此類似物也與所來(lái)源的供體抗體共有或保持同樣的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。
“共同抗原特異性或中和能力”是指如雖然Mab 3B9特征在于有某一水平的抗原親和性，且在一適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)環(huán)境中以核酸序列3B9編碼的CDR可具有低一些或高一些的親和性，但無(wú)論怎樣均認(rèn)為該環(huán)境中的3B9的CDRs能識(shí)別與3B9同樣的表位。3B9重鏈CDRs的例子包括SEQ ID NO22；SEQ ID NO24；SEQ ID NO26；3B9輕鏈CDRs的例子包括SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；和SEQ IDNO20。
“功能片斷”是指部分重鏈或輕鏈可變序列(如免疫球蛋白可變區(qū)在氨基或羧基末端的最小缺失)，其保持有片斷所源自的抗體的相同抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。
“類似物”是指被至少一個(gè)氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所說(shuō)的修飾可以是化學(xué)修飾或取代或是幾個(gè)氨基酸(即不多于10個(gè))的重排，這種修飾允許氨基酸序列保持未修飾序列的生物學(xué)性質(zhì)，如抗原特異性和高滴度或親合性。例如，通過(guò)置換(Substition)，可構(gòu)建沉默突變，以在CDR區(qū)內(nèi)或周圍建立內(nèi)切核酸酶限制酶切位點(diǎn)。
類似物也可由等位變異產(chǎn)生?！暗任蛔儺惢蛐揎棥笔侵冈诰幋a本發(fā)明氨基酸或肽序列的核酸序列中的改變。這種變異或修飾或是由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性或是被有目的地基因工程改造以提供所需的性質(zhì)。這些變異或修飾可以導(dǎo)致或不導(dǎo)致任一被編碼的氨基酸序列中的改變。例如，輕鏈CDR SEQ ID NO16的氨基酸序列與天然鼠或人源化3B9抗體是相同的。然而，該CDRs序列是被SEQ ID NO15和SEQ IDNO53共同編碼的。相似地，CDR SEQ ID NO22是被SEQ IDNO21和SEQ ID NO54共同編碼；CDR SEQ ID NO24是被SEQ ID NO23和SEQ ID NO55共同編碼的；且CDR SEQID NO26是被SEQ ID NO25和SEQ ID NO56共同編碼的。
術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子”指非蛋白載體分子，通過(guò)常規(guī)手段將融合蛋白，和/或供體抗體天然的或合成的輕鏈或重鏈或其它供體抗體片段與效應(yīng)子結(jié)合。這種非蛋白載體可包括用于診斷領(lǐng)域的常規(guī)載體，如聚苯乙烯或其它塑料珠、多糖，如用于BIA core[Pharmacia]體系中的，或其它用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的且給人和動(dòng)物施用具有安全性的其它非蛋白物質(zhì)，其它效應(yīng)子可包括能螯合一重金屬原子的大環(huán)或放射性同位素。這種效應(yīng)子也可用來(lái)延長(zhǎng)融合蛋白的半衰期，如聚乙二醇。
II高度親合性IL4單克隆抗體為用于構(gòu)建本發(fā)明的抗體、片斷和融合蛋白，非人類的種(如牛、馬、靈長(zhǎng)類、嚙齒類(如鼠和大鼠)等)可在天然人IL4或源于人IL4的肽表位存在時(shí)用來(lái)產(chǎn)生一種所需的免疫球蛋白。采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)以提供分泌非人類MAb至IL4的雜交瘤細(xì)胞系。然后使用共價(jià)吸附于96-孔板的IL4或可選擇地使用用于篩選分析中的生物素化IL4一起來(lái)篩選這種雜交瘤，如下面實(shí)施例2中的詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是一種檢測(cè)人IL4 MAbs的方法，其中該分析體系避免IL4的變性。以這種方式，我們發(fā)現(xiàn)可以檢測(cè)出高滴度(或高親合性)的人IL4的MAbs。
作為一個(gè)實(shí)例，第一次公開(kāi)了來(lái)自鼠供體的高滴度，中和MAb的生產(chǎn)。MAb3B9為用于開(kāi)發(fā)嵌合的或人源化抗體的所需鼠(供體)抗體，被詳細(xì)描述于下述實(shí)施例1中。3B9MAb特征在于與人IL4具有抗原結(jié)合特異性，與IL4的Kd小于2.0×10-10M(約1.8×10-10M)。此3B9的Fab片斷與IL4的Kd小于3×10-10M。該抗體的表位不能與線性肽一起在IL4形成圖譜，由此該表位被認(rèn)為非鄰接表位結(jié)合。結(jié)合方式表明結(jié)合位點(diǎn)在B-C環(huán)(殘基60-69)→C螺旋(殘基70-93)區(qū)。這些區(qū)圖譜指定，由Cook等人，J.Mol.Biol，218675-678(1991)，Walter等人，J.Biol.Chem.26720371-20376(1992)，Wlodaver等人，F(xiàn)EBS Lett.，30959-64(1992)，Redfield等人，Biochem.，3011029-11035(1991)，Smith等人，J.Mol.Biol.，224899-904(1992)，Garrett等人(1992)和Powers等人，Biochem.，314334-4346(1992)和Science，2561673-1677(1992)提供，這些在此均作為參考文獻(xiàn)。
另一所需的供體抗體是大鼠MAb 6A1。該MAb的生產(chǎn)描述于下述實(shí)施例7。該抗體的特征為同種型IgG2a，與hIL4的解離常數(shù)小于2.0×10-10M(約1.6×10-10M)。與3B9一樣，該6A1的靶表位不與IL4線性肽成圖，因此此表位被認(rèn)為是非鄰接的、三維的。與IL4突變蛋白質(zhì)的結(jié)合方式和其生物學(xué)活性表明在人IL4D螺旋區(qū)(氨基酸殘基109-127)的結(jié)合基本上圍繞著氨基酸殘基#124的酪氨酸。
本發(fā)明不限于使用3B9 MAb、6A1 MAb或其高變(即CDR)序列。任一其它合適的特征為與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2.0×10-10M的高滴度IL4抗體和相對(duì)應(yīng)的抗-IL4 CDRs在此可代替。無(wú)論在下述說(shuō)明中供體抗體被識(shí)別為3B9或6A1，這種指定用作為說(shuō)明和僅為簡(jiǎn)單描述。
III.抗體片斷本發(fā)明還包括來(lái)自指導(dǎo)抗人IL4的MAbs的Fab片斷或F(ab′)2片斷的應(yīng)用。這些片斷作為有用的試劑在體內(nèi)是保護(hù)性的防止IL4和IgE介導(dǎo)的疾病或在體外作為IL4診斷部分。Fab片斷包含整個(gè)輕鏈和重鏈的氨基末端部分；F(ab′)2片斷是由通過(guò)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片斷形成的MAbs 3B9，6A1和其它類似的高度親合性IL4結(jié)合抗體提供Fab片斷和F(ab′)2片斷的來(lái)源，可通過(guò)常規(guī)方法得到這些片斷，如用適合的蛋白酶，木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶切割MAb或通過(guò)重組的方法獲得。這些Fab和F(ab′)2片斷可用作治療劑、預(yù)防劑或診斷劑。并作為序列供體，包括用于這里所描述的重組或人源化抗體生成的可變區(qū)和CDR序列。
IV.目的抗IL4氨基酸和核苷酸序列上述的MAb 3B9或其它抗體均可提供這些序列，如可變重鏈和/或輕鏈肽序列，構(gòu)架序列，CDR序列，功能片斷和其類似物，以及編碼它們的核酸序列，用于設(shè)計(jì)和獲得各種融合蛋白(包括基因工程抗體)，這些融合蛋白的特征為具有供體抗體的抗原結(jié)合特異性。
作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明由此提供了源自IL4鼠抗體3B9的可變輕鏈和可變重鏈序列及這些序列衍生的序列。3B9重鏈可變區(qū)以SEQ IDNO4的20至140氨基酸殘基為特征。CDR區(qū)為圖2下劃線部分所表明，且由SEQ ID NO22；SEQ ID NO24和SEQ ID NO26提供。3B9的輕鏈克隆可變區(qū)以圖1[SEQ ID NO2]的21至132氨基酸殘基為特征。CDR區(qū)來(lái)自44-58[SEQ ID NO16]；74-80[SEQ ID NO18]和113-121氨基酸殘基[SEQ IDNO20]。
本發(fā)明提供了嵌合重鏈可變區(qū)和信號(hào)核苷酸及氨基酸序列。除信號(hào)序列不同外這些序列與3B9重鏈?zhǔn)窍嗤?。嵌合重鏈信?hào)序列由SEQID NOS5和6提供。CDR區(qū)在圖3中以下劃線表明，且與天然鼠CDRs的氨基酸序列相同[SEQ ID NOS21-26]，嵌合輕鏈可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列與未修飾的3B9序列(SEQ ID NO2的21-132氨基酸殘基)相同，利用了天然鼠信號(hào)序列(SEQ ID NO2的1-20氨基酸殘基)。
人源化重鏈可變區(qū)和信號(hào)序列示于圖4[SEQ ID NO11和12]。信號(hào)序列也可由SEQ ID NO5和6提供。其它適宜的本領(lǐng)域熟知的信號(hào)序列可代替這里所例證的信號(hào)序列。該構(gòu)建物的CDR氨基酸序列與天然鼠和嵌合重鏈CDRs相同，且由SEQ ID NO22(由SEQ IDNO54編碼)，SEQ ID NO24(由SEQ ID NO55編碼)和SEQ ID NO56(由SEQ ID NO26編碼)提供。
一例(合成)人源化輕鏈可變序列示于圖5[SEQ ID NOS13和14]。信號(hào)序列跨越SEQ ID NO8的1-19氨基酸殘基。該圖的CDR序列由下劃線部分所示，信號(hào)氨基酸為SEQ ID NO20不同于天然鼠CDR。因此，人源化輕鏈CDRs由SEQ ID NO53和16，SEQ ID NO17和18和SEQ ID NO27和28提供。區(qū)別之處詳細(xì)描述于實(shí)施例3。
本發(fā)明編碼可變輕鏈和重鏈肽序列的核酸序列或其片斷以未被修飾的形式使用，或是被合成以引導(dǎo)所需的修飾，如限制酶切位點(diǎn)，由MAb 3B9或其它所需的高滴度IL4抗體衍生的被分離出的天然產(chǎn)生或換個(gè)方法合成的核酸序列，可選擇性地含有限制酶切位點(diǎn)，以便于插入或連接一合適的核酸序列，如編碼所需抗體構(gòu)架區(qū)的序列，便于與誘變的CDRs的連接或與編碼所選第二融合配體的核酸序列的融合。
考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，可構(gòu)建各種編碼序列，其編碼本發(fā)明的可變重鏈和輕鏈氨基酸序列，和CDR序列以及其功能片斷和類似物，這些功能片斷和類似物共享有供體抗體的抗原特異性。本發(fā)明分離出編碼可變鏈肽序列或CDRs的核酸序列或其片斷，當(dāng)可操縱地與第二融合配體結(jié)合時(shí)可被用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，嵌合的或人源化抗體，或其它基因工程抗體。
這些序列也可用來(lái)在編碼CDRs或構(gòu)架區(qū)的核酸序列中誘變導(dǎo)入特定的改變，及用來(lái)在表達(dá)質(zhì)粒中插入最終修飾的或融合核酸序列，例如，在構(gòu)架區(qū)和CDR-編碼區(qū)的核苷酸序列的沉默取代被用來(lái)形成限制酶切位點(diǎn)，其便于誘變的CDR(和/或構(gòu)架)區(qū)的插入，這些CDR區(qū)用于本發(fā)明人源化抗體的構(gòu)建。
應(yīng)注意到，除這里所描述的編碼融合蛋白和抗體部分的分離出的核酸序列外，也可使用其它這類核酸序列，如那些天然序列的互補(bǔ)序列。有用的DNA序列包括那些在嚴(yán)格雜交條件[參見(jiàn)T.Maniatis等，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory(1982)，387至389頁(yè)]下與該DNA序列雜交的序列。這種雜交條件的一個(gè)實(shí)例為在65℃ 4×SSC雜交，然后在65℃0.1×SSC中洗滌1小時(shí)。另一例嚴(yán)格的雜交條件是在50％甲酰胺中42℃4×SSC。優(yōu)選這些雜交DNA序列長(zhǎng)度至少為18個(gè)核苷酸，即約為一個(gè)CDR的大小。
V.融合分子和融合蛋白融合分子可編碼融合蛋白，該融合蛋白包括基因工程抗體如嵌合抗體和人源化抗體，所需的融合分子含有CDR序列，其編碼具有IL4抗體抗原特異性的肽，優(yōu)選-高度親合性抗體，如本發(fā)明所提供的插入第一融合配體(人構(gòu)架或人免疫球蛋白可變區(qū))的抗體。
優(yōu)選第一融合配體可操縱地與第二融合配體相連接，在前面定義了第二融合配體，其可包含一個(gè)編碼感興趣的第二抗體區(qū)序列，如Fc區(qū)。第二融合配體也可包含編碼另一免疫球蛋白的序列，其輕鏈或重鏈恒定區(qū)與該免疫球蛋白在構(gòu)架中融合或通過(guò)一連接序列融合。指導(dǎo)作用于IL4功能片斷或類似物的基因工程抗體可以被設(shè)計(jì)引出與相同抗體增強(qiáng)的結(jié)合。
第二融合配體也可與上述的效應(yīng)子聯(lián)合使用，該效應(yīng)子包括非蛋白載體分子，該第二融合配體與效應(yīng)子通過(guò)常規(guī)方法可操縱地進(jìn)行連接。
可通過(guò)任一合適的方式如常規(guī)的共價(jià)鍵或離子鍵、蛋白融合或雜-雙功能交聯(lián)劑如碳二亞胺，戊二醛等在第二融合配體如抗體序列和效應(yīng)子間進(jìn)行融合或連接。這些技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的并且描述于傳統(tǒng)的化學(xué)和生物化學(xué)課本中。
此外，常規(guī)的僅在第二融合配體和效應(yīng)子間提供所需的空間的接頭序列也可被構(gòu)建入融合分子。該接頭的設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域也是所熟知的。
此外，可對(duì)本發(fā)明分子的信號(hào)序列進(jìn)行修飾以增強(qiáng)表達(dá)。例如，具有鼠重鏈序列氨基酸序列的所需融合蛋白，與圖2[SEQ ID NO4]的嵌合可變重鏈(VH)相同，其具有被另一信號(hào)序列(氨基酸殘基1-20)(SEQ ID NO6)取代的起始信號(hào)肽。
一例融合蛋白含有一可變重鏈和/或輕鏈肽或蛋白序列，該序列具有MAb 3B9的抗原特異性，如VH[SEQ ID NO9和10的氨基酸殘基21-141]和VL鏈[SEQ ID NOS1和2的氨基酸殘基21-132]。還有本發(fā)明的另一所需的融合蛋白其特征為氨基酸序列含有鼠抗體分子3B9的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)并優(yōu)選所有的CDRs，3B9保持有來(lái)源于人的序列或其功能片斷或類似物。參見(jiàn)如SEQID NO11和12及SEQ ID NOS13和14(圖4和5)的人源化VH和VL區(qū)。
在另一實(shí)例中，本發(fā)明的基因工程抗體可附帶一種添加劑。例如，重組DNA技術(shù)的步驟可用來(lái)生產(chǎn)一種本發(fā)明基因工程抗體，其中完整抗體分子的Fc片斷或CH3區(qū)被酶或其它可檢測(cè)分子(即多肽效應(yīng)因子或報(bào)道分子)取代。
第二融合配體也可操縱地與非免疫球蛋白肽、蛋白或其片斷連接，這些肽或蛋白或其片段與含有CDR的具有鼠3B9抗原特異性的序列是異源的。表達(dá)時(shí)所得結(jié)果蛋白可呈抗-IL4抗原特異性和非免疫球蛋白的特點(diǎn)。融合配體的特點(diǎn)可以是例如功能特征如另一結(jié)合或受體區(qū)域，或者融合配體本身是治療蛋白時(shí)為治療特征，或者是附帶的抗原特征。
本發(fā)明另一合乎需要的蛋白質(zhì)可包括具有全部長(zhǎng)度重鏈和輕鏈的完整抗體分子或其任意分離的片斷如Fab或F(ab′)2片斷，重鏈二聚體，或其任意最小的重組片斷如Fv或單鏈抗體(SCA)或任意其它與所選供體MAb例如MAb3B9或6A1具有同樣特異性的分子。這種蛋白質(zhì)可以其融合蛋白的形式或其非融合形式使用。
每當(dāng)?shù)诙诤吓潴w由另一抗體產(chǎn)生，該抗體如任一同種型或類的免疫球蛋白構(gòu)架或恒定區(qū)，就會(huì)產(chǎn)生基因工程抗體。工程抗體可包括得自一個(gè)種來(lái)源如受體抗體的免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)和可變構(gòu)架區(qū)及自供體抗體如此處所述的抗IL-4抗體的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選全部)CDRs。此外，為了保持供體抗體抗原結(jié)合特異性，可以進(jìn)行核酸或氨基酸水平的受體MAb輕鏈和/或重鏈可變區(qū)域構(gòu)架區(qū)或供體CDR區(qū)的改變，如缺失、取代或添加。
設(shè)計(jì)這種工程抗體，采用IL4 MAb(根據(jù)所描述的方式可選擇地進(jìn)行修飾)的一種(或兩種)可變重鏈和/或輕鏈，或一個(gè)或多個(gè)下部相同的重鏈或輕鏈CDRs(參見(jiàn)實(shí)施例3)。本發(fā)明的工程抗體是中和的，即它們適當(dāng)?shù)刈钄嗯cIL4蛋白受體的結(jié)合。例如，源于MAb 3B9的工程抗體直接作用于人IL-4特異的三級(jí)蛋白質(zhì)表位，認(rèn)為是在B-C環(huán)→C螺旋區(qū)，正如上所述。
這種工程抗體可包括含有所選人免疫球蛋白或亞型構(gòu)架區(qū)的人源化抗體，或含有與IL4抗體功能片斷融合的人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。適宜的人(或其它動(dòng)物)受體抗體同源于供體抗體核苷酸和氨基酸序列，可選自常規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)，如KABAT數(shù)據(jù)庫(kù)，Los Alamos數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Protein數(shù)據(jù)庫(kù)。以與供體抗體(在氨基酸基礎(chǔ)上)構(gòu)架區(qū)同源為特點(diǎn)的人抗體可適于提供重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變構(gòu)架區(qū)，以插入供體CDRs。能提供輕鏈恒定區(qū)和可變構(gòu)架區(qū)的適宜的受體抗體可以相似的方法選取，應(yīng)注意的是，供體抗體重鏈和輕鏈不必源于同樣的受體抗體。
合乎需要的異源構(gòu)架和恒定區(qū)選自人免疫球蛋白類和同種型，如IgG(亞型1至4)，IgM、IgA和IgE。然而，受體抗體不必僅含有人免疫球蛋白序列。例如可以構(gòu)建一個(gè)基因，其中編碼部分人免疫球蛋白鏈的DNA序列與編碼如多肽效應(yīng)因子或報(bào)道分子這樣的非免疫球蛋白氨基酸序列的DNA序列融合。
一例特別合乎需要的人源化抗體含有3B9的CDRs，其插入在所選人抗體序列的構(gòu)架區(qū)。為中和人源化抗體，一個(gè)、兩個(gè)或優(yōu)選三個(gè)來(lái)自IL4抗體重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDRs被插入在所選人抗體序列的構(gòu)架區(qū)，取代人抗體中天然的CDRs。
優(yōu)選地，在人源化抗體中，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)CDR置換建立人重鏈和輕鏈的可變區(qū)域。可使用全部6個(gè)CDRs或少于6個(gè)CDRs的不同組合。優(yōu)選全部六個(gè)CDRs均被置換，可僅在人重鏈中置換CDRs，使用輕鏈為來(lái)自人受體抗體的未修飾輕鏈。還可選擇地，匹配輕鏈可選自常規(guī)抗體數(shù)據(jù)庫(kù)中的另一人抗體。該工程抗體的剩余部分可來(lái)自任意合適的受體人免疫球蛋白。
由此優(yōu)選工程人源化抗體具有天然人抗體或其片斷的結(jié)構(gòu)，并且具有有效治療如人IL4開(kāi)導(dǎo)的炎癥的)治療或診斷應(yīng)用所需的結(jié)合性質(zhì)。
作為另一實(shí)例，工程抗體可含有3B9可變輕鏈區(qū)[SEQ ID NO16、18、20和28]的三個(gè)CDRs和3B9可變重鏈區(qū)[SEQ ID NO22、24和26]的三個(gè)CDRs。得到的人源化抗體以抗原結(jié)合特異性和MAb 3B9的高度親合性為特征。
基因工程抗體可通過(guò)多樣化區(qū)域氨基酸的變化被進(jìn)一步修飾，而不會(huì)必然地影響特異性和供體抗體(即類似物)高度親合性，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明了的。例如，人源化單克隆抗體已被構(gòu)建，其輕鏈氨基酸殘基在第120位是精氨酸[SEQ ID NO13和14]或蘇氨酸[SEQ ID NOS57和58]我們預(yù)期重鏈和輕鏈氨基酸在多樣化區(qū)域構(gòu)架區(qū)或CDRs或這兩個(gè)區(qū)可被其它氨基酸取代。
此外，可改變恒定區(qū)以增強(qiáng)或減弱本發(fā)明分子的選擇性質(zhì)，例如，二聚作用，與Fc受體結(jié)合，或結(jié)合和活化補(bǔ)體的能力(參見(jiàn)，如Angal等，Mol.Immunnol，30105-108(1993)，Xu等，J.Biol.Chem，2693469-3474(1994)，Winter等，EP307,434-B)。
作為嵌合抗體的融合蛋白不同于上述的人源化抗體，其提供了與兩鏈人免疫球蛋白恒定區(qū)相聯(lián)的包括構(gòu)架區(qū)的整個(gè)非人類供體抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)。我們期望保持附加的與本發(fā)明人源化抗體相關(guān)的非人類序列嵌合抗體可在人體引起明顯的免疫應(yīng)答。
這類抗體可用于預(yù)防和治療IL4介導(dǎo)的變應(yīng)性紊亂，如下所述。
VI.融合蛋白和工程抗體的生產(chǎn)優(yōu)選地，MAb 3B9的可變區(qū)輕鏈和/或重鏈序列及CDRs[SEQ IDNO16、18、20、22、24和26]或其它適合的供體MAbs(如6A1)，及它們的編碼核酸序列均被用于以下述方法構(gòu)建本發(fā)明融合蛋白和工程抗體，優(yōu)選人源化抗體。也可采用相同或相似的技術(shù)完成本發(fā)明的其它實(shí)例。
用常規(guī)手段克隆生產(chǎn)所選供體MAb如鼠抗體3B9的雜交瘤，且以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)獲得其重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA，如描述于Sambrook等，Molecular Cloning(A labortory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中的技術(shù)。以聚核苷酸引物和逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)得到3B9的可變重鏈和輕鏈區(qū)，該區(qū)至少包含為保持供體MAb結(jié)合特異性所需的CDRs和受體MAb輕鏈和/或重鏈可變區(qū)域構(gòu)架區(qū)的那些部分，以及存留的源自人免疫球蛋白的抗體鏈的免疫球蛋白衍生部分。采用已知數(shù)據(jù)庫(kù)和通過(guò)與其它抗體比較來(lái)鑒別CDRs。
然后可制備鼠/人嵌合抗體，并分析其結(jié)合能力。這種嵌合抗體含有整個(gè)非人供體抗體VH和VL區(qū)，與兩鏈中人Ig恒定區(qū)相聯(lián)。
利用計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)庫(kù)如KABAT鑒別來(lái)自人抗體的重鏈可變區(qū)的同源構(gòu)架區(qū)，選擇與3B9同源的人抗體為受體抗體，在人抗體構(gòu)架內(nèi)含有3B9 CDRs的合成的重鏈可變區(qū)序列用可選擇的核苷酸在構(gòu)架區(qū)中取代以結(jié)合限制酶切位點(diǎn)。然后通過(guò)重疊寡核苷酸合成所設(shè)計(jì)的序列，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，并改正錯(cuò)誤之處。
以相似的方式設(shè)計(jì)合適的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)。
人源化抗體可由嵌合抗體衍生，或優(yōu)選地通過(guò)在所選重鏈和輕鏈構(gòu)架中適當(dāng)?shù)夭迦雭?lái)自重鏈和輕鏈的供體MAb CDRs來(lái)合成制備人源化抗體。可選擇地，可使用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)制備本發(fā)明的人源化抗體。因此，結(jié)果得到的人源化抗體含有人構(gòu)架區(qū)和供體MAb CDRs。可隨后對(duì)構(gòu)架殘基進(jìn)行操作。所得到的人源化抗體能在如COS或CHO細(xì)胞這樣的重組宿主細(xì)胞中表達(dá)。該方法的另外的細(xì)節(jié)描述于實(shí)施例4中。將此技術(shù)用于其它合適的IL-4特異的中和的高滴度的非人類抗體，可制備其它人源化抗體。
通過(guò)設(shè)置可操縱地與常規(guī)調(diào)控序列相連的融合蛋白的編碼序列來(lái)生產(chǎn)傳統(tǒng)的表達(dá)載體或重組質(zhì)粒，該調(diào)控序列能在宿主細(xì)胞中控制復(fù)制和表達(dá)和/或從宿主細(xì)胞分泌。調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列如CMV啟動(dòng)子和信號(hào)序列，其可由其它已知抗體衍生而得。相似地，生產(chǎn)出第二種表達(dá)載體具有編碼互補(bǔ)抗體輕鏈或重鏈的DNA序列。優(yōu)選此第二表達(dá)載體與第一載體相同，除了考慮編碼序列和可選擇的標(biāo)記，以保證盡可能地每一多肽鏈被功能地表達(dá)出。
通過(guò)常規(guī)技術(shù)以第一和第二載體共同轉(zhuǎn)染所選擇的宿主細(xì)胞或以單一載體簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)染所選擇的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生本發(fā)明含有兩種重組的或合成的輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。然后以常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的工程抗體。用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄稳鏓LISA或RIA從培養(yǎng)物中篩選出此人源化抗體，其包含相聯(lián)的重組重鏈和/或輕鏈兩者?？刹捎孟嗨频某Ｒ?guī)技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的其它融合蛋白和分子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的載體用于克隆和亞克隆步驟，這些步驟是在本發(fā)明方法中和組合物構(gòu)建中所采用的。例如，可采用常規(guī)的pUC系列克隆載體，所用的一個(gè)載體是pUC19，可從供應(yīng)商店購(gòu)買，如Amersham(Buckinghamshire，英國(guó))或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。此外，任意一個(gè)能迅速?gòu)?fù)制，具有豐富的克隆位點(diǎn)和標(biāo)記基因及容易進(jìn)行操作的載體都可用于克隆。因此，克隆載體的選擇不是本發(fā)明限制因素。
相似地，用于表達(dá)本發(fā)明基因工程抗體的載體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員從任一常規(guī)載體中選擇，該載體也含有所選的調(diào)節(jié)序列，其操縱地伴隨免疫球蛋白區(qū)的DNA編碼序列的產(chǎn)生，且能在所選宿主細(xì)胞如CMV啟動(dòng)子中指導(dǎo)異源DNA序列的復(fù)制和表達(dá)。這些載體含有上述編碼基因工程抗體或融合分子的DNA序列?？蛇x擇地，載體可結(jié)合所選的免疫球蛋白序列，該序列通過(guò)插入有合乎需要的便于操作的限制酶切位點(diǎn)而被修飾。
表達(dá)載體也可以標(biāo)記基因?yàn)樘卣?，該?biāo)記基因適于異源DNA序列如哺乳動(dòng)物二氫葉酸還原酶基因(DHFR)或新霉素抗性基因(neoR)的擴(kuò)增表達(dá)。其它優(yōu)選的載體序列包括poly A信號(hào)序列，如來(lái)自牛生長(zhǎng)激素(BGH)和β珠蛋白啟動(dòng)序列(betaglopro)。此處所用的表達(dá)載體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)合成。
這些載體的成份，如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、信號(hào)序列等等可從天然來(lái)源或合成方法以所知技術(shù)而獲得，以用于指導(dǎo)重組DNA產(chǎn)品在所選宿主中的表達(dá)和/或分泌。也可根據(jù)此目的選擇其它適合的各種類型本領(lǐng)域所熟知的用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲(chóng)、酵母和真菌表達(dá)的表達(dá)載體。
本發(fā)明還包括以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，該質(zhì)粒含有工程抗體或融合分子的編碼序列。用于這些克隆載體的克隆和其它操作的宿主細(xì)胞也是常規(guī)的。然而，最合乎需要的是來(lái)自E.coli不同株的細(xì)胞被用于克隆載體的復(fù)制和構(gòu)建本發(fā)明融合蛋白的其它步驟。
表達(dá)本發(fā)明工程抗體或融合蛋白的適宜的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系優(yōu)選真核細(xì)胞，如CHO，COS，成纖維細(xì)胞(如3T3)和其它細(xì)胞中的骨髓細(xì)胞，最為優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞或骨髓細(xì)胞?？墒褂萌说募?xì)胞，由此能使分子以人糖基化模式被修飾?？蛇x擇地，可采用其它真核細(xì)胞。對(duì)合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇，轉(zhuǎn)化方法、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)品生產(chǎn)及純化均為本領(lǐng)域已知技術(shù)。參見(jiàn)如上述引用的Sambrook等。
細(xì)菌細(xì)胞證明可用作適于本發(fā)明重組MAbs的表達(dá)的宿主細(xì)胞。然而，由于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白傾向于呈未折疊形式或不恰當(dāng)折疊形式或未被糖基化形式，所以任一產(chǎn)生于細(xì)菌細(xì)胞中的重組MAb必須根據(jù)保留的抗原結(jié)合能力進(jìn)行篩選，如果由細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的分子以合適的折疊形式生產(chǎn)，則該細(xì)菌細(xì)胞是合乎需要的宿主。例如，用于表達(dá)的E.coli的各種株是生物技術(shù)領(lǐng)域熟知的宿主細(xì)胞?？莶菅挎邨U菌(B.Subtilis)、鏈霉菌(Streptomyces)的各種株、其它桿菌等也均可在此方法中采用。
當(dāng)需要時(shí)，本領(lǐng)域熟知的酵母細(xì)胞的株以及昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅屬(Drosophila)和鱗翹目(Lepidoptera)及病毒表達(dá)系統(tǒng)也可用作宿主細(xì)胞。參見(jiàn)如Miller等，Genetic Engineering，8277-298，Plenum Press(1986)及其所引用的參考文獻(xiàn)。
構(gòu)建本發(fā)明載體的一般方法，生產(chǎn)本發(fā)明宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)染方法以及從該宿主細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明融合蛋白或工程抗體所必需的培養(yǎng)方法均為常規(guī)技術(shù)。同樣地，一旦進(jìn)行生產(chǎn)，本發(fā)明的融合蛋白或工程抗體可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化，包括硫酸銨沉淀、親合柱、柱層析、凝膠電泳等等。這些技術(shù)均為本技術(shù)領(lǐng)域熟知技術(shù)且不限制本發(fā)明。
表達(dá)人源化抗體的另一方法是利用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)，如描述于U.S.專利4,873,316。這涉及利用動(dòng)物酪蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)酪蛋白啟動(dòng)子被轉(zhuǎn)基因摻入哺乳動(dòng)物中時(shí)使雌性動(dòng)物在奶中產(chǎn)生所需的重組蛋白。
當(dāng)用所需的方法進(jìn)行表達(dá)后，便使用合適的分析方法檢測(cè)工程抗體的體外活性?，F(xiàn)在采用常規(guī)的ELISA分析形式來(lái)評(píng)估工程抗體與IL4表位的定性和定量結(jié)合。此外，其它體外分析，如BIAcore[Pharmacia]也可在隨后的人臨床研究前驗(yàn)證中和效能，所進(jìn)行的人臨床研究以評(píng)估體內(nèi)的工程抗體的存在，不管通常的清除機(jī)理。
根據(jù)源自3B9的人源化抗體描述步驟，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可從這里描述的其它供體IL4抗體，可變區(qū)序列和CDR肽構(gòu)建人源化抗體。用被工程抗體的受體默認(rèn)為“自身”的可變區(qū)構(gòu)架可生產(chǎn)工程抗體。對(duì)可變區(qū)構(gòu)架能進(jìn)行小的修飾，以大大提高抗原結(jié)合性，而不會(huì)明顯增強(qiáng)受體的免疫原性。這種工程抗體能有效地治療人IL4介導(dǎo)的疾病。這種抗體也用于診斷這類疾病。
VII.治療/預(yù)防應(yīng)用本發(fā)明也涉及一種治療人變應(yīng)性紊亂的方法，其包含給與有效劑量的抗體，抗體包括這里所描述的一種或多種工程抗體或融合蛋白或其片斷。
由本發(fā)明分子誘導(dǎo)的治療應(yīng)答是通過(guò)與人IL4結(jié)合并由此隨后阻斷IgE的釋放而產(chǎn)生。因此，本發(fā)明分子當(dāng)用在適于治療用途的制劑和配方中時(shí)，對(duì)那些經(jīng)受變應(yīng)性反應(yīng)如變應(yīng)性鼻炎、結(jié)膜炎、特應(yīng)性皮炎、異位性哮喘和過(guò)敏性休克的人來(lái)說(shuō)是非常合乎需要的。
本發(fā)明的融合蛋白、抗體、工程抗體或其片斷也可與其它抗體結(jié)合使用，特別是能與疾病其它相關(guān)標(biāo)記(表位)反應(yīng)的人MAbs，這里本發(fā)明的工程抗體是治療該疾病的。類似地，能與所選動(dòng)物疾病相關(guān)表位反應(yīng)的MAbs也可用于獸藥組合物中，這里本發(fā)明的工程抗體是治療該疾病的。
本發(fā)明治療劑在治療變應(yīng)性疾病約2天至約3周或所需要的時(shí)間中被認(rèn)為是令人滿意的。例如，當(dāng)治療季節(jié)性鼻炎或類似的疾病時(shí)較長(zhǎng)時(shí)間的治療可滿足需要。這表明比當(dāng)前所使用的現(xiàn)有技術(shù)治療IL4介導(dǎo)紊亂的注射方法相比具有顯著的進(jìn)步。劑量和治療持續(xù)時(shí)間與本發(fā)明分子在人體循環(huán)中相對(duì)的持續(xù)時(shí)間有關(guān)，其能由本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)所治療的疾病和病人平時(shí)的健康狀況進(jìn)行調(diào)整。
本發(fā)明治療劑的給藥方式可以是給宿主遞送藥劑的任意合適途徑。本發(fā)明的融合蛋白、抗體、工程抗體、其片斷和藥物組合物特別用于非腸道形式給藥、即皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)方式。
本發(fā)明的治療劑可制備成藥物組合物，其含有本發(fā)明有效量的工程(如人源化)抗體，該抗體作為藥物上可接受載體中的活性成份。本發(fā)明的預(yù)防劑，優(yōu)選呈即時(shí)注射形式的含工程抗體的水懸浮液或溶液，特別是緩沖至生理pH的溶液。非腸道給藥的組合物通常包括一種本發(fā)明工程抗體的溶液或一種其溶解于藥物上可接受載體特別是水溶液載體的混合液?？刹捎酶鞣N水溶液載體，如0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等等。這些溶液是無(wú)菌的且通常不含特別物質(zhì)。這些溶液可用常規(guī)的熟知的滅菌技術(shù)(如過(guò)濾)進(jìn)行滅菌。為了按近生理?xiàng)l件如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑等的要求，組合物可包含藥物上可接受的輔助物質(zhì)。這種藥物制劑中本發(fā)明抗體的濃度根據(jù)所選擇的特定的給藥方式變化范圍很寬，即從低于0.5％，通常為或至少為大約1％至多至15或20％(重量百分比)，并且主要根據(jù)液體體積、粘度等進(jìn)行選擇。
因此，可制備用于肌內(nèi)注射的本發(fā)明藥物組合物，其含1mL無(wú)菌緩沖水和約1ng至約100mg間的如約50ng至約30mg或更為優(yōu)選地約5mg至約25mg的本發(fā)明工程抗體。相類似地，可制備用于靜脈內(nèi)輸注的本發(fā)明藥物組合物，其含約250ml的無(wú)菌林格溶液(Ringer′sSolution)和約1至30優(yōu)選5mg至約25mg的本發(fā)明工程抗體。制備可用非腸道形式給藥的組合物的實(shí)際方法是熟知的或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，且更詳細(xì)描述于如Remington′sPharmaceutical Science，15th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania。
優(yōu)選本發(fā)明治療劑當(dāng)用為藥物制劑時(shí)以單位劑量形式存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很易確定適當(dāng)?shù)闹委熡行┝?。為有效治療人體或其它動(dòng)物的炎癥疾病，應(yīng)以非腸道方式優(yōu)選肌內(nèi)方式(intramuscularly)給藥一劑本發(fā)明蛋白或抗體，一劑量為每70kg體重近0.1mg至近20mg。如果必要的話，可在炎癥反應(yīng)期間醫(yī)生所選擇的適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔重復(fù)該劑量。
本發(fā)明也包括將本發(fā)明IL4融合蛋白與其它抗體或融合蛋白一同給藥或連續(xù)給藥，這些其它抗體和融合蛋白的特征為具有抗-IL4活性，如抗腫瘤壞死因子活性或其它與本發(fā)明融合蛋白的IL4受體結(jié)合活性相容的藥物活性。這些抗體可購(gòu)買得到或用此處描述的相似方法設(shè)計(jì)。
本發(fā)明融合蛋白和工程抗體也可用于診斷治療方案，如確定IL4介導(dǎo)的疾病或跟蹤這種疾病的治療進(jìn)程。作為診斷試劑，這些融合蛋白可以常規(guī)方式標(biāo)記用于ELISA′s和其它常規(guī)分析形式，用于測(cè)量血清中，血漿中或其它合適組織中的IL4水平。使用融合蛋白的分析，其性質(zhì)是常規(guī)的，且不限制本公開(kāi)內(nèi)容。
這里所描述的抗體、工程抗體或其片斷可被冷凍干燥用于貯存且在使用之前以適當(dāng)?shù)妮d體重新配制。已證明這一技術(shù)對(duì)常用的免疫球蛋白是有效的，并且已知的冷凍干燥和重配制技術(shù)可被采用。
下述實(shí)施例描述本發(fā)明的各個(gè)方面，包括例證的工程抗體的構(gòu)建，其在合適的載體和宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這些實(shí)例并不構(gòu)成本發(fā)明的限制范圍。所有的氨基酸以常規(guī)的三字母或單字母表示。所有必需的限制酶、質(zhì)粒、其它試劑和材料除非另有說(shuō)明，均是通過(guò)購(gòu)買得到，所有通常的克隆連接和其它重組DNA技術(shù)見(jiàn)上面引用的T.Maniatis等，或其第二版(1989)，由Sambrook等編，同樣出版商(Sambrook等)出版。實(shí)施例1-MAb 3B9的生產(chǎn)A.免疫方法以弗氏完全佐劑中50μg重組大腸桿菌(E.coli)人IL4皮下免疫4只鼠(Balb/c和c57BL/6雜交的F1)，4周后以弗氏不完全佐劑中的50μg IL4腹膜內(nèi)(i.p.)增強(qiáng)免疫。在對(duì)IL4具良好的血清抗體滴度的基礎(chǔ)上，一只鼠在8周時(shí)以200μg IL4(i.p.鹽水中)，兩天后100μg IL4(i.p.鹽水中)及兩天后以50μg IL4(i.p.鹽水中)進(jìn)一步進(jìn)行免疫。最終免疫后兩天進(jìn)行脾切除術(shù)。
B.融合方法和篩選系統(tǒng)鼠脾細(xì)胞用于制備雜交瘤(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，如描述于Kohler等，Nature，256495(1975)，采用可購(gòu)買的BIAcore系統(tǒng)及下述的ELISA分析從該雜交瘤中篩選多于250個(gè)細(xì)胞克隆，其分泌對(duì)于IL4的抗體以與IL4結(jié)合。5個(gè)小孔得出陽(yáng)性反應(yīng)。只有1個(gè)來(lái)自鼠3B9的克隆呈強(qiáng)烈的陽(yáng)性。所有源于3B9的二次克隆均呈陽(yáng)性。實(shí)施例2-ELISA分析和親和常數(shù)A.ELISA設(shè)計(jì)下述的篩選分析以測(cè)定與天然人IL4的親合性。實(shí)驗(yàn)1用1μg/ml，100μl/孔，0.1M硼酸緩沖液中pH8.5的IL4涂布醛活化的96-孔板，并在RT保溫過(guò)夜。hIL4共價(jià)附著在板上。抽吸IL4溶液，并以含1％的牛血清白蛋白(BSA)的TBS緩沖液(50mM Tris，150mM NaCl，1mM MgCl2，0.02NaN3，pH7.4)37℃下阻斷非特異性結(jié)合(NSB)位點(diǎn)60分鐘。這步以及下面的每一步之后，將板在洗滌緩沖液(10mM Tris，150mM NaCl，0.05％Tween20，0.02％NaN3，pH7.4)中洗滌4次。之后，加入50μl雜交瘤培養(yǎng)基(或純化的3B9或Fab片斷)和50μl分析緩沖液(TBS緩沖液中的0.5％牛γ球蛋白)。平板在37℃保溫60分鐘。向每孔分析緩沖液中加入100μl生物素化的抗鼠抗體并如上述方法保溫。向每孔加入100μl與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的堿性磷酸酶并保溫(30分鐘，37℃)。每孔加入100μL PNP底物并于37℃保溫30分鐘。在光密度405nm處讀數(shù)。
實(shí)驗(yàn)2，鏈霉抗生物素蛋白涂布的板(100μL/孔，磷酸緩沖鹽水(PBS)中1μg/ml)于4℃保溫過(guò)夜并根據(jù)下述方法分析。抽吸鏈霉抗生物素蛋白溶液，以含1％BSA的TBS緩沖液阻斷NSB位點(diǎn)(60分鐘37℃)。這一步及下面每步之后，將板在洗滌緩沖液中洗4次。將50μl生物素化的IL4與50μl分析緩沖液一起加入并于37℃保溫30分鐘。之后，加入50μl純化的3B9 IgG或Fab片斷(或雜交瘤培養(yǎng)基)和50μl分析緩沖液，37℃保溫60分鐘。加入100μl抗鼠IgG堿性磷酸酶結(jié)合物并于37℃保溫60分鐘。加入100μl PNP底物并于37℃保溫30分鐘，如上述方法讀取數(shù)據(jù)。
B.計(jì)算3B9與IL4親合力利用上述實(shí)驗(yàn)和下面的簡(jiǎn)化結(jié)果，按Beatty等，J.Immunol.Methods，100173-179(1987)描述的方法計(jì)算3B9的KdKaff=12(2[Ab*]-[Ab])]]>Ab*＝結(jié)合于150ng/ml生物素化hIL4上的Ab的濃度Ab＝結(jié)合于300ng/ml生物素化hIL4上的Ab的濃度根據(jù)關(guān)系Kd=1Kaff]]>計(jì)算解離常數(shù)Kd。
實(shí)驗(yàn)1在鏈霉抗生物素蛋白涂布的96孔板(100ng/孔)上的ELISA分析。Kd＝2.2×10-10M(3B9 Fab)實(shí)驗(yàn)2在鏈霉抗生物素蛋白涂布的96孔板(100ng/孔)上的ELISA分析。Kd＝1.4×10-10M(3B9 IgG)C.特異性MAb 3B9識(shí)別人IL4，但不識(shí)別?；蚴驣L4，一種確定這一點(diǎn)的方法描述如下。進(jìn)行ELISA時(shí)使用-抗鼠IgG涂布的96孔板，隨后用牛血清白蛋白阻斷，板上50μl 3B9(100ng/ml)，25μL非人類IL4和25μL生物素-IL4被保溫于37℃60分鐘，隨后進(jìn)行洗滌，加入鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的堿性磷酸酶和PNP。
類似地發(fā)現(xiàn)MAb 6A1不能識(shí)別牛或鼠IL4。實(shí)施例3-人源化抗體設(shè)計(jì)人源化抗體，在一人抗體構(gòu)架中含有鼠CDRs。通過(guò)下列操作進(jìn)行IL4特異的鼠抗體3B9的人源化轉(zhuǎn)變A.cDNA克隆cDNA克隆是利用Boehrihger Mannbeim試劑盒從提取于3B9雜交瘤細(xì)胞系[實(shí)施例1]的mRNA得到的3B9重鏈和輕鏈制備的。對(duì)鼠樞紐區(qū)或Kappa恒定區(qū)特異的引物用于第一鏈的合成。Kappa鏈引物是[SEQ ID NO29]5′-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3′γ重鏈引物是[SEQ ID NO30]5′GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC3′.
雙鏈cDNA被直接克隆入質(zhì)粒pGEM7f+[Promega]，然后其被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli DH5-α[Bethesda Research Labs]。
B.DNA排序從上述A部分得到的8條重鏈和一條輕鏈?zhǔn)骳DNA克隆被排序。這些克隆可變區(qū)的排序結(jié)果示于SEQ ID NO1和2和3和4。每一克隆含有已知為保持在鼠重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的氨基酸和鼠信號(hào)序列。CDR氨基酸序列如下。
CDR區(qū)重鏈為SEQ ID NO22、24和26，(SEQ ID NO4的氨基酸50-56、71-86和119-129)。見(jiàn)圖2。這些序列分別由SEQ ID NO21、SEQ ID NO23和SEQ ID NO25編碼。CDR區(qū)輕鏈為SEQ ID NO16、18和20(SEQ ID NO2的氨基酸45-58、74-80和113-121)。見(jiàn)圖1。這些序列分別由SEQ ID NO15、17和19編碼。
C.人構(gòu)架的選擇3B9克隆之后，利用KABAT和SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)將不同區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO2的氨基酸21至132和SEQ ID NO4的氨基酸20至140)與人免疫球蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)比，以鑒定重鏈和輕鏈兩者的人構(gòu)架，其在序列同源性上非常匹配于鼠母鏈。除這些序列同源性探查之外，還評(píng)估重鏈和輕鏈對(duì)位置數(shù)據(jù)庫(kù)的作用，此數(shù)據(jù)庫(kù)由Fab區(qū)域的結(jié)構(gòu)模型產(chǎn)生，以估算由于氨基酸取代造成的潛在沖突，這種氨基酸取代可能會(huì)影響CDR的存在?，F(xiàn)情況下沒(méi)有在結(jié)構(gòu)探查中檢測(cè)出明顯的沖突；因此，使用由氨基酸序列同源性探查推斷出的DNA編碼。
使用由人骨髓瘤免疫球蛋白(COR)獲得的抗體的重鏈構(gòu)架區(qū)[E.M.Press和N.M.Hogg，Biochem.J.117641-660(1970)]。發(fā)現(xiàn)該序列在氨基酸水平上與3B9可變區(qū)具有約77％的同源性(69.4％等同性)。
對(duì)合適的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)，使用H.G.Klobeck等，Nucl.AcidsRes.，136515-6529(1985)中鑒定的人抗體的輕鏈可變構(gòu)架序列。發(fā)現(xiàn)人抗體序列在氨基酸水平與鼠3B9可變輕鏈區(qū)有近80.2％是同源的(72.0％等同)。
給出鼠3B9 CDRs[SEQ ID NO15-26]和人抗體序列，來(lái)制備合成的重鏈及PCR操作以填充和擴(kuò)增DNA，由下面重疊的寡核苷酸合成這些序列并以PCR擴(kuò)增。SEQ ID NO31-37提供5個(gè)重疊寡核苷酸(oligos)和2個(gè)PCR引物。發(fā)現(xiàn)寡核苷酸1[SEQ ID NO31]跨越堿基5-121。發(fā)現(xiàn)寡核苷酸2[SEQ ID NO32]跨越堿基122-241，寡核苷酸3[SEQ ID NO33]跨越堿基242-361。兩條底鏈引物SEQ ID NO34和SEQ ID NO35跨越堿基134-110和堿基253-230。在作出圖譜序列中的任意由PCR插入的錯(cuò)誤均被改正。使用作為5′引物的核苷酸1-25 SEQ ID NO36和作為3′引物的核苷酸361-341 SEQ ID NO37再次進(jìn)行PCR。
合成的可變區(qū)與來(lái)自嵌合重鏈構(gòu)建物的合成信號(hào)序列SEQ IDNO5和6和IgG1人恒定區(qū)一起被連接入表達(dá)載體pCD。合成VH和信號(hào)序列核苷酸及氨基酸序列由圖4提供[SEQ ID NOS11和12]。CDRs的氨基酸序列[SEQ ID NOS22、24和26]與鼠3B9 CDRs相同。然而，這些CDRs的編碼序列[SEQ ID NOS54、55和56]不同于鼠3B9編碼序列[SEQ ID NOS21、23和25]。得到的表達(dá)載體IL4hzhc-1-Pcd示于圖9。
先前存在的輕鏈構(gòu)架的CDR基因區(qū)被限制消化除去，并以下面的合成IL-4CDR基因取代，其是以合成法制得。
對(duì)于CDR1SEQ ID NO385′CTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGG 3′SEQ ID NO39CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGACACAGSEQ ID NO40TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAACCCSEQ ID NO41GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATAATCAACACTTTGGGAGGCCTC對(duì)于CDR2SEQ ID NO44GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGGTACSEQ ID NO45CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGGAGGCTGCCC對(duì)于CDR3SEQ ID NO42ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGGCGGAGGGACSEQ ID NO43CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTGCTGACAGTAGT
合成的VL和信號(hào)序列核苷酸及氨基酸序列由圖5提供[SEQ IDNOS13和14]。首先的兩個(gè)CDRs氨基酸序列[SEQ ID NOS16和18]與相應(yīng)的鼠3B9 CDRs相同。然而第一CDR的編碼序列[SEQ IDNO53]不同于鼠3B9編碼序列[SEQ ID NO15]。進(jìn)一步地，在最后的CDR中，構(gòu)建了兩個(gè)3B9氨基酸序列的人源化構(gòu)建物。一個(gè)[SEQ ID NO28]由于一個(gè)氨基酸不同[SEQ ID NO20]而不同于天然鼠3B9序列。SEQ ID NO28由SEO ID NO27編碼。合成的可變輕鏈區(qū)與信號(hào)序列[SEQ ID NOS7和8]一起連接入表達(dá)載體中。所得的表達(dá)載體之一IL4hzlcl-0-Pcn描繪于圖10。
在構(gòu)建人源化抗體中使用這些合成的可變輕鏈和/或重鏈序列。實(shí)施例4-人源化MAb在COS和CHO細(xì)胞中的表達(dá)制備VH的pUC18亞克隆以增加一個(gè)最初得自人抗體的信號(hào)序列SEQ ID NO5。對(duì)于VL，制備pUC18的亞克隆以增加一個(gè)信號(hào)序列SEQ ID NO7。
源自IgG1同種型的人源化重鏈，在氨基酸水平上與來(lái)自3B9的鼠重鏈呈89.3％的同源性(84.3％等同性)。這一合成的VH為SEQ IDNOS11和12的氨基酸20-141。
人源化輕鏈，人Kappa鏈在氨基酸水平上與3B9顯示出92.0％的同源性(86.6％的等同性)。設(shè)計(jì)這一含389 CDRs的合成VL[SEQ IDNOS13和14的氨基酸21至131]并根據(jù)上述合成重鏈的方法合成。
含有其各自的與人重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)相連的信號(hào)DNA片斷以常規(guī)方法[上述Maniatis等]被插入pUC-19為基礎(chǔ)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒中，該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子和下面實(shí)施例5生產(chǎn)的嵌合體的人重鏈或人輕鏈恒定區(qū)，生產(chǎn)出質(zhì)粒IL4hzlcl-1-Pcd(重鏈)[圖9]和IL4hzlcl-0-Pcn(輕鏈)[圖10]。HZHC和HZLC質(zhì)粒被共轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞，三和五天后以上述的ELISA分析上清液中人源化抗體的存在。以IgG4同種型構(gòu)建另一個(gè)人源化抗體。
上面的實(shí)施例描述了一例工程抗體的制備。使用常規(guī)方法所開(kāi)發(fā)的其它抗-IL4抗體(如6A1-實(shí)施例7)采取相似的步驟生產(chǎn)其它工程抗體。實(shí)旋例5-嵌合抗體的構(gòu)建A.從原始鼠MAb 3B9中分離作為EcoRI-BstEII限制片斷的鼠可變重鏈區(qū)來(lái)構(gòu)建嵌合重鏈。設(shè)計(jì)一小段DNA寡聚體，并合成以連接鼠可變區(qū)與人IgG1恒定區(qū)(BstEII-ApaI)5′引物SEQ ID NO50GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC3′引物SEQ ID NO51CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG這兩個(gè)片斷被連接入已編碼人IgG1恒定區(qū)的質(zhì)粒pCD(見(jiàn)圖7)(以EcoRI和ApaI消化)。這一克隆不表達(dá)，因此自然存在5′UTR和信號(hào)序列缺失并以SEQ ID NO5和6取代。
因?yàn)樵谛盘?hào)序列的3′末端不能獲得常規(guī)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，所以通過(guò)PCR引入BstEII位點(diǎn)(即沉默誘變)。使用下面的PCR引物SEQ ID NO485′引物5′CAGGTTACCCTGAAAGAGTC3′SEQ ID NO493′引物5′GAAGTAGTCCTTGACCAG3′然后從該質(zhì)粒中分離出BstEII-PstI限制性片斷。之后設(shè)計(jì)新的信號(hào)序列和5′UTR并合成使具有EcoRI和BstEII末端。SEQ ID NO465′引物AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAGSEQ ID NO473′引物GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAGAAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCG
應(yīng)用PCR技術(shù)，嵌合輕鏈被構(gòu)建到被克隆入pGEM72f(+)[Promega]的起始鼠3B9輕鏈上構(gòu)建。使用的引物是可購(gòu)買到的pUC18通用的在5′末端(EcoRI)反向引物和引入一個(gè)NarI位點(diǎn)的3′引物[5′CATCTAGATGGCG CCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3′SEQ ID NO52]，這些引物用來(lái)將鼠可變區(qū)融合入人恒定區(qū)。然后該可變區(qū)被連接入包含人Kappa區(qū)的表達(dá)載體pCDN(EcoRI NarI)(圖8)中。
三天和五天后收集培養(yǎng)基上清液并用下述的ELISA分析用0.1μg與人抗體Fc區(qū)特異的羊抗體涂布ELISA板，加入基質(zhì)上清液時(shí)間為1小時(shí)。加入與整個(gè)人IgG抗體特異的羊抗體結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶，然后加入ABTS過(guò)氧化物酶底物(Kirkegaard & Perry LaboratoriesInc.，Gaithersburg，MD)1小時(shí)。檢測(cè)嵌合抗體的表達(dá)。在另一ELISA中含有嵌合抗體的COS細(xì)胞上清液與重組人IL4蛋白特異地結(jié)合，這一結(jié)果確證了編碼特異于IL4的抗體的基因已被克隆。
B.也可從這一嵌合重鏈獲得人源化重鏈。在人構(gòu)架中插入鼠CDRs設(shè)計(jì)人源化重鏈。所選的人構(gòu)架如上所述，其是Swiss Protein數(shù)據(jù)庫(kù)中與鼠3B9 VH(SEQ ID NO4氨基酸20-140)最同源的蛋白序列，合成制備該人源化重鏈序列(EcoRI ApaI)并進(jìn)行PCR操作以填充和擴(kuò)增上述DNA。合成的可變區(qū)與來(lái)自嵌合重鏈構(gòu)建物的合成信號(hào)序列SEQ ID NOS5和6及IgG1人恒定區(qū)一起連接入表達(dá)載體pCD(EcoRI ApaI)。
相類似地，根據(jù)制備重鏈所述的方法，人源化輕鏈可自嵌合的輕鏈制備。基因(EcoRV NarI)也是合成制備的。人源化VL與信號(hào)序列(EcoRI EcoRV)一起連接入由EcoRI NarI消化的表達(dá)載體pCN。表達(dá)載體提供了人Kappa恒定區(qū)。實(shí)施例6-人源化MAb-純化和熱力學(xué)通過(guò)常規(guī)的蛋白質(zhì)A(或G)親和層析及隨后離子交換和分子篩層析可純化CHO表達(dá)的嵌合和人源化3B9。相類似的方法已成功地用于其它MAbs的純化，純度大于95％(如與呼吸性合胞體病毒和瘧環(huán)子孢子抗原)。
通過(guò)滴定微量熱法測(cè)定IL4與人源化MAb 3B9和鼠3B9(實(shí)施例1)結(jié)合的親和性和詳細(xì)的熱力學(xué)，該方法利用其反應(yīng)的內(nèi)熱測(cè)定結(jié)合反應(yīng)(參見(jiàn)如Wiseman等，Aanl.Biochem.179131-137(1989))。發(fā)現(xiàn)這兩種MAbs的親和力太大以致于在環(huán)境溫度下不能直接測(cè)量。因此采用的熱力學(xué)途徑為i)在60℃測(cè)量親和力，這時(shí)親和力很弱足以直接測(cè)量；ii)從30°-60℃測(cè)量結(jié)合焓的溫度依賴性。利用Gibbs-Helmholz方程將這些數(shù)據(jù)一起計(jì)算廣范圍溫度下的親和力。
人源化和鼠3B9抗體的IL4結(jié)合熱力學(xué)總結(jié)于表1?；趦煞NMAbs的自由能，焓、熵和熱容的變化，結(jié)合熱力學(xué)是不易覺(jué)查的。
表1在pH7.4，150mMNaCl，和25℃下hIL-4與人源化3B9和鼠3B9的結(jié)合熱力學(xué)MAb KdΔG ΔH -TΔS ΔC微微摩爾 kcal/kcal/kcal/ cal/molmol IL4 mol IL4 mol IL4 IL4/°K人源化3B9 11 -13.6±0.6 -21.8±2 8.2±2.1 -580±160鼠3B9 19 -13.3±0.6 -20.5±1 7.2±1.2 -660±200
分別測(cè)定人源化3B9和鼠3B9的IL-4親合力，使成四倍和兩倍值測(cè)。實(shí)施例7-大鼠MAb的生產(chǎn)和特征用實(shí)施例1中描述的免疫鼠的同樣的免疫過(guò)程免疫大鼠，所選擇的高度親和性MAb 6A1由一只已免疫大鼠得到。6A1選自雜交瘤，該雜交瘤從人IL4免疫的大鼠制備(特別是雜交瘤3426A11C1B9)。
根據(jù)Beatty等，J.Immunol，Methods，100173-179(1987)描述的方法計(jì)算6A1的Kd為2×10-10M。
根據(jù)European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)，雜交瘤3426A11C1B9于1993年10月6日保藏于PublicHealth Laboratory Service Centre for AppliedMicrobiology & Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，United Kingdom，保藏號(hào)93100620，且根據(jù)用于專利程序目的的微生物保藏的1977年布達(dá)佩斯條約，該雜交瘤已作為專利保藏而被接受。實(shí)施例8-MAbs 3B9(人源化)，3B9(鼠)和6A1的生物活性用下述方法進(jìn)行隨后的分析。
A.與糖基化的rhIL4結(jié)合將上面確認(rèn)的抗體與產(chǎn)生于E.coli的非糖基化重組人IL4(rhIL4)一起放置。因?yàn)樘烊蝗薎L4是糖基化的，所以確證與哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)分泌的材料間的結(jié)合是很重要的。3B9與糖基化和非糖基化的人重組IL4的結(jié)合是正好等同的，因此不指導(dǎo)遮蓋于天然人IL4上的表位。
B.IL4與受體結(jié)合的抑制作用使用結(jié)合于gibbon細(xì)胞系MLA[ATCC TIB201]125I-rhIL4研究3B9對(duì)IL4與其受體結(jié)合的抑制力，細(xì)胞系中每個(gè)細(xì)胞約有6000個(gè)受體。在37℃下MLA細(xì)胞與125I-IL4一起保溫30分鐘。以油梯度離心分離結(jié)合有125I-IL4的細(xì)胞后，在一γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定放射活性的攝取量，通過(guò)在100倍mol過(guò)量的未標(biāo)記IL4存在下保溫，測(cè)定非特異性的結(jié)合[Park等，J．Exp．Med．，166476-488(1987)]。當(dāng)IL4的量(加入的)是83pM時(shí)這種分析中未標(biāo)記的IL4的IC50值為22pM。完整的鼠(IgG)3B9 IC50是63pM，F(xiàn)ab片斷是93pM。在另一濃度的IL4(218pM)情況下，鼠(IgG)3B9的分析量為109pM。
C.淋巴細(xì)胞增殖的抑制使用Spits等，J.Immunol.，1391142-1147(1987)中所描述的方法，人外周血淋巴細(xì)胞與植物凝集素，一種T細(xì)胞促分裂原一起保溫3天，以向上調(diào)節(jié)IL4受體。然后進(jìn)一步用IL4刺激生成的blas成母細(xì)胞3天。通過(guò)3H胸苷的摻入測(cè)量增殖情況。用下列修改的Callard等，在Lymphokines and Interferons，A PracticalApproach，ch.19，p.345中的分析方法測(cè)量B細(xì)胞增殖。用IL4和固定化抗-IgM刺激純化的人扁桃體B細(xì)胞。通過(guò)3H胸苷的摻入測(cè)量增殖情況。
3B9(鼠)抑制3H-胸苷的摻入，通過(guò)以133pM IL4刺激的人外周血T淋巴細(xì)胞以167pM IL4刺激的人扁桃體B淋巴細(xì)胞來(lái)抑制。IL2-刺激的T淋巴細(xì)胞不受影響。抑制T細(xì)胞增殖的IC50是30pM，抑制B細(xì)胞增殖的是103pM。3B9(鼠)Fab片斷相應(yīng)的值是108和393pM。
D.CD23介入的抑制CD23是IgE(FcERII)的低親和性受體，其由低濃度IL4導(dǎo)入停留B淋巴細(xì)胞膜上，作為一種產(chǎn)生IgE的必要條件，用IL4刺激純化的人扁桃體B細(xì)胞2天。用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)[Defrance等，J.Exp.Med.，1651459-1467(1987)]測(cè)定表達(dá)CD23受體的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。3B9(鼠)抑制CD23在8.3pM IL4刺激的人扁桃體B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，IC50值為136pM。
E.IgE分泌的抑制不象其它分析測(cè)定中的IL4以EC50濃度加入[Pere等，Proc.Natl.Acad.Sci.856880-6884(1988)]，為了減少該系統(tǒng)固有的變化性在IL4給出最大分泌的濃度條件下檢查IgE分泌。根據(jù)下述方法測(cè)量T細(xì)胞的增殖。人外周血淋巴細(xì)胞與IL4一起保溫10-18天，優(yōu)選12天。由ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清液中的IgE濃度。
在1.7nM IL4存在條件下，用3B9(鼠)和3B9的Fab片斷抑制IgE分泌，分別得出IC50值為1.9和5.0nM。使用較低濃度的IL4 66.7pM重復(fù)進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，使對(duì)于3B9(鼠)的IC50值減少至0.65nM?？贵w(IgG)與IL4的摩爾比在所測(cè)濃度范圍內(nèi)保持不變(1∶1)。
F.數(shù)據(jù)總結(jié)及解釋在生物測(cè)定中抑制50％功能所需的IL4與各種MAbs的摩爾比例在表2示出。
>n＝實(shí)施分離試驗(yàn)的數(shù)目*不同時(shí)測(cè)定IgG1和IgG4在所有分析測(cè)定中，除IgE的分泌測(cè)定外，IL4約以ED50濃度加入。在兩個(gè)淋巴細(xì)胞增殖分析測(cè)定中對(duì)人源化3B9，鼠3B9和6A1來(lái)說(shuō)達(dá)50％抑制作用所要求的抗體與IL-4的摩爾比是相似的，但在CD23導(dǎo)入分析的情況下人源化3B9較高。后者為一種特別靈敏的分析，明顯要求很低(～5％)的受體占據(jù)(Kruse等，EMBOJ，125121 1993)，這從用鼠3B9所得結(jié)果明顯可見(jiàn)，這種分析主要測(cè)定中間分析的變化性。
大鼠6A1和鼠3B9的活性對(duì)比結(jié)果顯示出相似的功能效果曲線，但未想到6A1不能完全抑制放射性碘化IL4和其受體的結(jié)合。我們認(rèn)為用于受體結(jié)合分析中的放射性碘化IL4在易受影響的第124位殘基酪氨酸被碘化。當(dāng)對(duì)比6A1對(duì)未標(biāo)記的或碘化IL4誘導(dǎo)的CD23表達(dá)的抑制力時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)碘化配體的抑制效果要差。這些結(jié)果表明6A1在酪氨酸124區(qū)與IL4結(jié)合，但不是特異性的。
因此根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，6A1是一種高度親和性的與IL4結(jié)合區(qū)域大大不同于3B9的中和抗體。實(shí)施例9-藥物動(dòng)力學(xué)在雄性Sprague Dawley鼠上進(jìn)行人源化3B9的藥物動(dòng)力學(xué)研究。人源化3B9以iv丸劑形式1mg/kg給藥于4只動(dòng)物，用藥后抽血樣持續(xù)5周時(shí)間，使用IL-4/抗-人IgG夾心ELISA測(cè)定血漿人源化3B9濃度，設(shè)計(jì)ELISA實(shí)驗(yàn)不僅確證循環(huán)人IgG的存在，而且確證其與重組人IL-4的結(jié)合能力。
該研究結(jié)果總結(jié)于表3
表3在雄性Sprague Dawley鼠中人源化3B9的藥物動(dòng)力學(xué)(劑量1mg/kg iv丸)
藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)縮寫(xiě)如下Clp，表觀血漿清除率表示中間動(dòng)物變化性的數(shù)據(jù)相對(duì)較小且血漿中人源化3B9的消失表現(xiàn)為雙相的。表觀血漿清除率低(0.5ml/kg)。半衰期示為11天。因此源于CHO細(xì)胞的人源化3B9的藥物動(dòng)力學(xué)特性與大鼠中其它人源化單克隆抗體是一致的。人源化3B9在大鼠中的長(zhǎng)循環(huán)半衰期也顯示出當(dāng)給藥于人時(shí)，人源化3B9在延長(zhǎng)的時(shí)間期間看來(lái)是有效的。
本發(fā)明的各種修飾和改變包括在上述的說(shuō)明書(shū)中，且認(rèn)為其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。例如，人構(gòu)架區(qū)或其修飾物，不是上述例證的抗體，可用于人源化抗體的構(gòu)建物中。對(duì)本發(fā)明組合物和方法的這種修飾和改變被認(rèn)為包含在這里所附的權(quán)利要求的范圍中。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Holmes，Stephen D.
Gross，Mitchell S.
Sylvester，Daniel R.
(ii)發(fā)明名稱用于治療IL4介導(dǎo)疾病的重組IL4抗體(iii)序列數(shù)58(iv)通信地址(A)收信人SmithKline Beecham Corporation(B)街道Corporate Intellectual Property，UW2220-709Swedeland Rd(C)城市King of Prussia(D)州PA(E)國(guó)家USA(F)郵編19406-2799(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/117,366(B)申請(qǐng)日1993.9.7(C)分類(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/136,783
(B)申請(qǐng)日1993.10.14(C)分類(viii)代理人/公司信息(A)名字Sutton，Jeffrey A.
(B)登記號(hào)34,028(C)參考/摘要號(hào)P50186-2(ix)電信信息(G)電話(215)270-5024(H)電傳(215)270-5090(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度396堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..396(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG GAG ACA GAC ACA ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15GGC TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT 96Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala20 25 30GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT144Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser35 40 45GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA192Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT240Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser65 70 75 80GGG ATC CCA GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC288Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT336Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys100 105 110CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG384Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125GAA ATC AAA CGG396Glu Ile Lys Arg130(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度132個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Thr As Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser35 40 45Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser65 70 75 80Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys100 105 110Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Arg130(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度483堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置64..483
(xi)序列描述SEQ ID NO3GAATTCGCGG CCGCTATGCA GGGACAATCA GCAGCAGCAA TGAGGAAGTA AGCCTGTGCA 60GAT ATG AAC AGG CTT ACT TCC TCA TTG CTG CTG CTG ATT GTC CCT GCA108Met Asn Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala1 5 10 15TAT GTC CTG TCC CAG GTT ACT CTG AAA GAG TCT GGC CCT GGG ATA TTG156Tyr Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu20 25 30CAG CCC TCC CAG ACC CTC AGT CTG ACT TGT TCT TTC TCT GGG TTT TCA204Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser35 40 45CTG AGC ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC TGG ATT CGT CAG CCT TCA GGA252Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly50 55 60AAG GGT CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC300Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65 70 75TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC CGG CTC ACA ATC TCC AAG GAT ACC TCC348Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser80 85 90 95AGC AAC CAG GTA TTC CTC AAG ATC ACC AGT GTG GAC ACT GCA GAT ACT396Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr100 105 110GCC ACA TAC TAC TGT GCT CGA AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC444Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe115 120 125GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA483Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度140個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Asn Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr1 5 10 15Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln20 25 30Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu35 40 45Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys50 55 60Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr65 70 75 80Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser85 90 95Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala100 105 110Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp115 120 125Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度60堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..60(xi)序列描述SEQ ID NO5ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT 48Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15GGT GCC TAC GGG 60Gly Ala Tyr Gly20(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15Gly Ala Tyr Gly20(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度57堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..57(xi)序列描述SEQ ID NO7ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15GTC CAC TCC 57Val His Ser(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度423堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..423(xi)序列描述SEQ ID NO9ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT 48Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15GGT GCC TAC GGG CAG GTT ACC CTG AAA GAG TCT GGC CCT GGG ATA TTG 96Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu20 25 30CAG CCC TCC CAG ACC CTC AGT CTG ACT TGT TCT TTC TCT GGG TTT TCA 144Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser35 40 45CTG AGC ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC TGG ATT CGT CAG CCT TCA GGA 192Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly50 55 60AAG GGT CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC 240Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65 70 75 80TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC CGG CTC ACA ATC TCC AAG GAT ACC TCC288Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser85 90 95AGC AAC CAG GTA TTC CTC AAG ATC ACC AGT GTG GAC ACT GCA GAT ACT336Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr100 105 110GCC ACA TAC TAC TGT GCT CGA AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC384Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe115 120 125GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA423Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度141個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu20 25 30Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser35 40 45Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65 70 75 80Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser85 90 95Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr100 105 110Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe115 120 125Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度423堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..423(xi)序列描述SEQ ID NO11ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT 48Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15GGT GCC TAC GGG CAG GTT ACC CTG CGT GAA TCC GGT CCG GCA CTA GTT 96Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val20 25 30AAA CCG ACC CAG ACC CTG ACG TTA ACC TGC ACC TTC TCC GGT TTC TCC144Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser35 40 45CTG TCG ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC TGG ATC CGT CAG CCG CCG GGT192Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60AAA GGT CTA GAA TGG CTG GCT CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT240Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65 70 75 80TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC CGT CTG ACG ATA TCC AAA GAC ACC TCC288Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser85 90 95CGT AAC CAG GTT GTT CTG ACC ATG ACT AAC ATG GAC CCG GTT GAC ACC336Arg Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr100 105 110GCT ACC TAC TAC TGC GCT CGA CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC384Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe115 120 125GAC GTT TGG GGT CGT GGT ACC CCA GTT ACC GTG AGC TCA423Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度141個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15Gly Ala Tyr Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val20 25 30Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser35 40 45Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg65 70 75 80Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser85 90 95Arg Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr100 105 110Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe115 120 125Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度393堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)
(A)名字/鍵CDS(B)位置1..393(xi)序列描述SEQ ID NO13ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15GTC CAC TCC GAT ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCA GAC TCG CTA GCT GTG 96Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val20 25 30TCT CTG GGC GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AAG GCC TCC CAA AGT GTT 144Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val35 40 45GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCC GGG 192Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60CAG CCT CCT AAG TTG CTC ATT TAC GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT GGG 240Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65 70 75 80GTA CCT GAC CGA TTC AGT GGC AGC GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC 288Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu85 90 95ACC ATC AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA GTA TAC TAC TGT CAG 336Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln100 105 110CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG 384Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu115 120 125ATC AAA CGT 393Ile Lys Arg130(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度131個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val Mis Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val20 25 30Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val35 40 45Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65 70 75 80Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu85 90 95Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln100 105 110Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu115 120 125Ile Lys Arg130(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..45(xi)序列描述SEQ ID NO15AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC 45Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn1 5 10 15(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO16Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn1 5 10 15(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..21(xi)序列描述SEQ ID NO17GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT 21Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO18Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..27(xi)序列描述SEQ ID NOl9CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG 27Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr1 5(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO20Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr1 5(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知
(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..21(xi)序列描述SEQ ID NO21ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGCThr Ser Gly Met Gly Val Ser1 5(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO22Thr Ser Gly Met Gly Val Ser1 5(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)
(A)名字/鍵CDS(B)位置1..48(xi)序列描述SEQ ID NO23CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC 48His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO24His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..33
(xi)序列描述SEQ ID NO25AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC 33Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val1 5 10(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO26Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val1 5 10(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..27(xi)序列描述SEQ ID NO27CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG27Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg1 5(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO28Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg1 5(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO29CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO30GTACATGC AAGGCTTACA ACCACAATC 29(2)SEQ ID NO31信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度117堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO31GGTTACCCTG CGTGAATCCG GTCCGGCACT AGTTAAACCG ACCCAGACCC TGACGTTAAC60CTGCACCTTC TCCGGTTTCT CCCTGTCGAC CTCCGGTATG GGTGTTTCCT GGATCCG 117(2)SEQ ID NO32信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度120堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO32TCAGCCGCCG GGTAAAGGTC TAGAATGGCT GGCTCACATC TACTGGGACG ACGACAAACG 60TTACAACCCG AGCCTGAAAT CCCGTCTGAC GATATCCAAA GACACCTCCC GTAACCAGGT120(2)SEQ ID NO33信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度120堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO33TGTTCTGACC ATGGACCCGG TTGACACCGC TACCTACTAC TGCGCTCGTC GCGAAACCGT 60TTTCTACTGG TACTTCGACG TTTGGGGTCG TGGTACCCCA GTTACCGTGA GCTCCCAACC120(2)SEQ ID NO34信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO34ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGGAA 25(2)SEQ ID NO35信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO35ATGGTCAGAA CAACCTGGTT ACGG24(2)SEQ ID NO36信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO36TTCGGGTTAC CCTGCGTGAA TCCGG25(2)SEQ ID NO37信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO37CCAACCCTCG AGTGCCATTG A 21(2)SEQ ID NO38信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度43堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO38CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGG 43(2)SEQ ID NO39信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO39CCTTGCAGTT GATGGTGGCC CTCTCGCCCA GAGACACAG 39(2)SEQ ID NO40信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度67堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO40TCGAGAGGCC TCCCAAAGTG TTGATTATGA TGGTGATAGT TATATGAACTGGTATCAGCA60GAAACCC 67(2)SEQ ID NO41信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度63堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO41GGGTTTCTGC TGATACCAGT TCATATAACT ATCACCATCA TAATCAACAC TTTGGGAGGC60CTC 63(2)SEQ ID NO42信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO42ATACTACTGT CAGCAAAGTA ATGAGGATCC TCCGAGGTTC GGCGGAGGGA C 51(2)SEQ ID NO43信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO43CTTGGTCCCT CCGCCGAACC TCGGAGGATC CTCATTACTT TGCTGACAGT AGT 53(2)SEQ ID NO44信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度55堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO44GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACGCT GCATCCAATC TAGAATCTGG GGTAC55(2)SEQ ID NO45信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO45CCCAGATTCT AGATTGGATG CAGCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C 51(2)SEQ ID NO46信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度83堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO46AATTCGAGGA CGCCAGCAAC ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT60GGATCTCTGG TGCCTACGGG CAG83(2)SEQ ID NO47信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度84堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO47GTAACCTGCC CGTAGGCACC AGAGATCCAG AGCAACAGAG AAATGAAGAC CTGGGTCTGC60AACACCATGT TGCTGGCGTC CTCG 84(2)SEQ ID NO48信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO48CAGGTTACCC TGAAAGAGTC20(2)SEQ ID NO49信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO49GAAGTAGTCC TTGACCAG 18(2)SEQ ID NO50信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO50GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGG C 31(2)SEQ ID NO51信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO51CTTGGTGCTA GCTGAGGAGA CG 22(2)SEQ ID NO52信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度47堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO52CATCTAGATG GCGCCGCCAC AGTACGTTTG ATCTCCAGCT TGGTCCC 47(2)SEQ ID NO53信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO53AAGGCCTCCC AAAGTGTTGA TTATGATGGT GATAGTTATA TGAAC 45(2)SEQ ID NO54信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO54ACCTCCGGTA TGGGTGTTTC C 21(2)SEQ ID NO55信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO55CACATCTACT GGGACGACGA CAAACGTTAC AACCCGAGCC TGAAATCC48(2)SEQ ID NO56信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO56CGCGAAACCG TTTTCTACTG GTACTTCGAC GTT 33(2)SEQ ID NO57信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度393堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名字/鍵CDS(B)位置1..393(xi)序列描述SEQ ID NO57ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15GTC CAC TCC GAT ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCA GAC TCG CTA GCT GTG 96Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val20 25 30TCT CTG GGC GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AAG GCC TCC CAA AGT GTT144Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val35 40 45GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCC GGG192Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60CAG CCT CCT AAG TTG CTC ATT TAC GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT GGG240Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65 70 75 80GTA CCT GAC CGA TTC AGT GGC AGC GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC288Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu85 90 95ACC ATC AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA GTA TAC TAC TGT CAG336Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln100 105 110CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAA GTG GAG384Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu115 120 125ATC AAA CGT393Ile Lys Arg130(2)SEQ ID NO58信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度131個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO58Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val20 25 30Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val35 40 45Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly65 70 75 80Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu85 90 95Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln100 105 110Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu115 120 125Ile Lys Arg130
權(quán)利要求
1.一種具有與人白細(xì)胞介素-4(IL4)結(jié)合特異性的融合蛋白質(zhì)，其包含特征為與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2×10-10M的源自非人類中和單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，和第一融合配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其可操縱地與第二融合配體相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說(shuō)的非人類中和單克隆抗體選自3B9和6A1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所說(shuō)的第二融合配體含有所有的或部分免疫球蛋白不變重鏈或免疫球蛋白不變輕鏈，或兩鏈均有。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說(shuō)的第一融合配體序列是重鏈序列SEQ ID NO12的氨基酸21-50，56-71，88-119和131-141。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說(shuō)的第一融合配體序列是輕鏈序列SEQ ID NO14的氨基酸20-42，58-72，80-111和121-131。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說(shuō)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列是(a)ThrSerGlyMetGlyValSerSEQ ID NO22，(b)HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnPro-SerLeuLysSerSEQ ID NO24，或(c)ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspValSEQ ID NO26.
8.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說(shuō)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列是(a)LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsnSEQ IDNO16，(b)AlaAlaSerAsnLeuGluSerSEQ ID NO18，或(c)GlnGlnSerAsnGluAspProProArgSEQ ID NO28.
9.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說(shuō)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列是(a)LysAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsnSEQ IDNO16，(b)AlaAlaSerAsnLeuGluSerSEQ ID NO18，或(c)GlnGlnSerAsnGluAspProProThrSEQ ID NO20.
10.一種免疫球蛋白重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其氨基酸序列選自(a)ThrSerGlyMetGlyValSer.SEQ ID NO22，(b)HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnPro-SerLeuLysSerSEQ ID NO24，和(c)ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspValSEQ ID NO26.組成的組。
11.一種免疫球蛋白輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其氨基酸序列選自(a)LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsnSEQ IDNO16，(b)AlaAlaSerAsnLeuGluSerSEQ ID NO18，(c)GlnGlnSerAsnGluAspProProArgSEQ ID NO28；和(d)GlnGlnSerAsnGluAspProProThrSEQ ID NO20.組成的組。
12.一種編碼免疫球蛋白重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的核酸分子，該序列選自(a)ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGCSEQ ID NO21，(b)CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TATAACCCATCCCTGAAGAGCSEQ ID NO23，(c)AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GATGTCSEQ ID NO25.(d)ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCCSEQ ID NO54，(e)CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCGAGC CTG AAA TCCSEQ ID NO55，和(f)CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTTSEQID NO56.組成的組
13.一種編碼免疫球蛋白輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的核酸分子，該序列選自(a)AAG GCCAGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGTGAT AGT TAT ATG AACSEQ ID NO15，(b)AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGTTAT ATG AACSEQ ID NO53，(c)GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCTSEQ ID NO17，(d)CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACGSEQ ID NO19，和(e)CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGGSEQ ID NO27.組成的組。
14.一種含有重鏈和輕鏈的人源化抗體，所說(shuō)抗體特征為與人IL4的解離常數(shù)等于或小于約2×10-10M，其中所說(shuō)重鏈和輕鏈的構(gòu)架區(qū)源自至少一個(gè)所選擇的人抗體，每一所說(shuō)鏈的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列是特異于人IL4，特征為與人IL4的解離常數(shù)等于或小于約2×10-10M的源自非人類中和單克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的抗體，其中所說(shuō)的抗體可選擇地與一個(gè)效應(yīng)子連接，效應(yīng)子選自非蛋白載體分子，聚苯乙烯和塑料珠構(gòu)成的組。
16.一種含有一重鏈和一輕鏈的嵌合抗體，所說(shuō)抗體特征在于與人IL4的解離常數(shù)等于或小于約2×10-10M，其中所說(shuō)重鏈和所說(shuō)輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列源自特異于人IL4的非人類中和單克隆抗體，其特征為與人IL4的解離常數(shù)等于或小于2×10-10M。
17.一種含有權(quán)利要求1融合蛋白和藥物上可接受的載體的藥物組合物。
18.一種治療人體變應(yīng)性和其它相關(guān)于過(guò)量IgE產(chǎn)生的疾病的方法，包含步驟在需要時(shí)給藥于所說(shuō)病人有效量的權(quán)利要求1的融合蛋白。
19.一種分離的核酸序列，其選自下組(a)編碼權(quán)利要求1融合蛋白的核酸序列；(b)與(a)互補(bǔ)的核酸序列；(c)能在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)雜交的18個(gè)或更多核苷酸的核酸序列；和(d)(a)、(b)、(c)的片斷或類似物，其編碼特征為與人白細(xì)胞介素-4具有特異性的蛋白質(zhì)；其中所述序列選擇性地含有限制酶切位點(diǎn)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的分離的核酸序列，其中編碼融合蛋白的序列包含圖5，SEQ ID NO13的核酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的分離的核酸序列，其中編碼融合蛋白的序列包含SEQ ID NO11的核酸序列。
22.一種分離的核酸序列，其選自(a)編碼互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的核酸序列，其中所說(shuō)的CDR得自特異于人白細(xì)胞介素-4的解離常數(shù)等于或小于約2×10-10M的中和鼠單克隆抗體；(b)與(a)互補(bǔ)的核酸序列；(c)能在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)雜交的18或更多個(gè)核苷酸的核酸序列；和(d)(a)、(b)或(c)片斷或類似物，其編碼特征為具有人白細(xì)胞介素-4特異性的蛋白質(zhì)組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的分離的核酸序列，其中所說(shuō)的序列選自由(a)至(f)組成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)編碼序列的組(a)ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGCSEQ ID NO21，(b)CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TATAAC CCA TCC CTG AAG AGCSEQ ID NO23，(c)AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GATGTCSEQ ID NO25，(d)ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCCSEQ ID NO54，(e)CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCGAGC CTG AAA TCCSEQ ID NO55，和(f)CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTTSEQ ID NO56.
24.根據(jù)權(quán)利要求22的分離的核酸序列，其中所說(shuō)的序列選自由下組組成的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)編碼序列的組(a)AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGTGAT AGT TAT ATG AACSEQ ID NO15，(b)AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGTTAT ATG AACSEQ ID NO53，(c)GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCTSEQ ID NO17，(d)CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACGSEQ ID NO19，和(e)CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGGSEQ ID NO27.
25.一種包含權(quán)利要求19的核酸序列的重組質(zhì)粒。
26.一種包含權(quán)利要求22的核酸序列的重組質(zhì)粒。
27.一種以權(quán)利要求25的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
28.一種以權(quán)利要求26的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
29.一種生產(chǎn)特異于人白細(xì)胞介素-4的人源化抗體的方法，包括培養(yǎng)在選擇的調(diào)節(jié)序列控制下的由權(quán)利要求25的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，該調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)質(zhì)粒在所說(shuō)細(xì)胞中的表達(dá)。
30.一種診斷人體變應(yīng)性或其它相關(guān)于過(guò)量免疫球蛋白產(chǎn)生的其它疾病的方法，包括用人IL4的高滴度單克隆抗體接觸一生物液體樣品，分析所說(shuō)單克隆抗體和人白細(xì)胞介素4間結(jié)合的產(chǎn)生。
31.一種篩選對(duì)人白細(xì)胞介素4具有高滴度的單克隆抗體的方法，包括a)制備特征為分泌人白細(xì)胞介素4的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系；和b)用醛偶聯(lián)的人白細(xì)胞介素4或生物素化的人白細(xì)胞介素4篩選所說(shuō)的雜交瘤細(xì)胞系。
32.一種對(duì)人白細(xì)胞介素4具有高滴度的中和抗體，其Fab片斷或F(ab′)2片斷，通過(guò)用醛偶聯(lián)的人白細(xì)胞介素-4或生物素化的人白細(xì)胞介素-4篩選雜交瘤產(chǎn)品庫(kù)而生產(chǎn)。
33.一種嚙齒動(dòng)物的中和單克隆抗體，特異于人白細(xì)胞介素-4并具有結(jié)合親和性，特征為解離常數(shù)等于或小于約2×10-10M。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所說(shuō)的嚙齒動(dòng)物為鼠。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的單克隆抗體，其包括SEQ ID NO2的輕鏈氨基酸序列和SEQ ID NO4的重鏈氨基酸序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所說(shuō)的嚙齒動(dòng)物是大鼠。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的單克隆抗體，具有6A1的識(shí)別特征。
38.一種具有細(xì)胞系3426A11C1B9的識(shí)別特征的雜交瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了源自高度親合的單克隆抗體的嵌合和人源化IL4單克隆抗體，含有該抗體的藥物組合物及治療方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1133599SQ94193929
公開(kāi)日1996年10月16日 申請(qǐng)日期1994年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月7日
發(fā)明者S·D·霍爾姆斯, M·S·格羅斯, D·R·施爾韋斯特 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆公司, 史密絲克萊恩比徹姆有限公司