介白素-6抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了結(jié)合至人類介白素-6（IL6）的抗體及其用途。該抗體可以調(diào)節(jié)IL6的信息傳遞，從而使用于治療或預(yù)防IL6相關(guān)的疾病或失調(diào)，特別是炎癥性失調(diào)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid?arthritis，RA）、血管新生以及癌癥。
【專利說明】介白素-6抗體及其用途
[0001]相關(guān)申請案
[0002]本專利申請案根據(jù)35U.S.C.§ 119主張于2012年10月22日提出申請的美國臨時專利申請案序號第61/716，802號的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，該申請案的全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明是有關(guān)介白素-6的抗體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0004]人類介白素-6 (IL6)是一種具有184個氨基酸的分泌型糖蛋白(21kDa)，其具有四螺旋束狀結(jié)構(gòu)。IL-6是一種經(jīng)由與兩種不同的受體蛋白質(zhì)(IL6受體(IL6R)和糖蛋白130 (gpl30))結(jié)合而作用于各種細(xì)胞類型的多功能細(xì)胞介素，該等細(xì)胞類型例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、肝細(xì)胞、破骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腎小球環(huán)間膜細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞以及造血祖細(xì)胞。IL6/IL6R/gpl30復(fù)合體的形成轉(zhuǎn)換了細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞途徑，該信息傳遞途徑包括那些由(I)磷脂酰肌醇_3’ -激酶(PI3K)、(2)有絲分裂誘致劑活化蛋白激酶(MAK)以及(3)詹納斯氏酪氨酸激酶(Janus tyrosine kinase, JAK)-信息傳遞者和轉(zhuǎn)錄活化劑I和3 (STATI和STAT3)所調(diào)節(jié)者。
[0005]IL-6可發(fā)揮作為免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞生長因子、骨代謝調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞分化因子以及對抗一些效應(yīng)劑細(xì)胞的急性期蛋白誘導(dǎo)劑的功能。在肝臟中，IL6誘導(dǎo)各種急性期蛋白，例如血清類淀粉蛋白A (SAA)、C-反應(yīng)性蛋白(CRP)、鐵調(diào)節(jié)素、纖維蛋白原以及結(jié)合球蛋白抗胰凝乳蛋白酶。IL-6對于各種疾病的病理意義已在眾多的研究中被指出，該等疾病包括慢性炎癥疾病、自體免疫疾病(`例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏癥(Crohn’s disease)、巨大淋巴結(jié)增生(Castleman’s disease)及牛皮癬)、癌癥(例如多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、前列腺癌及各種癌癥)以及惡病質(zhì)和冠狀動脈心臟疾病。
[0006]因此，開發(fā)新的IL6拮抗劑以用于治療與IL6信息傳遞相關(guān)的疾病具有極大的利.、
Mo

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明基于鑒定一些示例性的抗IL6抗體，例如1-4-62、Agl-4-6 (也被稱為FB704)或HAglT-3-lO，其出乎意料地顯示出對人類IL6的高結(jié)合親和力和特異性，以及在抑制IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞增生(例如癌細(xì)胞的增生)和細(xì)胞介素產(chǎn)生(例如炎癥性細(xì)胞介素產(chǎn)生)、血管新生、癌癥引起的惡病質(zhì)及癌轉(zhuǎn)移上的優(yōu)越活性。這樣的抗體也顯著增強了其它化療試劑例如奧沙利鉬(01311口]^1:;[11)、吉西他濱(861110；^313；[116)及多西他賽(docetaxel)的抗癌效果。
[0008]因此，本發(fā)明的一方面是關(guān)于結(jié)合至人類介白素6 (IL-6)的分離抗體，包含:
[0009](a)重鏈變異區(qū)(VH)，其包含SEQ ID NO: 2所示的重鏈互補決定區(qū)I (HC CDR1)、SEQ ID N0:4所示的重鏈互補決定區(qū)2 (HC CDR2)以及SEQ ID N0:6或SEQ ID NO: 16所示的重鏈互補決定區(qū)3 (HC⑶R3);或
[0010](b)輕鏈變異區(qū)(VL)，其包含SEQ ID NO:9所示的輕鏈互補決定區(qū)I (LC CDR1)、SEQ ID NO: 11所示的輕鏈互補決定區(qū)2 (LC CDR2)以及SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15所示的輕鏈互補決定區(qū)3 (LC⑶R3)。
[0011]在一些具體實施例中，該分離的抗IL6抗體包含(i)包含SEQ ID NO:2所示的HCCDR1、SEQ ID NO:4 所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO:6 所示的 HC CDR3 的 VH ;或(ii)包含 SEQID N0:2 所示的 HC CDR1、SEQ ID N0:4 所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 16 所示的 HC CDR3的VH。在一實例中，該抗體包含包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列的VH0
[0012]在其他的具體實施例中，該分離的抗IL6抗體進一步包含(i)包含SEQ ID NO: 9所示的 LC CDR1、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 13 所示的 LC CDR3 的 VL ;或
(ii)包含 SEQ ID N0:9 所示的 LC CDR1、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 15 所示的LC CDR3的VL。在一實例中，該抗體進一步包含包含SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的VL。
[0013]本文所述的抗IL6抗體的實例包括但不限于:
[0014](i)包含 VH 和 VL 的抗體，該 VH 包含 SEQ ID NO: 2 所示的 HC CDRl、SEQ ID NO:4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO:6 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO:9 所示的 LC CDRl、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 13 所示的 LC CDR3 ；
[0015](ii)包含 VH 和 VL 的抗體，該 VH 包含 SEQ ID NO:2 所示的 HC CDRl、SEQ ID NO:4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 16 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO: 9 所示的 LC CDRl、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 13 所示的 LC CDR3 ；
[0016](iii)包含 VH 和 VL 的抗體，該 VH 包含 SEQ ID N0:2 所示的 HC CDR1、SEQ ID NO: 4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 6 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO: 9 所示的 LC CDRl、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 15 所示的 LC CDR3 ；
[0017](iv)包含 VH 和 VL 的抗體，該 VH 包含 SEQ ID N0:2 所示的 HC CDR1、SEQ ID NO:4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 16 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO: 9 所示的 LC CDRl、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 15 所示的 LC CDR3 ；
[0018](V)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，該VL包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列；
[0019](vi)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，該VL包含SEQ ID N0:20所示的氨基酸序列；及
[0020](vii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，該VL包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列；以及
[0021](viii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，該VL包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
[0022]本文中描述的任何抗IL6抗體可以是全長抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗原結(jié)合片段可以是Fab或(Fab’)2?；蛘撸摽笽L6抗體可以是單鏈抗體、人源化抗體或人類抗體。
[0023]在另一個方面，本發(fā)明提供一種包含核苷酸序列的核酸，該核苷酸序列編碼抗體重鏈變異區(qū)(VH)、抗體輕鏈變異區(qū)(VL)或兩者，其中該VH和該VL如本文所述。
[0024]在另一個方面,本發(fā)明提供一種載體(例如表達(dá)載體),該載體包含本文所描述的任何核酸以及含有這種載體的宿主細(xì)胞。
[0025]在又另一個方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)結(jié)合至人類IL-6的抗體的方法，包含:(i)在允許抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)申請專利范圍第40項所述的宿主細(xì)胞，以及視情況
(ii)獲取抗體。
[0026]本發(fā)明的另一個方面是關(guān)于組合物(例如醫(yī)藥組合物)，該組合物包含(a)本文所描述的任何抗IL6抗體、本文所描述的任何核酸或本文所描述的任何載體；以及(b)載劑，例如醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0027]在一些具體實施例中，本文所描述的任何組合物還包含另一種抗癌試劑或疾病修飾抗風(fēng)濕藥物(disease modifying antirheumatic drug, DMARD)?？拱┰噭┑膶嵗ǖ幌抻诙辔魉?docetaxel)、奧沙利鉬(oxaliplatin)及吉西他濱(86!110；^313；[116)。DMARDs的實例包括但不限于甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯奎寧輕氯奎寧(chloroquine hydroxychloroquine)、環(huán)抱靈(cyclosporin A)以及橫胺塞拉金(sulfasalazine)。
[0028]在又另一個方面，本發(fā)明提供一種用于治療IL6相關(guān)疾病的方法，包含投予治療有效量的本文所述任何抗IL6抗體或任何編碼這種抗IL6抗體的核酸至需要治療IL6相關(guān)疾病的個體。IL6相關(guān)疾病的實例包括但不限于炎癥性失調(diào)、自體免疫疾病、血管新生及癌癥。
[0029]在一些具體實施例中，IL-6相關(guān)疾病為癌癥，其可以是多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳癌，胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌。在一些實例中，抗體的量或編碼的核酸在減少腫瘤轉(zhuǎn)移或癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)上是有效的。在其他的實例中，該方法進一步包含投予該個體另一種抗癌試劑，例如奧沙利鉬、吉西他濱或多西他賽。
[0030]在其他的具體實施例中，該IL6相關(guān)疾病為自體免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、克羅恩氏癥、巨大淋巴結(jié)增生、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)黏連性脊椎炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬。在一些實例中，本文中描述的方法進一步包含向個體投予一或多個疾病改善抗風(fēng)濕藥物(DRAMD),例如甲氨喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯喹(chloroquine)、輕氯喹、環(huán)孢素A、柳氮塞拉金(sulfasalazine)。
[0031]同樣在本發(fā)明的范 圍內(nèi)的是用于治療IL-6相關(guān)疾病的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物包含(a)任何的抗IL6抗體或任何本文所描述的核酸/載體；(b)醫(yī)藥上可接受的載劑；以及視情況(c)抗癌試劑或本文所述的那些DMARD。IL-6相關(guān)的示例性疾病包括但不限于炎癥性失調(diào)、自體免疫疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、克羅恩氏癥、巨大淋巴結(jié)增生、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)黏連性脊椎炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎及牛皮癬)、血管新生、癌癥(例如多個多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)。
[0032]另外，本發(fā)明提供任何的抗IL6抗體或任何的在藥劑中編碼核酸的用途，或如本文所述用于制造治療IL-6相關(guān)疾病或病癥的藥劑。
[0033]在下面的描述中提出本發(fā)明中一或多個具體實施例的細(xì)節(jié)。從以下幾個具體實施例的圖示和實施方式以及所附的申請專利范圍，本發(fā)明的其它特征或優(yōu)點將是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為圖示高親和力抗IL6抗體對細(xì)胞信息傳遞途徑和增生的功效的圖。(A)磷酸化STAT3信息傳遞被抗IL6抗體Agl-4-6和HAgTl-3-lO以劑量依賴的方式減少。(B)抗IL6抗體Agl-4-6和HAgTl-3-lO抑制STAT3信息傳遞的程度遠(yuǎn)大于對照抗體Actemra。(C)抗IL6抗體l-4-62、Agl-4-6及HAglT-3-lO以劑量依賴的方式抑制B9細(xì)胞增生且IC50分別為 0.618、0.0468 及 0.00456 μ g/ml。
[0035]圖2為圖示抗IL6抗體抑制人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細(xì)胞中趨化素生產(chǎn)的圖。使用IL6、sIL6R、IL6和sIL6R或IL6、sIL6R和指示的抗IL6抗體的組合培養(yǎng)HUVEC24小時。以ELISA量測培養(yǎng)上清液中的MCP-1和sICAM-1。(A) IL6+sIL6R誘導(dǎo)MCP-1的分泌被抗IL6抗體 Agl-4-6 和 HaglT-3-lO 抑制。(B)抗體 Agl-4-6 和 HaglT-3-lO 抑制 sICAM-Ι 生產(chǎn)的程度大于Actemra。
[0036]圖3為圖示本文所述示例性抗IL6抗體的結(jié)合特異性的圖。
[0037]圖4為圖示抗體Agl-4-6 (FB704)體內(nèi)抑制血管新生的圖。將hIL6重組蛋白加入基質(zhì)膠并注入小鼠背側(cè)的兩個位點上。經(jīng)由靜脈注射抗體或預(yù)混合物來治療小鼠。(A)在治療6天后觀察FB704抑制IL6誘導(dǎo)的血管新生。(B)用抗體FB704治療明顯改變了血紅蛋白的濃度。
[0038]圖5為圖示抗體FB704抑制人類前列腺癌細(xì)胞PC-3誘導(dǎo)的惡病質(zhì)和轉(zhuǎn)移的圖。腫瘤注射之后，在第31天量測小鼠的體重。(A)PBS治療的小鼠體重下降了約19%。與此相反，高劑量FB704和Actemra治療的組保持穩(wěn)定并且表達(dá)出顯著的差異(P〈0.01)。(B) FB704(η=15 ;Ρ=0.00001 WPActemra (η=12 ;Ρ=0.024)明顯地延長了 PC3腫瘤小鼠的無癥狀存活期。FB704表示出比Actemra (Ρ=0.03)明顯更佳的療效。(C) PBS治療組的總解剖顯示肝臟有嚴(yán)重的腫大和腫瘤細(xì)胞浸潤。然而，F(xiàn)B704治療組表現(xiàn)出中度的腫瘤細(xì)胞浸潤，并且在肝臟的左葉和中葉有近50%的正常肝細(xì)胞。(D)免疫組織化學(xué)顯示以FB704治療腫瘤切片后血管密度降低。(E)⑶31染色的半定量分析顯示，F(xiàn)B704治療后明顯減少(Ρ〈0.05)。(F)FB704加上化療藥物多西他賽的結(jié)合治療提供了更佳的總體存活率。
[0039]圖6為圖示抗體FB704增強奧沙利鉬或吉西他濱對胰臟癌移植瘤的抗腫瘤活性的圖。(A)每周兩次用20mg/kg的FB704治療BxPC_3腫瘤小鼠加上每周一次的奧沙利鉬(3mg/kg)產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上49%的顯著腫瘤生長抑制(P〈0.01)。(B)小鼠的體重在治療過程中正常增加了。(C和D)實驗之后量測個別的腫瘤塊，而且治療之后腫瘤的重量明顯減少。(E)在不同治療的腫瘤切片上顯示出腫瘤細(xì)胞增生標(biāo)記物K1-67。(F)PBS、奧沙利鉬、FB704及FB704加上奧沙利鉬治療組的K1-67陽性細(xì)胞率分別顯示為26%、14%、16%及7.5%。(G)以每周兩次20mg/kg的FB704加上吉西他濱(80mg/kg)治療BxPC_3腫瘤小鼠產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上60%的明顯腫瘤生長抑制(P〈0.01)。
[0040]圖7為圖示本文所述的示例性抗IL6抗體對U937和人類PBMC細(xì)胞抑制MCP-1產(chǎn)生的圖。(A)用IL6培養(yǎng)U937細(xì)胞并以抗體治療24小時。以ELISA套件量測MCP-1。我們的抗體表現(xiàn)出劑量依賴的MCP-1生產(chǎn)抑制(n=3)。(B)用IL6培養(yǎng)PBMC細(xì)胞并以抗體治療24小時。通過ELISA量測MCP-1。我們的抗體表現(xiàn)出劑量依賴的MCP-1生產(chǎn)抑制(n=5)。[0041]圖8為圖示以本文所述示例性抗IL6抗體抑制RA-FLS的MCP-1產(chǎn)生的圖。(A)商業(yè)用RA-FLS細(xì)胞及(B)用IL6加上sIL6R在抗體存在或不存在下培養(yǎng)RA患者的FLS細(xì)胞24小時。我們的抗體表現(xiàn)出劑量依賴的MCP-1生產(chǎn)抑制(n=6)。
[0042]圖9為圖示以本文所述示例性抗IL6抗體抑制RA-FLS的VEGF產(chǎn)生的圖。(A)商業(yè)用RA-FLS細(xì)胞及(B)用IL6、sIL6R及ILl β培養(yǎng)RA患者的FLS細(xì)胞并用抗體治療24小時。我們的抗體表現(xiàn)出劑量依賴的VEGF生產(chǎn)抑制(η=6)。
【具體實施方式】
[0043]本發(fā)明是關(guān)于結(jié)合人類介白素-6 (IL6)的抗體(該抗體可以中和IL6的活性)以及該抗體在調(diào)節(jié)IL6調(diào)節(jié)的信息傳遞途徑的用途。本文所述的抗IL6抗體可用于治療IL6相關(guān)的疾病或失調(diào)，例如炎癥性失調(diào)、自體免疫疾病、血管新生、癌癥、腫瘤轉(zhuǎn)移及癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)。
[0044]以下的描述只是為了說明本發(fā)明的各種具體實施例。因此，本文所討論的特定具體實施例不應(yīng)被解讀為限制本發(fā)明的范圍。對于本【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者而言，顯而易見的是可以在不脫離本發(fā)明的范圍下作出各種改變或等同。
[0045]一般技術(shù)
[0046]除非另有指明，否則本發(fā)明的實施將釆用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)，該等技術(shù)是在【技術(shù)領(lǐng)域】的技藝內(nèi)。該等技術(shù)已在文獻中有完整的解釋，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, secondedition(Sambrook，et al.，1989)CoId Spring Harbor Press ;OligonucleotideSynthesis (M.J.Gait, ed ., 1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press ；CellBiology: A Laboratory Notebook (J.E.Cellisjed.，1998) Academic Press ；Animal CellCulture (R.1.Freshneyj ed., 1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather and P.E.Roberts, 1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures (A.Doyle, J.B.Griffiths, and D.G.Newell, eds.，1993-8) J.Wiley andSons ；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.) ；Handbook of ExperimentalImmunology (D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.) ；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calosj eds.,1987) ；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubelj et al., eds., 1987) ；PCR:The Polymerase ChainReaction, (Mullis, et al., eds., 1994) ；Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganet al., eds.,1991) ；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers, 1997) ；Antibodies (P.Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach(P.Shepherd and C.Dean, eds.，OxfordUniversity Press,2000) ；Using antibodies: a laboratory manual(E.Harlow andD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ；The Antibodies(M.Zanetti andJ.D.Capra, eds.，Harwood Academic Publishers, 1995)。
[0047]定義
[0048]為了提供對本發(fā)明明確的和立即的了解，首先定義若干用詞。其他的定義載于實施方式各處。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)用詞具有的涵義與在相關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者通常了解的相同。
[0049]本文所使用的冠詞「一」(a、an)是指一個或一個以上的(即至少一個)文章的語法對象。通過舉例的方式，「一元素」意指一個元素或一個以上的元素。
[0050]本文所使用的「多勝肽」一詞是指由勝肽鍵連接的氨基酸殘基所組成的聚合物?！傅鞍踪|(zhì)」一詞通常是指相對大的多勝肽?！竸匐摹挂辉~通常是指相對短的多勝肽(例如含有至多100個、80個、60個、50個、30個或20個氨基酸殘基)。
[0051]抗體(可與復(fù)數(shù)形互換使用)是能夠經(jīng)由至少一個位在免疫球蛋白分子的變異區(qū)中的抗原識別位點特異性結(jié)合到標(biāo)靶的免疫球蛋白分子，該標(biāo)靶例如碳水化合物、多聚核苷酸、脂質(zhì)、多勝肽等。本文所使用的「抗體」一詞不僅含括完整的(即全長的)多株或單株抗體，而且還含括其抗原結(jié)合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、其變異體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及任何其他包含所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗體的糖基化變體、抗體的氨基酸序列變體及共價修飾的抗體。
[0052]完整或全長的抗體包含兩個重鏈和兩個輕鏈。每個重鏈含有重鏈變異區(qū)(VH)和第一、第二及第三恒定區(qū)(CHl、CH2及CH3)。每個輕鏈含有輕鏈變異區(qū)(VL)和恒定區(qū)(CL)。全長的抗體可以是任何種類的抗體，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子類)，而且該抗體不需要屬于任何特定的類別。取決于重鏈的恒定域的抗體氨基酸序列，可以將免疫球蛋白指定為不同的類別。免疫球蛋白有五種主要的類別:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且這些類別中有幾個可以再被進一步區(qū)分成子類(同型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2。對應(yīng)于不同免疫球蛋白類別的重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、Y、以及μ。不同類別的免疫球蛋白的子單元結(jié)構(gòu)和三維架構(gòu)皆為眾所周知的。
[0053]「抗原結(jié)合域」或「抗原結(jié)合片段」一詞是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的完整抗體分子的一部分或區(qū)域?？乖Y(jié)合域可以包含重鏈變異區(qū)(VH)、輕鏈變異區(qū)(VL)或上述兩者。VH和VL中的每個典型地含有三個互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2及⑶R3。在VH或VL中的三個⑶R是由框架區(qū)(FR1、FR2、FR3及FR4)遞送。
[0054]抗原結(jié)合片段的實例包括但不限于=(I)Fab片段，其可以是具有VL-CL鏈和VH-CHl鏈的單價片段；(2) F(ab' ) 2片段，其可以是具有兩個Fab片段的二價片段，該兩個Fab片段由鉸鏈區(qū)的二硫橋(即Fab的二聚物)連接；(3)具有抗體的單臂的VL和VH域的Fv片段；(4)單鏈Fv (scFv),其可以是由VH域和VL域經(jīng)由勝肽連接符組成的單一多勝肽鏈；以及(5) (scFv) 2，其可以包含兩個由勝肽連接符連接的VH域和兩個VL域，該兩個VL域是經(jīng)由二硫橋與該兩個VH域組合。
[0055]「人類抗體」一詞是指所具有的變異和恒定區(qū)大致上對應(yīng)于(或衍生自)取自人類個體的抗體的抗體，例如由人類生殖免疫球蛋白序列或其變體所編碼者。本文所描述的人類抗體可以包括一或多個非由人類生殖免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如由體外或體內(nèi)體細(xì)胞突變的隨機或位點特異性誘變引入的突變)。這樣的突變可以存在于一或多個⑶R或一或多個FR中。在一些實例中，人類抗體可以具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多的位置被不是由人類生殖免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基取代。
[0056]「分離的」物質(zhì)意指其已通過人力從自然狀態(tài)改變了。假使「分離的」物質(zhì)出現(xiàn)在本質(zhì)上，則其已被從其原始環(huán)境改變或移除，或兩者兼而有的。舉例來說，天然存在于活的個體的多勝肽不是「分離的」，但假使該多勝肽已被實質(zhì)地從其天然狀態(tài)的共存材料中分開并存在于實質(zhì)上純的狀態(tài)，則該多勝肽為分離的。
[0057]「特異性結(jié)合」或「特異地結(jié)合」一詞是指兩個分子之間的非隨機結(jié)合反應(yīng)，例如抗體至抗原表位的結(jié)合?！柑禺惖亟Y(jié)合」至標(biāo)靶或表位的抗體為本【技術(shù)領(lǐng)域】中眾所了解的詞語，并且決定這種特異性結(jié)合的方法也是本【技術(shù)領(lǐng)域】中眾所周知的。假使分子與特定標(biāo)靶抗原或表位的反應(yīng)或結(jié)合比與替代標(biāo)靶/表位的反應(yīng)或結(jié)合更頻繁、更迅速、并且具有更長的持續(xù)時間及/或更大的親和力，則可說該分子表現(xiàn)出「特異性結(jié)合」。假使抗體結(jié)合至標(biāo)靶抗原比結(jié)合至其他物質(zhì)具有更大的親和力、結(jié)合性、更快速及/或具有更長的持續(xù)時間，則該抗體是「特異地結(jié)合」至標(biāo)靶抗原。舉例來說，特異地(或優(yōu)先地)結(jié)合至IgE表位的抗體為結(jié)合此IgE表位比結(jié)合至其他IgE表位或非-1gE表位具有更大的親和力、結(jié)合性、更快速及/或具有更長的持續(xù)時間的抗體。通過閱讀此定義還應(yīng)了解的是，例如特異地結(jié)合至第一標(biāo)靶抗原的抗體可能會或可能不會特異地或優(yōu)先地結(jié)合至第二標(biāo)靶抗原。因此，「特異性結(jié)合」或「優(yōu)先的結(jié)合」并不一定需要(雖然可以包括)排除性的結(jié)合。一般來說(但未必如此)，提及結(jié)合意指優(yōu)先的結(jié)合。
[0058]本文中「個體」、「個人」及「患者」等詞可互換使用，并且是指被評估治療及/或正在接受治療的哺乳動物。個體可以是人，但也包括其他的哺乳動物，特別是可用作人類疾病實驗?zāi)Ｐ偷哪切┎溉閯游?，例如小鼠、大鼠、兔子，狗等?br> [0059]「治療」一詞是指動作、施加或療法，其中個體(包括人類)以改善個體情況的目的直接地或間接地接收醫(yī)療救助。具體而言，該詞是指減少發(fā)病率、或減輕癥狀、消除復(fù)發(fā)、防止復(fù)發(fā)、防止發(fā)病、改善癥狀、改善預(yù)后或在一些具體實施例中為上述的組合。熟悉本技藝者會明白的是，治療并不一定導(dǎo)致癥狀完全不存在或去除。舉例來說，相對于癌癥，「治療」可以指減緩腫瘤或惡性細(xì)胞生長、增生、或轉(zhuǎn)移、防止或延緩腫瘤或惡性細(xì)胞生長、增生或轉(zhuǎn)移的發(fā)展、或上述的某些組合。
[0060]如本文中所使用的，與藥劑的投予相關(guān)`的「有效量」或「有效劑量」或「治療有效量」是指與未接收此量的對應(yīng)個體相比，藥物或藥劑的量產(chǎn)生意圖的藥理結(jié)果、或治療、治愈、預(yù)防或改善疾病、失調(diào)或副作用的效果、或降低疾病或失調(diào)的進展速率。藥劑的有效量或劑量可能取決于采用的特定活性成分、投予的模式以及待治療個體的年齡、大小及狀況。藥劑的精確量需要取決于行醫(yī)者的判斷來投予并且是每個個體特有的。
[0061]「IL6相關(guān)的疾病或病癥」是指其中IL6在導(dǎo)致該疾病或病癥的信息傳遞途徑中扮演調(diào)節(jié)的角色的任何疾病或病癥。IL6是經(jīng)由受體復(fù)合物啟動細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞介素家族的成員，該受體復(fù)合物是由信息傳遞糖蛋白gpl30和IL6受體(IL6R)的至少一子單元所組成。IL6結(jié)合至IL6R,然后二聚化gpl30而觸發(fā)gpl30的酪氨酸殘基的磷酸化。至少有三個主要的信息傳遞途徑涉及IL6/IL6R/gpl30復(fù)合物的形成:(I)磷脂酰肌醇_3’ -激酶(PI3K)，
(2)分裂素活化蛋白激酶(MAK)，以及(3)詹納斯氏酪氨酸激酶(JAK)信息傳遞者和轉(zhuǎn)錄活化劑I和3(STAT1和STAT3)路徑。據(jù)信IL6在范圍廣泛的疾病或失調(diào)的發(fā)展中發(fā)揮作用，該等疾病或失調(diào)包括但不限于炎癥、自體免疫疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、克羅恩氏癥、巨大淋巴結(jié)增生、多發(fā)性硬化癥、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬)、血管新生、癌癥(例如多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉(zhuǎn)移，癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)。
[0062]本文所使用的「類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎」是指一種類型的自體免疫疾病，其特征為全身性的滑動關(guān)節(jié)發(fā)炎。此疾病的早期癥狀是關(guān)節(jié)疼痛，進而演變成關(guān)節(jié)變形或損害身體器官，例如血管、心臟、肺、皮膚及肌肉。
[0063]本文所使用的「血管新生」一般是指形成新血管的基本過程。血管新生可以在組織生長的期間作為正常的生理過程發(fā)生，該組織生長例如肌肉增加、傷口修復(fù)和懷孕，但血管新生也會與血管生長不利病人健康的疾病狀況相關(guān)，例如癌癥和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
[0064]本文所使用的「癌癥」一詞是指由腫瘤或惡性細(xì)胞群、增生或轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)的醫(yī)療狀況，包括實質(zhì)癌和非實質(zhì)癌。癌癥的實例包括但不限于肺癌、腎癌、胃癌、乳癌、腦癌、前列腺癌、肝癌、胰臟癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、頭頸部癌、大腸癌、白血病、淋巴瘤及骨髓瘤。
[0065]「惡病質(zhì)」一詞是指一般健康狀況不佳和營養(yǎng)不良的狀態(tài)。其通常與惡性癌癥相關(guān)并由惡性癌癥所引起，而且特征是嚴(yán)重的食欲不振、體重劇烈下降(尤其是精瘦的體重)及肌肉萎縮。
[0066]高親和力抗IL6抗體
[0067]本發(fā)明是基于識別數(shù)種高親和力的抗IL6抗體，包括1-4-62、Agl-4-6 (亦習(xí)知為FB704)以及HAglT-3-lO。這些抗IL6抗體被發(fā)現(xiàn)可以高結(jié)合親和力(例如具有小于10-8M的KD值，較佳為小于10-9M)和高特異性結(jié)合至人類IL-6，例如以與人類IL6相比遠(yuǎn)較低的結(jié)合親合性結(jié)合至其他的IL6家族細(xì)胞介素，如圖3所圖示者。此外，這些抗體被發(fā)現(xiàn)可明顯地減少IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞增生和STAT3磷酸化、血管新生及血紅蛋白產(chǎn)生。此外，這些抗IL6抗體成功地抑制癌癥引起的(例如前列腺癌引起的)惡病質(zhì)、胰臟癌生長及癌癥轉(zhuǎn)移，例如前列腺癌轉(zhuǎn)移；明顯地增強其它化療試劑的抗癌效用，其它化療試劑例如奧沙利鉬、吉西他濱和多西他賽；以及減少由HUVEC和PBMC細(xì)胞及/或滑液膜纖維母細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞介素(例如MCP-1和sICAM)及/或VEGF，例如從RA患者取得者。
[0068]因此，本文所描述的是能夠結(jié)合(例如特異性結(jié)合至)人類IL6的高親和力抗體，包括1-4-62、Agl-4-6和HAglT-3-lO及上述的功能性變體。將每個1-4-62、Agl-4-6和HAglT-3-lO的重鏈變異區(qū)(VH)和輕鏈變異區(qū)(VL)的氨基酸序列顯示于下表1。這三個抗體中任何抗體的功能性變體所包含的VH鏈可以包含至少85%(例如90%、92%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%)與 1-4-62、Agl-4-6 或 HAglT-3-10 (SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO: 18)的VH相同的氨基酸序列、所包含的VL鏈可以具有至少85% (例如90%、92%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%)與 1-4-62、Agl-4-6 或 HAglT-3-10 (SEQ ID NO:19 或 SEQ ID NO:20)的 VL 相同的氨基酸序列或上述兩者皆有。這些變體能夠結(jié)合至人類IL6。在一些實例中，相對于上述的參考抗體，該等變體具有相似的抗原結(jié)合親和力(例如Kd小于I X 10-8M，較佳為小于1X10-9 或 1X10-10M)。
[0069]結(jié)合親和力是由ka (結(jié)合速率常數(shù))、kd (解離速率常數(shù))或KD (平衡解離)等詞所定義。典型地，當(dāng)相對于抗體使 用時，特異地結(jié)合是指抗體特異地結(jié)合至(「識別」)其標(biāo)靶的親和力(KD)值小于10-8M，例如小于10-9M或10-10M。較低的KD值表示較高的結(jié)合親和力(即較強的結(jié)合)，如此10-9的KD值表示的結(jié)合親和力比10-8的KD值更高。
[0070]兩個氨基酸序列的「識別百分比」是使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264_68, 1990 的算法來決定，并如 Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-77, 1993中所修正。這樣的算法被并入Altschul等人在J.Mol.Biol.215:403-10, 1990發(fā)表的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。BLAST蛋白質(zhì)研究可以使用XBLAST程序、得分=50、字長=3來進行，以獲得與感興趣的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。在兩個序列之間存在間隙之處可以使用Gapped BLAST,如Altschul等人在NucleicAcids Res.25(17):3389-3402, 1997 中所述。當(dāng)使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序時，可以使用各個程序(例如XBLAST和NBLAST)的系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。
[0071]結(jié)合至相同表位的抗體如1-4-62、Agl-4-6及HAglT-3-lO也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0072]在一些具體實施例中，抗IL6抗體包含的重鏈變異區(qū)(VH)包含MHIDDSNGYXSDAF(SEQ ID N0:21)的HC⑶R3，其中X為芳香氨基酸殘基，例如F、Y、H或W。在一些實例中，該HC CDR3為SEQ ID N0:6或SEQ ID NO: 16。這樣的抗體的VH鏈可以進一步包含SEQ IDN0:2所示的HC CDR1、SEQ ID N0:2所示的HC CDR2或上述兩者。
[0073]替代地或附加地，該抗IL6抗體包含的輕鏈變異區(qū)(VL)包含SEQ ID NO: 13或SEQID NO: 15所示的LC CDR3。這樣的抗體的VL鏈可以進一步包含SEQ IDN0:9所示的LC CDR1、SEQ ID NO: 11所示的LC CDR2或上述兩者。
[0074]在一些具體實施例中，本文所述的抗IL6抗體包含與抗體1-4-62、Agl-4-6及HAglT-3-lO相同的重鏈和輕⑶R，如下表1所示。在一些實例中，這些抗體包含與1-4-62、Agl-4-6及HAglT-3-lO相同的VH和VL鏈。該VH和VL鏈可以分別與重鏈CHl和CL融合而形成Fab、Fab’或F(ab' )2片段。或者，該VH和VL鏈可以與重鏈恒定區(qū)(例如人類IgG恒定鏈)和輕鏈恒定區(qū)(K鏈)融合而形成全長抗體。在其他的實例中，該VH和VL鏈可以直接或經(jīng)由連接符被融合而形成單鏈抗體。
[0075]在其他的具體實施例中，與抗體l-4-62、Agl-4_6及HAglT-3-lO中的相比，本文所述的功能性變體可以在該VH、`該VL或兩者的FR中含有一或多個突變(例如保守性取代)。較佳地，這樣的突變不會發(fā)生在預(yù)期會與一或多個CDR相互作用的殘基上。如本【技術(shù)領(lǐng)域】中習(xí)知的，F(xiàn)R區(qū)內(nèi)的突變不太可能會影響抗體的抗原結(jié)合活性。在一些實例中，在抗體1-4-62、Agl-4-6和HAglT-3-lO的一或多個CDR區(qū)中的變化是非實質(zhì)性的，即大致上與參考序列相同。
[0076]「非實質(zhì)性」或「大致上相同的」一詞是指變體的相關(guān)氨基酸序列(例如在FRXDR、VH或VL域中)與參考的抗體相比非實質(zhì)性地不同(例如包括保守的氨基酸取代)，使得該變體相對于參考抗體具有大致上相似的結(jié)合活性(例如親和力、特異性或上述兩者)和生物活性。這樣的變體可以包括少數(shù)的氨基酸變化，例如在指定區(qū)的5氨基酸序列中的I或2個取代。一般來說，與CDR區(qū)相反的是，在FR區(qū)可以進行更多的取代，只要該等取代不會對抗體的結(jié)合功能產(chǎn)生不利的影響(例如與原始的抗體相比減少超過50%的結(jié)合親和力)。在一些具體實施例中，序列同一性可以在原始的和經(jīng)修飾的抗體之間為約85%、90%、95%、96%、97%、98%,99%或更高。在一些具體實施例中，修飾后的抗體具有相同的結(jié)合特異性，并且具有至少50%原始抗體的親和力。在一些實例中，在抗體1-4-62、Agl-4-6及
[0077]HAglT-3-lO的該VH、該VL或上述兩者的一或多個⑶R區(qū)中，該變體包括多達(dá)5個氨基酸取代，例如保守性取代(例如1、2、3、4或5)。
[0078]保守性取代會產(chǎn)生功能和化學(xué)特性與進行這些修飾的分子相似的分子。例如，「保守性氨基酸取代」可能涉及天然氨基酸殘基與其他殘基的取代，使得對該位置上的氨基酸殘基的極性或電荷有很少或沒有影響。所需的氨基酸取代(不論是保守性的或非保守性的)可以由本【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者決定。舉例來說，可以使用氨基酸取代來確認(rèn)重要分子序列中的殘基，或提高或降低本文所述的分子的親合性。包含一或多個保守性氨基酸取代的變體可以根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者習(xí)知的改變多勝肽序列的方法來制備，例如在匯編這種方法的參考文獻中找到的，例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual, J.Sambrookjet al.，eds.，Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York, 1989 或 Current Protocols in MolecularBiology, F.M.Ausubelj et al.，eds.，John Wiley&Sons, Inc., New York。保守性氨基酸取代包括在以下群組內(nèi)的氨基酸之間進行的取代:(a)M、1、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G ;(e)S、T ;(f)Q、N;以及(g)E、D。
[0079]本發(fā)明還提供了具有改良的抗體生物性質(zhì)(例如更高的結(jié)合親和力)的抗體變體?？梢酝ㄟ^將適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓肟贵w的核酸中或經(jīng)由勝肽合成來制備該抗體的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括例如從該抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基去除、及/或插入及/或取代該抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基。進行去除、插入及取代的任何組合，以實現(xiàn)最終的構(gòu)筑體，其前提是最終的構(gòu)筑體具有所需的特性。編碼該抗體的氨基酸序列變體的核酸分子可以通過本【技術(shù)領(lǐng)域】中習(xí)知的各種方法來制備。這些方法包括但不限于寡核苷酸調(diào)節(jié)的(或位點定向的)誘變、PCR誘變以及抗體的早期制備變體或非變體(天然的)形式的盒式誘變。在一個具體實施例中，本發(fā)明的抗IL6抗體的平衡解離常數(shù)(KD)值小于10-8M，特別是小于10-9M或10-10M?？梢允褂帽尽炯夹g(shù)領(lǐng)域】中習(xí)知的技術(shù)測定結(jié)合親和力，例如ELISA或生物特異性相互作用分析、或本【技術(shù)領(lǐng)域】中習(xí)知的其他技術(shù)。
[0080]本文所述的示例性抗IL6抗體包括但不限于:
[0081](i)抗體，包含(a) VH，該 VH 包含 HC CDRUHC CDR2 及 HC CDR3，該 HC CDRl 包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，該HCCDR3包含SEQ ID N0:6或SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列；或(b) VL，該VL包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，該LC C DRl包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，該LC CDR2包含SEQID NO: 11所示的氨基酸序列，以及該LC CDR3包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列；
[0082](ii)包含 VH 的抗體，該 VH 包含 HC CDRUHC CDR2 及 HC CDR3，該 HC CDRl 包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，該HCCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
[0083](iii)包含 VL 的抗體，該 VL 包含 LC CDRl、LC CDR2 及 LC CDR3，該 LC CDRl 包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，以及該LC⑶R3包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列；
[0084](iv)抗體，包含(a) VH，該 VH 包含 HC CDRUHC CDR2 及 HC CDR3，該 HC CDRl 包含SEQ ID NO: 2，該HC CDR2包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，該HC CDR3包含SEQ IDNO: 6所示的氨基酸序列；或(b) VL，該VL包含LC CDRULC CDR2及LC CDR3，該LC CDRl包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，該LC⑶R2包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，該LC⑶R3包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列；[0085](V)包含 VL 的抗體，該 VL 包含 LC CDRULC CDR2 及 LC CDR3，該 LC CDRl 包含 SEQID N0:9所示的氨基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，以及該LCCDR3包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列；
[0086](vi)抗體，包含(a)VH，該 VH 包含 HC CDRUHC CDR2 及 HC CDR3，該 HC CDRl 包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，該HCCDR3包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列；或(b) VL，該VL包含LC CDRl、LC CDR2及LCCDR3，該LC CDRl包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，該LC⑶R3包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列；
[0087](vii)包含 VH 的抗體，該 VH 包含 HC CDR1、HC CDR2 及 HC CDR3，該 HC CDRl 包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，該HCCDR3包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列；
[0088](viii)包含 VH 的抗體，該 VH 包含(a)HC CDR1、HC CDR2 及 HC CDR3，該 HC CDRl包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，該HC CDR3包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列；及(b) VL，該VL包含LC CDRULC CDR2及LC CDR3，該LC CDRl包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，該LC⑶R3包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。
[0089]可以按照例行方法，例如在以下的實例中描述的那些方法檢查本文所描述的任何抗IL6抗體，以決定它們的性質(zhì)，例如抗原結(jié)合活性、抗原結(jié)合特異性及生物功能。
[0090]可以將本文所描述的任何抗IL6抗體修飾為含有額外的本【技術(shù)領(lǐng)域】中習(xí)知的且容易獲得的非蛋白質(zhì)部分，例如通過聚乙二醇化、高度糖基化及其類似物。可以提高血清半衰期的修飾是令人感興趣的。
[0091]本文還揭示了編碼本文所述的任何抗IL6抗體的核酸、諸如包含這些核酸的表達(dá)載體的載體、以及包含該等載體的宿主`細(xì)胞。在一個實例中，編碼序列(例如編碼VH和VL、VH-CHl及VL-CL或全長重鏈和全長輕鏈的序列)的重鏈和輕鏈被包括在一個表達(dá)載體中。在另一個實例中，抗體的每個重鏈和輕鏈被選殖到單獨的載體中。在后者的情況下，編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體可以被共同轉(zhuǎn)染到一個宿主細(xì)胞中用于表達(dá)兩個鏈，該二鏈可以在體內(nèi)或在體外進行組裝，以形成完整的抗體?；蛘?，編碼重鏈和編碼輕鏈的表達(dá)載體可以被引入不同的宿主細(xì)胞中用于表達(dá)每個重鏈和輕鏈，然后該等重鏈和輕鏈可以被純化和組裝，以在活體外形成完整的抗體。
[0092]在本【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者習(xí)知的許多方法可被用于獲得抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，可以使用重組DNA的方法來生產(chǎn)抗體。還可以通過產(chǎn)生融合瘤來生產(chǎn)單株抗體。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)篩選以此方式形成的融合瘤，以識別一或多個產(chǎn)生與特定抗原特異性結(jié)合的抗體的融合瘤。此外，可以使用噬菌體顯示系統(tǒng)來篩選單鏈抗體。
[0093]或者，可以經(jīng)由傳統(tǒng)的方法，例如重組技術(shù)來制備任何抗IL6抗體。例如，可以使用本文所提供的用于本文所述的示例性抗體的多勝肽序列(參見例如表1)來獲得適合的核酸序列編碼，而這樣的核酸序列可以經(jīng)由傳統(tǒng)的重組技術(shù)被選殖到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，以通過例行的方法在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，諸如CHO細(xì)胞)中生產(chǎn)抗體。可以將由此制備的抗體從細(xì)胞或培養(yǎng)上清液分離，并且也可以通過例行技術(shù)檢查該抗體的結(jié)合特征和生物活性。
[0094]在一個實例中，使用噬菌體顯示系統(tǒng)來選擇IL6單鏈抗體。一旦分離，可以將編碼特定IL6SCFVS的多核苷酸選殖到表達(dá)載體，該表達(dá)載體設(shè)以表達(dá)全長免疫球蛋白及其具有所需特異性的片段。簡單來說，單鏈抗體的VH和VL多核苷酸被選殖到免疫球蛋白支架(即IgG)載體、表達(dá)以及二聚化，以便將單鏈「轉(zhuǎn)換」成完整的抗體。該免疫球蛋白支架可以視需要選自五大類免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)中的任何類別。將scFvs轉(zhuǎn)換成完整免疫球蛋白分子的方法是眾所周知的，例如如W094/11523、W097/9351或EP0481790中所描述的。 [0095]本文所述用以表達(dá)抗體的重組載體通常含有編碼抗體氨基酸序列的核酸，該抗體氨基酸序列可操作地連接組成型或誘導(dǎo)型的啟動子。該載體可以適用于原核生物、真核生物或上述兩者的復(fù)制和整合。典型的載體含有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯終止子、起始序列及可用于調(diào)節(jié)編碼抗體的核酸的表達(dá)的啟動子。該載體視情況地含有通用表達(dá)盒，該通用表達(dá)盒含有至少一個獨立的終止子序列、允許在真核生物和原核生物中復(fù)制盒的序列(即，穿梭載體)以及原核和真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。
[0096]本文所述的重組抗IL6抗體可以在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)，該表達(dá)系統(tǒng)例如細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲以及哺乳動物細(xì)胞。在真核細(xì)胞中糖基化或表達(dá)本發(fā)明的重組抗體是沒有必要的；然而，在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)通常是較佳的。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞株的實例為人類胚腎細(xì)胞株(293細(xì)胞)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK細(xì)胞)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-或+DHFR (CH0、CH0-S、CH0-DG44、Flp-1n CHO 細(xì)胞)、非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0 細(xì)胞)以及人類肝細(xì)胞(Hep G2細(xì)胞)。以載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(例如通過化學(xué)轉(zhuǎn)染或電穿孔法)并在傳統(tǒng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(或適當(dāng)?shù)匦薷?，以誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增編碼所需序列的基因?？梢詫⑺a(chǎn)的抗體蛋白進一步分離或純化，以獲得大致上均勻的制劑，可用于進一步的試驗和應(yīng)用。可以使用本【技術(shù)領(lǐng)域】中習(xí)知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。例如，適當(dāng)?shù)募兓绦蚩梢园庖哂H和或離子交換管柱上的分餾、乙醇沉淀、高效液相層析(high-performance liquid chromatography, HPLC)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)、硫酸銨沉淀以及凝膠過濾。
[0097]當(dāng)需要全長抗體時，本文所述的任何抗IL6VH和VL鏈的編碼序列可以被連接到人類免疫球蛋白的Fe區(qū)的編碼序列，并且所得到的編碼全長抗體重鏈和輕鏈的基因可以被表達(dá)和組裝在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，該宿主細(xì)胞例如植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
[0098]可以經(jīng)由例行的方法制備抗原結(jié)合片段。例如，F(xiàn)(ab’)2片段可以通過全長抗體分子的胃蛋白酶消化來生產(chǎn)，而Fab片段可以通過減少F(ab’)2片段的二硫鍵來生產(chǎn)?；蛘撸@樣的片段可以經(jīng)由重組技術(shù)、通過在適合的宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌、酵母、哺乳動物、植物或昆蟲細(xì)胞)中表達(dá)重鏈和輕鏈片段來制備，并在活體內(nèi)或活體外讓該等片段被組裝形成所需的抗原結(jié)合片段。
[0099]可以經(jīng)由重組技術(shù)、通過連接編碼重鏈變異區(qū)的核苷酸序列和編碼輕鏈變異區(qū)的核苷酸序列來制備單鏈抗體。較佳地，將柔性連接符并入該兩個變異區(qū)之間。
[0100]抗IL6抗體的使用[0101]發(fā)現(xiàn)到，本文所述的抗IL6抗體結(jié)合IL6并作為IL6的拮抗劑以及調(diào)節(jié)IL6依賴的信息途徑。特別的是，發(fā)現(xiàn)到那些抗體明顯抑制IL6依賴的細(xì)胞增生(例如胰臟癌細(xì)胞生長)和磷酸化STAT信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、減少IL6誘導(dǎo)的血管新生在體內(nèi)形成以及抑制人體腫瘤轉(zhuǎn)移(例如前列腺癌轉(zhuǎn)移)。此外，當(dāng)與化療劑一起使用時，這些抗體在人類胰臟腫瘤的動物模型中表現(xiàn)出協(xié)同療效，該化療試劑例如奧沙利鉬、吉西他濱(gemticibine)及多西他賽。
[0102]因此，本文所述的抗IL6抗體可被用于治療與IL6相關(guān)的疾病或病狀，包括但不限于炎癥性失調(diào)、自體免疫疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、克羅恩氏癥、巨大淋巴結(jié)增生、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)黏連性脊椎炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎及牛皮癬)、血管新生、癌癥例如實體瘤(例如多個多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉(zhuǎn)移以及癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)。
[0103]為了實施本文所述的治療方法，可以將編碼這種抗體的任何抗IL6抗體(例如具有與抗體1-4-62、Agl-4-6或HAglT-3-lO相同的CDR或相同的VH和VL鏈的抗體)或核酸(例如表達(dá)載體)與一或多種醫(yī)藥上可接受的載劑配制成醫(yī)藥組合物。本文使用的「醫(yī)藥上可接受的」是指載劑與該組合物中含有的活性成分兼容，較佳為能夠穩(wěn)定活性成分，而且對待治療的個體不會有害。該載劑可以作為活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或培養(yǎng)基。適當(dāng)載劑的一些實例包括生理上兼容的緩沖液，例如漢克溶液(Hank’s solution)、林格氏液(Ringer’s soIution)、生理鹽水緩沖液、乳糖、右旋糖、鹿糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、無菌水、糖漿及甲基纖維素。該醫(yī)藥組合物還另外包括潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，例如甲基-和丙基羥基-苯甲酸酯；增甜劑；以及調(diào)味劑° 參見例如 Remington, s Pharmaceutical Sciences, Editionl6, Mack PublishingC0., Easton, Pa (1980)；以及 Goodman and GilmanVThe Pharmacological Basis ofTherapeutics", Tenth Edition, Gilman, J.Hardman and L.Limbird, eds., McGraw-HillPress, 155-173, 2001。
[0104]根據(jù)本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、錠劑、香囊劑、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液及包裝粉劑的形式。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以經(jīng)由任何生理上可接受的路徑傳遞。這些路徑可以包括但決不限于非口服投予、全身投予、口服投予、經(jīng)鼻投予、直腸投予、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮投予、吸入投予以及肌內(nèi)注射。本文所使用的「非口服」一詞包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、關(guān)節(jié)腔、胸骨內(nèi)、脊髓內(nèi)、病灶內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
[0105]可以通過混合具有所需純度的試劑與視情況的醫(yī)藥上可接受載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciencesl6th edition, Osol, A.Ed.(1980))以凍干制劑或水溶液的形式制備配制用于治療用途的醫(yī)藥組合物用于存儲?？山邮艿妮d劑、賦形劑或穩(wěn)定劑在采用的劑量和濃度上對接受者是無毒的，并且包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；包括抗壞血酸和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑(例如十八碳基二甲基芐基氯化銨；氯化六輕季銨；氯化節(jié)燒銨、節(jié)索氯銨(benzethonium chloride);苯酹、丁基或芐醇；對羥苯甲酸烷酯，例如對羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)多勝肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、麩酰氨酸、天冬酰氨酸、組氨酸、精氨酸或離氨酸；單糖、雙糖及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ;糖類，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如，鋅蛋白質(zhì)錯合物)'及/或非離子型界面活性劑，例如TWEENTM、PLURONICSTM 或聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)。
[0106]在一些具體實施例中，本文所述的方法目的在于治療癌癥，例如前列腺癌。需要此治療的人類個體可以是患有或懷疑有癌癥的患者。在一些實例中，本文所述的抗IL6抗體的量與空白對照相比可有效抑制至少20%、30%、50%、80%、100%,200%,400%或500%的IL6誘導(dǎo)的細(xì)胞增生。在其他的具體實施例中，本文所述的抗IL6抗體的量可有效抑制至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%的STAT3磷酸化。在一些實例中，本文所述的抗IL6抗體的量可有效抑制IL6誘導(dǎo)的血管新生、癌癥引起的惡病質(zhì)(例如前列腺癌引起的惡病質(zhì))、癌癥轉(zhuǎn)移(前列腺癌轉(zhuǎn)移)或上述的組合。
[0107]在其他的具體實施例中，本文所述的方法是用于治療自體免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個實例中，該個體為患有或被懷疑有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。在一些實例中，本文所述的抗IL6抗體的量足以減少例如至少20%、30%、50%、80%、100%,200%,400%或500%的炎癥性細(xì)胞介素產(chǎn)生，該炎癥性細(xì)胞介素例如MCP-1及/或sICAMo
[0108]為了治療目標(biāo)疾病，例如癌癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，可以將上述的有效量醫(yī)藥組合物經(jīng)由適當(dāng)?shù)穆窂酵队栊枰撝委煹膫€體(例如人類)。需要治療的人類個體可以是已處于患有IL6相關(guān)失調(diào)的風(fēng)險或懷疑患有IL6相關(guān)失調(diào)的人類患者。這樣的患者可以通過例行體檢來確認(rèn)。
[0109]可以將本文所述的任何抗IL6抗體與其他的治療劑組合使用。在此上下文中「組合」一詞是指該抗體組合物和治療劑不是同時就是依序給出。例如，組合療法可以包括與至少一額外的治療劑共同配`制及/或共同給藥的至少一抗IL6抗體。在一個具體實施例中，該額外的治療劑是一種癌癥化療劑，例如奧沙利鉬、吉西他濱、多西他賽。在另一個具體實施例中，該額外的治療劑可以是疾病改善抗風(fēng)濕藥物(disease modifying antirheumaticdrugs, DMARDs),例如甲氨喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯喹(chloroquine)、輕氯喹、環(huán)孢素A、柳氮塞拉金(sulfasalazine),用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。這種組合療法可以有利地利用低劑量投予的治療劑，從而防止可能的毒性或伴隨各種單一療法的并發(fā)癥。此外，本文所揭示的該額外的治療劑可以作用于除了或不同于IL6/I6R/gpl30途徑的途徑，因此，預(yù)期該額外的治療劑可以增強及/或協(xié)同抗IL6抗體的效用。
[0110]當(dāng)本文所述的抗體組合物與第二治療劑共同使用時，治療劑量不足的該組合物或第二劑、或治療劑量不足的該組合物與該第二劑兩者可被用于治療具有、或處于與IL6調(diào)節(jié)的細(xì)胞信息傳遞相關(guān)的疾病或失調(diào)的發(fā)展風(fēng)險的個體。本文中使用的「治療劑量不足」是指在沒有其他試劑存在下投予的劑量低于會在個體產(chǎn)生療效的劑量。因此，治療劑量不足的試劑在沒有投予本文所述的抗IL6抗體的下并不會在個體產(chǎn)生所需療效。許多臨床使用的試劑的治療劑量為醫(yī)藥領(lǐng)域中眾所周知的，并且本【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者無需過多的實驗即可決定額外的治療劑量。治療劑量已被廣泛描述于參考文獻中，該參考文獻例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences, 18th ed.，1990 ;以及許多其他被醫(yī)學(xué)界仰賴作為疾病和失調(diào)的治療指導(dǎo)的醫(yī)療參考文獻。[0111]可以使用在醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者習(xí)知的傳統(tǒng)方法來將該醫(yī)藥組合物投予個體，這取決于待治療的疾病類型或疾病的部位。
[0112]可注射的組合物可以含有各種載劑，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉宣蘧酸異丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及類似物)。對于靜脈注射，可以通過滴注法投予水溶性抗體，藉以注入含有該抗體和生理上可接受的賦形劑的醫(yī)藥制劑。生理上可接受的賦形劑可以包括例如5%右旋糖、0.9%生理鹽水、林格氏溶液或其他適合的賦形劑。肉內(nèi)制劑，例如適當(dāng)可溶性鹽形式抗體的無菌制劑可以被溶解并在醫(yī)藥賦形劑中投予，該醫(yī)藥賦形劑例如注射水、0.9%生理鹽水或5%葡萄糖溶液。
[0113]當(dāng)本文所述的編碼抗IL6抗體的核酸被用作治療劑時，表達(dá)該抗體的核酸或載體可以被以例如Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bi0.2，139中描述的方法傳遞給個體。例如，可以使用脂質(zhì)體、水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解的奈米膠囊或生物黏附性微球?qū)⒃摵怂峄蜉d體引入細(xì)胞?；蛘撸梢酝ㄟ^直接注射或通過使用輸液泵局部傳遞該核酸或載體。其他的方法包括采用各種輸送和載劑系統(tǒng)，例如經(jīng)由使用共軛物和生物可降解的聚合物。
[0114]為了方便傳遞，任何的抗IL6抗體或其編碼核酸可以與伴護劑(chaperon agent)共軛。如本文所使用的，「共軛」是指兩個實體為結(jié)合的，較佳為具有足夠的親和力，以實現(xiàn)兩個實體之間的結(jié)合的治療效益。共軛包括共價或非共價鍵結(jié)以及其他形式的結(jié)合，例如一個實體陷在另一實體上或內(nèi)，或任一實體或兩個實體皆陷在第三實體(例如微胞)上或內(nèi)。
[0115]該伴護劑可以是天然存在的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)(例如人類血清白蛋白、低密度脂蛋白或球蛋白)、碳水化合物(例如葡聚糖、普魯藍(lán)多糖(pullulan)、甲殼糖、聚殼糖、菊糖、環(huán)糊精或透明質(zhì)酸)或脂質(zhì)。該伴護劑也可以是重組或合成的分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的實例包括聚離氨`酸(polylysine，PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-麩氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N_異丙基丙烯酰胺聚合物以及聚膦氮(polyphosphazine)。
[0116]在一個實例中，該伴護劑為微胞、脂質(zhì)體、奈米顆?；蛭⑶蝮w，其中封裝寡核苷酸/干擾RNA。制備這種微胞、脂質(zhì)體、奈米顆?；蛭⑶蝮w的方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】中眾所周知的。參見例如美國專利 5，108，921 ;5，354，844 ;5，416，016 以及 5，527，5285。
[0117]在另一個實例中，該伴護劑是作為附接膜融合劑或縮合劑中的一或多者的基質(zhì)。
[0118]膜融合劑是響應(yīng)于局部的pH值。舉例來說，在遇到核內(nèi)體內(nèi)的pH值時，其可以在其直接環(huán)境中引起物理變化，例如滲透性質(zhì)的變化，這會破壞或增加核內(nèi)體膜的通透性，從而便于釋放反義寡核苷酸進入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。較佳的膜融合劑會改變電荷，例如在pH值低于生理范圍(例如在pH為4.5-6.5)時變成質(zhì)子化。膜融合劑可以是含有能夠在曝露于特定PH范圍時經(jīng)歷電荷變化(例如質(zhì)子化)的胺基的分子。這樣的膜融合劑包括具有聚胺鏈(例如聚乙烯亞胺)的聚合物和膜破壞劑(例如蜂毒素(mellittin))。其他的實例包括聚組氨酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亞胺以及聚縮醛物質(zhì)(例如陽離子聚縮醛)。
[0119]縮合劑與反義寡核苷酸相互作用而使其縮合(例如縮小寡核苷酸的大小)，從而保護其對抗降解。較佳地，該縮合劑包括經(jīng)由例如離子交互作用與寡核苷酸交互作用的部分(例如帶電的部分)。縮合劑的實例包括聚離氨酸、精胺、亞精胺、聚胺或其季鹽、假勝肽-聚胺、勝肽模擬聚胺、聚胺樹枝狀聚合物、精氨酸、脒、魚精蛋白、陽離子性脂質(zhì)、陽離子性卟啉以及α-螺旋勝肽。
[0120]本文所述的抗IL6抗體也可以用于在生物樣品中檢測IL6的存在?；诳贵w的檢測方法是本【技術(shù)領(lǐng)域】中眾所周知的，并且包括例如ELISA、免疫印跡(immunoblots)、放射免疫試驗、免疫熒光法、免疫沉淀及其他相關(guān)的技術(shù)?？梢栽谠\斷套組中設(shè)置抗體，該診斷套組整合至少一個其他的組件來檢測蛋白質(zhì)。該套組也可以含有包裝、說明書或其他的材料，以幫助蛋白質(zhì)的檢測和套組的使用。
[0121]可以使用檢測標(biāo)記修飾抗體，該檢測標(biāo)記包括配體基團(例如生物素)、放射性同位素、熒光團或酶。酶是通過其活性檢測。例如，山葵過氧化酶是檢測其將基質(zhì)四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)轉(zhuǎn)換成藍(lán)色顏料的能力，其可使用分光亮度計量化?？贵w也可以被功能性地連接(例如通過基因融合、化學(xué)耦合、非共價結(jié)合或以其他方式)至至少一個其他的分子，例如另一種抗體(例如雙特異性和多特異性抗體)、細(xì)胞毒性或細(xì)胞生長抑制劑、毒素、放射性同位素及類似物。
[0122]套組
[0123]本發(fā)明還提供了用于治療IL6相關(guān)疾病的套組。這樣的套組可以包括一或多個容器，該容器包含抗IL6抗體(例如1-4-62、Agl-4-6及HAglT-3-lO)或其編碼核酸。
[0124]在一些具體實施例中，該套組可以包含根據(jù)本文所述的任何方法使用的說明。包括的說明可以包含根據(jù)本文所述的任何方法投予抗IL6抗體來治療、延緩發(fā)病或減輕IL6相關(guān)疾病的描述，該IL6相關(guān)疾病例如癌癥(例如前列腺癌)或自體免疫疾病(例如RA)。該套組可以進一步包含基于識別個人是否患有該疾病來選擇適用治療的個人的描述。在仍其他的具體實施例中，該說明包含向處于該疾病風(fēng)險的個人投予抗IL6抗體的描述。
[0125]與抗IL6抗體的使 用有關(guān)的說明通常包括有關(guān)劑量、給藥時間表及意圖治療的投予途徑的信息。該容器可以是單位劑量、散包(例如多劑量包裝)或子單位劑量。在本發(fā)明的套組中提供的說明通常是寫在標(biāo)簽或包裝說明書上的說明(例如該套組中包括的紙張)，但是機器可讀的說明(例如磁盤或光儲存碟上進行的說明)也是可以接受的。
[0126]卷標(biāo)或包裝說明書表明，該組合物是用于治療、延緩發(fā)病及/或減輕肝纖維化或肝硬化?？梢蕴峁┱f明來實施本文所述的任何方法。
[0127]本發(fā)明的套組是在適合的包裝中。適合的包裝包括但不限于玻璃小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝(例如密封的聚酯膠膜或塑料袋)及其類似物。還可以構(gòu)思的是與特定的裝置結(jié)合使用的包裝，例如吸入器、經(jīng)鼻的投予裝置(例如霧化器)或輸液裝置，例如微型泵。套組可以具有無菌的接取端口(例如該容器可以是靜脈溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的栓塞的小瓶)。該容器也可以具有無菌的接取端口(例如該容器可以是靜脈溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的栓塞的小瓶)。該組合物中至少一活性劑為抗IL6抗體。
[0128]本文所述的任何套組還可以包括額外的治療劑，該治療劑例如抗癌藥物(例如奧沙利鉬、吉西他濱、多西他賽)或DMARD (例如甲氨喋呤、硫唑嘌呤、氯喹、羥氯喹、環(huán)孢素A或柳氮塞拉金)。
[0129]套組可以視情況地提供額外的組件，例如緩沖液和解釋性信息。通常情況下，該套組包含容器及在容器上或與容器結(jié)合的標(biāo)簽或包裝說明書。在一些具體實施例中，本發(fā)明提供的制造對象包含如上所述的套組內(nèi)含物。
[0130]不需要進一步的闡述，據(jù)信本【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識者可以根據(jù)以上的描述來利用本發(fā)明到最完整的程度。因此，以下的特定具體實施例是被解讀為僅僅是說明性的，而不是以任何方式限制本發(fā)明的其余部分。本文中引用的所有出版物系為了本文中提及的目的或標(biāo)的物以引用方式并入。
[0131]實施例1:高親和力抗體結(jié)合至人類IL6的鑒別
[0132]構(gòu)建顯示噬菌體的人類原生scFv抗體庫如下，以用于鑒別能夠結(jié)合至人類IL6的高親和力人類抗體。
[0133]從151個健康捐贈者的周邊血管淋巴細(xì)胞中分離出mRNA，并通過M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas公司)使用寡聚dT引子由此合成cDNA。擴增VH和VL基因、組裝并通過具有一些修改的標(biāo)準(zhǔn)流程接合到噬菌體載體。將接合的產(chǎn)物經(jīng)由電穿孔引入TGl大腸桿菌細(xì)胞中。之后，回收大腸桿菌細(xì)胞并在含有100mg/ml的安比西林和2%葡萄糖的2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將M13K07輔助噬菌體顆粒加入培養(yǎng)中，以產(chǎn)生scFv-噬菌體顆粒，從而產(chǎn)生單鏈抗體(scFv)庫。該抗體庫的多樣性是由超過1000個選殖定序來決定。
[0134]將scFv庫進行四輪的生物篩選如下。在4°C將培養(yǎng)孔涂布在0.1M NaHC03緩沖液中的重組IL6整夜,然后用300 μ I的磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline, PBS)沖洗兩次。在37°C用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)在PBS中阻斷培養(yǎng)孔I小時；加入100 μ I在含1%BSA的PBS中的噬菌體顆粒(2X lOllpfu)，并在室溫(roomtemperature，RT)搖動I小時。然后，用300 μ 10.5% (重量/體積)的Tween20/PBS將培養(yǎng)孔洗滌6次。洗提結(jié)合的噬菌體并通過大腸桿菌TGl感染而放大。用M13K07解救感染的細(xì)胞。將所得的噬菌體顆粒經(jīng)由PEG沉淀濃縮并用于下一輪的生物篩選。
[0135]在第四輪和第五輪的生物篩選中，通過酶連接的免疫吸附試驗(ELISA)檢查噬菌體殖株來篩選其抗原結(jié)合的特異性。在4°C用重組人類IL6或2 μ g/ml在0.lMNaHC03緩沖液中的BSA涂布ELISA盤整夜。用PBS洗滌過后，在室溫用在PBS中的1%(重量/體積)BSA阻斷培養(yǎng)孔I小時。將噬菌體殖株和scFv片段加入培養(yǎng)盤中在室溫培養(yǎng)I小時。用含有0.1%(體積/體積)Tween20的PBS洗滌培養(yǎng)盤，然后在室溫以在1%BSA_PBS中稀釋為1:10, 000的HRP標(biāo)記山羊抗人類IgG (KPL)作為探針。再次洗滌培養(yǎng)盤并加入3，3' ,5,51 -四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)基質(zhì)溶液來顯色。然后加入終止溶液(1M H2S04)并使用自動盤亮度計(Bio-Rad公司)定量在450nm的吸收。
[0136]四輪的生物篩選之后，由上述的ELISA試驗確認(rèn)有超過八百個噬菌體植株能夠結(jié)合到rhIL6。選擇29個噬菌體植株進行序列分析，以確定編碼抗IL6抗體的VH和VL序列。鑒別數(shù)個獨特的植株；通過比較的ELISA試驗測定其結(jié)合活性和特異性。
[0137]選擇由上述生物篩選程序鑒定的母代噬菌體植株，植株1-4-62，進行親和力熟化，以經(jīng)由隨機化VL/VH CDR噬菌體抗體庫的位點定向誘變的建構(gòu)產(chǎn)生高親和力抗IL6抗體，每個抗體庫含有超過0.9X 109的變體抗體。使用在CDR區(qū)含有隨機序列的VL和VH前向引子基于植株1-4-62的VL和VH序列按照下面的標(biāo)準(zhǔn)流程建構(gòu)該抗體庫。使該CDR隨機抗體庫在本文所述的高嚴(yán)格條件下進行生物篩選程序，并且確定至少兩個高親和力植株Agl-4-6 (FB704)和HaglT-3-lO相對于母代植株具有較高的結(jié)合活性。[0138]下表1提供三個抗IL6抗體l-4-62、Agl-4_6及HaglT-3-lO的VH和VL域的互補決定區(qū) 1-3 (CDR1-3)和框架區(qū) 1-4 (Fff 1-4):
[0139]表1抗IL6抗體的VH和V L域的氨基酸序列
[0140]
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合至人類介白素6 (IL-6)的分離抗體，包含: (a)重鏈變異區(qū)(VH)，其包含SEQID NO: 2所示的重鏈互補決定區(qū)I (HC CDRl )、SEQID N0:4所示的重鏈互補決定區(qū)2 (HC CDR2)以及SEQ ID N0:6或SEQ ID NO: 16所示的重鏈互補決定區(qū)3 (HC⑶R3);或 (b)輕鏈變異區(qū)(VL)，其包含SEQID N0:9所示的輕鏈互補決定區(qū)I (LC CDRl)、SEQID NO: 11所示的輕鏈互補決定區(qū)2 (LC CDR2)以及SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15所示的輕鏈互補決定區(qū)3 (LC⑶R3)。
2.如權(quán)利要求1的分離抗體,包含: (i)包含 SEQ ID N0:2 所示的 HC CDRl、SEQ ID N0:4 所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO:6所示的HC CDR3的VH ;或(^)包含SEQ ID NO:2所示的HC CDR1、SEQ ID NO:4所示的HCCDR2及SEQ ID NO: 16所示的HC CDR3的VH ;其中VH可視需要為包含SEQ ID NO: 17或SEQID NO: 18所示的氨基酸序列；及/或
(i)包含 SEQ ID N0:9 所示的 LC CDR1、SEQ ID N0:11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 13所示的 LC CDR3 的 VL ;或(ii)包含 SEQ ID NO:9 所示的 LC CDRl、SEQ ID NO: 11 所示的 LCCDR2及SEQ ID NO: 15所示的LC CDR3的VL ;其中VL可視需要為包含SEQ ID NO: 19或SEQID NO:20所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1的分離抗體，其是選自由下列所組成的群組: (i)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQID NO:2所示的HC CDRl、SEQ ID NO:4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 6 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO: 9 所示的 LC CDRl、SEQID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 13 所示的 LC CDR3 ； (ii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQID NO:2所示的HC CDRl、SEQ ID N0:4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 16 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO:9 所示的 LC CDR1、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 13 所示的 LC CDR3 ； (iii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQID NO:2所示的HC CDR1、SEQ ID N0:4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 6 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO: 9 所示的 LC CDRl、SEQID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 15 所示的 LC CDR3 ； (iv)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQID NO:2所示的HC CDRl、SEQ ID N0:4所示的 HC CDR2 及 SEQ ID NO: 16 所示的 HC CDR3，該 VL 包含 SEQ ID NO:9 所示的 LC CDR1、SEQ ID NO: 11 所示的 LC CDR2 及 SEQ ID NO: 15 所示的 LC CDR3 ； (V)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，該VL包含SEQID NO: 19所示的氨基酸序列； (vi)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQID NO: 17所示的氨基酸序列，該VL包含SEQID N0:20所示的氨基酸序列；及 (vii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQID NO: 18所示的氨基酸序列，該VL包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列；以及 (viii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQID NO: 18所示的氨基酸序列，該VL包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1的分離抗體，其是全長抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗原結(jié)合片段是Fab或(Fab，)2。
5.如權(quán)利要求1的分離抗體，其是單鏈抗體、人源化抗體或人類抗體。
6.一種醫(yī)藥組合物，其包括權(quán)利要求1-5中任一項的抗體及醫(yī)藥上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求6的醫(yī)藥組合物，其進一步包含另一種抗癌試劑或疾病修飾抗風(fēng)濕藥物(disease modifying antirheumatic drug, DMARD)。
8.如權(quán)利要求7的醫(yī)藥組合物，其中該抗癌試劑是選自以下所組成的群組:多西他賽(docetaxel)、奧沙利鉬(01&11卩]^1:;[11)及吉西他濱(〖6111(3；^313；[116),及/或該疾病修飾抗風(fēng)濕藥物是選自以下所組成的群組:甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯奎寧輕氯奎寧(chloroquine hydroxychloroquine)、環(huán)抱靈(cyclosporin A)以及橫胺塞拉金(sulfasalazine)。
9.權(quán)利要求1-5中任一項所述的分離抗體在制備治療IL6相關(guān)疾病的藥物中的用途。
10.如權(quán)利要求9的用途，其中該IL6相關(guān)疾病是選自以下所組成的群組:炎癥性失調(diào)、自體免疫疾病(可視需要地選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、克羅恩氏癥、巨大淋巴結(jié)增生、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)黏連性脊椎炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬)、血管新生、癌癥(可視需要地多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳癌，胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)。
11.一種包括編碼權(quán)利要求1-5中任一項所述的重鏈變異區(qū)(VH)、輕鏈變異區(qū)(VL)或兩者的核苷酸序列的核酸，其中該核酸可視需要并入載體(vector)，該載體可視需要為表達(dá)載體(expression vector)。
12.—種包括權(quán)利要求11所述的核酸的宿主細(xì)胞。
13.—種制備結(jié)合至人類介白素6 (IL-6)的抗體的方法，包含: 將權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞培`養(yǎng)于容許表達(dá)該抗體的條件下:以及可視需要地收集該抗體。`
【文檔編號】A61K39/395GK103772503SQ201310492386
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月22日
【發(fā)明者】林衛(wèi)理, 李冬陽, 吳漢忠, 陳旦生 申請人:泉盛生物科技股份有限公司